Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

Biochemistry

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Summary

Combinado precursor de marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia proteómica cuantitativa que mejora las capacidades de multiplexación de muestra de las etiquetas isobáricas. Este protocolo describe la aplicación de cPILOT a los tejidos de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer.

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King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (123), e55406, doi:10.3791/55406 (2017).

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Abstract

Existe una creciente demanda para analizar muchas muestras biológicas para la comprensión de la enfermedad y el descubrimiento de biomarcadores. estrategias proteómica cuantitativa que permiten la medición simultánea de múltiples muestras se han generalizado y reducir en gran medida los costes y los tiempos experimentales. Nuestro laboratorio ha desarrollado una técnica llamada precursor combinado marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT), que mejora la muestra de multiplexación de marcaje isotópico tradicional o enfoques de etiquetado isobáricas. cPILOT Global se puede aplicar a las muestras procedentes de células, tejidos, fluidos corporales, o organismos completos y proporciona información sobre la abundancia relativa de proteínas a través de diferentes condiciones de la muestra. cPILOT funciona por 1) usando condiciones de tampón de pH bajo para selectivamente péptido dimethylate N-terminales y 2) usando condiciones de tampón de pH alto para etiquetar aminas primarias de residuos de lisina con reactivos isobáricas comercialmente disponibles (véase la Tabla de Materiales / Reactivos). El grado demultiplexación muestra disponible depende del número de etiquetas precursores utilizados y el reactivo de marcado isobárica. A continuación, presentamos un análisis de 12-plex usando luz y dimetilación pesado combinado con seis plex reactivos isobáricas para analizar 12 muestras de tejidos de ratón en un solo análisis. multiplexación mejorada es útil para reducir el tiempo y el coste experimental y lo más importante, lo que permite la comparación a través de muchas condiciones de la muestra (réplicas biológicas, estadio de la enfermedad, los tratamientos con fármacos, genotipos, o longitudinales puntos de tiempo) con sesgo menos experimental y error. En este trabajo, el enfoque cPILOT global se utiliza para analizar el cerebro, el corazón, el hígado y los tejidos biológicos a través de repeticiones de los controles modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de Alzheimer. Global cPILOT se puede aplicar para estudiar otros procesos biológicos y adaptado para aumentar la multiplexación muestra a mayor de 20 muestras.

Introduction

Proteómica menudo implica el análisis de muchas muestras utilizadas para comprender mejor los procesos de enfermedad, la cinética enzimática, modificaciones post-traduccionales, de respuesta a los estímulos ambientales, de la respuesta a los tratamientos terapéuticos, el descubrimiento de biomarcadores, o mecanismos de drogas. Los métodos cuantitativos se pueden emplear para medir diferencias relativas en los niveles de proteína a través de las muestras y puede ser libre de etiqueta o implicar marcaje isotópico (metabólica, química o enzimática). métodos de marcaje de isótopos estables han crecido en popularidad debido a que permiten muchas muestras a ser analizadas simultáneamente y son adecuados para muestras de diferentes células, tejidos, fluidos corporales, u organismos enteros. Los métodos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 aumentar el rendimiento experimental, el etiquetado de isótoposal tiempo que reduce el tiempo de adquisición, los costos, y el error experimental. Estos métodos utilizan los espectros de masas precursor para medir la abundancia relativa de las proteínas de picos de péptidos. En contraste, los reactivos de marcado isobáricas 8, 9, 10 generan iones informadores que se detectan ya sea en MS / MS o MS 3 11 espectros y estos picos se utilizan para informar sobre la abundancia relativa de las proteínas.

El estado de la técnica actual en la multiplexación proteómica es o bien un 10-plex 12 o 12-plex análisis etiqueta isobárica 13. Multiplexación muestra mejorada (es decir,> 10 muestras) métodos han sido desarrollados por nuestro laboratorio para los tejidos 14, 15, 16, 17, y por otros para el análisis de células 18 sup>, 19, 20, 21 tejidos, o péptidos dirigidos 22. Hemos desarrollado una técnica de multiplexación mejorado denominado precursor de marcaje isotópico combinado con etiquetado isobárico (cPILOT). CPILOT Global es útil para obtener información acerca de las concentraciones relativas de todas las proteínas a través de diferentes condiciones de la muestra (≥12) 14. La Figura 1 muestra un flujo de trabajo general cPILOT. Trípticos o Lys-C péptidos se etiquetan de forma selectiva en el extremo N-terminal con dimetilación usando bajo pH 2 y en los residuos de lisina con 6-plex reactivos usando pH alto. Esta estrategia se duplica el número de muestras que se pueden analizar con reactivos isobáricas que ayuda a reducir los costos experimentales y, además, reduce pasos y el tiempo de experimentación.

cPILOT es flexible ya que hemos desarrollado otros métodos para estudiar la modificación oxidativa después de la traducciónficaciones, incluyendo proteínas 3-nitrotirosina modificado 14 y de cisteína que contiene péptidos con S-nitrosilación (oxcyscPILOT) 23. También hemos desarrollado un aminoácido enfoque selectivo, cPILOT cisteína (cyscPILOT) 17. MS 3 adquisición con una parte superior de iones de 11 o selectiva-y 1 -ion método 15 puede ayudar a reducir la interferencia de iones reportero y mejorar la precisión cuantitativa de cPILOT. El uso de MS 3 en el método de adquisición requiere un instrumento de alta resolución con un analizador de masas orbitrap aunque de baja resolución instrumentos trampa de iones también pueden trabajar 24.

Anteriormente, cPILOT se ha utilizado para estudiar las proteínas hepáticas 16 de modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer. A continuación, describimos cómo realizar análisis global cPILOT utilizando el cerebro, el corazón y el hígado homogeneizado para estudiar el papel de la peripheria en la enfermedad de Alzheimer. Este experimento incorpora replicación biológica. Debido a la versatilidad de cPILOT, los usuarios interesados ​​pueden utilizar la técnica para estudiar otros tejidos para una serie de problemas y sistemas biológicos.

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Protocol

Ética declaración: Los ratones fueron adquiridos de una institución independiente de investigación biomédica, sin ánimo de lucro y alojados en la División de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad de Pittsburgh. Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Pittsburgh.

1. extracción de proteínas y la generación de péptidos de Química-etiquetado

  1. Extracto de proteína a partir de tejido, células, o fluidos corporales.
    1. Homogeneizar 60-90 mg de tejido (por ejemplo cerebro, el corazón y el hígado) en solución salina tampón fosfato (1x PBS) con urea 8 M (500 l) usando un homogeneizador mecánico. Los inhibidores de proteasa o fosfatasa pueden ser añadidos a la memoria intermedia si es necesario. En este proyecto, que no estaban acostumbrados. Usa los siguientes parámetros para el homogeneizador: la lisis de perlas de una matriz, 4 m / s, 20 s. tejido del corazón puede requerir hasta 9 ciclos de homogeneización.
      NOTA: proteasa o inhibidor de la fosfatasa s puede añadirse a la memoria intermedia si es necesario. No se utilizaron en este estudio.
      1. Eliminar homogeneizado de tejido desde el tubo de lisis y transferir a un tubo de microcentrífuga. Enjuague lisis de tubos con 100-500 l de PBS con 8 M urea y combinar la solución de enjuague con homogeneizado de tejido.
    2. Centrifugar los tejidos homogeneizados (9447 xg, 4 ° C, 15 min) y recoger el sobrenadante.
  2. Determinar la concentración de proteína usando un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) según las instrucciones del fabricante.
    NOTA: La dilución adicional con tampón puede ser necesario si la concentración de proteína es demasiado alto. Las concentraciones resultantes para las muestras de estos tejidos estaban en entre 6-13 g / l.
    1. Opcional: Añadir un estándar de control de calidad interno (por ejemplo, caseína alfa bovina u otra proteína exógena) con el estándar g relación de 1: 100 g de muestra de proteína.
jove_title "> 2. La digestión de la muestra

  1. Añadir 100 g (100 x 10 -6 g) de proteína de cada muestra a etiquetados individualmente tubos de microcentrífuga. El volumen es dependiente de la concentración de proteína (véase el paso 1.2).
  2. Añadir ditiotreitol (DTT) (40: 1 reactivo a la muestra relación mol) a cada muestra. Incubar a 37 ° C durante 2 h. El cálculo para la relación molar está basada en la masa de la proteína de la albúmina de suero bovino (BSA), que es 66,5 x 10 3 g / mol.
  3. Añadir yodoacetamida (IAM) (80: 1 reactivo a la muestra relación mol) a cada muestra. Incubar en hielo en la oscuridad durante 2 h. Esta reacción se lleva a cabo en hielo durante 2 h para evitar reacciones secundarias.
  4. Añadir L-cisteína (40: 1 reactivo a la muestra relación mol) a cada muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
  5. Añadir tampón Tris 20 mM con 10 mM CaCl 2 (pH 8,2) para diluir la urea a una concentración final de 2 M.
  6. Añadir L-1-tosilamido-2 feniletil clorometil cetona (TPCK) tratado con tripsina (50: 1 de sustrato a la enzima relación mol) a cada muestra y se incuba a 37 ° C durante 24 h.
  7. Se detuvo la digestión de la proteína por el flash de congelación de la muestra en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su posterior procesamiento.

La desalación 3. Muestra

  1. Re-acidificar las muestras mediante la adición de ácido fórmico (FA). Añadir suficiente FA para obtener una concentración final de 0,1%. Si las muestras son inicialmente a -80 ° C, descongelar las muestras en hielo antes de volver a la acidificación.
  2. De-sal los péptidos utilizando C 18 hidrófilo lipófilo equilibrada (HLB) cartuchos de 10 mg como se ha descrito previamente 16.
  3. Secar las muestras por centrifugación al vacío (5 Torr, 45 ° C, 77 xg) hasta un volumen de ~ 10 l.

4. dimetilación Etiquetado (N-terminales)

  1. Reconstituir péptidos en ácido acético al 1% (0,25 g /? L) disuelto en cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o agua de calidad de nano-puro. Retirar un 50 μ; Porción g a un nuevo tubo de microcentrífuga (1,5 ml) y almacenar el resto a -80 ° C.
  2. Añadir 8 l de 60 mM (4%) CH 2 O (37% p / v) o 60 mM (4%) 13 CD 2 O (20% p / v) a las muestras para el etiquetado con luz o dimetilación pesada, respectivamente . Típicamente, 4 l de reactivo se añade por cada 25 g de péptidos (Pasos 4.2, 4.3, 4.6).
  3. Añadir 8 l de 24 mM NaBH3CN o 24 mM BDAN 3 CN a las muestras marcadas con luz o dimetilación pesada, respectivamente.
  4. Vortex y agitar en un agitador de tubo para ~ 10 min a temperatura ambiente.
  5. Se inactiva las reacciones mediante la adición de 16 l de 1% de amoniaco (~ / v 28-30% v) durante 5 min. Típicamente, 8 l de reactivo se añaden por 25 g de péptidos.
  6. (V / 98% v). Re-acidificar las mezclas de reacción mediante la adición de 8 l de 5% FA
  7. Combinar la luz y péptidos dimetilados pesados (Figura 1) para generar un total de seis muestras. Ver Tabla 1
  8. Realizar desalado de la muestra de acuerdo a los pasos 3.2 y 3.3.

5. isobárico Tagging (residuos de Lys)

  1. Reconstituir 100 g de péptidos dimetilados (1 g / l) en 100 mM de bicarbonato de amonio tri-acetato de tampón (TEAB) (pH ~ 8,5).
  2. Preparar los reactivos isobáricas como se indica en el protocolo del fabricante (véase la Tabla de Materiales / Reactivos).
  3. Añadir reactivos isobáricas solubilizadas (41 L) a péptidos y de vórtice durante ~ 10 s. Agitar las muestras en un agitador de tubo de microcentrífuga durante ~ 1 h. Se inactiva la reacción con 8 hidroxilamina l (10% w / v) e incubar las muestras durante 15 min a temperatura ambiente.
  4. Reunir las seis muestras marcadas en una sola mezcla y desalt (pasos 3.1 a 3.3) o se almacena a -80 ° C hasta su uso posterior.
    NOTA: Para mejorar la cobertura proteoma y profundidad, se sugiere una estrategia de separación multidimensionaltales de intercambio catiónico como fuerte (SCX).

6. intercambio catiónico fuerte

  1. Realizar SCX según el protocolo del fabricante (ver Tabla de Materiales).
    1. Preparar ~ 1 ml de las soluciones de formiato de amonio (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, y 500 mM) con 10% de acetonitrilo (ACN), 0,1% FA (pH 3).
    2. Retire la tapa roja de la parte superior de la punta de pipeta y toque la punta de pipeta con el embalaje de suspensión para asegurar que el material de embalaje es hacia la parte inferior de la punta de pipeta.
      NOTA: Crítica: No tire la punta de la pipeta hasta el final del protocolo.
    3. Coloque el adaptador de centrífuga en la parte superior de un tubo de microcentrífuga (2 ml) y asegurar la punta de la pipeta en el interior.
    4. Añadir 150! L de tampón de reconstitución SCX para puntas de pipeta.
    5. Centrifugar las puntas de pipeta para 6 min a temperatura ambiente (4000 xg). Repita este paso dos veces más y desechar los residuos.
    6. Disolver el peptides en 150 l de tampón de reconstitución SCX. Asegúrese de que el pH es 3.
    7. Añadir péptidos a las puntas de pipeta, se centrifuga (véase 6.1.5), y mantener el eluyente.
    8. Transferir el filtro y la pipeta a un nuevo tubo de microcentrífuga (2 ml) y añadir 150 l de solución de formiato de amonio 20 mM. Centrifugar durante 6 min a temperatura ambiente (4000 xg) y mantener el eluyente.
    9. Repita el paso 6.1.8 un adicional de siete veces, utilizando concentraciones sucesivas (es decir, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM y 500 mM) de formiato de amonio.
  2. Transferencia de las ocho fracciones de SCX a tubos de microcentrífuga (1,5 ml) y concentrar a ellos mediante evaporación centrífuga (véase el paso 3.3).

7. Cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS) y MS 3

  1. Reconstituir los péptidos en agua masa grado espectrometría con 0,1% FA, filtrar y colocar en un vial de auto-muestreador. péptidos de filtro como SSOWS:
    1. Añadir péptidos reconstituidas a un tubo de microcentrífuga que contiene un filtro de 0,65 m (ver Tabla de Materiales).
    2. péptidos Centrifugar a 12.000 xg durante 1 min. Retirar filtro, desechar, y añadir péptidos filtrados en un vial de auto-muestreador.
  2. Preparar las memorias intermedias de la fase móvil de la siguiente manera: 3% (v / v) de ACN con 0,1% de FA (A) y 100% de ACN con 0,1% de FA (B).
  3. Inyectar 6 l de cada muestra de fracción en una columna SCX trampa empaquetada a 2 cm con el material de C 18 (5! M, 200 Å de tamaño de poro).
    NOTA: la limpieza de la muestra en la trampa es el siguiente: 3 min, 0% de B; 3 l / min usando un sistema de cromatografía líquida 2D (ver Tabla de Materiales).
  4. Ejecutar el método de separación analítica. Utilice una columna 75 m ID x 13,2 cm láser-tip tirado sílice fundida capilar lleno de C 18 de material (5! M, 100 Å). El gradiente es: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% de B; 40-90 min, 15-25% de B; 90-115 min, 25-30% de B; 115-130 min, 30-60% de B; 130-135 min, 60-80% de B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% de B; 150-180 min, 10% B; 300 nL / min, 180 min.
  5. Ejecutar la adquisición de datos para el espectrómetro de masas, mientras que el método de separación analítica se está ejecutando.
    NOTA: Los parámetros para la exploración encuesta EM son los siguientes: 400-1,600 m / z, 60000 resolución, control automático de ganancia (AGC) Objetivo 1 x 10 6 iones, tiempo de inyección máxima de 500 ms. Parámetros para CID-MS / MS son los siguientes: Top 1-7 o la adquisición dependiente de datos Top 8-14 (DDA), 3 m / anchura z aislamiento, 500 de señal mínimo, 35% energía de colisión normalizada (NCE), 0,25 activación q , 10 ms de tiempo de activación, 3 x 10 4 AGC, 50 ms de tiempo de inyección máxima. Parámetros para HCD-MS 3 son los siguientes: 200 de señal mínimo, 4 m / z anchura aislamiento, 60% NCE, tiempo de 0,1 activación, 3 x 10 5 AGC, 250 ms de TI, 300-1,300 m / z rango de selección MS / MS , excluir ion primario no-fragmentada.
  6. NOTA: Para las muestras se ejecutan en un modelo más nuevo de un instrumento que contiene una orbitrap o un espectrómetro de masas trihíbrido, los parámetros de DDA pueden variar y pueden ser optimizados para incluir más MS / MS y MS 3 exploraciones. Además, para los instrumentos trihíbrido, selección precursor síncrona (SPS) -MS deben emplearse 3.

8. Análisis de Datos 16

  1. Buscar en los archivos RAW usando software de análisis de proteína frente a una base de datos adecuada, tal como un ratón Uniprot.
    NOTA: Es importante crear dos flujos de trabajo para cada archivo RAW con el fin de buscar la luz y péptidos dimetilados pesados.
  2. Busca los archivos RAW utilizando los siguientes parámetros: la tripsina con dos divisiones perdidas, rango de masas péptido 300-6,000 Da, 15 ppm padre tolerancia de masa, 1 Da tolerancia fragmentación. modificaciones estáticas: dimetilación de luz (28,031, péptido N-terminal) o hdimetilación eavy (36.076 Da, péptido N-terminal), Carbamidomethyl (57.021 Da, C).
    NOTA: A veces el pico dimethylated pesado es ~ 7 Da (35.069 Da, péptido N-terminal) es desde el pico de la luz dimetilada y por lo tanto se debe incorporar en el flujo de trabajo búsqueda de péptidos dimetilados pesados. modificaciones dinámicas: oxidación (15.995 Da, M), etiqueta isobárica 6-plex (229.163 Da, K). Incluyen una búsqueda de base de datos de señuelo para producir tasas de falso descubrimiento (por ejemplo 1 y 5%) y un nodo de cuantificación para buscar las intensidades de iones informadores de etiquetas isobáricas.
  3. Estadística
    1. Exportación de datos en un programa de hoja de cálculo electrónica el fin de normalizar los valores de iones reportero proteína. Para cada proteína, dividir cualquiera de los ratios de iones informadores mediana o intensidades de iones informadores prima por la relación de la mediana de la norma interna o intensidades de iones reportero primas del patrón interno, respectivamente. Utilice el software estadístico apropiado, tal como un programa de hoja de cálculo electrónica, PersEUS, o R para determinar cambios significativos entre condiciones de la muestra.

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Representative Results

cPILOT utiliza la química basado en amina a químicamente péptidos de la etiqueta en el extremo N-terminal y los residuos de lisina y mejora las capacidades de multiplexado de la muestra. La Figura 2 muestra los datos de MS representante que se obtiene a partir de un análisis cPILOT 12-plex de cerebro, el corazón y los tejidos del hígado de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer. Como se muestra en la Tabla 1, dos réplicas biológicas para los ratones de la enfermedad y de tipo salvaje de Alzheimer se incluyen en este análisis 12-plex. La figura 2A muestra un par de pico cargada doblemente que está separado por m / z espaciamiento de 4 indica un único grupo de dimetilo fue incorporada en el péptido. Tanto la luz y picos dimetilados pesados ​​en este par son independientemente aislada y fragmentada con CID. Los datos MS / MS para cada uno de los péptidos dimetilados se muestran en las Figuras 2B y C. Resultados de la búsqueda indican que este pair de los picos pertenece a la T (dimetil) ELNYFAK (isobárica-tag 6) péptido de la fosfoglicerato proteína quinasa 1. El ión fragmento más intenso es y 3+ que es similar tanto para la luz y picos dimetilados pesados. Estos picos se aíslan más lejos para HCD-MS 3 y se observan los iones informadores (m / z 126-131) como se muestra en las Figuras 2D y 2E. Ambos conjuntos de MS 3 espectros son necesarios para obtener información sobre las 12 muestras. En este ejemplo, las proporciones de iones reportero (AD / WT) (control de la enfermedad / de tipo salvaje de Alzheimer) para el cerebro, el hígado y los tejidos del corazón son similares a través de las dos réplicas biológicas. Los valores de veces de cambio para cada comparación sugieren que fosfoglicerato quinasa 1 los niveles en el cerebro y el corazón son más altas en los ratones de AD, mientras que en el hígado de los niveles son más bajos.

Figura 1
Figure 1: Proteómica flujo de trabajo utilizando cPILOT. Como un ejemplo, este flujo de trabajo describe el análisis de 12 muestras individuales. Las proteínas de los tejidos, células o fluidos corporales se extraen y se añade un patrón de proteína adecuado (por ejemplo bovina alfa-caseína). Las proteínas se digirieron utilizando tripsina. Los péptidos se etiquetan en el extremo N-terminal mediante el uso de luz o dimetilación pesada (pH ~ 2,5) y en los residuos de lisina mediante el uso de TMT 6 -plex (pH ~ 8,5). Péptidos marcados se combinaron en una sola mezcla y sujeto a SCX RP-LC-MS / MS y MS 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Datos de Ejemplo cPILOT de péptidos a partir de cerebro, el corazón y los tejidos del hígado de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer. (A) muestra ligeras y pesadas péptidos dimetilados, representados por los picos a m / z 643,854 y 647,875. Se seleccionaron estos péptidos, aislado, y fragmentado, generando así CID-espectros MS / MS (B y C), que proporcionó la identificación de péptidos. Un adicional de selección, el aislamiento, y la fragmentación del ión más intenso fragmento de la luz y péptidos dimetilados pesados en la etapa de MS / MS generado HCD-MS 3 espectros (D y E), respectivamente. La secuencia del péptido es T (dimetil) ELNYFAK (isobárica-tag 6) y pertenece a la fosfoglicerato quinasa 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reactivo isobárica0;
126 127 128 129 130 131
dimetilaci luz WT una AD b WT ANUNCIO WT ANUNCIO
cerebro corazón hígado
dimetilaci pesada WT ANUNCIO WT ANUNCIO WT ANUNCIO
corazón hígado cerebro
El tejido es ya sea desde un un control de tipo salvaje (WT) o el ratón de la enfermedad (AD) b de Alzheimer.

Tabla 1: agrupación cPILOT de AD y cerebro de WT, el corazón y los tejidos del hígado.

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Discussion

cPILOT permite la medición simultánea de más de 12 muestras únicas. A fin de garantizar el etiquetado exitosa tanto en el N-terminal y lisina residuos de péptidos, es imperativo para que el pH correcto para cada conjunto de reacciones y para llevar a cabo la reacción dimetilación primero para el etiquetado del péptido. dimetilación selectiva en el extremo N-terminal se realiza por tener un pH a ~ 2,5 (± 0,2). Esto se consigue mediante la explotación de las diferencias de los valores de pKa de los grupos amino en la lisina y la N-terminal. A pH 2,5, la lisina es inactivo (pKa ~ 10,5); sin embargo, si el pH es ligeramente ácido (es decir, pH 5-7) o básico, se dimetilado tanto el N-terminales y los residuos de lisina. Además, si el etiquetado isobárico se realiza primero a un pH bajo, la N-terminales tendrá la etiqueta y lisina residuos isobáricas se dimetilado. Esto puede resultar en menos fragmentos de ser seleccionado para MS 3 como tendrían que ser seleccionado iones b. Los costos relativos de la dimetilreacciones ación son de bajo costo en comparación con los reactivos isobáricas comerciales. Si bien se puede utilizar todo un vial de reactivo isobárica por 100 g, también hemos tenido éxito en el uso medio del vial reactivo por 100 g con etiquetado de eficiencia comparable. Esto ayuda a reducir significativamente los costos de los experimentos cPILOT individuales y permite más muestras para ser analizadas. También es importante señalar que otros reactivos de marcado isobáricas se pueden utilizar en lugar del reactivo isobárica utilizado en este protocolo ya que previamente han demostrado 14. Para garantizar una alta eficiencia de marcaje y etiquetado, es importante añadir reactivos a las muestras rápidamente. Esto permitirá que para las muestras que tengan aproximadamente el mismo tiempo de reacción. Para fines cuantitativos, cada muestra debe ser tratada idénticamente especialmente antes de la puesta en común de muestras a la dimetilación y pasos de etiquetado isobáricas. Por último, cabe señalar que el trabajo con muchas muestras simultáneamente en los pasos iniciales RequirES habilidad de los usuarios cuidado y atención al Tratamiento de Muestras.

El escenario más ideal es la obtención de los iones informadores para cada proteína en la mezcla a través de las 12 muestras. Sin embargo, este no es el caso para un gran número de proteínas. El número de péptidos detectados con la información de cuantificación para el cPILOT y otra multiplexación mejorada acercarse depende de varios factores, incluyendo el tipo de muestra, el fraccionamiento de la muestra y etapas de procesamiento, los métodos de adquisición de datos de MS, y el tipo de instrumento. Aunque tanto dimetilación y pasos de marcado isobáricas tienen una alta eficiencia de marcaje del péptido de ~ 95-99%, todavía hay ~ 20% de los datos MS 3 que no contendrá informaciones ion reportero. Esto es debido en parte a la utilización de tripsina que genera péptidos de arginina-terminado que resultan en no incorporación de reactivo isobárica. Esto se puede resolver utilizando otras enzimas, tales como LysC, con una solución de compromiso potencial en la identificación de proteínas 25. También para pesadapéptidos dimetilados, el pico seleccionado para la fragmentación pueden ser la M o M-1 pico, que tienen diferentes intensidades y afectará a las intensidades de iones informadores observadas en la etapa de MS 3. Así, puede haber algunos iones bajas reportero intensidad que no son detectados para algunas muestras. Tales situaciones se observan a menudo comúnmente para baja intensidad fragmentos de MS / MS que se aíslan para MS 3 pasos. Una gran solución a este problema se ha incorporado en los espectrómetros de masas trihíbrido, que, en lugar de utilizar la selección de una sola muesca para MS 3, utilizan multi-muesca o múltiples MS / MS fragmenta 26.

Hay una gran cantidad de versatilidad en el enfoque cPILOT especialmente con respecto a la cantidad de muestras que puede ser comparado en un solo análisis (es decir, hasta 20 con reactivos isobáricas comerciales) y los tipos de tejidos utilizados. Hemos demostrado que es fácil de obtener información cuantitativa precisa del cerebro, el corazón, ytejidos de hígado en el mismo análisis en el contexto de una enfermedad. Este método, de manera similar a otros métodos de multiplexación, permite el análisis de múltiples muestras a la vez, y es aplicable a las muestras procedentes de células, tejidos, fluidos corporales, u organismos enteros. Además, cPILOT péptidos marcados son capaces de ser analizados usando ya sea una baja resolución 24 o alto (60000) instrumento. En comparación, la obtención de la medición con éxito utilizando otros métodos de multiplexación puede estar limitada a un tipo específico de muestra (es decir, células) 18, pueden requerir un instrumento con muy alta resolución 20, o el acceso a las etiquetas de isótopos estables. cPILOT es ideal para los usuarios interesados ​​en la comprensión de la enfermedad, el descubrimiento de biomarcadores, como respuesta a un fármaco o intervención terapéutica, o los cambios longitudinales a través de muchos puntos de tiempo. Por otra parte, para las grandes proteómica escopeta análisis de muestras clínicas (donde N es grande, cientos de miles), CPILOT también pueden ser adecuados para ayudar a reducir los costos y el tiempo de experimentación. En el futuro, cPILOT se ampliará para multiplexar un número mayor de muestras utilizando isotópica existente y novedoso y etiquetas isobáricas.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses en competencia.

Acknowledgments

Los autores reconocen la Universidad de Pittsburgh fondos iniciales y los NIH, NIGMS subvención R01 (GM 117191-01) a RASR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Water - MS Grade Fisher Scientific W6-4 4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade Fisher Scientific A955-4 4 L quantity is not necessary
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) Sigma Aldrich 320145-500ML
Ammonium formate Acros Organics 208-753-9
Formic Acid Fluka Analytical 94318-250ML-F
BCA protein assay kit Pierce Thermo Fisher Scientific 23227
Urea Biorad 161-0731
Tris Biorad 161-0716
Dithiothreiotol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Iodoacetamide (IAM) Acros Organics 144-48-9
L-Cysteine Sigma Aldrich, Chemistry 168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich, Life Science T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O Sigma Aldrich, Life Science F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C Sigma Aldrich, Chemistry 596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% Sigma Aldrich 156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP Sigma Aldrich, Chemistry 190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit Protea BioSciences SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer Sigma Aldrich, Life Science T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) Thermo Fisher Scientific 90061
Hydroxylamine hydrochloride Sigma Aldrich, Chemistry 255580-100G
Standard vortex mixer Fisher Scientific 2215365 any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges Waters 186000383 These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model Sigma Aldrich 57265 A 12 port model is also sufficient
Speed-vac Thermo Scientific SPD1010 any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber Thermo Scientific 2825/2826 Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) MP Biomedicals 116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler Sciex - This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer Thermo Scientific - This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) Thermo Scientific IQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balance Mettler Toledo AL54
Stir plate VWR 12365-382 Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable) Fisher Scientific (Accumet) 13-620-183 Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer Fisher Scientific 06-664-261 Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer Fisher Scientific 06-664-260 Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-129 Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 04-408-120 Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units EMD Millipore UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units Thermo Scientific 69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å) Bruker PM5/61100/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å) Bruker PM5/61200/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient

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References

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