दवा वितरण के तरीके माउस भीतरी कान के लिए लक्षित की एक तुलनात्मक अध्ययन: Bullostomy * These authors contributed equally

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Murillo-Cuesta, S., Vallecillo, N., Cediel, R., Celaya, A. M., Lassaletta, L., Varela-Nieto, I., Contreras, J. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J. Vis. Exp. (121), e54951, doi:10.3791/54951 (2017).

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Abstract

हम मध्य कान में विशिष्ट दवा वितरण के लिए कृन्तकों में दो न्यूनतम इनवेसिव microsurgical तकनीक मौजूद है, ताकि यह भीतरी कान तक पहुंच सकता है। पहली प्रक्रिया मध्य कर्ण बुल्ला, करार दिया bullostomy के छिद्र होते हैं; दूसरा एक transtympanic इंजेक्शन है। दोनों मानव नैदानिक ​​intratympanic प्रक्रियाओं का अनुकरण।

Chitosan-glycerophosphate (CGP) और Ringer's लैक्टेट बफर (आरएल) स्थानीय दवा वितरण के लिए biocompatible वाहनों के रूप में इस्तेमाल किया गया। CGP एक nontoxic biodegradable बहुलक व्यापक रूप से दवा अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है। यह आरटी पर एक चिपचिपा तरल है, लेकिन यह शरीर के तापमान पर एक अर्द्ध ठोस चरण के लिए congeals। आरएल एक isotonic मनुष्यों में नसों में प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया समाधान है। इस वाहन की एक छोटी मात्रा ठीक एक bullostomy के माध्यम से दौर विंडो (आरडब्ल्यू) आला पर रखा गया है। एक transtympanic इंजेक्शन मध्य कान भरता है और कम नियंत्रण है, लेकिन भीतरी कान के लिए व्यापक उपयोग की अनुमति देता।

दोनों प्रक्रियाओं, माउस मध्य कान में दवा वितरण के तरीकों के रूप में उपयुक्त हैं, हालांकि transtympanic इंजेक्शन bullostomy की तुलना में कम आक्रामक साबित हुई।

Introduction

सुनवाई हानि सबसे लगातार मानव संवेदी घाटा (है और दुनिया भर में जनसंख्या का 5.3%, और 65 साल की उम्र से अधिक व्यक्तियों के 30% को प्रभावित करता है http://www.who.int/topics/deafness/en अद्यतन 2016,)। नुकसान सुनकर बच्चों में भाषा के अधिग्रहण को प्रभावित करता है और पुराने लोगों में संज्ञानात्मक गिरावट accelerates। इसलिए, यह एक जबरदस्त सामाजिक-आर्थिक प्रभाव के साथ एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य देखभाल समस्या है। यह आनुवंशिक दोष, पर्यावरणीय कारकों या दोनों 1, जो अंत में कोक्लीअ में नुकसान और बालों की कोशिकाओं और न्यूरॉन्स की मौत के लिए प्रेरित का एक संयोजन की वजह से हो सकता है। इन कोशिकाओं को पुनर्जीवित स्तनधारियों में नहीं है, इसलिए सेलुलर घटाने और सहवर्ती सुनवाई हानि के उलट नहीं किया जा सकता है। नैदानिक विकल्प सुनवाई एड्स और कर्णावत, मध्य कान और हड्डी चालन प्रत्यारोपण 2 सहित कृत्रिम उपकरणों, पर आधारित हैं। दुर्भाग्य से, वहाँ कोई विशेष चिकित्सा दृढ Trea हैंऔर हानि सुनवाई के लिए tments इस प्रकार कई अनुसंधान लाइनों निवारक और विरोहक उपचारों के विकास पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। उपन्यास चिकित्सीय विकल्प औषधीय चिकित्सा 2 के लिए जीन और सेल उपचार के साथ-साथ छोटे अणुओं का विकास शामिल है।

कर्णावत औषधीय चिकित्सा में सबसे महत्वपूर्ण चुनौतियों में से एक दवा वितरण है। प्रणालीगत उपचार रक्त-भूलभुलैया बाधा 3 के कारण कोक्लीअ में प्रभावकारिता सीमित है, कर्णावत रक्त वाहिकाओं, जो भीतरी कान तरल पदार्थ homeostasis बनाए रखने के लिए है, इसलिए भीतरी कान के लिए दवा पारित होने को सीमित करने के लिए एक भौतिक और जैव रासायनिक बाधा के रूप में कार्य करता है के साथ संपर्क में निरंतर endothelium। यह केवल छोटे liposoluble अणुओं के लिए पारगम्य है, हालांकि पारगम्यता मूत्रल या आसमाटिक एजेंटों के उपयोग के साथ कर्णावत सूजन के दौरान बढ़ाया जा सकता है, और भी। दवा है कि अंततः कोक्लीअ के बाद प्रणालीगत प्रशासन कम हो जाता है पहुँचता है की मात्रा;इसलिए, उच्च खुराक है कि जैविक विषाक्तता का कारण बन सकता आवश्यक हैं। इसके अलावा, दवा के यकृत चयापचय विषाक्त या निष्क्रिय चयापचयों 4, 5, 6, 7 का उत्पादन कर सकते हैं। इसके विपरीत, स्थानीय हस्तक्षेप अवांछनीय दुष्प्रभाव 4, 7, 8, 9 के बिना मध्य या भीतरी कान में दवा की एक ज्ञात सीमित मात्रा की नियुक्ति की अनुमति देते हैं। वर्तमान नैदानिक अभ्यास में, intratympanic प्रशासन ऐसे Meniere रोग 10 में जेंटामाइसिन के रूप में कुछ कर्णावत विकृतियों, के लिए सीमित कर रहे हैं, अचानक बहरापन में corticosteroids, Meniere रोग, प्रतिरक्षा की मध्यस्थता और शोर प्रेरित सुनवाई हानि, 11, 12, 13, 1अचानक बहरापन 4, 16, 17 में 4, 15 और इंसुलिन की तरह वृद्धि कारक 1 (IGF1)।

स्थानीय प्रशासन के लिए योगों कर्णावत तरल पदार्थ की नाजुक समस्थिति (पीएच और परासारिता) की रक्षा करनी चाहिए। इसके अलावा, यह प्रक्रिया के दौरान बाँझपन बनाए रखने के लिए मस्तिष्कमेरु द्रव के जीवाणु संक्रमण से बचने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। दवा वितरण के लिए इस्तेमाल किया excipient biocompatible, nonototoxic और उचित स्थिरता का होना चाहिए। तरल समाधान Eustachian ट्यूब के माध्यम से क्लीयरेंस के कारण intracochlear इंजेक्शन के लिए सिफारिश की है, लेकिन intratympanic मार्ग के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इस मामले में, दवाओं को आम तौर पर अर्द्ध ठोस जैल द्वारा किया जाता है मध्य कान 4, 18, 19 में अपने स्थायित्व बढ़ाने के लिए। वैकल्पिक वितरण systeभीतरी कान के लिए दवा के पारित होने में वृद्धि करने के वाहक के रूप में इस्तेमाल किया एमएस नैनोकणों 20 कर रहे हैं और 21 adenoviruses यहाँ हम दो वाहनों की तुलना में: CGP और एक आर एल समाधान। CGP एक हाइड्रोजेल chitosan द्वारा गठित एक रेखीय polysaccharide डी-glucosamine और एन एसिटाइल-D-glucosamine जलीय गोले से प्राप्त किया, और β-glycerophosphate, एक polyol कि chitosan चेन चारों ओर पानी की एक ढाल रूपों और में यह कहना है से बना है तरल रूप। CGP थर्मल है और मध्य कान 22, 23, 24, 25 में निरंतर दवा रिहाई की इजाजत दी, lysozymes द्वारा अपमानित किया जा सकता है। Chitosan आधार हाइड्रोजेल प्रतिरक्षाजनकता और स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 23, 24 के सक्रियण की कमी की कमी के कारण इस तरह के दवा वितरण के रूप में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त वाहनों रहे हैं। अन्य संगठनों परएर हाथ, आर एल बफर, पानी और इलेक्ट्रोलाइट्स का एक स्रोत के रूप में एक गैर pyrogenic isotonic समाधान (273 mOsm / एल और पीएच 6.5) मनुष्यों में नसों में प्रशासन के लिए इरादा है, विशेष रूप से खून की कमी, मानसिक आघात या क्योंकि लैक्टेट चयापचय के उपोत्पाद चोटों जला जिगर में एसिडोसिस प्रतिक्रिया।

यहाँ हम वर्णन है और दो शल्य चिकित्सा पद्धतियों कि माउस भीतरी कान के लिए स्थानीय दवा वितरण के लिए परिष्कृत किया गया है की तुलना करें। दोनों तकनीकों की सुरक्षा प्रोफाइल, कार्यात्मक रूपात्मक और आणविक परीक्षण का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। सुनवाई श्रवण brainstem रिस्पांस (ABR), 26, 27 से पहले और अलग अलग समय पर microsurgery के बाद प्रदर्शन का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। अंत बिंदु प्रक्रियाओं कोक्लीअ काटना और इन दोनों प्रक्रियाओं के microsurgical, संरचनात्मक सेलुलर और आणविक प्रभाव की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया।

Protocol

सुनिश्चित करें कि जानवर से निपटने प्रक्रियाओं अंतरराष्ट्रीय और राष्ट्रीय नियमों के अनुसार कर रहे हैं। प्रोटोकॉल यूरोपीय समुदाय 2010/63 / यूरोपीय संघ और स्पेनिश आरडी 53/2013 के दिशा-निर्देशों में क्रमश: इस प्रकार है।

1. सामान्य जानवर से निपटने

  1. फ़ीड चूहों विज्ञापन में एक मानक आहार और पीने के पानी के साथ libitum। नियंत्रण के लिए स्वास्थ्य और प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघों (FELASA) की सिफारिशों के लिए रूस का पालन करके अच्छी तरह से किया जा रहा।

2. सुनवाई आकलन

नोट: सर्जरी के बाद पहले परीक्षण सुनवाई के द्वारा microsurgical प्रक्रियाओं और कई बार ट्रैक कार्यात्मक प्रभाव ऐसे ABR 9 के रूप में गैर-आक्रामक प्रक्रियाओं के साथ (इस काम 2, 7, 14 और 28 डी postmicrosurgery में)।

  1. ABR परीक्षण के लिए, कम अवधि प्रभाव प्रोटोकॉल के साथ चूहों anesthetize (100 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन (BW) ketamine के intraperitoneal इंजेक्शन और xylazine यानी (10मिलीग्राम / किग्रा, BW)। वैकल्पिक रूप से, inhalant संज्ञाहरण के तहत परीक्षण सुनवाई प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: चूंकि ABR मानकों को संवेदनाहारी प्रोटोकॉल 28 से प्रभावित किया जा सकता है, प्रयोग के दौरान ही एक का उपयोग करें।
  2. पैर के अंगूठे चुटकी पलटा परीक्षण द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें।
    नोट: जब वापसी पलटा गायब हो जाता है, पशु श्रवण परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए संज्ञाहरण का एक उचित गहराई तक पहुँच गया है।
  3. ऐसे hydroxypropyl methylcellulose आधारित जैल के रूप में आंसू की आपूर्ति करता है, के सामयिक प्रशासन द्वारा सुखाना और माध्यमिक keratoconjunctivitis sicca से आंखों की रक्षा।
  4. पूरी प्रक्रिया के दौरान शारीरिक तापमान (37.5-38 डिग्री सेल्सियस) पर माउस रखें। बिजली के हस्तक्षेप से बचने के लिए, एक गर्म पानी पंप और हीटिंग पैड का उपयोग करें। गुदा जांच के साथ शरीर के तापमान की निगरानी। हमेशा जानवर ज़रूरत से ज़्यादा गरम नहीं ख्याल रखना।
    नोट: हम चूहों के बीच एक सतह कीटाणुनाशक के साथ हीटिंग पैड सफाई सलाह देते हैं।0; संज्ञाहरण प्रेरण और वसूली, बिजली का हीटिंग पैड, गरमागरम या अवरक्त रोशनी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. ABR प्रक्रिया
    नोट: ABR पंजीकरण के लिए, तरंग पैदा करने के लिए एक भीतर साउंड कार्ड के साथ एक कंप्यूटर कार्य केंद्र का उपयोग करें (एनालॉग से डिजिटल, डीए उत्पादन, रूपांतरण) और बिजली प्रतिक्रिया waveforms digitize करने के लिए (डिजिटल, ई निवेश करने के लिए एनालॉग), एक attenuator, एक आस्टसीलस्कप और एक कम प्रतिबाधा एम्पलीफायर। आधुनिक श्रवण कार्यस्थानों (यानी टकर डेविस Techonologies) एक कॉम्पैक्ट प्रणाली में इन सभी घटक शामिल हैं।
    1. एक ध्वनि attenuating कक्ष के भीतर हीटिंग पैड पर प्रवण स्थिति में anesthetized माउस की जगह परिवेश शोर हस्तक्षेप और गूंज (चित्रा 1) से बचने के लिए।
    2. बाहरी श्रवण नहर में ध्वनिक उत्तेजनाओं देने। पूर्व निर्धारित उत्तेजनाओं या नए उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ डिजाइन संकेतों का प्रयोग करें। चुने गए अध्यक्ष को डीए वर्कस्टेशन उत्पादन में कनेक्ट।
      नोट: Freबाहरी श्रवण नहर में डाला ई-क्षेत्र या बंद क्षेत्र वक्ताओं इस्तेमाल किया जा सकता है। पूर्व पसंद किया जब बंद सिस्टम में जांच प्रविष्टि और ध्वनि अंशांकन में कठिनाई की वजह से चूहों के साथ काम कर रहे हैं। मुक्त क्षेत्र वक्ताओं दोनों कानों को उत्तेजित और एक binaural प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना। मुक्त क्षेत्र वक्ताओं के साथ मुख्य रूप से monaural प्रतिक्रियाएं प्राप्त करने के लिए, contralateral गतिविधि रोड़ा (यानी कान प्लग के साथ) या शोर मास्किंग द्वारा द्वारा समाप्त किया जाना है।
      1. एक निश्चित दूरी (आमतौर पर 5-20 सेमी) वक्ता बाहरी श्रवण नहर के साथ गठबंधन के केंद्र के साथ सिर या चयनित कान का सामना करना पड़ पर मुफ्त मैदान वक्ता रखें। सुनिश्चित करें कि कोई बाधाएं और स्पीकर और कान के बीच है कि पंख पूरी तरह से खोला जाता है।
    3. स्टेनलेस स्टील subdermal सुई इलेक्ट्रोड के रूप में इस जगह: i) सक्रिय (सकारात्मक) कान के बीच खोपड़ी में इलेक्ट्रोड (खोपड़ी के शिखर से अधिक), द्वितीय) संदर्भ (नकारात्मक) इलेक्ट्रोड, कर्णमूलीय मेंपंख के नीचे क्षेत्र, और iii) वापस, पूंछ या हिंद अंग क्षेत्र में जमीन इलेक्ट्रोड (चित्रा 1)।
      1. सकारात्मक और नकारात्मक इलेक्ट्रोड में बिजली प्रतिबाधा की जाँच करें। सुनिश्चित करें कि प्रतिबाधा कम से कम 3 kOhm (आदर्श 1 kOhm) है। यदि यह अधिक है, का स्थान है, शराब के साथ स्वच्छ या इलेक्ट्रोड जगह।
    4. ABR रिकॉर्डिंग के लिए, 5-10 डीबी SPL कदम 27, 29, 30 में ध्वनि दबाव स्तर (एसपीएल) के लिए 90 से 10 डीबी रिश्तेदार तीव्रता को कम करने में ब्रॉडबैंड क्लिक और शुद्ध स्वर आवृत्तियों और वर्तमान उत्पन्न करते हैं।
      1. वर्तमान संक्षिप्त क्लिक करें या स्वर उत्तेजनाओं (1-5 एमएस) उच्च स्तर (यानी 80 या 90 डीबी एसपीएल) के साथ शुरुआत की और 5-10 डीबी SPL चरणों में तीव्रता को कम करने फट। रजिस्टर उत्तेजना के बाद पहली बार 10 एमएस में बिजली प्रतिक्रिया (पैदा ABR प्रतिक्रियाओं 6-8 एमएस में दिखाई देते हैं)।
        नोट: इस कारण से, उत्तेजना दरों/ S (सामान्य दर 20-50) अधिक से अधिक 50 उत्तेजनाओं नहीं होना चाहिए।
    5. बढ़ाना, रिकॉर्ड और प्रत्येक उत्तेजना और तीव्रता को पैदा की बिजली प्रतिक्रिया औसत। कम शोर और एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ एक एम्पलीफायर का उपयोग करें, और यह विज्ञापन इनपुट से कनेक्ट।
      नोट: ABRs बहुत कम आयाम, 1 आम तौर पर नीचे μV (पीक से पीक) है और बहुत कम शोर के साथ एक एम्पलीफायर का उपयोग कर दर्ज किया जाना चाहिए। सामान्य सुनवाई चूहों में स्पष्ट ABR तरंगों 100 औसत के बाद उभरने - 200 प्रतिक्रियाएं, हालांकि उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए, या श्रवण के मामले में अधिक repetitions सिफारिश कर रहे हैं (750-1,000) 27।
    6. दिखने में परीक्षण के दौरान ABR सीमा का निर्धारण।
      नोट: ABR दहलीज सबसे कम ध्वनि उत्तेजनाओं तीव्रता मतलब पृष्ठभूमि गतिविधि 31 से ऊपर के लिए मैं चतुर्थ स्पष्ट रूप से दिखाई और मध्यम चोटी से पीक वोल्टेज 2 एसडी लहरों के साथ रिकॉर्डिंग एक विश्वसनीय ABR elicits है। इस डेटा डु पुष्टि की गई है, अंगूठी बंद लाइन विश्लेषण चोटी और interpeak विलंबता सहित अन्य मानकों के साथ-साथ, और लहर आयाम।
    7. या तो स्वयं या स्वचालित रूप से डेटा विश्लेषण करते हैं।
      1. मैनुअल विश्लेषण के लिए, 4-5 ABR तरंगों की पहचान (मैं, द्वितीय, तृतीय ... आदि।) और चोटियों (P1, P2, पी 3 ...) और घाटियों के बाहर मार्क (एन 1, एन 2, एन 3 ...) प्रत्येक लहर के लिए। विश्लेषण पूरा हो गया है एक बार स्प्रेडशीट या टेक्स्ट फाइल करने के लिए, निर्यात डेटा।
        नोट: बिजली प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग के लिए विशेष सॉफ्टवेयर आमतौर पर स्वचालित रूप से विश्लेषण करता है। अतिरिक्त माप एक निश्चित तीव्रता (यानी 70 या 80 डीबी एसपीएल) करने के लिए या व्यक्तिगत क्लिक थ्रेसहोल्ड (दहलीज पर यानी 15 डीबी एसपीएल) के सापेक्ष तीव्रता पर प्रतिक्रिया में ABR रिकॉर्डिंग में निर्धारित किया जा सकता है।
  6. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ABR डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं। प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है, उपयोग मानक टी परीक्षण या विचरण (एनोवा) के विश्लेषण बनती मुख्य ABR parame तुलना करने के लिएविभिन्न समूहों के 26, 30 में मंत्रियों।
    नोट: अनुदैर्ध्य अध्ययन में, कई कार्यात्मक डेटा अलग लौकिक बिंदुओं पर एक ही जानवर से एकत्र कर रहे हैं (यानी पहले और microsurgery के बाद)। इस मामले में, एक सामान्य रेखीय मॉडल दोहराया उपाय के परीक्षण के लिए एक विस्तृत विचरण विश्लेषण प्रदान करता है।

3. वाहन तैयारी

  1. तैयार है और बाँझ शर्तों के तहत वाहन समाधान का उपयोग करें।
    नोट: तरल समाधान आमतौर पर Eustachian ट्यूब के माध्यम से जल्दी से मंजूरी दे दी है। विभिन्न इंजेक्शन वितरण प्रणाली हाइड्रोजेल और नैनोकणों 32 सहित मध्य कान में दवा के निवास समय बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. CGP-हाइड्रोजेल तैयार करने के लिए, एक 1.5-2% (भार / गुम्मट) chitosan समाधान उपज 0.2 एम एसिटिक एसिड में 75% deacetylated chitosan भंग। 9% glycerophosphate (भार / गुम्मट) इस समाधान 7 में जोड़े। समाधान तैयारसिर्फ प्रशासन से पहले और उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोजेल की दुकान।
      नोट: CGP-हाइड्रोजेल मामूली चिपचिपा लेकिन अभी भी इस तापमान पर इंजेक्शन है। 4 डिग्री सेल्सियस से नीचे यह एक ठोस चरण में परिवर्तन, अपने आवेदन अवरुद्ध। आवेदन के बाद, CGP एक चरण 37 डिग्री सेल्सियस पर के बारे में 15 मिनट में एक अर्द्ध ठोस जेल के लिए संक्रमण आए।
    2. विभाज्य (0.5 एमएल) वाणिज्यिक आरएल बफर और दुकान उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर।

4. microsurgical प्रक्रिया

  1. शामक और दर्दनाशक दवाओं के ketamine आधारित संयोजन के साथ (यानी ketamine 100 मिलीग्राम / किग्रा, medetomidine 0.05 मिलीग्राम / किग्रा और 0.025 मिलीग्राम / किलोग्राम phentanile) intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा सामान्य संज्ञाहरण प्रेरित, inhalant एजेंट (यानी isoflurane) द्वारा पीछा किया।
    1. इंजेक्शन एजेंटों का प्रबंध करने के बाद, माउस थूथन करने के लिए संवेदनाहारी facemask को समायोजित करने और कनेक्ट isoflurane वाष्प को हे 2 आपूर्ति। के दौरान साँस लेना संज्ञाहरण बनाए रखेंmicrosurgery और पैर के अंगूठे चुटकी पलटा और सांस लेने पैटर्न के साथ संवेदनाहारी विमान की निगरानी। शल्य चिकित्सा की तैयारी शुरू हो पलटा पूरी तरह से समाप्त कर दिया है और नियमित रूप से श्वास माउस प्रस्तुत करता है।
    2. पूरी प्रक्रिया के दौरान हीटिंग पैड के साथ शरीर का तापमान बनाए रखने और एक hydroxypropyl methylcellulose आधारित जेल के साथ कार्निया स्वचछपटलशोथं से आंखों की रक्षा।
  2. बाँझ पर्दे का उपयोग करके एक स्वच्छ शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार करें। एक गिलास मनका अजीवाणु सर्जरी से पहले साथ microsurgical उपकरणों जीवाणुरहित। पूरे शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान बाँझ शर्तों (बाँझ दस्ताने, पर्दे, शल्य चिकित्सा उपकरणों, आदि) को बनाए रखें।
  3. microsurgery
    1. Bullostomy
      नोट: Bullostomy एकतरफा प्रक्रिया है। माउस के एक कान प्रचालन और नियंत्रण के रूप में contralateral कान का उपयोग करें।
      1. एक डेक्यूबीटस लापरवाह स्थिति में माउस रखें। करने के लिए क़ैंची का उपयोग गर्दन के उदर सतह पर शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयारफर हटा दें। povidone आयोडीन आधारित एंटीसेप्टिक समाधान के साथ त्वचा को साफ, और बाँझ पर्दे के साथ कवर।
      2. एक छुरी का प्रयोग, हंसली के लिए जबड़ा से 2 सेमी अनुदैर्ध्य चीरा बनाते हैं।
      3. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के साथ बढ़ाई के तहत, अवअधोहनुज ग्रंथियों की पहचान करने और संदंश के साथ दोनों अलग। अवअधोहनुज ग्रंथियों वापस लेना और द्वितुंदी मांसपेशियों का मूल है और चेहरे तंत्रिका स्थानीय बनाना।
      4. एक कैंची से द्वितुंदी पेशी के मूल में एक चीरा मध्य कर्ण बुल्ला की अंतर्निहित अवर औसत दर्जे का पहलू को उजागर करें, और यह पेट के बल वापस लेना।
      5. एक 27 जी सुई (2A चित्रा) के साथ में यह ड्रिलिंग द्वारा बुल्ला में एक खोलने बनाओ। Stapedial धमनी और आरडब्ल्यू झिल्ली दुम यह करने के लिए (चित्रा 2 बी) के स्थानीय बनाना। एक absorbable जिलेटिन स्पंज के साथ drilled क्षेत्र से खून साफ ​​करें।
      6. एक 34 जी कैथेटर और एक गिलास सूक्ष्म सिरिंज का प्रयोग, धीरे-धीरे 3-5 μ इंजेक्षनवाहन समाधान (CGP-हाइड्रोजेल या आर एल) bullostomy सीधे आरडब्ल्यू आला पर के माध्यम से एल, भरने यह (चित्रा -2)। ऊतक चिपकने की 1-2 बूंदों के साथ bullostomy सील।
      7. उनकी प्रारंभिक स्थिति में अवअधोहनुज ग्रंथियों लौटें और 5-0 रेशम शल्य सीवन के साथ त्वचा चीरों बंद करें। एक chlorhexidine आधारित चीरा आसपास एंटीसेप्टिक से बचने के लिए घाव संक्रमण को लागू करें। नोट: absorbable और गैर absorbable sutures के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। गैर absorbable sutures 2 सप्ताह में हटाया जाना चाहिए। सिल्क त्वचा बंद करने के लिए सिफारिश नहीं है, क्योंकि इसके प्रयोग चीरा संक्रमण और स्थानीय ऊतक प्रतिक्रियाओं के साथ जुड़ा हुआ है।
    2. द्विपक्षीय transtympanic इंजेक्शन
      1. पार्श्व decubitus स्थिति में माउस प्लेस और 4.3.1.1 में वर्णित के रूप में बाहरी कर्णद्वार नीचे एक मम्मियाँ शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार करते हैं।
      2. बाहरी कान नहर के ऊर्ध्वाधर हिस्सा तुंगिका और एस के लिए पास में एक 0.5 सेमी अनुदैर्ध्य चीरापंख (वैकल्पिक) के आंतरिक त्वचीय गुना ection।
      3. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 ई) का उपयोग बाहरी कान नहर के अंत में कान की झिल्ली जानें, और ऊपरी Pars flaccida और अवर Pars Tensa है, जो कान में की हड्डी की संभाल द्वारा पूर्वकाल और कूल्हों वर्गों में बांटा गया है की पहचान (चित्रा 2 एफ)
      4. Pars flaccida की दुम हिस्से में एक छोटा सा myringostomy बनाओ। इंजेक्शन 33 के दौरान हवा निकासी की अनुमति के लिए कान की झिल्ली की पार्स Tensa में एक अतिरिक्त चीरा। धीरे वाहन के 10-15 μL (CGP-हाइड्रोजेल या आर एल) एक गिलास सूक्ष्म Pars flaccida, आरडब्ल्यू आला के करीब जब तक मध्य कान स्पष्ट रूप से भरा हुआ है के माध्यम से एक 34 जी कैथेटर से जुड़े सिरिंज के साथ समाधान इंजेक्षन।
      5. 5-0 रेशम शल्य सीवन के साथ त्वचा चीरों बंद करो और स्वच्छ 4.3.1.7 में वर्णित है।
      6. अपने दूसरे पक्ष और कार्रवाई पर माउस रखेंcontralateral कान खाया (कदम 4.3.2.5 4.3.2.1 करने)।
  4. जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर माउस रखें। एक जानवर जब तक पूरी तरह से ठीक है कि अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है वापस नहीं है।
  5. शरीर की स्थिति, गतिविधि और दर्द या तनाव के लक्षण की उपस्थिति पर नजर रखने। यदि आवश्यक हो तो दर्दनाशक दवाओं प्रदान करें (यानी Buprenorphine 0.05 मिलीग्राम / किलो, Carprofen 5-10 मिलीग्राम / किग्रा)। शल्य घाव दैनिक समीक्षा करें और postoperatively पुष्टि है कि घाव भर जाने के बाद 7-14 दिनों त्वचा closures को हटा दें।

5. कर्णावत cytoarchitecture की रूपात्मक मूल्यांकन

  1. प्रयोग (यह काम 28 दिनों में postmicrosurgery) के अंत में माउस euthanize, एक intraperitoneal pentobarbital जरूरत से ज्यादा (100 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ सर्जरी के दीर्घकालिक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए।
  2. ठंड 0.1 एम फॉस्फेट बफर के साथ एक transcardial छिड़काव प्रदर्शन करनाखारा (पीबीएस), पीएच 7.5, 0.1 एम पीबीएस में 4% (भार / v) paraformaldehyde (पीएफए) के द्वारा पीछा किया, पीएच 7.5 वर्णित 26 के रूप में।
    चेतावनी: Paraformaldehyde बेहद जहरीला है; त्वचा, आंखों या श्लेष्मा झिल्ली के साथ संपर्क से बचें। मापने और तैयारी के दौरान पाउडर साँस लेने से बचें।
  3. के रूप में 34, 35 में वर्णित vestibular और भीतरी कान की कर्णावत घटकों को अलग करने के बिना लौकिक हड्डी से भीतरी कान काटना करने के लिए एक stereomicroscope का प्रयोग करें।
  4. पृथक भीतरी कान कोमल झटकों के साथ 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम पीबीएस, 7.5 पीएच में 4% (भार / वी) पीएफए ​​के साथ ठीक करें। 0.1 एम पीबीएस, पीएच 7.5 से 5 मिनट के लिए धो 3x।
  5. 10% ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) लगातार झटकों के साथ 10 डी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम पीबीएस, पीएच 6.5 से तैयार के साथ नमूने decalcify, बदलते EDTA समाधान हर 3 डी।
  6. cochleae एक नरम स्थिरता प्राप्त है, EDTA हटाने और 0.1 एम पीबीएस, पीएच 7.5, वाई के साथ 5 मिनट के लिए 3x धोनेआरटी पर मिलाते वें।
  7. वर्णित 34 के रूप में पैराफिन मोम में नमूने एम्बेड और 7 माइक्रोन मोटी कर्णावत वर्गों modiolus के समानांतर हैं।
  8. कर्णावत cytoarchitecture, haematoxylin और eosin (एच एंड ई) 30 के साथ दाग वर्गों का मूल्यांकन और एक डिजिटल कैमरे से जुड़ा एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग छवियों 4X और 20x लेंस के साथ कब्जा करने के लिए।

6. कर्णावत जीन एक्सप्रेशन

  1. काम की सतह और RNase परिशोधन समाधान के साथ सर्जिकल उपकरणों को साफ करें।
  2. 5.1 में वर्णित है और जल्दी से अस्थायी हड्डी एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने से भीतरी कान काटना के रूप में माउस euthanize। एक गिलास युक्त ribonucleic एसिड (आरएनए) रक्षक और स्टेबलाइजर अभिकर्मक डिश में भीतरी कान विसर्जित कर दिया।
  3. जौहरी संदंश के साथ शेष पथराया हुआ हड्डी निकालें और धीरे Vanna की आंख कैंची 35 का उपयोग कर बरोठा से कोक्लीअ अलग।
  4. इसके तत्काल बाद स्ि्न्ंतररएर 80 μL आरएनए रक्षक और स्टेबलाइजर समाधान के साथ एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में कोक्लीअ और सूखी बर्फ में ट्यूब डाल द्वारा ऊतक फ्रीज। -70 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक कर्णावत नमूनों को बचाना।
  5. कर्णावत शाही सेना को अलग रूप में वर्णित 35 और spectrophotometrically इसकी गुणवत्ता और मात्रा का निर्धारण।
  6. एक रिवर्स प्रतिलेखन वाणिज्यिक किट का उपयोग कर कुल माउस शाही सेना के बराबर मात्रा से कर्णावत सीडीएनए उत्पन्न करता है।
  7. तीन प्रतियों में पूरक deoxyribonucleic एसिड (सीडीएनए) बढ़ाना जीन टेप 35, 36 को मापने के लिए QRT- पीसीआर प्रदर्शन करना।
    नोट: इस काम के समर्थक और Il1b, Il6, Tgfb1, Tnfa, Il10 और Dusp1 के विरोधी भड़काऊ जीन टेप में मापा गया था।
  8. संदर्भ जीन स्तर के गणित का मतलब है और सामान्य से रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए लक्ष्य प्रतिलेख चक्र सीमा (सीटी) के स्तर सामान्य से रिश्तेदार अभिव्यक्ति अनुपात की गणनासमस्या समूह अंशशोधक समूह 37 के समांतर माध्य के लिए प्रतिलिपि स्तरों।

Representative Results

सुनवाई के बाद microsurgery ABR पहले से और कई बार परीक्षण किया गया था श्रवण समारोह (चित्रा 1 ए) पर प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए। ABR रजिस्टरों संज्ञाहरण के तहत किया गया था पशु आंदोलन और वोल्टेज कलाकृतियों से बचने के लिए और इसलिए अपनी reproducibility 27 में सुधार होगा। Intraperitoneally ketamine आधारित संयोजन प्रशासित या inhalatory isoflurane आमतौर पर ABR परीक्षण के दौरान पशुओं anesthetize करने के लिए कार्यरत थे। ABR रजिस्टरों प्रदर्शन करते हुए ketamine / xylazine संयोजन एक छोटे से अभिनय (2-3 मिनट) शामिल है और एक स्थिर, सुरक्षित रखरखाव चरण प्रदान करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि isoflurane ABR माप संवेदनशीलता 38 प्रभावित कर सकते हैं। ABR रजिस्टरों के लिए, subdermal इलेक्ट्रोड विशिष्ट स्थानों (चित्रा 1 बी) में रखा जाता है और बिजली प्रतिबाधा मापा जाता है। प्रतिबाधा 3 kOhm या अधिक है, तो इलेक्ट्रोड स्थिति से बचने के लिए Alt जाँच की जानी हैABR लहर आयाम में erations।

Intratympanic वितरण दो microsurgical प्रक्रियाओं (चित्रा 2) द्वारा चूहों में किया जाता है। Bullostomy दौरान बुल्ला का एक्सपोजर अवअधोहनुज ग्रंथियों और मांसपेशियों द्वितुंदी का त्याग करना शामिल है। यह प्रक्रिया चरम देखभाल के साथ किया जाता है क्योंकि कैरोटिड धमनी और vagal तंत्रिका बहुत करीब (2A चित्रा) कर रहे हैं। अगले, बुल्ला stapedial धमनी और आरडब्ल्यू झिल्ली (चित्रा 2 बी) के स्थानीय बनाना drilled है। हड्डी खुर से बचने के लिए, एक छोटे से 0.5 मिमी एपर्चर ड्रिलिंग से पहले एक 27 जी सुई के साथ बनाया गया है। 34 जी कैथेटर आरडब्ल्यू झिल्ली और वाहन की एक छोटी मात्रा की ओर bullostomy माध्यम से निर्देशित है खिड़की आला (चित्रा -2) पर दिया जाता है। Transtympanic इंजेक्शन Pars में एक चीरा के माध्यम से किया जाता है एक 27 जी सुई के साथ कान की झिल्ली की flaccida; एक बड़ा एक पर उत्तेजित कर सकते हैंझिल्ली में कान। इंजेक्शन से पहले, हम Pars Tensa में एक अतिरिक्त चीरा बनाने की सिफारिश वाहन (चित्रा 2 एफ) के इंजेक्शन के दौरान हवा का बहिर्वाह की अनुमति है। यह stapedial धमनी, आंतरिक मन्या धमनी की एक शाखा है, जो जीवन के लिए खतरा खून बह रहा करने के लिए नेतृत्व करेंगे के नुकसान से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।

संरक्षित प्रयोग, गैर संचालित नियंत्रण (चित्रा 3) के समान भर में सुनवाई bullostomy या transtympanic सर्जरी के साथ चूहे। क्लिक और स्वर फटने के जवाब में ABR थ्रेसहोल्ड आधारभूत मूल्यों की तुलना microsurgery के बाद काफी बदलाव नहीं किया। कोई महत्वपूर्ण मतभेद bullostomy और transtympanic दृष्टिकोणों के बीच मनाया गया। आकृति विज्ञान के अध्ययन से बाहर किए गए मध्य कान में सही वाहन डिलीवरी की पुष्टि के लिए और कर्णावत cytoarchitecture में प्रक्रियाओं की वजह से संभावित परिवर्तनों का आकलन करने के लिए। मुख्य कर्णावत क्षेत्रों रों में से कोई भीhowed रूपात्मक परिवर्तन और दोनों प्रक्रियाओं से पशुओं सब कर्णावत संरचनाओं (चित्रा -4 ए) के एक समान आकृति विज्ञान प्रस्तुत किया। इसके अलावा, समर्थक और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स के जीन की अभिव्यक्ति के लिए कर्णावत प्रोफाइल भी अध्ययन किया गया। दो प्रक्रियाओं के बीच ABR डेटा में कार्यात्मक मतभेद की कमी के बावजूद, bullostomy transtympanic दृष्टिकोण (चित्रा 4 बी) की तुलना में मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया का कारण बना।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रयोगात्मक डिजाइन और आकलन सुनवाई। (ए) प्रयोगात्मक प्रक्रिया का आरेख। सुनवाई से पहले और बाद microsurgery ABR के साथ मूल्यांकन किया गया था। कर्णावत नमूने 28 दिनों microsurgery के बाद प्राप्त किया गया। (बी) एक ध्वनि attenuating कक्ष के अंदर हीटिंग पैड पर प्रवण स्थिति में anesthetized माउस, subdermal Electrod साथखोपड़ी (सक्रिय, सकारात्मक) के शिखर के ऊपर कान के बीच खोपड़ी में रखा तों; पंख (संदर्भ, नकारात्मक) नीचे कर्णमूलीय क्षेत्र में और वापस (भूमि) में। मुक्त क्षेत्र वक्ता एक निश्चित दूरी (5 सेमी) दाहिना कान का सामना करना पड़ पर रखा गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. वाहन आवेदन के लिए Microsurgery। (ए) मध्य कर्ण बुल्ला के उदर देखें। bullostomy एक 27 जी सुई के साथ चेहरे की नसों को दुम किया जाता है। (बी) RWN और stapedial धमनी छिद्र के माध्यम से देखा जा सकता है। (सी) 34 जी कैथेटर आरडब्ल्यू आला ओर bullostomy के माध्यम से निर्देशित है। (डी) bullostomy के बाद एक महीने, एक छोटे से बोनीनिशान उद्घाटन साइट (नोक) में मौजूद है। (ई) कान के पार्श्व दृश्य, बाहरी कान नहर में चीरा और कान की झिल्ली (वर्ग) दिखा। (एफ) कान की झिल्ली का विस्तार। एक पंचर (Pars flaccida में काले तारांकन,) कान की झिल्ली एक 27 जी सुई का उपयोग की दुम ऊपरी वृत्त का चतुर्थ भाग में बनाया गया था; इंजेक्शन एक 34 जी कैथेटर का उपयोग कर इस छिद्र के माध्यम से किया गया था। एक अतिरिक्त छेद इंजेक्शन के लिए झिल्ली के कपाल अवर चक्र में बनाया गया था (सफेद तारांकन, Pars Tensa में) पूर्व मध्य कर्ण दबाव संतुलन के लिए। (G) कान की झिल्ली का पंचर के माध्यम से 34 ग्राम कैथेटर के देखें। (एच) microsurgery के बाद कर्णावत क्षेत्र 24 घंटे के देखें। RWN वाहन समाधान (तारांकन) के साथ भर दिया। , लैट पार्श्व; आरओ, व्याख्यान चबूतरे वाला; क्या, पृष्ठीय; मा, कान में की हड्डी; सह, कोक्लीअ; ओ, अंडाकार खिड़की; RWN, गोल खिड़की आला। स्केल सलाखों = ए, डी, एफ में 200 माइक्रोन; स्केल सलाखों = 100 बी, सी, एच में माइक्रोन; स्केल सलाखों = ई में 1,000 माइक्रोन, जी यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. आकलन सुनवाई। क्लिक करने के लिए ABR थ्रेसहोल्ड (मतलब डीबी SPL में ± SEM) के जवाब में की इवोल्यूशन (ए) और स्वर फट (बी) उत्तेजनाओं, पहले और 7, 14 और 28 दिनों के पुरुष आठ सप्ताह पुराने C57BL / 6J में माइक्रो सर्जरी के बाद चूहों। Bullostomy (नारंगी, n = 11); transtympanic इंजेक्शन (नीला, एन = 6); गैर-संचालित (ग्रे, n = 11), यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

जेपीजी "/>
चित्रा 4. कर्णावत आकृति विज्ञान और जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण। (ए) कोक्लीअ के आधार पर मुख्य कर्णावत संरचनाओं की आकृति विज्ञान। गैर संचालित चूहों से मध्य modiolar आयल वर्गों (7 माइक्रोन), कान की, और चूहों एक महीने bullostomy या transtympanic इंजेक्शन द्वारा microsurgery हस्तक्षेप के बाद की Haematoxilin-eosin धुंधला हो जाना। स्केला मीडिया डिब्बे (क, ख, ग) सभी मुख्य घटकों प्रस्तुत करता है। इन संरचनाओं (गिने बक्से) में से प्रत्येक के विवरण बाद में छवियों में दिखाया जाता है: सर्पिल नाड़ीग्रन्थि (1), Corti के अंग (2), सर्पिल बंधन (3) और हलकी लीक vascularis (4)। इनर बाल सेल (तारांकन); बाहरी बालों की कोशिकाओं (तीर के सिर)। स्केल सलाखों = ए, बी, सी में 100 माइक्रोन; स्केल सलाखों = एक-1,2,3,4 में 50 माइक्रोन। (बी) के भड़काऊ मार्करों microsurgery के बाद 28 डी के कर्णावत अभिव्यक्ति। bullostomy (नारंगी) और transtympanic इंजेक्शन (नीला) के बीच और गैर संचालित चूहों (सफेद) की तुलना। *: गैर संचालित बनामसंचालित समूहों; ^: संचालित समूहों के बीच तुलना। जीन अभिव्यक्ति के स्तर 2 के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं - ΔΔCt, या गैर संचालित group.Values n करने के लिए गुना अंतर रिश्तेदार हालत प्रति 3 चूहों के पूल के नमूनों से triplicates का मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। सांख्यिकीय महत्व: पी ** ≤0.01; *** पी ≤0.001; ^^ पी ≤0.01; ^^^ पी ≤0.001। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

भीतरी कान के लिए स्थानीय दवा वितरण सीधे intracochlear इंजेक्शन द्वारा या परोक्ष रूप से intratympanic प्रशासन द्वारा किया जा सकता, मध्य कान 4, 19, 39 में दवा रखकर। Intracochlear प्रशासन नियंत्रित प्रदान करता है और कोक्लीअ के लिए सटीक दवा वितरण, खिड़की झिल्ली के माध्यम से प्रसार से परहेज है, बेसल करने वाली शिखर एकाग्रता ढ़ाल और निकासी Eustachian ट्यूब के माध्यम से। हालांकि, यह आमतौर पर एक अत्यधिक आक्रामक प्रक्रिया है कि एक जटिल और नाजुक microsurgery 7, 39 की आवश्यकता है। इस संदर्भ में, उद्योग नए, लेपित, निरंतर दवा रिहाई 40, 41 के लिए प्रत्यारोपण उपकरणों विकसित कर रहा है। दूसरी ओर, intratympanic प्रशासन एक न्यूनतम इनवेसिव और प्रदर्शन करने के लिए आसान प्रक्रिया है कि डी की बड़ी मात्रा के इंजेक्शन की अनुमति देता हैमध्य कान में गलीचा, हालांकि फार्माकोकाइनेटिक्स नियंत्रित करने के लिए आसान नहीं है। दवा के बहुमत Eustachian ट्यूब के माध्यम से मंजूरी दे दी है और शेष अंश कोक्लीअ 18 तक पहुंचने के लिए आरडब्ल्यू झिल्ली के माध्यम से फैलाना है। आरडब्ल्यू कोक्लीअ 7 की perilymph से भरे मध्य कर्ण नली में मध्य कान से पदार्थों की अधिकतम अवशोषण की साइट है। यह एक semipermeable तीन परत संरचना है, हालांकि इसकी पारगम्यता दवा विशेषताओं (आकार, एकाग्रता, घुलनशीलता और बिजली के प्रभारी) पर और transmembrane परिवहन व्यवस्था (प्रसार, सक्रिय परिवहन या phagocytosis), 42 पर निर्भर करता है। अंडाकार खिड़की और कान का कैप्सूल कोक्लीअ 43, 44 के लिए विकल्प नहीं है लेकिन कम प्रभावी प्रवेश द्वार हैं।

यहाँ हम प्रदर्शन और माउस मध्य कान में लक्षित दवा वितरण के लिए दो microsurgical तरीकों की तुलना: bullostomy और transtympaएनआईसी इंजेक्शन प्रक्रियाओं। इन प्रक्रियाओं के लिए आम महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: i) सुनवाई के मूल्यांकन से पहले और microsurgery के बाद, द्वितीय) बाँझ शर्तों के तहत एक सजातीय वाहन समाधान की तैयारी, iii) संवेदनाहारी प्रक्रिया और पशुओं के शरीर का तापमान और स्थिरांक की निगरानी के सावधान पर्यवेक्षण, चतुर्थ ) वाहन आरडब्ल्यू को निशाना बनाने का उचित मात्रा की धीमी गति से नियुक्ति, और चतुर्थ) कर्णावत के नमूने लेने के आणविक और रूपात्मक विश्लेषण पूरा करने के लिए।

Bullostomy के लिए Retroauricular और उदर दृष्टिकोण वर्णित किया गया है 7, 45। क्योंकि हमारे अनुभव में यह कम रुग्णता में हुई और आरडब्ल्यू 46 के लिए बेहतर उपयोग प्रदान की गई है हम उदर सन्निकटन इस्तेमाल किया। Transtympanic इंजेक्शन आमतौर पर Pars कान की झिल्ली की Tensa के माध्यम से बाहर किया जाता है, कान में की हड्डी manubrium से 12 पूर्वकाल या पीछे। मेंयह काम हम इंजेक्शन के दौरान हवा निकासी की अनुमति देने के Pars Tensa के पिछले अतिरिक्त पंचर के साथ कान में की हड्डी से परे Pars flaccida के माध्यम से तकनीक, एक इंजेक्शन के एक संशोधन का प्रदर्शन किया।

transtympanic इंजेक्शन कम पश्चात आरोग्यलाभ बार और कोई रुग्णता के साथ, bullostomy से कम आक्रामक था, हालांकि दोनों microsurgeries थे तेजी (20 और 5 bullostomy और transtympanic दृष्टिकोण क्रमशः के लिए कान प्रति मिनट)। सबसे महत्वपूर्ण बात, दोनों प्रक्रियाओं सुनवाई बनाए रखा और ABR मापदंडों के microsurgery से पहले निर्धारित उन लोगों के लिए समान थे। transtympanic दृष्टिकोण bullostomy की तुलना में कम समय लगता है और एक ही हस्तक्षेप के दौरान एक ही पशु के दोनों कानों में प्रदर्शन किया जा सकता है। transtympanic इंजेक्शन के लाभ इस प्रकार हैं कि यह, यदि जरूरी हुआ तो द्विपक्षीय किया जा सकता है और दोहराया। दूसरी ओर, bullostomy आरडब्ल्यू झिल्ली के लिए सीधी पहुँच प्रदान करता है दृश्य और filli की अनुमति देता हैआरडब्ल्यू आला की एनजी। इसके विपरीत, transtympanic इंजेक्शन आरडब्ल्यू आला में वाहन स्थापन के नियंत्रण के लिए अनुमति नहीं है।

प्रक्रियाओं इस काम में सूचना दी कि कैसे इस तरह के नुकसान की सुनवाई में ototoxicity और प्रभावकारिता के मूल्यांकन के मूल्यांकन के रूप में पूर्व नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए मध्य कान के लिए एक स्थानीय दवा वितरण वाहन प्रदर्शन करने का वर्णन है। दो microsurgery प्रक्रियाओं का वर्णन किया है कि विशिष्ट फायदे और कमियों के साथ वैकल्पिक तरीकों प्रदान कर रहे हैं। दोनों सुनवाई के संरक्षण और रूपात्मक परिवर्तन का कारण नहीं है। स्थानीय सूजन bullostomy का एक संभावित जटिलता के रूप में वर्णन किया गया है। पूरक तकनीकों का एक सेट भी सुनवाई, रूपात्मक और भड़काऊ मार्कर अभिव्यक्ति के मूल्यांकन सहित postsurgical प्रक्रियाओं, के लिए वर्णित हैं। इन तकनीकों के लिए भविष्य अनुप्रयोगों, आनुवंशिक सेलुलर और औषधीय दृष्टिकोण सहित नुकसान, श्रवण, पशु मॉडल में के लिए नए उपचारों के preclinical मूल्यांकन में शामिल हैं। Intratympanic administratआयनों, मध्य कान में उपचार के वितरण सुनिश्चित दौर खिड़की झिल्ली के साथ संपर्क में, स्पष्ट कर्णावत क्षति के बिना perilymph में पारित होने की सुविधा।

Acknowledgments

लेखक अपनी तकनीकी सहायता के लिए जीनोमिक्स और noninvasive Neurofunctional मूल्यांकन सुविधाएं (IIBM, CSIC-UAM) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम स्पेनिश "Ministerio de अर्थशास्त्र Y Competitividad" (फेडर-SAF2014-53979-आर) और यूरोपीय संघ (FP7-AFHELO और FP7 लोगों के बीच-TARGEAR) IVN के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine (Imalgene) Merial # 2529 CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections
Xylacine (Xilagesic)  Calier # 6200025225
Lubricant eye gel (Artific) Angelini # 784710
Water pump  Gaymar # TP472
Surface disinfectant José Collado SA # CR-36
Subdermal needle electrodes  Spes Medica # MN4013D10SM
Low Impedance Headstage  (RA4LI) Tucker-Davis Technologies
Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) Tucker-Davis Technologies
System 3 Evoked Potential Workstation Tucker-Davis Technologies The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier 
SigGenRP software Tucker-Davis Technologies
Warming pads (TP pads) Gaymar # TP3E
Statistics software (SPSS) IBM
Chitosan (deacetylated) Sigma-Aldrich # C3646
Acetic acid (glacial) VWR # 20103.295 CAUTION: flammable liquid, skin corrosion, respiratory and skin sensitizer
Glycerophosphate Sigma # SLBG3671V
Ringer´s lactate buffer Braun # 1520-ESP
Medetomidine (Domtor) Esteve # 02400190
Phentanile (Fentanest) Kern Pharma # 756650.2 CAUTION:   avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections
Isoflurane (IsoVet) Braun # 469860 CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2 ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed 1 h.
Surgical microscope (OPMI pico) Zeiss
Sterile drape (Foliodrape) Hartmann # 277546
Sterilizer  Fine Science Tools # 18000-45
Scalpel blade Swann Morton # 0205 CAUTION
Scalpel handle Fine Science Tools # 91003-12
Povidone iodine-based antiseptic (Betadine) Meda Pharma SAU # M-12207
Adventitia scissors (SAS18-R8) S&T # 12075-12
Curved scissors CM Instrumente # AJ023-18
Forceps CM Instrumente # BB019-18
Gelatine sponge (Spongostan) ProNaMAc # MS0001
Microlance 27 G Becton Dickinson # 302200
Microliter syringe (701 RN SYR) Hamilton # 80330
Catheter (Microfil 34 G) World Precision Instruments  # MF34G-5
Tissue Adhesive (Vetbond) 3M # 1469SB
Needle holder (Round handled needle holder)  Fine Science Tools # 12075-12
Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) Arago # 990011
Chlorhexidine (Cristalmina) Salvat # 787341
Pentobarbital  (Dolethal) Ventoquinol # VET00040 CAUTION:   avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections
Stereomicroscope (Leica) Meyer Instruments # MZ75
Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action Harvard Apparatus # 28483
Jeweller’s forceps (Dumont) Fine Science Tools # 11252-00
RNase Decontamination Solution  (RNaseZap) Sigma-Aldrich # R2020
RNA Stabilization Solution  (RNAlater) Thermo Fisher Scientific # R0901
Purification RNA kit (RNeasy) Qiagen # 74104
cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific # 4368814
Gene expression assay (TaqMan probes) Thermo Fisher Scientific Il1b: Mm00446190_m1
Il6: Mm00446190_m1
Tgfb1: Mm01178820_m1
Tnfa: Mm99999068_m1
Il10: Mm00439614_m1
Dusp1: Mm00457274_g1
Hprt1: Mm00446968_m1
Real-time PCR System (7900HT) Applied Biosystems # 4329001
Paraformaldehyde (PFA) Merck # 1040051000 TOXIC: PFA is a potential carcinogen
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck # 405491 CAUTION:  harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if
inhaled.
Hematoxylin solution Sigma-Aldrich # HHS16
Eosin Y Sigma-Aldrich # E4382 Hazards: causes serious eye irritation

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References

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