Rapid Isolering av BMPR-IB + adipose-avledet stromale celler for bruk i en Calvarial Defect Healing Model

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Store beinskader som følge av skade, infeksjon eller invasiv kreft har en betydelig innvirkning på pasientens bedring og livskvalitet. Teknikker finnes for å fylle disse defekter med friskt ben fra andre steder i pasientens egen kropp, men denne overføringen bærer sin egen sykelighet og risikoen for komplikasjoner 1, 2, 3. Videre har en del feil er så stor eller kompleks at tilstrekkelig donor bein er ikke tilgjengelig for å fylle defekten. Proteser er en potensiell mulighet for å fylle beinskader, men disse er forbundet med flere ulemper inkludert smitterisiko, maskinvarefeil, og fremmedlegeme reaksjon fire.

Av disse grunner er det stor interesse for muligheten for å konstruere biologiske bensubstitutter ved hjelp av en pasientens egne celler 5. Adipose-deriverte stromale celler (ASCs)har potensial for dette programmet fordi de er rikelig tilgjengelig i pasientens eget fettvev, og de har vist evne til å helbrede beinskader ved å generere ny benvev 6, 7. ASCs er en mangfoldig befolkning av celler og flere studier har vist at å velge for spesifikke celleoverflatemarkører kan produsere cellepopulasjoner med forbedret osteogene aktivitet 8, 9. Valg av ASCer med høyest osteogene potensialet vil øke sannsynligheten for at et stillas sådd med disse cellene kan regenerere et stort bendefekt.

Benmorfogenetisk protein (BMP) signalering er kritisk for regulering av beindannelse og differensiering 10 og BMP-reseptor typen IB (BMPR-IB) er kjent for å være viktig for osteogenesis på ASCer 11. Nylig, har vi vist at uttrykk av BMPR-IB kan be anvendt for å selektere for ASCer med forbedret osteogen aktivitet 12. Her viser vi en protokoll for isolering av BMPR-IB-uttrykk ASCer fra humant fett, etterfulgt av en undersøkelse av deres osteogen aktivitet ved anvendelse av en in vivo-modell calvarial defekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Prøver ble innhentet fra pasienter som ga informert samtykke. Alle protokoller ble gjennomgått og godkjent av den aktuelle Stanford University Institutional Review Board. Mens håndtering menneskelig vev og celler, alltid holder seg til biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) forholdsregler, som angitt av din institusjon.

1. Utarbeidelse av reagenser

  1. Forbered FACS-buffer: Tilsett 10 ml FBS, 5 ml Poloxamer 188 og 5 ml Pen-Strep til 500 ml steril fosfatbufret saltløsning (PBS).
  2. Forbered fordøye blanding: Legg 0,375 g C. hemolyticum collagenase type II pulver og 5 ml Poloksamer 188 til 500 ml steril 199 / EBSS mellom.
  3. Forbered standard medium: Tilsett 50 ml FBS og 5 ml Pen-Strep til 500 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium.

2. Høsting og Isolering av ASCs

MERK: Kontroller at tilstrekkelige institusjonelle godkjenninger er på plass for å bruke menneskelig vev og for å isolere hUman stamceller. Skaff menneskelivs, flanke eller lår underhudsfett fra en frisk donor som gjennomgår elektiv fettsuging. Holde fettet i en plast sugebeholderen.

  1. Legg steril PBS i et 1: 1 forhold til fettet i den opprinnelige plastbeholderen. (Hvis det er 500 ml fett, tilsett 500 ml PBS). Bland forsiktig omrøring i 30 s. Tillat det vandige laget for å sette seg på bunnen (figur 1) og deretter Aspirer og kast det vandige lag med en 10 ml pipette plast festet til sugekraft.
  2. Dekanter fettet inn i en stor plastbeholder og tilsett fordøye blanding i et 1: 1 forhold. Lukk beholderen og rengjør utsiden med 70% etanol. Tett cap med parafin film.
  3. Agitere denne beholder i en orbital rystemaskin ved 180 rpm ved 37 ° C i 30 minutter.
  4. Nøytraliser fordøyelse ved tilsetning av standard medium i et 1: 1 forhold. (Hvis det er 1000 ml fettblanding, tilsett 1000 ml standard medium).
  5. Fordel blandingen jevnt i et jevnt antall 250 ml plast konisk sentrifugerør og sentrifuger av blandingen ved 300 xg i 20 min ved 4 ° C.
  6. Aspirer supernatanten og være forsiktig med å forlate pellet intakt. Resuspender pellets i 5 ml standard medium for hvert konisk rør.
  7. Filtrer suspensjonen gjennom et 100 pm filter inn i en 50 ml konisk sentrifugerør. Deretter, sentrifuger ved 300 xg i 15 min ved 4 ° C.
  8. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml romtemperatur rbc lyseringsbuffer. La blandingen stå i 5 minutter ved romtemperatur og deretter sentrifuger ved 300 xg i 15 minutter ved romtemperatur (RT).
  9. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 15 ml standard medium. Igjen filtreres gjennom et 100 pm filter inn i et 50 ml konisk sentrifugerør.
  10. I en ny femti ml konisk, tilsett 15 ml polysucrose løsning utviklet for tetthetsbasert separasjon (se liste over reagenser). Deretter holder røret i en 45 ° vinkel, nøye pipette cellene på siden avrøret, slik at cellesuspensjonen forsiktig lag på toppen av polysucrose oppløsning (figur 2).
    Merk: Det er viktig å pipette celler på overflaten av oppløsningen. Tilsett ikke polysucrose oppløsning til en suspensjon av celler, da dette vil skape en irreversibel blanding. Tilsvarende vil ikke pipette cellene inn i sentrum av den polysucrose løsning.
  11. Sentrifuger av denne blandingen ved 300 x g i 10 min ved RT. Bruk lav akselerasjon (2 - 3 av 10) og setter bremse funksjon av sentrifugen til null for dette trinnet.
    MERK: Tre lag vil være synlig: tydelig på bunnen, skyet i midten, og laks-farget på toppen. Den midterste laget inneholder cellene av interesse.
  12. Ved hjelp av en 10 ml pipette forsiktig fjerne det midterste laget og overføre til en ny 50 ml konisk tube.
    MERK: Det er bedre å helt overføre det midterste laget, og i prosessen ta noen av de øverste og nederste lag enn å forlate bak noen av de midterste laget.
  13. <li> Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og bestemme total levende celle nummer.
    MERK: Vi bruker vanligvis trypanblått tilsatt til celleblandingen til en sluttkonsentrasjon på 0,8% for å hjelpe til med å telle cellene. Levedyktige levende celler vil ikke ta opp den blå fargestoff og blir hvit.

3. FACS sortering for BMPR-IB positive celler og klargjøring av Cell-holdig Stillas

  1. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender cellene i FACS-buffer ved en konsentrasjon på 1 million celler per 100 ul (basert på celletallet gjort i trinn 2.13).
  2. Overføre minst 10 millioner celler til en plast sentrifugerør merket "BMPR-IB". Separat, overføre en million celler i 100 ul FACS-buffer til en separat plast sentrifugerør merket "Ufarget". Tilsett 1 ml FACS-buffer til "Ufarget" rør. Hold resten av cellene i FACS-buffer på is mens FACS sortering parti av experform blir gjort. Merke disse cellene "Usorterte." Bruke disse som kontroller senere i forsøket.
  3. Tilsett en passende mengde av et fluoriserende anti-humant BMPR-IB-antistoff til "BMPR-IB" rør i henhold til produsentens instruksjoner. Pipetter blandingen opp og ned forsiktig for å fordele antistoffet.
    MERK: Vi bruker en menneskelig BMPR-IB / ALK-6 APC-konjugert antistoff ved en 1:10 fortynning (se liste over reagenser for detaljer). Imidlertid vil antistoffer fra forskjellige produsenter har forskjellige anbefalte konsentrasjoner.
  4. Dekk isen bøtte på en måte som holder ut lys. La celle / antistoff blandingen til å sitte i 30 min (eller i henhold til instruksjonene fra antistoffet produsenten).
    MERK: Hvis anti-BMPR-IB antistoff kommer som en primær konjugert antistoff som krever et sekundært antistoff, utføre en egen farging skritt på isen med det sekundære antistoff i henhold til produsentens instruksjoner.
  5. Sentrifuger begge rør på300 x g i 5 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten, være forsiktig med å suge pelleten. Resuspender de pelleterte celler i 1 ml FACS-buffer. Igjen sentrifugere rørene ved 300 xg i 5 minutter. aspirer supernatanten forsiktig og resuspender cellene i FACS-buffer til en konsentrasjon på 1 million celler per 1 mL.
  6. Filtrer "BMPR-IB", "Ufarget," og "usorterte" celler gjennom 40 mikron celle siler inn i nye merkede glass FACS rør. Skyll filtre med 500 mL FACS buffer for å sikre at cellene ikke blir liggende igjen i filteret. Også tilsett 2 ml standardmedium til to separate plast sentrifugerør merket "BMPR-IB-positive" og "BMPR-IB-negative". Bruke disse to til å samle de sorterte cellene i FACS maskinen.
  7. På FACS maskinen, bruker de ufargede celler for å definere en negativ port for det fluorescerende markør.
  8. Ved hjelp av en 100 micron dyse, sortere BMPR-IB positive og negative celler i de respektive rør conholde standard medium. Holde disse rørene nedkjølt ved 4 ° C i løpet av den type hvis FACS maskinen har denne evnen.
    MERK: Vennligst referer til JOVE artikkel 13 av Sharon et al. for en utmerket protokoll for FACS sortering.
  9. Ved hjelp av et hemocytometer, telle cellene i hvert rør. Sentrifuger "BMPR-IB-positiv", "BMPR-IB-negativ" og "usorterte" rør ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C og aspirer supernatanten, være forsiktig for ikke å forstyrre cellen pellet. Deretter resuspender cellene i standard medium til en konsentrasjon på 1 million celler per 250 ul.
  10. Skaffe pre-cut 4 mm PLGA (poly [melke-ko-glykolsyre]) stillaser belagt med hydroksyapatitt. Plasser hver stillas i en brønn av en 24-brønns plate. Dekker hvert stillas med 50 ul av cellesuspensjon fra en av de tre gruppene (i .e, 200.000 celler.): Usorterte, BMPR-IB-positiv, og BMPR-IB-negative (figur 3).
    MERK: VærSe artikkelen JOVE 14 av Lo et al. for mer informasjon om bygging av PLGA stillasene.
  11. Delvis fylle de omkringliggende tomme brønner med standard medium (for å hindre uttørking av stillasene), dekke platen med sitt lokk, og inkuberes i en cellekulturinkubator ved 37 ° C i 30 minutter.

4. Opprettelse av Calvarial Defekter og anvendelse av ACS-holdig Stillas

MERK: Kontroller at tilstrekkelige institusjonelle godkjenninger er på plass for etableringen av calvarial defekter i levende mus. Denne protokollen er godkjent av Stanford University Institutional Animal Care og bruk komité.

  1. Anesthetize en CD-en naken mus ved hjelp av enten inhalert isofluran gass eller en injisert langtidsvirkende bedøvende cocktail.
    1. For å bruke gass alene, plasserer du muse inn en anestesi kammer og starte flyten av oksygen på 2-3 l / min med en 2% konsentrasjon av isofluran. Når mus er fully bevisstløs, legg den utsatt på et varmt vann resirkulerings teppe med en absorberende pute og plassere snuten inn i en bedøvelse nese kjegle med samme konsentrasjon av oksygen og isofluran. overvåke respirasjonsfrekvens forsiktig og justere konsentrasjonen av isofluran etter behov.
    2. For å kunne bruke en injisert langtidsvirkende bedøvelsesmiddel cocktail, bedøve mus i et anestesikammer som beskrevet ovenfor, og deretter injisere narkosen cocktail. Fjern musen fra anestesi kammeret og observere dens atferd.
      MERK: mus kan kort komme fra anestesi, men i løpet av noen minutter bør være igjen fullstendig bedøvet under virkningen av det injiserte bedøvelse. Overfør musen til et varmt vann resirkulerings teppe dekket med en absorberende pute.
      MERK: For en bedøvende cocktail, anbefaler vi en blanding som inneholder ketamin 10 mg / ml og xylazin 1 mg / ml i normal saltløsning, levert intraperitonealt. Standarddosen av denne blandingen er300 ul av en 30 g mus, noe som tilsvarer ketamin 100 mg / kg og Xylazine 10 mg / kg. Se diskusjon seksjon for mer informasjon om den injiserbare bedøvelse.
    3. Bruke en tå klype manøver for å bestemme dybden av anestesi. Et tilstrekkelig bedøvet musen vil ikke trekke labben når det er lett klemt av kirurgen.
    4. Påfør øye salve for å hindre uttørking av hornhinnen.
    5. Administrer 1 mg / kg buprenorfin SR subkutant.
      MERK: Tilby analgesi før operasjonen resulterer i overlegen smertelindring.
    6. Under hele prosedyren, overvåke respirasjonsfrekvens av musen.
      MERK: En mus skikkelig bedøvd etter isofluran bør ha en lufthastighet på 50 - 100 åndedrag / min. Økt respirasjonsfrekvens indikerer at bedøvelse er for lys, mens en redusert respirasjonsfrekvens kan tyde på at anestesi er for dypt.
  2. Prep huden av den dorsale aspekt av skallen med povidon-iodine, etterfulgt av 70% etanol tre ganger. Drapere med sterile forheng, forlater operasjonsstedet utsettes.
    MERK: Bruk sterile operasjonshansker og vedlikeholde steril teknikk under prosedyren. Bare ta på sterile flater og gjenstander som den sterile drapere og autoklaveres instrumenter. Har en assistent justere belysning, åpne sutur pakker, etc.
  3. Ved hjelp av en 15-blad skalpell, gjør en sagittal midtlinje innsnitt som strekker seg over størstedelen av dorsal skallen. Ved hjelp av en fintannet tang, trekke huden på høyre side av snittet for å eksponere den høyre parietale ben.
  4. Ved hjelp av en drill en autoklaveres 4 mm diamantbelagt trephine drill bit, bore en defekt gjennom issebeinet. Ikke forlenge mangelen siste bein i dura mater lag. (Figur 4)
  5. Plasser et stillas i feilen, og deretter lukke snitt i huden med rennende nylon sutur.
  6. Overvåke mus og gi standard postoperativ omsorg enccording til institusjonelle retningslinjer.
    1. Hold musen på et rent papirhåndkle i et rent bur mens det kommer seg. Den ene halvdelen av buret bør plasseres over et varmt vann som resirkulerer teppe og musen skal i utgangspunktet bli plassert i denne omgangen.
    2. Ikke la en mus uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til ambulate. Ikke returnere en mus som har gjennomgått kirurgi for å et bur med annen mus før det er fullt restituert.
  7. Gjenta trinnene ovenfor med en ny mus for hver stillaset som skal testes. Sterilisere kirurgiske instrumenter i mellom operasjoner ved hjelp av en varm perle sterilisator eller annen egnet metode.
  8. Kort tid etter inngrepet, og deretter på 2, 4, 6 og 8 uker, bruker micro CT-skanning for å analysere frekvensen av calvarial feil nedleggelse.
    MERK: Se artikkel av Levi et al. 6 for en beskrivelse av mikro CT av calvarial defekter.
  9. Når forsøket er complete, avlive musene ved å plassere dem i en ren eutanasi kammer og starter en strøm av karbondioksidgass inn i kammeret med en hastighet på 2 l / min. Etter respirasjon har opphørt helt (etter omtrent 10 min) utfører halshugging for å bekrefte aktiv dødshjelp.
  10. Eventuelt etter forsøket er ferdig, bruk seksjonering og histologisk farging å vurdere beindannelse innen mangelen.
    MERK: Se artikkel av McArdle et al. 12 for detaljer om å forberede bein eksemplarer for histologi. For en gjennomgang av histologiske og fargeteknikker, se en histologisk manual som Manualen kirurgisk patologi 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Micro CT scan gjort på operasjonsdagen vil tydelig vise skallen defekt. På dette tidspunktet vil det ikke være innvekst inn i 4 mm defekten. Påfølgende skanninger blir oppnådd over tid for å kvantifisere størrelsen av feilen over tid, sammenlignet med grunnlinjen. Defekter sådd med BMPR-IB + celler bør vise mer hurtig lukking av defekten i forhold til BMPR-IB- og usorterte celler (figur 5). I tillegg kan den del av hodet som inneholder defekten avkalkes og behandlet for histologi ved hjelp av standard metoder 12. Seksjoner farget med Movat sin pentachrome flekken vil avdekke større bein regenerasjon i defekten behandlet med BMPR-IB celler sammenlignet med de andre cellepopulasjoner (figur 6).

Figur 1
Figur 1: Lipoaspirate etter PBS Wash. strong> A tønne av lipoaspirate etter PBS tilsettes, og blandingen får lov til å bunnfelle. Det øverste laget er vevet fettvev som er vert ASCer, mens bunnlaget er det vandige lag, i hovedsak består av saltløsning og blod. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Plassering av cellesuspensjonen på Polysucrose Solution. (a) Cellesuspensjonen må være meget pipetteres forsiktig ned på siden av røret, slik at det til lag på toppen av polysucrose løsning. (b) Dette er den riktige opptreden av en cellesuspensjon lag på toppen av den polysucrose før sentrifugering."> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Seeding Celler bort på stillaset. (a) På den sterile overflate av en brønn i en 24-brønners cellekulturplate, laste inn en tørr stillas med ca 50 ul av cellesuspensjon. (b) Inkuber stillaset i en cellekulturinkubator i 30 min for å tillate celleadhesjon. Merk: I figuren, er en 10-cm plate brukes til demonstrasjonsformål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Etableringen av Calvarial Defect. Den calvarial defekt (piler) er synlig iåpen hud innsnitt. Legg merke til de intakte durale blodkar (pilhoder), noe som indikerer at bore ikke har brutt dura. Scale bar, 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Healing av kritisk størrelse Calvarial Defekter med ulike ASC undergruppene. (A) Tredimensjonal mikro CT rekonstruksjoner ble utført for calvarial feil reparert med usorterte, BMPR-IB (+), eller BMPR-IB (-) ASCs. (B) Kvantifisering av healing på 8 uker viste signifikant større bein regenerasjon med BMPR-IB (+) ASCs (92%) sammenlignet med usortert og BMPR-IB (-) ASCs (58% og 46%, henholdsvis, ** p < 0,01). Signifikante forskjeller i healing ble også sett på to viEKS (** p <0,01), 4 uker (*** p <0,001), og 6 uker (*** p <0,001). Micro-CT, mikro-computertomografi. Gjengitt med tillatelse fra McArdle et al. 12. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Histologisk Farging av Bone regenerere. (A) Movat sin pentachrome farging av bein regenerere i feil reparert med usortert, BMPR-IB (+), eller BMPR-IB (-) ASCs på 5X forstørrelse ved hjelp av lyse felt mikroskopi. Merk mer robust beindannelse i BMPR-IB (+) sammenlignet med gruppen BMPR-IB (-) gruppe. Den stiplede linje representerer utstrekningen av det defekte området. Området innenfor den svarte firkanten er vist på høyere magnificasjon ved anvendelse av (B) og 10X (C) 40X lyse felt mikroskopi av defekte område. Gjengitt med tillatelse fra McArdle et al. 12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trinn i protokollen

Under innhøstingen av ASCs, er det avgjørende skritt tilstrekkelig fordøyelsen av fett med kollagenase. Utilstrekkelig fordøyelse vil resultere i et lavt utbytte av ASC. Under FACS-sortering av BMPR-IB + celler, er det viktig å nøye definere porten for positivitet. Definere porter for løst kan føre sorterte bestander som ikke er rene. Under etableringen av calvarial defekt, er det avgjørende å bore defekten gjennom benet av skallen, men ikke for å rykke inn i dura mater. Dette vil føre til rikelig blødning og eksponering av hjernen, som vil nødvendiggjøre avliving av dyret.

Modifikasjoner og feilsøking

Når det gjelder anestesi for calvarial defekten kirurgi, foretrekker vårt laboratorium for å bruke inhalert isofluran, men et annet alternativ er å intraperitonealt å injisere en blanding inneholdende en sluttkonsentrasjon på ketamin 10 mg / ml og xylazin 1 mg / ml i normal salinje. Standarddosen av denne blanding er 300 ul av en 30 g mus. Dette gir omtrent 30 min pålitelige anestesi som ikke krever musen til å være i den isofluran koniske nese under operasjonen. En ulempe ved bruk av injisert bedøvelse er at det ikke er mulig å redusere dosen etter at injeksjonen er gitt. I motsetning til dette, kan inhaleres isofluran enkelt titreres opp eller ned i sanntid.

Ved tilsetning av cellesuspensjon til stillaset, kan forskere finne at væskevolumet er for lite, og vil delvis fordampe i 30 min inkubering. Fordampning kan føre til celledød, noe som er en særlig skadelig confounder i bentilheling eksperimenter. For å bekjempe dette, legger stillaset inne i en brønn i en 24 brønners plate. Fyll umiddelbart omkringliggende brønner med vanlig medium. Dette vil skape en fuktet mikromiljø som bidrar til å holde lastet stillaset tørker ut.

Histologisk farging av bein er predicated på korrekt og grundig avkalking av calvarium før innstøping og snitting. Det er akseptert at hodeskaller av ulik alder krever ulik varighet avkalking, tradisjonelt gjort i en EDTA-løsning

Begrensninger av teknikken

Denne protokollen benytter en 4 mm calvarial defekten for å vurdere evnen til en populasjon av celler for å forbedre lukking av defekten. Denne modellen kan ikke simulere helbredelse som forekommer i et mer komplekst miljø, slik som et langt ben brudd eller en svulst reseksjon. Av denne grunn, kan alternative dyremodeller må brukes for å forstå bidraget fra ASC til bentilheling i disse miljøene.

Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder

Ved hjelp av strømningscytometri for å isolere bestemte ASC-populasjoner er en lovende metode for å øke helbredelse og regenerering i sammenheng med flere vev og iJuryen modeller, for eksempel angiogenese, adipogenesen, og osteogenesis. Nytten av pro-osteogene celler er undersøkt i denne studien, viser en dyp effekt med celler positivt selekterte for BMPR-IB i healing en calvarial defekt.

Tidligere protokoller for isolering av ASC innebærer dyrking av cellene i flere dager for cellekulturplater 16. Imidlertid kan celler oppleve betydelige fenotypiske drift mens i kultur. Av denne grunn bruker vi en ASC isolasjonsprotokoll som tillater hurtig isolering av disse cellene, etterfulgt av ytterligere undergruppe rensing under anvendelse av FACS. Hele fremgangsmåten utføres i løpet av mindre enn en dag, noe som minimerer effekten av celleoverflatemarkør eller fenotypisk drift.

Fremtidige Søknader og Veibeskrivelse

Vi har vist at ASCer høyt uttrykk BMPR-IB demonstrerer en større evne til å forbedre regenerativ bendefekt helbredelse sammenlignet med andre ASCer. Mekanismene underlying dette fenomenet er ikke kjent. For eksempel, er det ikke klart hvorvidt cellene seg direkte differensiere til bendannende celler, eller hvorvidt de produserer faktorer som stimulerer andre celler for å gjøre dette. Fremtidige studier må utføres for å svare på disse spørsmålene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28, (2), 134-139 (2003).
  2. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
  3. Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3, (1), 49-57 (2006).
  4. Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11, (5), 1253-1263 (2015).
  5. Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53, (6), 617-620 (2000).
  6. Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5, (6), e11177 (2010).
  7. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, (9), 1249-1260 (2007).
  8. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286, (45), 39497-39509 (2011).
  9. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19, (7-8), 989-997 (2013).
  10. Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242, (4885), 1528-1534 (1988).
  11. Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (33), 12335-12340 (2006).
  12. McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20, (21-22), 3031-3040 (2014).
  13. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
  14. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
  15. Lester, S. C. Manual of surgical pathology. Saunders/Elsevier. (2010).
  16. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45, (2), 115-120 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics