Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

Biochemistry

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Summary

Kombinierte Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT) ist eine quantitative Proteomik-Strategie, die Probe Multiplexierungsfähigkeiten von isobar-Tags verbessert. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von cPILOT an Gewebe von einer Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen der Alzheimer.

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King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (123), e55406, doi:10.3791/55406 (2017).

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Abstract

Es gibt eine steigende Nachfrage viele biologischen Proben für die Krankheit Verständnis und zur Entdeckung von Biomarkern zu analysieren. Quantitative Proteomik-Strategien, die gleichzeitige Messung mehrerer Proben ermöglichen haben sie weit verbreitet und stark experimentell Kosten und -zeiten reduzieren. Unser Labor entwickelt eine Technik namens kombiniert Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT), die Ansätze Probe Multiplexen der traditionellen Isotopenmarkierung oder isobar Tagging verbessert. Globale cPILOT können auf Proben angewendet werden, die von Zellen stammen, Gewebe, Körperflüssigkeiten oder ganze Organismen und gibt Informationen über relative Proteinhäufigkeiten in verschiedenen Probenbedingungen. cPILOT arbeitet durch 1) Puffer mit niedrigeren pH Bedingungen unter Verwendung von Bedingungen , um selektiv dimethylate Peptid N-Termini und 2) mit hohem pH - Puffer mit im Handel erhältlichen Reagenzien isobaren primäre Amine der Lysinreste zu kennzeichnen (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien). Der Grad derProbe Multiplexen verfügbar ist abhängig von der Anzahl von Vorläufern Etikett verwendet, und das isobare Markierungsreagens. Hier stellen wir eine 12-Plex-Analyse unter Verwendung von leichten und schweren Dimethylierung kombiniert mit sechs-plex isobaren Reagenzien 12 Proben von Geweben der Maus in einer einzigen Analyse zu analysieren. Verbessern Multiplexen ist hilfreich zur Reduzierung experimentelle Zeit und Kosten, und was noch wichtiger ist, so dass in vielen Vergleichsprobenbedingungen (biologische Replikaten, Krankheitsstadium, medikamentöse Behandlung, Genotypen oder longitudinale Zeitpunkt) mit weniger experimentellen Bias und Irrtum. In dieser Arbeit wird der globale cPILOT Ansatz zur Analyse Gehirn, Herzen und Lebergewebe durch biologische Replikate von einer Alzheimer-Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen. Globale cPILOT können andere biologische Prozesse angewandt werden, studieren und angepasst Probe Multiplexen von mehr als 20 Proben zu erhöhen.

Introduction

Proteomik beinhaltet oft die Analyse vielen Proben verwendet, um einen besseren Krankheitsprozess, Enzymkinetik, post-translationale Modifikationen, Reaktion auf Umweltreize, als Reaktion auf therapeutische Behandlungen, die Entdeckung neuer Biomarker oder Drogen Mechanismen zu verstehen. Quantitative Methoden können relative Unterschiede in Proteinspiegeln über die Proben zu messen, können verwendet werden, und markierungsfreie oder beinhalten Isotopenmarkierung (metabolic, chemische oder enzymatisch) werden. Stabilisotopenmarkierungsverfahren haben in der Popularität gewachsen, weil sie viele Proben erlauben gleichzeitig analysiert werden und eignen sich für Proben aus verschiedenen Zellen, Geweben, Körperflüssigkeiten oder ganzen Organismen. Isotopen - Markierungsverfahren 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Anstieg experimenteller Durchsatz,bei gleichzeitiger Reduzierung Erfassungszeit, Kosten und experimentelle Fehler. Diese Verfahren verwenden Vorläufermassenspektren relative Häufigkeiten von Proteinen aus Peptidpeaks zu messen. Im Gegensatz dazu isobaren Markierungsreagenzien 8, 9, 10 erzeugen Reporter - Ionen, die detektiert werden , entweder in MS / MS oder MS 3 11 Spektren und diese Peaks werden verwendet , auf dem relativen Abundanzen von Proteinen zu melden.

Die aktuelle Zustand-of-the-art in der Proteomik Multiplexen ist entweder eine 10-plex 12 oder 12-plex isobaren tag Analyse 13. Verbesserte Proben Multiplexing (dh> 10 Proben) Methoden wurden von unserem Labor für Gewebe 14 entwickelt, 15, 16, 17 und von anderen für die Analyse von Zellen 18 sup>, 19, 20, Geweben 21 oder 22 gezielt Peptide. Wir entwickelten eine verbesserte Multiplex-Technik kombiniert Vorläufer Isotopenmarkierung mit isobar Tagging genannt (cPILOT). Globale cPILOT ist nützlich , um Informationen über die relativen Konzentrationen aller Proteine in den verschiedenen Probenbedingungen (≥12) 14. Abbildung 1 zeigt einen allgemeinen cPILOT Workflow. Tryptic oder Lys-C - Peptide am N-Terminus mit Dimethylierung unter Verwendung von niedrigem pH - Wert bei 2 und Lysinresten mit 6-Plex - Reagenzien unter Verwendung von hohem pH - Wert selektiv markiert. Diese Strategie verdoppelt die Anzahl der Proben, die mit isobar Reagenzien analysiert werden können, die Versuchskosten und zusätzlich zu reduzieren hilft, reduziert experimentelle Schritte und Zeit.

cPILOT ist flexibel, wie wir andere Methoden entwickelt haben oxidative post-translationale modi zu studierenfikationen, einschließlich 3-Nitrotyrosin-modifizierte Proteine 14 und Cystein enthaltenden Peptiden mit S-Nitrosylierung (oxcyscPILOT) 23. Wir haben auch eine Aminosäure-selektiven Ansatz, Cystein cPILOT (cyscPILOT) 17 entwickelt. MS 3 Erwerb mit einem Top-Ionen 11 oder selektiv-y 1 -Ion Verfahren 15 kann Reporter Ionen Interferenz reduzieren und quantitative Genauigkeit der cPILOT verbessern. Die Verwendung von MS 3 in dem Erfassungsverfahren erfordert ein hochauflösendes Gerät mit einem Orbitrap - Massenanalysator obwohl niedrige Auflösung lonenfalle Instrumente auch 24 arbeiten können.

Zuvor hat cPILOT verwendet Leberproteine 16 von einer Alzheimer-Krankheit Mausmodell zu untersuchen. Hier beschreiben wir, wie die globale cPILOT Analyse unter Verwendung von Gehirn, Herz durchzuführen, und Leberhomogenisaten die Rolle des periphe zu studierenry in der Alzheimer-Krankheit. Dieses Experiment beinhaltet biologische Replikation. Aufgrund der Vielseitigkeit von cPILOT können interessierte Benutzer die Technik verwenden, um andere Gewebe für eine Reihe von biologischen Problemen und Systemen zu untersuchen.

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Protocol

Ethik-Statement: Die Mäuse wurden an der Universität von Pittsburgh von einer unabhängigen, gemeinnützigen Einrichtung der biomedizinischen Forschung und beherbergten in der Abteilung für Labortier Ressourcen erworben hat. Alle Tierprotokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Pittsburgh genehmigt.

1. Proteinextraktion und Erzeugung von Peptiden für Chemisch-Tagging

  1. Extraktprotein aus Geweben, Zellen oder Körperflüssigkeiten.
    1. Homogenisiert 60-90 mg Gewebe (zB Gehirn, Herz und Leber) in Phosphatpuffer - Salzlösung (1x PBS) mit 8 M Harnstoff (500 & mgr; l) unter Verwendung eines mechanischen Homogenisators. Protease oder Phosphatase-Inhibitoren können in den Puffer, wenn notwendig, hinzugefügt werden. In diesem Projekt wurden sie nicht verwendet. Verwenden Sie die folgenden Parameter für den Homogenisator: Lysismatrix A-Kügelchen, 4 m / s, 20 s. Herzgewebe kann bis zu 9 Zyklen der Homogenisierung erfordern.
      HINWEIS: Protease oder Phosphatasehemmer s kann den Puffer bei Bedarf hinzugefügt werden. Sie wurden in dieser Studie nicht verwendet.
      1. Entfernen Gewebshomogenisat aus dem Lysieren Rohr und Transfer in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Spülrohre mit 100-500 ul PBS mit 8 M Harnstoff und kombiniert, um die Spüllösung mit Gewebehomogenat lysieren.
    2. Zentrifugieren der homogenisierten Gewebe (9.447 xg, 4 ° C, 15 min) und sammle den Überstand.
  2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration eine Bicinchoninsäure (BCA) -Assay nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird .
    HINWEIS: Eine weitere Verdünnung mit Puffer notwendig sein kann, wenn die Proteinkonzentration zu hoch ist. Die resultierenden Konzentrationen für Proben aus diesen Geweben waren zwischen 6-13 ug / ul.
    1. Optional: Fügen Sie eine interne Qualitätskontrolle Standard (zB Rinder-Alpha - Casein oder andere exogene Protein) mit dem Verhältnis 1 & mgr; g - Standard: 100 ug Proteinprobe.
jove_title "> 2. Probenaufschluss

  1. Füge 100 & mgr; g (100 x 10 -6 g) Protein aus jeder Probe einzeln Mikrozentrifugenröhrchen bezeichnet. Das Volumen ist abhängig von der Proteinkonzentration (siehe Schritt 1.2).
  2. Hinzufügen Dithiothreitol (DTT) (40: 1 Molverhältnis Reagenz zu Probe) zu jeder Probe. Inkubieren bei 37 ° C für 2 h. Die Berechnung für das Molverhältnis von der Proteinmasse von Rinderserumalbumin (BSA) basiert, die 66,5 x 10 3 g / mol ist.
  3. Hinzufügen Iodacetamid (IAM) (80: 1 Molverhältnis Reagenz zu Probe) zu jeder Probe. Inkubieren auf Eis im Dunkeln für 2 Stunden. Diese Reaktion wird für 2 Stunden auf Eis durchgeführt, um Nebenreaktionen zu verhindern.
  4. Hinzufügen L-Cystein (40: 1 Molverhältnis Reagenz zu Probe) zu jeder Probe. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  5. Zugabe von 20 mM Tris - Puffer mit 10 mM CaCl 2 (pH 8,2) Harnstoff auf eine Endkonzentration von 2 M zu verdünnen
  6. Hinzufügen L-1-Tosylamido-2 phenylethyl-chlormethylketon (TPCK) -behandelten Trypsin (50: Substrat 1 mol-Verhältnis) zu jeder Probe und inkubiere für 24 h bei 37 ° C bis Enzym.
  7. Quenche die Proteinverdauung durch Flash-Gefrieren der Probe in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur Weiterverarbeitung.

3. Probe Entsalzung

  1. Re-säuert die Proben durch Zugabe von Ameisensäure (FA). Fügen Sie genug FA eine Endkonzentration von 0,1% zu erhalten. Wenn Proben ursprünglich bei -80 ° C sind, tauen Proben auf Eis vor dem erneuten Ansäuerung.
  2. De-Salz der Peptide C 18 hydrophilic lipophilic ausgewogen (HLB) 10 mg Kartuschen , wie zuvor unter Verwendung von 16 beschrieben.
  3. Trockne die Proben durch Vakuumzentrifugation (5 Torr, 45 ° C, 77 × g) auf ein Volumen von ~ 10 & mgr; l.

4. Dimethylierung Labeling (N-Termini)

  1. Rekonstituieren Peptide in 1% Essigsäure (0,25 ug / ul) in Hochleistungsflüssigkeitschromatographie aufgelöst (HPLC) oder Nano reiner Qualität Wasser. Entfernen Sie eine 50 μ; G-Teil in ein neues Röhrchen Mikrozentrifuge (1,5 ml), und den Rest bei -80 ° C lagern.
  2. Aus 8 ul 60 mM (4%) CH 2 O (37% wt / v) oder 60 mM (4%) , 13 CD 2 O (20% wt / v) zu den Proben zur Markierung mit leichter oder schwerer Dimethylierung bzw. . Typischerweise wird 4 & mgr; l Reagenz pro 25 ug Peptiden hinzugefügt (Schritte 4.2, 4.3, 4.6).
  3. Aus 8 & mgr; l 24 mM NaBH 3 CN oder 24 mM NaBD 3 CN zu den markierten Proben mit leichter oder schwerer Dimethylierung, respectively.
  4. Vortex und schütteln auf einem Rohr Schüttler für ~ 10 min bei Raumtemperatur.
  5. Quenche die Reaktion durch 16 ul 1% igem Ammoniak Zugabe (~ 28-30% v / v) für 5 min. Typischerweise wird, 8 & mgr; L Reagens pro 25 & mgr; g Peptide zugegeben.
  6. Re-säuert die Reaktionsgemische durch Zugabe von 8 & mgr; l von 5% FA (98% v / v).
  7. Kombinieren , um die leichten und schweren dimethyliert Peptide (Abbildung 1) insgesamt sechs Proben zu erzeugen. Siehe Tabelle 1
  8. Führen Probe Entsalzen gemäß den Schritten 3.2 und 3.3.

5. Isobare Tagging (Lys-Reste)

  1. Rekonstituieren 100 ug dimethyliert Peptide (1 ug / ul) in 100 mM tri-ethyl Ammoniumbicarbonat (TEAB) Puffer (pH ~ 8,5).
  2. Bereiten Sie isobar Reagenzien wie in dem Protokoll des Herstellers angegeben (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien).
  3. In solubilisierten isobar Reagenzien (41 ul) auf Peptide und Wirbel für ~ 10 s. Schütteln Sie die Proben auf einem Mikrozentrifugenröhrchen Schüttler für ~ 1 h. Quenche die Reaktion mit 8 ul Hydroxylamin (10% w / v) und inkubiere die Proben für 15 min bei Raumtemperatur.
  4. Pool mit sechs markierten Proben in einer einzigen Mischung und entsalzen (Schritte 3.1-3.3) oder bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
    HINWEIS: Proteom Abdeckung und Tiefe zu verbessern, eine mehrdimensionale Trennung Strategie wird vorgeschlagen,wie starker Kationenaustausch (SCX).

6. Starker Kationenaustausch

  1. Führen SCX gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialien Tabelle).
    1. Bereiten ~ 1 ml Ammoniumformiat-Lösungen (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, & 500 mM) mit 10% Acetonitril (ACN), 0,1% FA (pH 3).
    2. Entfernen Sie die rote Kappe vom oberen Ende der Pipettenspitze und anschließend auf die Pipettenspitze mit der Aufschlämmung verpacken, um sicherzustellen, dass das Verpackungsmaterial in Richtung der Unterseite der Pipettenspitze ist.
      HINWEIS: Kritisch: Werfen Sie nicht die Pipettenspitze bis zum Ende des Protokolls.
    3. Platzieren Sie den Zentrifugen Adapter auf der Oberseite eines Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL) und befestigen im Inneren der Pipettenspitze.
    4. In 150 ul SCX Rekonstitutionspuffers zu Pipettenspitzen.
    5. Zentrifugierte die Pipettenspitzen für 6 min bei Raumtemperatur (4,000 xg). Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal und entsorgen den Abfall.
    6. Man löst die peptides in 150 ul SCX Rekonstitutionspuffer. Sicherzustellen, dass der pH 3 ist.
    7. In Peptide an den Pipettenspitzen, Zentrifuge (siehe 6.1.5) und die Eluenten halten.
    8. Übertragen der Filter und Pipette in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen (2 ml) gelöst und 150 ul 20 mM Ammoniumformiat-Lösung. Zentrifuge 6 Minuten bei Raumtemperatur (4000 xg) und halten die Eluenten.
    9. Wiederholen Sie Schritt 6.1.8 sieben weitere Male unter Verwendung von aufeinander folgenden Konzentrationen (dh 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM und 500 mM) Ammoniumformiat.
  2. Überträgt die acht Fraktionen zu SCX Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) und engt sie durch zentrifugale Verdampfung (siehe Schritt 3.3).

7. Flüssigchromatographie-Tandem - Massenspektrometrie (LC-MS / MS) und MS 3

  1. Rekonstituieren der Peptide in der Massenspektrometrie-Wasser mit 0,1% FA, Filter, aufnehmen und in einem Auto-sampler Phiole. Filter Peptide als Follows:
    1. Hinzufügen rekonstituiert Peptide zu einem Mikrozentrifugenröhrchen einen 0,65 um - Filter (siehe Materialien Table) enthält.
    2. Zentrifuge Peptide bei 12.000 × g für 1 min. Filter entfernen, verwerfen, und fügen gefiltert Peptide in einem Autosampler Fläschchen.
  2. Bereiten Sie die mobile Phase Puffer wie folgt: 3% (v / v) ACN mit 0,1% FA (A) und 100% ACN mit 0,1% FA (B).
  3. Einzuspritzen 6 ul jeder Fraktion SCX Probe auf eine Säule gepackte trap bis 2 cm mit C 18 - Material (5 um, 200 Å Porengröße).
    HINWEIS: Probenreinigung auf der Falle ist wie folgt: 3 min, 0% B; 3 & mgr; L / min ein 2D - Flüssigkeitschromatographie - System (siehe Materialien Tabelle).
  4. Führen Sie die analytischen Trennverfahren. Verwenden , um eine 75 um ID x 13,2 cm Laser ausgezogene Spitze Quarzglas - Kapillarsäule , gepackt mit C 18 - Material (5 um, 100 Å). Der Gradient: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% B; 40-90 min, 15-25% B; 90-115 min, 25-30% B; 115-130 min 30-60% B; 130-135 min 60-80% B; 135-145 min 80% B, 145-150 min 80-10% B; 150-180 min, 10% B; 300 Nl / min, 180 min.
  5. Führen Sie die Datenerfassung für das Massenspektrometer, während die analytischen Trennverfahren laufen.
    HINWEIS: Die Parameter für die Übersichtsabtastung MS sind wie folgt: 400-1,600 m / z, 60000 Auflösung, automatische Verstärkungsregelung (AGC) -Target 1 x 10 6 Ionen, die maximale Einspritzzeit 500 ms. Parameter für die CID-MS / MS wie folgt: Top 1-7 oder 8-14 Top datenabhängigem Erfassung (DDA), 3 m / z Isolationsbreite, 500 minimales Signal, 35% normalisierten Kollisionsenergie (NCE), 0,25 q Aktivierungs , 10 ms Aktivierungszeit, 3 x 10 4 AGC, 50 ms maximale Einspritzzeit. Parameter für die HCD-MS 3 sind wie folgt: 200 minimales Signal, 4 m / z Isolationsbreite, 60% NOA, 0,1 Aktivierungszeit, 3 x 10 5 AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z MS / MS Auswahllbereich ausschließen, un-fragmentierten Stammion.
  6. HINWEIS: Für die Proben auf ein neueres Modell eines Instruments führen eine Orbitrap oder eine tribrid Massenspektrometers enthält, DDA Parameter variiert und optimiert werden können , um mehr MS / MS und MS 3 Scans enthalten. Zusätzlich für tribrid Instrumente, Synchron Vorläufer Auswahl (SPS) -MS 3 eingesetzt werden soll.

8. Datenanalyse 16

  1. Suche die RAW-Dateien Protein-Analyse-Software gegen eine entsprechende Datenbank, wie Maus Uniprot.
    HINWEIS: Es ist wichtig, zwei Workflows für jede RAW-Datei, um für leichte und schwere dimethyliertem Peptiden suchen zu erstellen.
  2. Suche die RAW-Dateien mit den folgenden Parametern: Trypsin mit zwei verpassten cleavages, Peptidmassenbereich 300-6,000 Da, 15 ppm Muttermassentoleranz, Da 1 Fragmentierungstoleranz. Statische Änderungen: Licht Dimethylierung (28,031, Peptid-N-Terminus) oder HEavy Dimethylierung (36,076 Da, Peptid-N-Terminus), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
    Hinweis: Manchmal ist die schwere dimethyliertem Spitze ist ~ 7 Da (35,069 Da, Peptid N-Terminus) ist von der Licht dimethyliertem Spitze und sollte daher in das Such Workflow für schwere dimethyliertem Peptide eingebaut werden. Dynamische Änderungen: Oxidation (15,995 Da, M), 6-plex isobaren tag (229,163 Da, K). Fügen Sie eine Lockvogel - Datenbank suchen False Discovery Rate (zB 1 und 5%) und eine Quantifizierung Knoten für die Reporter Ionenintensitäten von isobar Tags suchen zu erhalten.
  3. Statistiken
    1. Export von Daten in ein elektronisches Tabellenkalkulationsprogramm, um Protein-Reporter-Ionenwerte zu normalisieren. Für jedes Protein, teilen entweder die mediane reporter Ionenverhältnisse oder rohe reporter Ionenintensitäten durch den Median-Verhältnis des internen Standards oder rohe reporter Ionenintensitäten des internen Standards, respectively. Verwenden Sie die entsprechende Statistik-Software wie zum Beispiel ein Tabellenkalkulationsprogramm, Perseus oder R zu signifikanten Veränderungen bei den Probenbedingungen zu bestimmen.

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Representative Results

cPILOT verwendet Aminbasis Chemie zu Label-Peptide am N-Terminus chemisch und Lysinreste und verbessert Probe Multiplexing-Funktionen. Abbildung 2 zeigt repräsentative MS - Daten , die von einem 12-plex cPILOT Analyse von Gehirn, Herz, Leber und Geweben von einer Alzheimer-Krankheit - Maus - Modell und Wildtyp - Kontrollen erhalten wird. Wie in Tabelle 1 gezeigt, zwei biologische Replikate für die Alzheimer-Krankheit und Wildtyp - Mäuse werden in dieser 12-plex Analyse einbezogen. 2A zeigt ein doppelt geladenes Peak - Paar , das durch m / z Abstand von 4 getrennt, um eine einzelnen Dimethylgruppe anzeigt , wurde in das Peptid eingebaut. Sowohl die leichte und schwere dimethyliertem Spitzen in diesem Paar unabhängig voneinander isoliert und fragmentiert mit CID. Die MS / MS - Daten für jede der dimethyliert Peptide ist in den Figuren 2B und C gezeigt ist . Suchergebnisse zeigen diese pair von Peaks gehört zur T (dimethyl) ELNYFAK (isobare-tag 6) Peptid des Proteins Phosphoglyceratkinase 1. Die intensivste Fragmention ist y 3+ , die für ähnlich ist , sowohl den leichten und schweren dimethylierten Spitzen. Diese Peaks werden getrennt weiter für HCD-MS 3 und die Reporter - Ionen (m / z 126-131) beobachtet , wie in den 2D und 2E gezeigt. Beide Sätze von MS 3 Spektren notwendig sind , um Informationen über die 12 Proben zu erhalten. In diesem Beispiel ist die Reporterionenverhältnisse (AD / WT) (Alzheimer-Krankheit / Wild-Typ-Steuerung) für Gehirn, Leber, und Herzgewebe ähnlich in den beiden biologischen nachbildet. Die x-fache Veränderung Wert für jeden Vergleich lassen vermuten, dass Phosphoglyceratkinase 1-Spiegel im Gehirn und Herzen höher ist in AD Mäusen, während in der Leber die Werte niedriger sind.

Abbildung 1
Figure 1: Proteomics-Workflow mit cPILOT. Als Beispiel beschreibt dieser Workflow die Analyse von 12 Einzelproben. Proteine , die aus Geweben, Zellen oder Körperflüssigkeiten extrahiert werden und ein geeigneter Proteinstandard (zB bovines alpha-Casein) zugegeben. Die Proteine ​​werden verdaut unter Verwendung von Trypsin. Peptide am N-Terminus markiert durch leichte oder schwere Dimethylierung unter Verwendung von (pH ~ 2,5) und an Lysinresten von TMT Verwendung -plex 6 (pH ~ 8,5). Markierte Peptide werden in einem einzigen Gemisch vereinigt und unter SCX RP-LC-MS / MS und MS 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Beispiel cPILOT Daten von Peptiden , die aus Hirn, Herz, Leber und Geweben eines Krankheitsmausmodell und Wildtyp - Kontrollen Alzheimer. (A) zeigt leichte und schwere dimethyliert Peptide, die durch die Peaks bei m / z 643,854 und 647,875 dargestellt. Diese Peptide wurden ausgewählt, isoliert und fragmentiert, so dass Erzeugung CID-MS / MS - Spektren (B und C), die Peptid - Identifikation versehen. Eine zusätzliche Auswahl, Isolation und Fragmentierung des intensivsten Fragmention der leichten und schweren dimethylierten Peptide an der MS / MS - Stufe erzeugt HCD-MS - Spektren 3 (D und E), respectively. Die Peptidsequenz ist T (Dimethyl) ELNYFAK (isobar-Tag 6) und gehört zum Phosphoglyceratkinase 1. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

isobar Reagenz0;
126 127 128 129 130 131
Licht Dimethylierung WT ein AD b WT ANZEIGE WT ANZEIGE
Gehirn Herz Leber
schwere Dimethylierung WT ANZEIGE WT ANZEIGE WT ANZEIGE
Herz Leber Gehirn
Das Gewebe wird entweder von einem Wildtyp - Kontrolle (WT) einem oder Alzheimer-Krankheit Maus (AD) b.

Tabelle 1: cPILOT Gruppierung von AD und WT Gehirn, Herz und Leber - Gewebe.

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Discussion

cPILOT ermöglicht die gleichzeitige Messung von mehr als 12 einzigartigen Proben. Um bei erfolgreichen Tagging, um sicherzustellen, sowohl des N-Terminus und Lysinresten von Peptiden, ist es zwingend notwendig, den richtigen pH-Wert für jeden Satz von Reaktionen zu haben und die Dimethylierung Reaktion zunächst für die Peptidmarkierung durchzuführen. Selective Dimethylierung am N-Terminus wird durch einen pH-Wert bei etwa 2,5 (± 0,2) durchgeführt. Dies wird durch Ausnutzung der Unterschiede der pKa der Aminogruppen auf Lysin und dem N-Terminus erreicht. Bei pH 2,5, Lysin ist inaktiv (pKa ~ 10,5); Wenn jedoch der pH - Wert leicht sauer ist (dh pH 5-7) oder basische, sowohl die N-Termini und Lysinreste werden dimethyliert werden. Darüber hinaus, wenn isobaren Markierungs zuerst bei einem niedrigen pH-Wert durchgeführt wird, werden die N-Termini die isobare Etikett und Lysinreste dimethyliert werden. Dies kann in weniger Fragmente ergeben sich für MS 3 ausgewählt ist , als B-Ionen ausgewählt werden müssten. Die relativ Kosten der dimethylation Reaktionen sind preiswert im Vergleich zu dem kommerziellen isobar Reagenzien. Während man eine ganze isobar Reagenzabfüllung pro 100 ug verwenden kann, haben wir hatten auch Erfolg pro 100 ug mit Effizienz vergleichbar Kennzeichnung Hälfte des Reagenzabfüllung verwenden. Dies hilft, deutlich die Kosten für die einzelnen cPILOT Experimente zu reduzieren und ermöglicht es, Proben zu analysieren. Auch ist es wichtig , dass andere isobar Tagging Reagenzien zu beachten , können in diesem Protokoll verwendet anstelle des isobar Reagenz verwendet werden , wie wir zuvor 14 gezeigt. Um eine hohe Etikettier- und Kennzeichnungs Effizienz zu gewährleisten, ist es wichtig, Reagenzien zu Proben schnell hinzuzufügen. Dies ermöglicht für die Proben in etwa die gleiche Reaktionszeit haben. Für die quantitative Zwecke sollte jede Probe identisch insbesondere vor Proben Pooling in den Schritten Dimethylierung und isobaren Markierungs behandelt werden. Schließlich sei darauf hingewiesen, dass gleichzeitig mit vielen Proben arbeiten in den ersten Schritten requires vorsichtig Benutzer Geschick und Aufmerksamkeit Handhabung zu probieren.

Das ideale Szenario ist in der Mischung für die 12 Proben Reporter Ionen für jedes Protein zu erhalten. Dies ist jedoch nicht der Fall für eine große Anzahl von Proteinen. Die Anzahl von Peptiden mit Quantifizierungsinformationen für cPILOT und andere verbesserte Multiplexen detektiert Annäherung hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich Probentyp, Proben Fraktionierung und Verarbeitungsschritte, MS Datenerfassungsmethoden und Gerätetyp. Obwohl beide Dimethylierung und isobaren Markierungsschritte eine hohe Markierungseffizienz Peptid von ~ 95-99% haben, gibt es immer noch ~ 20% der Daten MS 3 , die nicht die Reporter - Ionen Informationen enthält. Dies ist teilweise Trypsin verwendet, die Arginin-terminierten Peptiden, die in keinem Einbau von isobaren Reagenz erzeugt führen. Dies kann mit anderen Enzymen gelöst werden, wie LysC, mit einem möglichen Kompromiss in Protein - Identifikationen 25. Auch für schweredimethyliertem Peptide, die Spitze für die Fragmentierung ausgewählt kann der M oder M-1 Spitze sein, die unterschiedlichen Intensitäten haben und die Reporter Ionenintensitäten beobachteten in der MS 3 Stufe beeinflussen. Daher kann es einige niedrige Intensität reporter Ionen sein, die nicht für einige Proben nachgewiesen werden. Solche Situationen werden häufig für niedrige Intensität MS / MS - Fragmente , die isoliert werden für MS 3 Stufen häufig beobachtet. Eine gute Lösung für dieses Problem ist in tribrid Massenspektrometern aufgenommen worden, die anstelle Single-notch - Auswahl für MS 3, multi-Kerbe oder mehrerer der Verwendung von MS verwenden / MS Fragmente 26.

Es gibt eine Menge an Vielseitigkeit in dem cPILOT Ansatz vor allem im Hinblick auf die Anzahl der Proben , die in einer einzigen Analyse verglichen werden können (dh bis zu 20 mit kommerzieller isobar Reagenzien) und den Arten von Geweben verwendet. Wir haben gezeigt, dass es einfach ist, eine genaue quantitative Informationen von Gehirn, Herz zu erhalten, undLebergewebe in der gleichen Analyse im Zusammenhang mit einer Krankheit. Diese Methode, die in ähnlicher Weise auf andere Multiplexverfahren, ermöglicht die Analyse von mehreren Proben auf einmal, und ist anwendbar auf Proben aus Zellen stammen, Geweben, Körperflüssigkeiten oder ganze Organismen. Darüber hinaus sind cPILOT markierte Peptide können entweder einen niedrigen oder 24 mit hoher Auflösung (60,000) Instrument analysiert werden. Im Vergleich zu erhalten erfolgreiche Messung anderen Multiplexverfahren verwendet , kann auf eine bestimmte Art der Probe ( das heißt Zellen) 18, begrenzt sein kann , ein Instrument mit sehr hoher Auflösung 20 oder den Zugang zu stabilen Isotopenmarker erforderlich. cPILOT ist ideal für Benutzer interessiert sich für Krankheit Verständnis, zur Entdeckung von Biomarkern, als Reaktion auf ein Medikament oder eine therapeutische Intervention oder Längenänderungen in vielen Zeitpunkten. Darüber hinaus für große Shotgun Proteomics Analysen von klinischen Proben (wobei N groß ist, Hunderte bis Tausende), cPILOT kann auch geeignet seine experimentell Kosten und Zeit zu reduzieren. In Zukunft wird cPILOT erweitert werden, um eine größere Anzahl von Proben unter Verwendung von bestehenden und neuen Isotopen und isobar Etikett multiplexen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen an der University of Pittsburgh-Startfonds und NIH, NIGMS R01 Zuschuss (GM 117191-01) zu RASR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Water - MS Grade Fisher Scientific W6-4 4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade Fisher Scientific A955-4 4 L quantity is not necessary
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) Sigma Aldrich 320145-500ML
Ammonium formate Acros Organics 208-753-9
Formic Acid Fluka Analytical 94318-250ML-F
BCA protein assay kit Pierce Thermo Fisher Scientific 23227
Urea Biorad 161-0731
Tris Biorad 161-0716
Dithiothreiotol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Iodoacetamide (IAM) Acros Organics 144-48-9
L-Cysteine Sigma Aldrich, Chemistry 168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich, Life Science T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O Sigma Aldrich, Life Science F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C Sigma Aldrich, Chemistry 596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% Sigma Aldrich 156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP Sigma Aldrich, Chemistry 190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit Protea BioSciences SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer Sigma Aldrich, Life Science T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) Thermo Fisher Scientific 90061
Hydroxylamine hydrochloride Sigma Aldrich, Chemistry 255580-100G
Standard vortex mixer Fisher Scientific 2215365 any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges Waters 186000383 These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model Sigma Aldrich 57265 A 12 port model is also sufficient
Speed-vac Thermo Scientific SPD1010 any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber Thermo Scientific 2825/2826 Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) MP Biomedicals 116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler Sciex - This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer Thermo Scientific - This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) Thermo Scientific IQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balance Mettler Toledo AL54
Stir plate VWR 12365-382 Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable) Fisher Scientific (Accumet) 13-620-183 Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer Fisher Scientific 06-664-261 Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer Fisher Scientific 06-664-260 Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-129 Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 04-408-120 Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units EMD Millipore UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units Thermo Scientific 69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å) Bruker PM5/61100/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å) Bruker PM5/61200/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient

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References

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