该芯片外型方法:确定蛋白质-DNA相互作用与近基部精密配对

1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
Biology

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Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. J. Vis. Exp. (118), e55016, doi:10.3791/55016 (2016).

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Abstract

染色质免疫沉淀(ChIP)是表观遗传学和基因调节的隔离特定蛋白质-DNA相互作用领域不可缺少的工具。沉淀耦合到高通量测序(芯片起)通常用于确定与染色质相互作用的蛋白质的基因组位置。然而,芯片起是由几百个碱基对相对低的映射分辨率和高背景信号受到阻碍。芯片外的方法是芯片起的改良版本对分辨率和噪声大大提高。芯片外方法论的主要区别是:在图书馆准备的工作流程,有效足迹左侧的lambda核酸外切酶消化的引入和蛋白质-DNA交联网站的权5'DNA边界。然后芯片外库进行高通量测序。所得到的数据可以被利用,以提供独特的和超高分辨率分析上市功能组织ÒF中的基因组中。在这里,我们描述了我们优化和精简了哺乳动物系统和新一代测序边合成平台芯片外的方法。

Introduction

染色质免疫沉淀(ChIP)是一种强有力的方法通过对与在活细胞中给定蛋白质相互作用的DNA片段选择性富集来研究基因调控机制。的ChIP富集的DNA片段的检测方法已演变随着技术的改进,从检测单一位点(标准芯片定量PCR)的对寡核苷酸芯片(芯片芯片),以高通量测序(芯片起)1杂交。虽然芯片起已经看到了广泛的应用,染色质异质性和非特异性DNA的相互作用,阻碍了数据质量,导致误报和不准确的映射。为了规避这些限制,弗兰克普格博士开发芯片外方法2。沉淀 - 外的显着特点是,它包括一个5'至3'外切核酸酶,从而有效地足迹转录因子结合的位置。其结果,芯片外的方法实现了更高的分辨率,detectio的更大的动态范围N,和较低的背景噪音。

虽然沉淀外型更加技术上具有挑战性的掌握比芯片起,它被广泛地研究的目的使用不同的生物系统3-8获得独特的超高分辨率的见解采纳。实际上,芯片外已成功地应用于细菌,酵母,小鼠,大鼠和人的细胞系统。作为证据原则,芯片外原本用于识别的精确结合基序的酵母转录一把因素2。也用于在酵母中的技术,研究了转录预起始复合物的组织,并破译各种组蛋白9,10 subnucleosomal结构。最近,我们利用的ChIP-外解决相邻TFIIB和Pol II结合在促进人的事件,并表明广泛转录分歧源于不同的起始复合物11。

这里提出的工作流程最优化和streamlined用于哺乳动物的ChIP -外( 图1)。首先,住伯或组织培养细胞用甲醛处理通过共价交联的体内蛋白-DNA相互作用保存。将细胞裂解和染色质剪切至〜100 - 500碱基对大小的片段。沉淀然后选择性富集为交联到感兴趣的蛋白质的DNA片段。在这点上,芯片起库通常制备,这固有地限制了检测分辨率到几百个碱基对的平均片段大小。然而,芯片外克服通过调整左和右5所述蛋白质-DNA交联位点以拉姆达核酸外切酶的“DNA边界此限制。测序文库,然后从外切核酸酶消化的DNA构建了如下详述。所得嵌套5'边界代表蛋白质-DNA相互作用( 图1,步骤14)的体内足迹,并且通过高通量测序进行检测。 Alt键霍夫芯片外的方法比芯片起更多的参与,多数步骤之间的转换需要简单洗珠,最大限度地减少样品损失和实验的可变性。重要的是,由于沉淀外型是芯片起,即成功的芯片起也应该是成功的为片外的任何样品的改良版本。

在从芯片起一个根本不同的数据结构的ChIP外型结果蛋白-DNA相互作用的体内足迹。虽然通用芯片起呼叫者可以应用到芯片外的数据,以获得最精确的峰值呼叫,我们建议专门为片外数据心目中的独特的结构设计,生物信息学工具。这些措施包括Genetrack,创业板,MACE,Peakzilla和ExoProfiler 12-15。

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Protocol

注:双蒸H 2 O或等值级分子被推荐用于所有的缓冲区和反应混合物。

0天:材料制备和电池丰收

1.缓冲液配制

  1. 准备裂解缓冲液1 - 3( 表1 - 3),并添加100微升完整的蛋白酶抑制剂股票(CPI)为各50毫升缓冲液在使用前的。通过溶解一片1毫升分子级的H 2 O.准备CPI股票
  2. 准备内部缓冲器( 表4 - 7)。加入100微升CPI股票至50ml阻塞和RIPA缓冲液。不要添加到CPI的Tris和芯片洗脱缓冲液。

2.适配器寡核苷酸退火

注:特定的寡核苷酸序列可以在附加信息部分找到。

  1. 准备适配器退火混合物( 表8 - 9年 )。涡旋混合并短暂旋管收集的内容。分装100微升每个混合成0.5毫升管。
  2. 通过运行在热循环仪程序( 表10)杂交的寡核苷酸。
    商店在-80℃下退火的寡核苷酸。

3. 在体内染色质交联与甲醛

注:对于典型的ChIP实验,原料应包含约50万个细胞。

  1. 加入新鲜37%不含甲醇的甲醛原液磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞培养物的1%(V / V),调匀,并让在室温下放置10分钟的最终浓度。
    注意:例如,我们通常在50毫升室温的PBS加1.4毫升37%不含甲醇的甲醛至细胞。此外,避免甲醛交联传媒自媒体的蛋白质会熄灭一些甲醛。
  2. 淬火加2.5M的甘氨酸交联反应E对于125毫米的终浓度。调匀。
  3. 细胞转移到50毫升管冰。旋转细胞5分钟以1000 xg离心在4℃下。倒出上清。
  4. 通过移液加入1毫升冰冷的1×PBS中至细胞沉淀重悬。转移到1.5mL管中。
  5. 自旋细胞3分钟以2000 xg离心在4℃下。吸上清。
  6. 马上闪1.5毫升管用液态氮冷冻细胞沉淀。存储在-80℃。交联细胞是无限稳定在-80℃。

第1天:细胞裂解,超声处理以及芯片

4.细胞裂解

注:在所有的细胞裂解段,样品必须保持在冰上或4℃,以减少交联逆转。

  1. 简言之解冻交联细胞沉淀。彻底重悬每个粒料在0.5ml裂解缓冲液1和用4.5ml裂解缓冲液1在15ml聚苯乙烯管结合。
  2. 岩管10分钟,4℃为在摇摆平台上。旋在2000 xg离心在4℃下4分钟。倒出上清。
  3. 彻底悬浮颗粒每0.5ml的裂解液2,并添加4.5毫升裂解液2次重悬。
  4. 在4℃下摇动5分钟在摇摆平台上。旋在2000 xg离心在4℃下5分钟。倒出上清,轻轻拍打过量对纸巾。
  5. 彻底悬浮颗粒每0.5ml的裂解液3和加入1 ml裂解液3次重悬。保持冰核裂解液并立即进行超声波处理。

5.超声核裂解液

注:在所有的超声波段,样品必须保持在冰上,以尽量减少交联逆转。在与下面的协议结合使用超声波仪的具体型号可能会在材料表中找到。特定的声波仪的使用和其他仪器的指导方针的细节可以在附加信息部分找到。

  1. PL含核提取物15毫升聚苯乙烯管王牌共振适配器(金属条不应该接触管壁)。
  2. 超声处理核裂解液在冰冷水浴2×15分钟的会议以30秒开/ 30秒关在中等功率。在一个时间只有超声处理两个15毫升管。这些设置在广泛的细胞系和原代细胞类型工作,但如果染色质剪切是不完全的,可能需要进一步优化。
  3. 要检查超声结果,转让2×10微升样本裂解成1.5毫升管。
    1. 扭转交联,用10微升TE-的RNaseA并在37℃下0.2微升蛋白酶K.孵育的30分钟结合第一10微升等分试样。加入4微升6X二甲苯DNA染料。
    2. 为了保持交联,与2微升6X二甲苯DNA染料结合第二个10微升等分。
    3. 在140 V代表约30运行上的1.5%琼脂糖凝胶两个样品 - 45分钟,直到在梯形溴酚染料我的一路下跌凝胶小号¾。
  4. 如果超声成功(剪切至100个最DNA片段 - 500基点),转让超声裂解液含有150微升10%的Triton X-100的2ml管。旋涡混合。
  5. 以沉淀不溶染色质和碎屑,旋超声核裂解物10分钟,以20,000 xg离心在4℃下。
  6. 转移上清液至新的2ml管中。在-80℃,立即着手芯片或存储样本下去。超声处理提取物不应该被冷冻和解冻不止一次。

6.耦合抗体珠

注意:不要旋涡或冻结/解冻磁珠因为他们将打破,并增加背景信号。

  1. 充分混合股票,分装ÿ微升珠浆到1.5mL管中后,其中Y = 1.1×2.5微升X(多家芯片样品)。 2.5微升珠浆结合能力高达13微克的IgG。洗合并的珠用1ml阻断3倍缓冲。
  2. 对于洗涤后的珠更一致aliquotting,在原来的10倍浆液的体积(25微升/芯片)用封闭缓冲液重悬珠。分装25微升每芯片的样品放入1.5毫升管。
  3. 加入5 - 10微克抗体相应的重悬珠等分。最终带来量高达250微升用封闭缓冲。在4℃孵育的样品4小时(或者,过夜16小时)的旋转平台上。
  4. 吸上清。为了除去未结合的或过剩的抗体,用1毫升封闭缓冲液洗珠一次。
  5. 吸最后一次洗涤后,立即加入超声提取物(〜1.6ml)中的5000万细胞当量抗体:珠缀合物。如果超声提取物是没有准备好,在100微升封闭缓冲液重悬珠,直到他们准备好了。关键是要永远让珠干燥。

7.染色质免疫沉淀(ChIP)

  1. 每个芯片样品,结合1.5毫升超声的ð萃取液用抗体:珠缀合物在1.5ml或2ml管。
  2. 以9速度设定孵育管上的微型管旋转过夜(大约16小时)在4℃。检查几个分钟后,以确保样本不漏,并适当混合。

第2天:沉淀洗和树脂上的酶反应

8.沉淀洗

注意:要尽量减少交叉污染,简单地说每次冲洗之间旋转管。对于第一个愿望,改变每个样品之​​间的技巧。在随后的洗涤,同样尖端可以使用,只要它没有碰珠。请参阅有关正确木片水洗方向附加信息部分。

  1. 非常简要地旋转用离心管(〜500 XG 3秒)以收集液体在帽和在磁性架放置1分钟。同时仍然在磁性架,吸提取物。
  2. 添加0.75毫升RIPA缓冲液到每个管中。卸下磁架管和颠倒几次混合。更换磁架及吸上清管。重复7倍。
  3. 加0.75毫升的10mM Tris盐酸(pH7.5)中,以每管。卸下磁架管和颠倒几次混合。更换磁架及吸上清管。重复2倍。
  4. 吸最后一次洗涤后,进行抛光。
    注意:在部分9.3,10.3,11.3,12.3,13.3,14.3每次温育反应,和15.3,旋管短暂地方针对磁性机架1分钟和抽吸上清液后。洗2次以0.75毫升RIPA缓冲液和2×0.75 ml的三盐酸(pH7.5)中。

9.抛光反应

  1. 填写抛光主结构计算( 表11)。使冰1.5mL管中混合抛光。吸取混合。
  2. 最后的沉淀洗被吸入后,立即加入,同时还对磁架的抛光组合,以每个样品树脂的50微升。温育30分钟的样品在3 XG在一个恒温30℃。
  3. 作为吸气8.4节之后的说明中描述最后一次洗涤后,前往A-拖尾。

10.尾反应

  1. 填写A尾主结构计算( 表12)。使冰上1.5 ml管A尾组合。吸取混合。
  2. 抛光部后,立即对磁架加入50微升A尾组合的每个样品的树脂,同时还。在一个恒温在3 XG孵育样品30分钟在37℃。
  3. 作为吸气8.4节之后的说明中描述最后一次洗涤后,继续P7适配器结扎。

11. P7适配器连接反应

  1. 填写结扎主结构计算( 表13)。使连接混合物在1.5ml管冰。移液器混合。
  2. 紧接着A尾部分,添加48微升P7结扎预混液和2微升不同的适配器指数tO的同时仍然在磁架每个样品树脂。在恒温在3 XG孵育样品2小时在25℃。
    注意:使用针对每个样本的不同的索引的将允许更多的样本,以在一个单一的流动池进行测序。
  3. 作为吸气8.4节之后的说明中描述最后一次洗涤后,前往Φ-29尼克修复。

12.披29尼克修复反应

  1. 填写Φ-29主结构计算( 表14)。使冰1.5mL管中Φ-29组合。吸取混合。
  2. 紧接着P7结扎部分,添加50微升Φ-29组合的每个样品的树脂,同时还对磁架。在一个恒温在3 XG孵育样品20分钟,在30℃。
  3. 作为吸气8.4节之后的说明中描述最后一次洗涤后,进行激酶反应。

13.激酶反应

  1. 填写激酶主结构计算(
  2. 紧接着Φ-29部分,添加50微升激酶的同时仍然对磁架混合每个样品树脂。在一个恒温在3 XG孵育样品20分钟在37℃。
  3. 作为吸气8.4节之后的说明中描述最后一次洗涤后,前往LAMBDA核酸外切酶反应。

14. LAMBDA核酸外切酶反应

  1. 填写LAMBDA核酸外切酶预混液计算( 表16)。让LAMBDA核酸外切酶混合在1.5ml管冰。吸取混合。
  2. 紧接着激酶部分,添加50微升LAMBDA核酸外切酶,同时仍对磁架混合每个样品树脂。在一个恒温在3 XG孵育样品30分钟在37℃。
  3. 作为吸气8.4节之后的说明中描述最后一次洗涤后,前往RecJ˚F反应。

15. RecJ˚F核酸酶反应

  1. 填写RecJ˚F主结构计算( 表17)。使冰1.5mL管中RecJ˚F组合。吸取混合。
  2. 紧接着LAMBDA核酸外切段,加入50微升RecJ˚F组合的每个样品的树脂,同时还对磁架。在一个恒温在3 XG孵育样品30分钟在37℃。
  3. 作为吸气8.4节之后的说明中描述最后一次洗涤后,进行芯片洗脱。

16.洗脱和交联逆转

  1. 制备主混合物:样本数x 1.1×1.5毫升管(200微升沉淀洗脱缓冲液+ 1微升20毫克/毫升蛋白酶K)。加入200μl的ChIP洗脱缓冲液+蛋白酶K预混每个样品树脂。
  2. 在3 XG孵育样品过夜(约16小时),在65℃的恒温带热盖,以防止结露。

第3天:DNA提取离子和适配器结扎

17.洗脱和交联逆转(续)

  1. 在65℃孵育过夜后,旋转简要样品收集冷凝水。在1分钟的磁架的地方样本。
  2. 转移200μl的上清含有200微升TE缓冲液(pH7.5)中新的1.5毫升管。

18.酚氯仿异戊醇(PCIAA)提取

  1. 异戊醇添加400μl的苯酚氯仿至每个样品。涡旋混合20秒。
  2. 在室温下(RT)20000 xg离心离心10分钟。仔细325微升上层水层的转移至新管。
    注:请注意不要任何有机(下层)转移到新管。
  3. 添加1/10容量的3M醋酸钠(pH值5.5)和1μl20mg / ml的糖原向每个样品。对于多个样本,准备一个主结构。
  4. 添加3体积冰冷的100%乙醇,以每个样品涡流混合。在-80℃孵育15分钟。
  5. 离心机以20,000 xg离心在4℃15分钟。 小心倒出上清,确保不打扰颗粒。
  6. 轻轻地加入500μl新鲜的冰冷的70%乙醇,并确保不打扰颗粒。离心机以20,000 xg离心在4℃5分钟。小心倒出上清液。
  7. 干燥小丸,以用于在45℃的速度真空大约20分钟(或直至干燥)。
    注意:这是在协议的暂停点。干燥DNA沉淀可以储存在-20℃。
  8. 在10微升的DDH 2 O吸取悬浮粒料反复过其中的DNA丸状,即使将干燥的粒料不可见的区域。
  9. 转移10微升各样品至一个新鲜0.3毫升PCR管或8架,这取决于样品的数目。

19. P7引物延伸反应

  1. 填写P7引物延伸主结构计算( 表18)。使扩展混合在1.5ml管冰。吸取混合。
  2. 添加扩展混合的10微升(减Φ-29聚合酶)每10微升样品。吸取混合。
  3. 使用程序( 表19)到退火的引物与模板直至30℃的热循环运行的样品“持有”步骤。
  4. 在30℃时加入1μlΦ-29聚合酶“持有”的程序步骤。吸取混合。恢复计划( 表19)的其余部分。

20.尾反应

  1. 填写A尾主结构计算( 表20)。使冰上1.5 ml管A尾组合。吸取混合。
  2. 加10μlA尾组合的每个样品。吸取混合。
  3. 在热循环仪,孵育样品30分钟,在37℃,然后在75℃热灭活20分钟。

21. P5适配器连接反应

  1. 费尔L out输出P5接头连接主结构计算( 表21)。使连接混合物在1.5ml管冰。吸取混合。
  2. 加入20微升P5结扎混合每个样品。吸取混合。
  3. 在热循环仪,孵育样品在25℃下2小时。

22.珠清理

注:请参阅制造商的详细信息资料部分上珠清理。

  1. 每50微升样品转移到一个新的1.5 ml管。
  2. 悬浮在15速度设定清理上的微型管旋转体珠在室温下15分钟。不要让珠吸取之前结清。
  3. 添加60微升清理珠样品(1.2:1清理珠粒采样比率是至关重要的,除去的DNA短于200个碱基对)。移液管混合20秒。
  4. 悬浮在15速度设定清理上的微型管旋转体珠在室温下3分钟。旋转简要管。
  5. 放置管上1分钟磁性机架。吸管关闭并丢弃上清液。
    注意:不要用负压吸引在这一部分,因为它会吸了清理珠。
  6. 加入400微升新鲜制备的RT 70%的乙醇,以每个样品,而他们上磁性机架上。不要混在一起。吸上清。重复2倍。
  7. 干燥该清理珠在室温10分钟。珠的颜色会变成深到浅棕色和非常小的裂缝,当珠粒干将在树脂粒料可见。
  8. 为了洗脱DNA,添加40微升的10mM的Tris(pH7.5)中。彻底吸管混合20秒。
  9. 放置1分钟磁性机架样本。慢慢地吸取和36微升洗脱液直接转移到0.3毫升PCR管。
  10. 在-20℃直接进行PCR反应或储存洗脱液。

第4天:PCR和凝胶分析

23. PCR

  1. 填写PCR主混合计算( 表22)。使PCR混合物。吸取轻轻混合,以避免气泡。
  2. 加入14微升PCR的组合,以每36微升DNA样本。吸取混合。保持样品在冰上,直到准备把在热循环仪。
  3. 对于阳性PCR对照,包括预先制备文库。对于阴性PCR对照,包括水。在热循环运行的样品使用PCR程序( 表23)。

24.凝胶制备,DNA切除和可视化

  1. 彻底清洁和冲洗,用去离子水适当大小的凝胶盒。制备1.5%琼脂糖凝胶(含有0.5mg / ml溴化乙锭)配有可容纳60微升厚,宽孔梳。
    注:溴化乙锭(乙锭)是一种致癌物质,必须小心处理。
  2. 降速PCR样品管简单地收集冷凝。
  3. 加入1/5体积的6倍二甲苯DNA染料的结合到样品。在DNA染料,因为它迁移在同一位置作为样品的DNA不使用溴酚蓝。
  4. 加载整个样本INTØ每孔,最好有样本之间的空井。
    注意:库具有相同的索引不能在同一凝胶上运行。
  5. 负载7微升样本的两侧100bp的阶梯。在140 V代表约30-45分钟运行凝胶,直到阶梯溴苯酚染料是¾一路下滑的凝胶。
  6. 图像,并在低UV设置可视上的透射凝胶。切下含有的DNA片段琼脂糖200的部分 - 500基点。要非常小心,以避免切割出运行在125 bp的适配器二聚体带。
  7. 各切出凝胶切片放入15毫升管。记录净重凝胶片。直接在管道写这个重量。
  8. 图像,保存和注释切除凝胶,以确认正确的尺寸范围内选择。

25.凝胶纯化

  1. 根据制造商的说明从切下的凝胶切片中回收DNA,并作以下修改。
  2. 摇着溶解的凝胶片在室温在摇动平台。这将需要约20分钟使其溶解。
  3. 以获得高度纯化的DNA,洗柱用0.5ml缓冲液QG溶解后凝胶已通过柱。
  4. PE缓冲液洗涤后,让列坐在RT 2 - 5分钟。在室温13000 xg离心旋转1分钟。
  5. 为了留出空间PCR反应预混液,用40微升EB缓冲液洗脱样品到一个新的1.5 ml管。

26. DNA定量

  1. 根据制造商的说明( 表24)制备的样品。测量样品中的光管中指定的仪器。
  2. 一旦沉淀-外库量化,提交用于测序使用测序逐合成化学16,它与在此协议的DNA适配器相兼容的平台上。
    注意:通常情况下,2微升样品是足够的量化,但更多的,如果试样的浓度低可能是必要的。 DNA产生典型50和200纳克之间光年范围内。
  3. 量化后,店内样品在-20℃。

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Representative Results

下图说明从这里提交芯片外协议代表性的结果。相比之下,传统的芯片起的方法用几个酶促步骤,芯片外要求11顺序依赖性酶反应( 图1)。因此,必须小心在每个步骤可采取以确保每个反应组分加入到其相应的反应母液。我们建议基于所述反应表公式化电子表格来自动执行反应母液的计算,打印生成的表,它被加入到主混合物后,然后检查关每个项目。

我们聘请了一批质量控制措施在整个协议,以确保高质量的测序结果( 图2)。每个芯片反应包含三个基本组成部分:1)超声处理的染色质提取物从intere的细胞ST,2)针对感兴趣的蛋白的抗体,以及3)ProteinG(或蛋白A)的树脂来固定沉淀免疫复合物。获得高品质的超声处理的染色质提取物( 图2A)可以是相当有挑战性的,因为超声处理条件必须针对每个小区类型和超声处理仪器进行优化。 500bp的( 图2A,“+”线) -因为高质量的图书馆与产生100之间的DNA片段超声处理结果开始值得花时间来优化这一步。因为甲醛交联是不稳定的并且甲醛本身具有有限的保质期,我们用电泳迁移率变动分析( 图2A,“ - ”泳道)以验证该超声处理提取物含有完整的蛋白质的DNA交联,明显的,因为超移的DNA片段。为了评估背景信号我们经常进行“模拟”的芯片,从芯片的反应忽略抗体。高品质的ChIP-EXO库制剂将具有很少,如果有的话,在“模拟”的ChIP背景信号(“ - ”)相对于特定的ChIP抗体,在这种情况下,针对聚合酶II。 如图2B所示,传统的芯片起库具有比沉淀-外基本上更多的背景信号。最后,测序前,芯片外库的质量进行评估的生物分析仪( 图2C - D)。分析精确测量的文库大小分布,并检测污染适配器二聚体(由箭头表示),在125 bp的运行。如果适配器二聚体存在,它们会降低测序带宽。因此,我们建议额外珠清理,这将有效地去除DNA片段小于200 bp的。

沉淀外型是一个强大的功能基因组学技术,因为它能够在空间上分辨发散,启动的唯一方法,顿了一顿,拉长RNA聚合酶IIØ呐全基因组规模( 3)11。由于这些相邻的结合事件是几十个碱基对的间隔,芯片起无法分辨与拆分的几百个碱基对功率这些结合事件。

图1
图1: 芯片外型示意图。沉淀后,将P7适配器连接到超声处理边界。拉姆达核酸外切酶然后修剪DNA的5'到3'的交联点,从而足迹的蛋白质-DNA相互作用。洗脱和交联的逆转后,引物延伸合成双链DNA。最后,P5适配器结扎标志着左和右外切酶的边界,将所得文库经受高通量测序。映射序列标签的5'端与参考基因组标定核酸外切酶屏障并因此蛋白质的DNA的精确位点交联。图从李承晚和普格17修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2: 芯片外型质量控制。面板AC显示不相关的实验代表性的结果。 (A)中的超声处理的染色质提取物的质量(来自人HCC1806乳腺癌细胞系)通过琼脂糖凝胶电泳评价与(+)和无提取物( - )的交联逆转。完整的交联将导致蛋白质-DNA复合物迁移更慢。因此,在没有交联运行提取反转( - )允许甲醛交联进行评估,这是一个成功的ChIP临界质量。 (B)的模拟IP的比较( - )一第二聚合酶II(+)芯片外型和PCR扩增21个周期后芯片起库准备。 PCR后,DNA片段200-500碱基被切除(由红色散列框表示),并使用凝胶提取试剂盒纯化。 (光盘)在面板C中,上部曲线代表从一个共用的库(P1)的理想跟踪,底部跟踪显示包含适配器二聚体汇集库(P2)。面板D显示对应于从面板C上P1-2库迹线(箭头表示适配器二聚体频带)的DNA的密度图。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3: 芯片外型空间上解析鲜明的双向转录起始复合物。 (A)股,分隔符的平滑分布ED的ChIP-外标签5'末端的聚合酶II,TFIIB和TBP在增殖K562细胞的人类基因RPS12。 (B)平均约最接近的RefSeq TSS的ChIP-外模式。峰对标签被对准到TSS基因逐基因,分级在非重叠相到TSS,然后平均峰 - 对密度值10BP间隔在所有TFIIB占领(N = 6511)的基因被绘制为总数的百分比。在TBP和TFIIB的“尖峰”是难以辨识(在插图垂直偏移)。 (C)模式的基础上B组数据,说明由Chip-外(黑色线)解决不同的转录起始复合物。聚合酶II占据,与不同的转录起始(“发散性”)和“暂停”网站的网站正好两个不同的解析位置。聚合酶II复合物的这种清晰的空间上的分离表明,不同的转录不同于起始复合物出现。绝大多数聚合酶II交联ABO在“暂停”的网站,它预计起始转录后暂停UT 50个基点的TSS的下游。聚合酶II是最消耗20 - 60基点的TSS,其中,预启动复合物(“PIC”)的形式,这表明平均起来可能花费更少的时间还有比在暂停网站的上游。这表明,在大多数(但不一定是所有)的情况下,一旦RNA聚合酶II是找来,它迅速清除启动并假定一个暂停状态约30 - 该TSS的50个基点下游,与RNA聚合酶II暂停发行是观察一致一个限速步骤中转录。这些相邻的起始复合物是由芯片起(由灰色填充迹示出)未解析因为其分辨率被限制为几百个碱基对。图来自皮尤和Venters 11修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

内容】“FO:保together.within页=”1“> 补充文件1:更多信息 请点击这里下载此文件。

试剂 体积(ml) [最后]
溶于1M HEPES-KOH(pH7.5)中 50 50毫米
5 M氯化钠 28 140毫米
的0.5M EDTA 2 1毫米
100%甘油 100 10%
10%NP40 50 0.50%
10%的Triton X100 25 0.25%
DDH 2 O的 填充到1升

表1.配方的裂解液1.使用0.22微米的过滤器过滤。贮存于4℃50ml试管。加入100微升CPI股票到50毫升缓冲液在使用前的。

试剂 体积(ml) [最后]
的1M的Tris-HCl(pH 8)中 10 10毫
5 M氯化钠 40 200毫米
的0.5M EDTA 2 1毫米
0.5M的EGTA 1 0.5毫米
双蒸水2 O 填充到1升

表2.配方使用 0.22微米的过滤裂解液2.过滤。贮存于4℃50ml试管。加入100微升CPI股票到50毫升缓冲液在使用前的。

试剂 体积(ml) [最后]
的1M的Tris-HCl(pH 8)中 10 10毫
5 M氯化钠 20 100毫米
的0.5M EDTA 2 1毫米
0.5M的EGTA 1 0.5毫米
10%的脱氧胆 10 0.10%
5克 0.5%(重量/体积)
DDH 2 O的 填充到1升

表3.配方使用 0.22微米的过滤裂解液3.过滤。贮存于4℃50ml试管。加入100微升CPI股票到50毫升缓冲液在使用前的。

试剂 体积(ml) [最后]
10X PBS 50 1X
牛血清白蛋白 2.5克 0.50%
DDH 2 O的 补500

表4.配方阻止缓冲。使用过滤0.22微米的过滤器。贮存于4℃50ml试管。加入100微升CPI股票到50毫升缓冲液在使用前的。

试剂 体积(ml) [最后]
溶于1M HEPES(pH7.5)中 25 50毫米
的0.5M EDTA(pH 8)中 1 1毫米
10%的脱氧胆酸钠 35 0.70%
10%NP40 50 1%
1M的氯化锂 250 500毫米
DDH 2 O的 补500
内容“FO:保together.within页=”1“FO:保持与 - next.within页=”总是“>

表5.配方为RIPA缓冲。使用过滤0.22微米的过滤器。贮存于4℃50ml试管。加入100微升CPI股票到50毫升缓冲液在使用前的。

试剂 体积(ml) [最后]
的1M Tris-CL(pH7.5)中 2.5 50毫米
的0.5M EDTA 1 10毫
20%SDS 2.5 1%
DDH 2 O的填充到50

表6.配方芯片洗脱缓冲液。使用过滤0.22微米的过滤器。存放在室温下。

试剂 体积(ml) [最后]
的1M Tris-CL(pH7.5)中 0.5 10毫
DDH 2 O的 填充到50

表7.食谱TE缓冲。使用过滤0.22微米的过滤器。存放于4℃。

体积(微升) [最后]
100μMExA2-IX 75 15μM
100μMExA2-33 75 15μM
的1M Tris(pH7.5)中 50 100毫米
5 M氯化钠 50毫米
DDH 2 O的 295 -
总成交量 500

表8. P7适配器退火组合。

表9. P5适配器退火组合。

体积(微升) [最后]
100μMExA1-58 75 15μM
100μMExA1-13 75 15μM
的1M Tris(pH7.5)中 50 100毫米
5 M氯化钠 50毫米
DDH 2 O的 295 -
总成交量 500
温度(C) 时间
95 5分钟
72 5分钟
65〜60斜坡下降 5分钟
55〜50斜坡下降 3分钟
45〜40斜坡下降 3分钟
三十 3分钟
20 3分钟
10 3分钟
4 永远

表10.适配器退火计划。

1X(微升 [最后]
DDH 2 O的 39.8
10X反应缓冲液2 1X
100μMATP 0.5 1毫米
3毫米的dNTP 1.7 100μM
3 U /微升T4聚合酶 1
5U /微升克列诺 1 5单位
10U /微升T4多核苷酸激酶 1 10单位
总反应体积 50

表11.抛光预混。

1X(微升) [最后]
DDH 2 O的 42.3
10X反应缓冲液2 1X
3毫米的dATP 1.7 100μM
5U /微升Klenow酶3'-5'外切减 1 5单位
总反应体积 50

表12. A尾母液。

1X(微升) [最后]
DDH 2 O的 41
100毫摩尔ATP 0.5 1毫米
10X反应缓冲液2 1X
400 U /微升T4 DNA川芎嗪ASE 1.5 600单位
反应混合物体积 48
15毫米指数适配器 2 30皮摩尔
总反应体积 50

表13. P7接头连接主结构。

1X(微升) [最后]
DDH 2 O的 41
10XΦ-29缓冲区 1X
3毫米的dNTP 2.5 150μM
10U /微升Φ-29聚合酶 1.5 15单位
总反应体积 50

表14.Φ-29尼克维修师傅组合。

1X(微升) [最后]
DDH 2 O的 43.5
100毫摩尔ATP 0.5 1毫米
10X反应缓冲液2 1X
10U /微升T4多核苷酸激酶 1 10单位
总反应体积 50

表15.激酶反应预混液。

1X(#956; L) [最后]
DDH 2 O的 43
10X LAMBDA缓冲区 1X
5U /微升LAMBDA核酸外切酶 2 10单位
总反应体积 50

表16. LAMBDA核酸外切酶反应预混液。

1X(微升) [最后]
DDH 2 O的 44
10X反应缓冲液2 1X
30U /微升RecJ外切酶˚F 1 30单位
总反应volume 50

表17. RecJ˚F核酸酶反应预混液。

1X(微升) [最后]
DDH 2 O的 6.45
10XΦ-29缓冲区 2 1X
3毫米的dNTP 1.3 200μM
20μMP7底漆 0.25 0.25μM
反应混合物体积 10
乙醇沉淀样本 10
总反应体积 20

表18. P7引物延伸反应预混液。

温度(C) 时间
95 5分钟
65 5分钟
三十 2分钟
三十按住,直到被加到Φ-29
三十 20分钟
65 10分钟
4 永远

表19. P7引物延伸程序。

1X(微升) [最后]
DDH 2 O的
3 1X
3毫米的dATP 1 0.1毫米
5U /微升Klenow酶3'至5'外切减 1 5单位
反应混合物体积 10
底漆扩展样本 20
总反应体积 三十

表20. A尾母液。

1X(微升) [最后]
DDH 2 O的 11.5
10X T4连接酶缓冲液 1X
15μMExA1-58 /13适配器 2 30皮摩尔
400 U /微升T4 DNA连接酶 1.5 600单位
反应混合物体积 20
A-尾样本三十
总反应体积 50

表21. P5接头连接主结构。

1X(微升) [最后]
5X PCR缓冲 10 1X(2毫米氯化镁2)
各dNTP的10mM 1 每200μM
20μMP1.3底漆 1.25 0.5μM
20μMP2.1底漆 1.25 0.5μM
2 U /μL热启动聚合酶 0.5 1 U
反应混合物体积 14
珠洗脱出来的样本 36
总反应体积 50

表22. PCR。

<TR>
温度(C) 时间 周期
98 30秒 1
98 10秒 15-21(取决于芯片效率)
52 30秒
72 20秒
72 2分钟 1
4 永远保持

表23. PCR程序。

每DNA标准(微升) 每样品(微升)
1:200稀释缓冲/染料混合 190 198
DNA标准 10
沉淀外型库 2
总成交量 200 200

表24.量化。

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Discussion

我们提出了一个功能基因组学的协议,以确定染色质以接近碱基对的分辨率相互作用的蛋白质在一个不带偏见,全基因组的方式精确绑定位置。实现近基部对映射解决最关键的一步就是芯片富集DNA的核酸外切酶处理而免疫沉淀留在磁性树脂。从表面上看,蛋白质复合物有可能阻断体内的任何给定的亚单位(如染色质重塑复合物或核小颗粒)的足迹。然而,如以前报道10中 ,由于甲醛是一种低效的交联剂,它变得越来越不可能,一个复杂的多个亚基将交联的DNA,并在同一轨迹彼此在相同的细胞。因此, 蛋白质复合物的个别亚基,如核的个体组蛋白亚基体内足迹,可以带芯片-外。

T“>芯片外型最显着的优点是其近碱基对分辨率和低背景,超高分辨率使得那些目前还无法与任何其他的方法来对基因组范围内进行了详细的结构及空间的见解。在另一方面,芯片外的主要限制是,这是一个在技术上具有挑战性的分子生物学方法来掌握,另外,该芯片步骤的一般性的限制也适用于沉淀-外( 例如 ,商用抗体可用性和特异性簇,表位可访问性,和细胞的相对大量的需要)。常用的缺陷包括低质量的超声处理提取物,使用非沉淀级抗体,而不是保持在冰上的样品尽可能。因此,超声处理条件必须小心地优化各验证为先前抗体描述18,以避免有害影响,这些参数可能对实验结果。

据,直到...为止一个转录因子的目标测序深度,我们通常会瞄准约2000万唯一对准读取。因为聚合酶II和组蛋白修饰更广泛分布,我们的目标为30至5000万的读取。要注意的是,因为沉淀 - 外具有比芯片起背景基本上更小,更少的读取,需要实现类似测序深度是很重要的。

芯片外技术现在,尽管其技术上的挑战被广泛采用,如在原始协议鲁棒变化继续出版17,19,20。特别是,一种变体,可能为困难证明是有益的沉淀的蛋白质被称为的ChIP-关系,它使用一个单一的连接步骤,以增加文库制备20的效率更高。总之,芯片外是在全球范围内染色质相互作用蛋白的超高分辨率测绘的越来越多的利用和强大的方法论。作为市售的ChIP同类蚂蚁的列表ibodies继续增长,芯片 - 外方法的未来的应用程序将在映射未知基因调控网络被引导到理解在超高分辨率的细胞的分子电路。此外,芯片外很可能会进一步完善和调整以接近碱基对的决议,足迹体内蛋白质的RNA相互作用。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% formaldehyde, methanol free, 10 x 10 ml ampules ThermoFisher Scientific 28908 Section 3
Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) Roche Life Science 11873580001 Sections 4, 8
Bioruptor sonicator Diagenode UCD200 Section 5
15 ml polystyrene tubes BD Falcon 352095 Section 5
MagSepharose Protein G Xtra beads GE Healthcare 28-9670-66 Section 6
DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack Invitrogen 12321D Sections 6-17, 22
Mini-Tube Rotator Fisher Scientific 05-450-127 Sections 7, 22
T4 DNA Polymerase New England BioLabs M0203 Section 9
DNA Polymerase I, Klenow New England BioLabs M0210 Section 9
10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) New England BioLabs B7002 Sections 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer C Eppendorf 5382 Sections 9-16
ATP Roche Life Science 010419979001 Sections 9, 11, 13
dNTPs New England BioLabs N0447 Sections 9, 12, 19, 23
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201 Sections 9, 13
dATP New England BioLabs N0440 Sections 10, 20
Klenow 3'-5' Exo Minus New England BioLabs M0212 Sections 10, 20
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202 Sections 11, 21
Φ-29 DNA Polymerase New England BioLabs M0269 Sections 12, 19
10x Φ-29 Buffer New England BioLabs B0269 Sections 12, 19
Lambda Exonuclease New England BioLabs M0262 Section 14
10x Lambda Buffer New England BioLabs B0262 Section 14
RecJf Exonuclease New England BioLabs M0264 Section 15
Proteinase K Roche Life Science 03115828001 Section 16
Glycogen Roche Life Science 010901393001 Section 18
10x T4 Ligase Buffer New England BioLabs B0202 Section 21
AMPure XP (clean up) beads  Beckman Coulter A63881 Section 22
Q5 Hot Start DNA Polymerase  New England BioLabs M0493 Section 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) New England BioLabs B9027 Section 23
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Section 25
Qubit Fluorometer Invitrogen Q33216 Section 26
Optical Clear Qubit tubes  Invitrogen Q32856 Section 26
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit Invitrogen Q32851 Section 26

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References

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