לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

תיוג מבשר איזוטופים בשילוב ותיוג isobaric (cPILOT) הוא אסטרטגית פרוטאומיקה כמותית המשפר יכול ריבוב מדגם של תגי isobaric. פרוטוקול זה מתאר את היישום של cPILOT לרקמות מתוך שולטת מודל עכבר מחלת אלצהיימר ו wild-type.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (123), e55406, doi:10.3791/55406 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ישנה דרישה גוברת לנתח דגימות ביולוגיות רבות להבנת מחלות גילוי סמן ביולוגי. אסטרטגיות פרוטאומיקה כמותיות המאפשרות מדידה בו זמנית של מספר דגימות הפכה נפוצה לצמצם במידה ניכרת את עלויות וזמניות ניסיוני. המעבדה שלנו פיתחה טכניקה הנקראת מבשר בשילוב תיוג איזוטופי ותיוג isobaric (cPILOT), אשר משפר מדגם ריבוב של תיוג איזוטופי מסורתיים או גישות תיוג isobaric. cPILOT העולמי ניתן ליישם דגימות שמקורם בתאים, ברקמות, נוזלי גוף, או אורגניזמים שלמים נותן מידע על שכיחותם יחסית חלבון על פני תנאים מדגמים שונים. cPILOT עובד ע"י 1) באמצעות תנאי חיץ pH נמוכים כדי פפטיד dimethylate סלקטיבי N-טרמיני 2) באמצעות תנאי חיץ pH הגבוה לתייג אמינים ראשוניים של שאריות ליזין עם ריאגנטים isobaric-זמינים מסחרי (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים). המידהריבוב המדגם זמין תלוי מספר ההתוויות מבשרות משומשות מגיב תיוג isobaric. כאן, אנו מציגים ניתוח 12-Plex באמצעות קל וכבד dimethylation בשילוב עם שש-Plex ריאגנטים isobaric לנתח 12 דגימות מרקמות עכבר בניתוח יחיד. ריבוב משופר מועיל להקטנת זמן ניסיוני ועלות וחשובה יותר, מה שמאפשר השוואה על פני תנאים מדגמים רבים (ביולוגי משכפלות, שלב מחלה, טיפולים תרופתיים, גנוטיפים, או בזמן נקודות אורכות) עם הטיה וטעייה ניסיוניות פחות. בעבודה זו, גישת cPILOT הגלובלית משמשת כדי לנתח מוח, לב, כבד ורקמות ברחבי ביולוגי משכפל ממודל עכבר מחלת אלצהיימר בקרות מסוג פרא. ניתן ליישם גלובל cPILOT ללמוד תהליכים ביולוגיים אחרים ומותאם להגדיל ריבוב מדגם גדול מ 20 דגימות.

Introduction

פרוטאומיקה קרובות כרוך הניתוח של דגימות רבות השתמשו כדי להבין טוב יותר תהליכי מחלה, קינטיקה אנזימטית, ופוסט translational שינויים, בתגובה לגירויים סביבתיים, בתגובת טיפולים רפואיים, גילוי סמן ביולוגי, או מנגנוני סמים. יכול להיות מועסק שיטות כמותיות למדוד הבדלים ביחס ברמות החלבון ברחבי דגימות וניתן ללא תווית או לערב תיוג איזוטופי (מטבולית, כימיים, או אנזימטי). שיטות תיוג איזוטופ יציבות גדלו ב פופולרי כי הם מאפשרים דגימות רבות להיות מנותחות בו זמנית ומתאימים דגימות מתאים שונים, רקמות, נוזלי גוף, או אורגניזמים שלמים. תיוג איזוטופ שיטות 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 תפוקה ניסיון עלייה,תוך צמצום זמן רכישה, עלויות, וטעייה ניסיונית. שיטות אלה להשתמש ספקטרה המונית מבשר למדוד שכיחותם היחסית של חלבונים מן הפסגות פפטיד. לעומת זאת, ריאגנטים תיוג isobaric 8, 9, 10 יוצרים יונים כתב כי מזוהים או ב MS / MS או MS 3 11 ספקטרום ופסגות אלה משמשים לדווח על שכיחותם היחסית של חלבונים.

הזרם המדינה- of-the-art ריבוב פרוטאומיקה הוא או ניתוח תג isobaric 10-Plex 12 או 12-Plex 13. ריבוב מדגם משופר (כלומר> 10 דגימות) שיטות פותחו על ידי המעבדה שלנו עבור רקמות 14, 15, 16, 17, ועל ידי אחרים לניתוח תאים 18 sup>, 19, 20, רקמות 21, או פפטידים ממוקדים 22. פתחנו טכניקת ריבוב משופרת שנקראת תיוג איזוטופי מבשרים בשילוב עם תיוג isobaric (cPILOT). CPILOT גלובל שימושי להשגת מידע על הריכוזים היחסיים של כל החלבונים על פני תנאים מדגמים שונים (≥12) 14. איור 1 מציג את זרימת העבודה cPILOT בכלל. פפטידים tryptic או ליס-C מסומנים באופן סלקטיבי על הסופית- N עם dimethylation באמצעות נמוך pH 2 ובבית שאריות ליזין עם ריאגנטים 6-Plex באמצעות pH גבוה. אסטרטגיה זו מכפילה את מספר הדגימות כי ניתן לנתח עם ריאגנטים isobaric שעוזרים להפחית עלויות ניסוי ובנוסף, מפחית צעדים וזמן הניסיונות.

cPILOT היא גמישה כמו פיתחנו שיטות אחרות כדי ללמוד חמצוני ופוסט translational מודיfications, כולל חלבונים 3-modified-nitrotyrosine 14 ופפטידים המכילים ציסטאין עם S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. גם פיתחנו חומצת אמינו גישה סלקטיבית, cPILOT ציסטאין (cyscPILOT) 17. רכישת MS 3 עם שיטת 11-יון עליון או סלקטיבית-y 1 -ion 15 יכול לעזור להפחית פרעות כתב יון ולשפר את דיוק כמותית של cPILOT. שימוש MS 3 בשיטת הרכישה דורש מכשיר ברזולוציה גבוהה עם נתח מונית orbitrap למרות מכשירי מלכודת יונים ברזולוציה נמוכה עשויים גם לעבוד 24.

בעבר, cPILOT נוצל בעבר ללמוד חלבונים בכבד 16 ממודל העכבר מחלת האלצהיימר. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע ניתוח cPILOT הגלובלית באמצעות המוח, הלב, ואת homogenates הכבד כדי ללמוד את התפקיד של peripheר"י במחלת האלצהיימר. ניסוי זה משלב שכפול ביולוגית. בגלל הרבגוניות של cPILOT, משתמשים מעוניינים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי ללמוד ברקמות אחרות עבור מגוון של בעיות ומערכות ביולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

משפט ואתיקה: עכברים נרכשו ממוסד מחקר ביו עצמאי, ללא כוונת רווח ו שוכנו אגף משאבי חיות מעבדה באוניברסיטת פיטסבורג. כל הפרוטוקולים חיה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת פיטסבורג.

1. מיצוי חלבון ואת הדור של פפטידים עבור תיוג-כימי

  1. חלץ חלבון מן הרקמה, תאי, או נוזלי גוף.
    1. Homogenize 60-90 מ"ג של רקמות (למשל מוח, לב וכבד) ב חיץ מלוח פוספט (PBS 1x) עם 8 M אוריאה (500 μL) באמצעות homogenizer מכאני. מעכבי פרוטאז או phosphatase ניתן להוסיף למאגר במידת הצורך. בפרויקט זה, הם לא היו רגילים. השתמש בפרמטרים הבאים עבור homogenizer: lysing חרוזים מטריצה ​​A, 4 מ '/ s, 20 s. רקמת לב עשויה לדרוש עד 9 מחזורים של הומוגניזציה.
      הערה: פרוטאז או מעכב phosphatase ים ניתן להוסיף למאגר במידת הצורך. הם לא שימשו במחקר זה.
      1. הסר homogenate רקמות מהצינור lysing ומעבירים צינור מיקרו צנטריפוגות. יש לשטוף lysing צינורות עם 100-500 μL של PBS עם 8 אוריאה ז ולשלב הפתרון שטיפה עם homogenate רקמות.
    2. צנטריפוגה רקמות הומוגני (9447 XG, 4 ° C, 15 דקות) ולאסוף את supernatant.
  2. קביעת ריכוז חלבון באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) assay פי הוראות היצרן.
    הערה: דילול יתר עם חיץ עשוי להיות נחוץ אם ריכוז החלבון גבוה מדי. הריכוזים וכתוצאה עבור דגימות מרקמות אלה היו בין 6-13 מיקרוגרם / μL.
    1. אופציונלי: להוסיף תקן בקרת איכות פנימית (קזאין אלפא למשל שור או חלבון אקסוגניים אחרים) עם תקן מיקרוגרם יחס 1: 100 מיקרוגרם מדגם חלבון.
jove_title "> 2. עיכול לדוגמא

  1. הוספת 100 מיקרוגרם (100 x 10 -6 גרם) של חלבון מכל מדגם כדי שכותרתו בנפרד צינורות מיקרו צנטריפוגות. ההיקף תלוי בריכוז החלבון (ראה שלב 1.2).
  2. להוסיף dithiothreitol (DTT) (40: 1 מגיב לדגום יחס mol) מדגם זה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 h. החישוב עבור היחס הטוחן מתבסס מעל מסת חלבון אלבומין בסרום שור (BSA), המהווה 66.5 x 10 3 g / mol.
  3. להוסיף iodoacetamide (IAM) (80: 1 מגיב לדגום יחס mol) מדגם זה. לדגור על הקרח בחושך במשך 2 h. תגובה זו מבוצעת על הקרח עבור 2 h כדי למנוע תגובות לוואי.
  4. הוספת L-ציסטאין (40: 1 מגיב לדגום יחס mol) מדגם זה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  5. להוסיף 20 מ"מ טריס חיץ עם 10 מ"מ CaCl 2 (pH 8.2) כדי לדלל אוריאה לריכוז סופי של 2 מ '
  6. הוספת L-1-tosylamido-2 phenylethyl chloromethyl קטון (TPCK) -treated טריפסין (50: המצע 1 ולאנזים יחס mol) מדגם לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  7. להרוות את עיכול החלבון על ידי פלאש-מקפיא המדגם בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C עד עיבוד נוסף.

Desalting לדוגמא 3.

  1. Re-להפוך לחומצה דגימות ידי הוספת חומצה פורמית (FA). להוסיף מספיק FA כדי לקבל ריכוז סופי של 0.1%. אם הדגימות הן במקור -80 ° C, להפשיר דגימות קרח לפני מחדש החמצה.
  2. דה-מלח פפטידים באמצעות C 18 הידרופילי lipophilic מאוזנת (HLB) 10 מחסניות מ"ג כפי שתואר לעיל 16.
  3. יבש את דגימות על ידי צנטריפוגה ואקום (5 Torr, 45 ° C, 77 XG) בהיקף של ~ 10 μL.

4. תיוג Dimethylation (N-Termini)

  1. לשקם פפטידים חומצת אצטית 1% (0.25 מיקרוגרם / μL) מומס כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) או מי כיתה ננו-טהורה. הסרת 50 μחלק ז לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדשה (1.5 מ"ל) ולאחסן והיתרה ב -80 מעלות צלזיוס;.
  2. להוסיף 8 μL של 60 מ"מ (4%) CH 2 O (37% wt / v) או 60 מ"מ (4%) 13 CD 2 O (20% wt / v) על דגימות עבור תיוג עם אור או dimethylation כבד, בהתאמה . בדרך כלל, 4 μL של מגיב מתווסף לכל 25 מיקרוגרם של פפטידים (שלבים 4.2, 4.3, 4.6).
  3. להוסיף 8 μL של 24 מ"מ NaBH 3 CN או 24 מ"מ NaBD 3 CN דגימות שכותרתו עם אור או dimethylation כבד, בהתאמה.
  4. וורטקס ולנער על שייקר צינור עבור ~ 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. להרוות את התגובות על ידי הוספת 16 μL של 1% אמוניה (~ 28-30 v% / נ) עבור 5 דקות. בדרך כלל, 8 μL של מגיב מתווסף לכל 25 מיקרוגרם של פפטידים.
  6. Re-להפוך לחומצה תערובות התגובה על ידי הוספת 8 μL של 5% FA (98% v / v).
  7. מערבב את האור פפטידים dimethylated הכבדים (איור 1) כדי ליצור סך של שש דגימות. ראה טבלה 1
  8. בצעו desalting מדגם פי שלבים 3.2 ו 3.3.

5. Isobaric תיוג (שאריות ליס)

  1. לשקם 100 מיקרוגרם של פפטידים dimethylated (1 מיקרוגרם / μL) ב 100 מ"מ אמוניום ביקרבונט Tri-אתיל (TEAB) חיץ (pH ~ 8.5).
  2. כן ריאגנטים isobaric כאמור הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים).
  3. הוספת ריאגנטים isobaric solubilized (41 μL) כדי פפטידים מערבולת של ~ 10 s. Shake דגימות על שייקר צינור מיקרו צנטריפוגות עבור ~ 1 h. להרוות את התגובות עם 8 hydroxylamine μL (10% w / v) דגירה דגימות עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. פינת שש דגימות שכותרתו לתוך אחת לתערובת desalt (שלבים 3.1-3.3) או בחנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
    הערה: לשיפור הכיסוי proteome ועומק, אסטרטגיה ההפרדה רב-ממדי הוא הציעכפי חזקה קטיון כגון חילופי (SCX).

6. קטיוני סטרונג

  1. בצע SCX לפי הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלת חומרים).
    1. הכן ~ 1 מ"ל של פתרונות formate אמוניום (20 מ"מ, 40 מ"מ, 60 מ"מ, 80 מ"מ, 100 מ"מ, 150 מ"מ, 250 מ"מ, & 500 מ"מ) עם 10% אצטוניטריל (ACN), 0.1% FA (pH 3).
    2. להסיר את הכובע האדום מהחלק העליון של קצה פיפטה והקש על קצה פיפטה עם אריזה תרחיף כדי להבטיח את חומרי האריזה היא לכיוון החלק התחתון של קצה פיפטה.
      הערה: קריטית: אל תזרוק את קצה פיפטה עד סוף הפרוטוקול.
    3. מניחים את מתאם צנטריפוגה על גבי צינור מיקרו צנטריפוגות (2 מ"ל) ולאבטח את קצה פיפטה בפנים.
    4. הוספת 150 μL של חיץ הכינון מחדש SCX טיפים פיפטה.
    5. צנטריפוגה טיפים פיפטה עבור 6 דקות בטמפרטורת החדר (4000 XG). חזור על פעולה זו עוד פעמיים וזורקים את הפסולת.
    6. ממיסים את peptides ב 150 μL של חיץ הכינון מחדש SCX. ודא כי ה- pH הוא 3.
    7. הוספת פפטידים אל טיפים פיפטה, צנטריפוגה (ראה 6.1.5), ולשמור את eluent.
    8. העבר את המסנן פיפטה צינור מיקרו צנטריפוגות חדשות (2 מ"ל) ולהוסיף 150 μL של פתרון formate אמוניום 20 מ"מ. צנטריפוגות במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר (4000 XG) ולשמור את eluent.
    9. חזור על שלב 6.1.8 פעמים שבעה נוספים, באמצעות ריכוזים רצופים (כלומר 40 מ"מ, 60 מ"מ, 80 מ"מ, 100 מ"מ, 150 מ"מ, 250 מ"מ ו 500 מ"מ) של formate אמוניום.
  2. העבר שמונה שברים SCX כדי צינורות מיקרו-צנטריפוגה (1.5 מ"ל) ולרכז אותם באמצעות אידוי צנטריפוגלי (ראה שלב 3.3).

7. נוזלי כרומטוגרפיה-טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) ו- MS 3

  1. לשקם את פפטידים במי כיתה ספקטרומטריית מסה עם 0.1% FA, מסנן, ולמקם לתוך בקבוקון האוטומטי סמפלר. פפטידים מסננים כמו follOWS:
    1. הוספת פפטידים מחדש לצינור מיקרו צנטריפוגות המכיל מסנן 0.65 מיקרומטר (ראו טבלה חומרים).
    2. פפטידים צנטריפוגה XG ב 12,000 במשך 1 דקות. הסר סינון, להשליך, ולהוסיף פפטידים מסונן לתוך בקבוקון אוטומטי סמפלר.
  2. כן מאגרי השלב הניידים כדלקמן: 3% (v / v) ACN עם 0.1% FA (א) ו- 100% ACN עם 0.1% FA (B).
  3. להזריק 6 μL של כל דגימת SCX שבריר גבי טור מלכודת הארוז ל 2 סנטימטר עם חומר C 18 (5 מיקרומטר, 200 גודל נקבובי).
    הערה: ניקוי לדוגמא על המלכודת הוא כדלקמן: 3 דקות, 0% B; 3 μL / min באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית 2D (ראה טבלת חומרים).
  4. הפעל את שיטת ההפרדה האנליטית. השתמש בעמודה סיליקה התמזגו נימי משך-טיפ לייזר 75 מיקרומטר id x 13.2 ס"מ ארוז עם 18 C חומר (5 מיקרומטר, 100 א). השיפוע הוא: 0-5 דק ', 10% B; 5-40 דק ', 10-15% B; 40-90 דק ', 15-25% B; 90-115 דקות, 2530% B; 115-130 דקות, 30-60% B; 130-135 דקות, 60-80% B; 135-145 דקות, 80% B, 145-150 דקות, 80-10% B; 150-180 דקות, 10% B; 300 NL / min, 180 דק '.
  5. הפעל את רכישת נתונים עבור ספקטרומטר מסה ואילו שיטת ההפרדה האנליטית פועל.
    הערה: הפרמטרים עבור סריקת סקר MS הם כדלקמן: 400-1,600 מ '/ z, 60,000 רזולוציה, שליטה אוטומטית (AGC) למקד 1 x 10 6 יונים, בזמן הזרקת מקסימלית 500 ms. פרמטרים עבור CID-MS / MS הם כדלקמן: מדורגים 1-7 או רכישה תלויה 8-14 נתוני Top (DDA), 3 מ '/ רוחב בידוד z, אות מינימום 500, 35% אנרגית התנגשות מנורמלת (NCE), q הפעיל 0.25 , זמן הפעלה 10 מילישניות, 3 x 10 4 AGC, 50 ms זמן הזרקת מקסימלית. פרמטרים HCD-MS 3 הן כדלקמן: 200 אות מינימלי, 4 רוחב הבידוד m / z, 60% NCE, 0.1 זמן ההפעלה, 3 x 10 5 AGC, 250 ms IT, 300-1,300 מ '/ z טווח הבחירה MS / MS , להוציא יון הורה בלתי מקוטע.
  6. הערה: לקבלת דוגמיות לרוץ על דגם חדש של מכשיר המכיל orbitrap או ספקטרומטר מסה tribrid, פרמטרים DDA ישתנו והוא יכול להיות מותאם כדי לכלול יותר MS / MS ו- MS 3 סריקות. בנוסף, עבור מכשירי tribrid, מבחר מבשר סינכרוני (SPS) -MS 3 אמורים להיות מועסקים.

8. ניתוח נתונים 16

  1. חיפוש קבצי RAW באמצעות תוכנת ניתוח חלבון מול בסיס נתונים מתאימים, כגון עכבר Uniprot.
    הערה: חשוב ליצור שתי דרכים שבעזרתן כל קובץ RAW כדי לחפש אור פפטידים dimethylated כבד.
  2. חיפוש קבצי RAW באמצעות הפרמטרים הבאים: טריפסין עם שני שסעים החמיצו, הטווח המוני פפטיד 300-6,000 דא, 15 עמודים לדקת סובלנות מונית הורה, 1 סובלנות פיצול דא. שינויים סטטי: dimethylation אור (28.031, פפטיד הסופית- N) או hdimethylation eavy (36.076 דא, פפטיד N- הסופית), carbamidomethyl (57.021 דא, ג).
    הערה: לפעמים שיא dimethylated הכבד היא ~ 7 Da (35.069 דא, פפטיד N- סופי) הוא משיא אור dimethylated וכך צריך להיות משולב לתוך העבודה בחיפוש אחר פפטידים dimethylated כבדים. שינויים דינאמיים: חמצון (15.995 דא, ז), תג isobaric 6-Plex (229.163 דא, K). כלול חיפוש בבסיס הנתונים דמה להניב שיעור התגליות השגויות (למשל 1 ו 5%) ובלוטת לכמת לחפש את עוצמות יון הכתב של תגי isobaric.
  3. סטָטִיסטִיקָה
    1. נתוני יצוא לתוך תכנית גיליון אלקטרונית כדי לנרמל ערכי יון כתב חלבון. עבור כל חלבון, לחלק גם את יחסי יון כתב חציון או בעוצמות יון כתב גלם על ידי היחס החציוני של ההתקן הפנימי או בעוצמות יון כתב גלם של ההתקן הפנימי, בהתאמה. השתמש בתוכנה סטטיסטית המתאימה כגון תכנית גיליון אלקטרונית, PersEUS, או R כדי לקבוע שינויים משמעותיים בין תנאים מדגמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

cPILOT משתמשת כימיה מבוססת אמינה כדי כימי פפטידים תווית על יכולות ריבוב N- הסופי ואת השאריות ליזין ושפר מדגם. איור 2 מציג נתוני MS נציג כי מתקבל ניתוח cPILOT 12-Plex של מוח, לב, כבד ורקמות ממודל עכבר מחלת אלצהיימר בקרות מסוג פרא. כפי שניתן לראות בטבלה 1, שני משכפל ביולוגי עבור מחלת אלצהיימר ו עכברי-בר כלול בניתוח 12-Plex זה. איור 2 א מראה זוג שיא-טעון כפליים כי הוא מופרד על ידי ריווח m / z של 4 המציין קבוצת דימתיל יחידה שולב פפטיד. שניהם האור והפסגות כבדות dimethylated בצמד הזה הם עצמאי מבודדים מקוטעים עם CID. נתוני MS / MS עבור כל אחד פפטידים dimethylated מוצגים 2B הדמוי ו- C. תוצאות חיפוש מצביעות פאי זהr של פסגות שייך T (דימתיל) ELNYFAK (isobaric-תג 6) פפטיד של החלבון קינאז phosphoglycerate 1. היון שהבר האינטנסיבי ביותר הוא y 3+ דומה לשני האור ופסגות dimethylated כבדים. פסגות אלה מבודדים נוספים HCD-MS 3 ואת יוני הכתב (m / z 126-131) נבדקים כפי שמוצגים 2D דמויות 2E. שתי קבוצות של ספקטרה 3 MS נחוצים כדי לקבל מידע על 12 דגימות. בדוגמא זו, יחסי יון כתב (AD / WT) (מחלת אלצהיימר / שליטת wild-type) עבור מוח, כבד, לב ורקמות דומה על פני שני המשכפל ביולוגי. הערכים מתקפלים השינוי עבור כל השוואה מראים כי 1 רמות קינאז phosphoglycerate ב מוח ולב הן גבוהות ב עכברים לספירה, ואילו כבד הרמות נמוכות.

איור 1
figuמחדש 1: עבודת פרוטאומיקה באמצעות cPILOT. כדוגמא, זרימת עבודה זו מתארת ​​את הניתוח של 12 דגימות בודדות. חלבונים מרקמות, תאים, או נוזלי גוף מחולצים ורמת חלבון מתאימה (שור למשל קזאין אלפא) מתווספת. חלבונים מתעכלים באמצעות טריפסין. פפטידים מסומנים ב N- הסופית באמצעות אור או dimethylation כבד (pH ~ 2.5) ובבית שאריות ליזין באמצעות TMT 6 -plex (pH ~ 8.5). פפטידים שכותרתו הם אספו לתוך תערובת ובכפוף יחיד SCX RP-LC-MS / MS ו- MS 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: נתוני הדוגמא cPILOT של פפטידים מן המוח, לב, כבד ורקמות של מודל עכבר מחלת אלצהיימר ובקרות wild-type. (א) מראה קלים וכבדים פפטידים dimethylated, המיוצג על ידי פסגות ב m / z 643.854 ו 647.875. פפטידים אלו נבחרו, מבודדים, ו מקוטעת, ובכך לייצר CID-MS / MS ספקטרה (B ו- C), אשר סיפקה זיהוי הפפטיד. מבחר, בידוד נוסף, ופיצול של יון שהבר האינטנסיבי ביותר של אור פפטידים dimethylated כבדים בשלב MS / MS שנוצרו HCD-MS 3 ספקטרום (D ו- E), בהתאמה. רצף הפפטיד הוא T (דימתיל) ELNYFAK (isobaric-תג 6) ושייך phosphoglycerate kinase 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

מגיב Isobaric0;
126 127 128 129 130 131
אור Dimethylation WT מודעה ב ' WT מוֹדָעָה WT מוֹדָעָה
מוֹחַ לֵב כָּבֵד
Dimethylation כבד WT מוֹדָעָה WT מוֹדָעָה WT מוֹדָעָה
לֵב כָּבֵד מוֹחַ
הרקמה או משלט wild-type (WT) a או עכבר מחלת אלצהיימר (AD) ב.

טבלת 1: קיבוץ cPILOT של מחלת אלצהיימר, WT המוח, לב, ואת הרקמות כבדות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

cPILOT מאפשרת מדידה בו זמנית של יותר מ 12 דגימות ייחודי. על מנת להבטיח תיוג מוצלח בשני שאריות N- הסופית וליזין של פפטידים, זה הכרחי כדי לקבל את ה- pH הנכון עבור כל קבוצה של תגובות ולבצע את התגובה dimethylation הראשון עבור תיוג פפטיד. dimethylation סלקטיבי על הסופית- N מבוצע על ידי בעל pH ב ~ 2.5 (± 0.2). זו מושגת על ידי ניצול ההבדלים של PKA של קבוצות אמינו על ליזין ואת N- הסופית. בשעה 2.5 pH, ליזין אינו פעיל (pKa ~ 10.5); עם זאת, אם ה- pH הוא חומצי מעט (כלומר pH 5-7) או בסיסי, הוא שאריות N-טרמיני ליזין יהיה dimethylated. בנוסף, אם התיוג isobaric מבוצע הראשון ב- pH נמוך, N-Termini תהיה שאריות התווית ליזין isobaric יהיה dimethylated. הדבר עלול לגרום שברים פחות להיבחר MS 3 כמו-יוני ב היה צריך להיבחר. העלויות היחסיות של דימתילתגובות ation הן זולות בהשוואת ריאגנטים isobaric המסחרי. בעוד שניתן להשתמש בקבוקון ריאגנט isobaric כולו לכל 100 מיקרוגרם, אנחנו גם נחלו הצלחה באמצעות וחצי של הבקבוקון מגיב לכל 100 מיקרוגרם עם יעילות תיוג דומה. זה עוזר להפחית את העלויות משמעותיות עבור ניסויי cPILOT פרט ומאפשר יותר דגימות להיות מנותחות. כמו כן חשוב לציין כי ריאגנטים תיוג isobaric אחרים יכולים לשמש במקום של מגיב isobaric להשתמש בפרוטוקול זה כפי שהראנו קודם לכן 14. כדי להבטיח תיוג גבוה ויעילות תיוג, חשוב להוסיף ריאגנטים דגימות במהירות. זה יאפשר דגימות כדי לקבל את זמן התגובה זהה בקירוב. לצורך כמותית, כל דגימה צריכה להיות מטופלים באופן זהה במיוחד לפני איגום דגימות בבית dimethylation וצעדי תיוג isobaric. לבסוף, יש לציין כי בעבודה עם דגימות רבות בו זמנית בשלבים הראשוניים requires מיומנת המשתמשים זהירים ותשומת לב לדגום טיפול.

התרחיש האידיאלי ביותר הוא להשיג יוני כתב לכל חלבון בתערובת ברחבי 12 הדגימות. עם זאת, זה לא המקרה עבור מספר רב של חלבונים. מספר פפטידים המזוהה עם מידע לכמת עבור cPILOT ריבוב משופר אחר מתקרב תלוי במספר גורמים, ביניהם סוג מדגם, חלוקת מדגם וצעדי עיבוד, שיטות איסוף נתוני MS, וסוג המכשיר. למרות ששני dimethylation וצעדים תיוג isobaric יש יעילות תיוג פפטיד גבוהה של ~ 95-99%, יש עדיין ~ 20% מהנתונים 3 MS שלא תכלול מידע יון הכתב. זה נובע בין השאר באמצעות טריפסין אשר מייצר פפטידים הסתיים ארגינין כי התוצאה לא ההתאגדות של ריאגנט isobaric. זה יכול להיפתר באמצעות אנזימים אחרים, כגון LysC, עם תחלופה פוטנציאלית הזדהויות חלבון 25. כמו כן עבור כבדפפטידים dimethylated, השיא שנבחר עבור פיצול יכול להיות M או שיא M-1, אשר יש עוצמות שונות ישפיע על עוצמות כתב היון שנצפו בשלב 3 MS. לכן ייתכנו כמה יוני כתב בעצימות נמוכים אינם מזוהים על כמה דוגמאות. מצבים כאלה לעתים קרובות הם נצפו כלל על שברי MS / MS בעצימות נמוכה שמבודדים עבור שלבים 3 MS. פתרון נהדר לבעיה זו כבר שולב ספקטרומטרים מונית tribrid, אשר, במקום להשתמש לבחירה יחידה מסוגם עבור MS 3, לשימוש רב-notch או MS המרובה / MS שבר 26.

יש הרבה צדדי בגישת cPILOT במיוחד לגבי מספר הדגימות כי ניתן להשוות בניתוח יחיד (כלומר, עד 20 עם ריאגנטים מסחריים isobaric) ואת סוגי רקמות בשימוש. הראינו שזה קל להשיג מידע כמותי מדויק מן המוח, הלב, ואתרקמות כבדות באותו הניתוח בהקשר של מחלה. שיטה זו, בדומה לשיטות ריבוב אחרים, מאפשר ניתוח של דגימות מרובות בבת אחת, והיא חלה על דגימות שמקורם בתאים, ברקמות, נוזלי גוף, או אורגניזמים שלמים. בנוסף, פפטידים שכותרתו cPILOT מסוגלים לנתח או באמצעות ברזולוציה נמוכה 24 או גבוה (60,000) מכשיר. לשם השוואה, קבלת מדידה מוצלחת בשיטות ריבוב אחרות עשויים להיות מוגבל לסוג מסוים של מדגם (תאים כלומר) 18, רשאי לדרוש מכשיר עם רזולוציה גבוהה מאוד 20, או גישת תוויות איזוטופ יציבות. cPILOT הוא נהדר עבור משתמשים מעוניינים הבנת מחלה, גילוי סמן ביולוגי, בתגובת תרופה או התערבות טיפולית, או שינויים אורכים לרוחב נקודות זמן רבים. יתר על כן, עבור חקר חלבונים רובה גדולים מנתח דגימות קליניות (כאשר N הוא גדול, מאות אלף), CPIlot יכול להיות גם מתאים כדי לעזור להפחית את העלויות וזמן הניסיונות. בעתיד, cPILOT יורחב לבצע ריבוב מספר גדול יותר של דגימות באמצעות איזוטופים קיימים רומן ותוויות isobaric.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים שום אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים מאוניברסיטת פיטסבורג קרנות הזנק NIH, מענק R01 NIGMS (GM 117,191-01) כדי RASR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Water - MS Grade Fisher Scientific W6-4 4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade Fisher Scientific A955-4 4 L quantity is not necessary
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) Sigma Aldrich 320145-500ML
Ammonium formate Acros Organics 208-753-9
Formic Acid Fluka Analytical 94318-250ML-F
BCA protein assay kit Pierce Thermo Fisher Scientific 23227
Urea Biorad 161-0731
Tris Biorad 161-0716
Dithiothreiotol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Iodoacetamide (IAM) Acros Organics 144-48-9
L-Cysteine Sigma Aldrich, Chemistry 168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich, Life Science T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O Sigma Aldrich, Life Science F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C Sigma Aldrich, Chemistry 596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% Sigma Aldrich 156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP Sigma Aldrich, Chemistry 190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit Protea BioSciences SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer Sigma Aldrich, Life Science T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) Thermo Fisher Scientific 90061
Hydroxylamine hydrochloride Sigma Aldrich, Chemistry 255580-100G
Standard vortex mixer Fisher Scientific 2215365 any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges Waters 186000383 These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model Sigma Aldrich 57265 A 12 port model is also sufficient
Speed-vac Thermo Scientific SPD1010 any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber Thermo Scientific 2825/2826 Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) MP Biomedicals 116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler Sciex - This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer Thermo Scientific - This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) Thermo Scientific IQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balance Mettler Toledo AL54
Stir plate VWR 12365-382 Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable) Fisher Scientific (Accumet) 13-620-183 Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer Fisher Scientific 06-664-261 Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer Fisher Scientific 06-664-260 Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-129 Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 04-408-120 Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units EMD Millipore UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units Thermo Scientific 69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å) Bruker PM5/61100/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å) Bruker PM5/61200/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1, (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85, (4), 2478-2485 (2013).
  3. Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
  4. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73, (13), 2836-2842 (2001).
  5. Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1, (1), 27-33 (2002).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17, (10), 994-999 (1999).
  7. Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5, (1), 4-15 (2005).
  8. Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75, (8), 1895-1904 (2003).
  9. Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3, (12), 1154-1169 (2004).
  10. Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82, (7), 2817-2825 (2010).
  11. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8, (11), 937-940 (2011).
  12. McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84, (17), 7469-7478 (2012).
  13. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87, (3), 1646-1654 (2015).
  14. Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84, (11), 4677-4686 (2012).
  15. Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13, (22), 3267-3272 (2013).
  16. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9, (9-10), 872-884 (2015).
  17. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26, (4), 615-630 (2015).
  18. Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5, (217), rs2 (2012).
  19. Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10, (4), 332-334 (2013).
  20. Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13, (9), 2503-2512 (2014).
  21. Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87, (19), 9855-9863 (2015).
  22. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85, (11), 5340-5346 (2013).
  23. Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141, (12), 3904-3915 (2016).
  24. Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29, (11), 1025-1030 (2015).
  25. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9, (3), 1323-1329 (2010).
  26. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86, (14), 7150-7158 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics