펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

Immunology and Infection

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Chen, C. W., Chang, C. Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J. Vis. Exp. (121), e55417, doi:10.3791/55417 (2017).

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Abstract

면역 시스템에 의해 항원 성 에피토프의 확인은 백신 펩타이드 약물의 개발을 용이하게 할 수있다 중화 항체의 보호 메커니즘을 이해할 수있다. 펩티드 스캐닝 노골적 모노클로 날 항체 (단클론 항체)에 의해 인식되는 선형 에피토프를 맵핑하는 간단하고 효과적인 방법이다. 여기에서, 저자는 중화 단클론 항체를 이용하여 신경 괴사 바이러스 코트 단백질의 항원 인식 직렬 절두 재조합 단백질, 합성 펩티드 설계, 도트 블롯 혼성화를 포함하는 에피토프의 결정 방법을 제안한다. 이러한 기술은 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인 합성 펩티드 및 모노클로 날 항체의 도트 블롯 하이브리드 화에 의존한다. RG-M56 단클론 항체에 의해 인식 바이러스 외피 단백질 항원의 최소 영역은 6 량체 펩티드 에피토프에 펩티드 맵핑을 트리밍 단계별로 좁힐 수있다. 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 및 잔여 서브stitution는 에피토프를 구성하는 각각의 아미노산 잔기의 중요성 결합을 특징으로 수행 될 수있다. 에피토프 부위를 플 랭킹 잔기가 펩타이드 형태의 조절에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 동정 된 에피토프 펩티드는 X- 선 회절 연구 및 기능적 경쟁 또는 치료학 대한 에피토프 펩타이드 - 항체 복합체의 결정을 형성하는데 사용될 수있다.

Introduction

면역계에서 V, D,J 세그먼트의 재조합 항체는 병원균 감염으로부터 숙주를 보호하는 다양한 항원 결합에 대해 상보성 결정 영역 (CDR을)의 상당한 변화를 생성 할 수있다. 항원에 대한 항체의 중화 방어 항체의 CDR을하고 항원의 에피토프 사이의 공간 상보성에 따라 달라집니다. 따라서이 분자의 상호 작용에 대한 이해는 예방 백신 디자인과 치료 펩티드 약물 개발에 도움이 될 것입니다. 그러나,이 중화 상호 작용은 단일 항원 여러 항원 도메인 의해 결과적 에피토프 결정 처리는 더 복잡하게 항체의 복수 개의 CDR에 의해 모두 영향을받을 수있다. 다행히도, 골수종 세포와 개별 항체 생산 세포를 하이 브리 도마 융합 기술의 개발은, 초 셀 끊임없이 나누어 배치 허용모노클로 날 항체 (단클론)로 알려진 하나의 특정 항체 RETE 1. 하이 브리 도마 세포는 특이 적 항원 항원의 한 영역에 결합하는 이들의 순수한 고 친 화성 모노클로 날 항체를 생산한다. 확립 된 항원 - 항체, 펩티드 주사 등 여러 방식의 관계를, 그 대응하는 단클론 항체를 이용하여 항원의 에피토프를 결정하기 위해 사용될 수있다. 합성 펩타이드 기술의 최근 발전은 펩타이드 스캐닝 기술은 더 접근하고 수행하는 것이 더 편리 만들었습니다. 간단히, 중복 합성 펩티드의 세트는 표적 항원 서열에 따라 제조되고, 단클론 혼성화 고체지지 막에 관련된다. 펩티드 스캐닝 영역을 결합 항체를 맵핑하는 간단한 방법을 제공하지만, 또한 에피토프 펩티드 각각 AA 잔기 및 항체의 CDR의 결합 상호 작용을 평가하기 위해 잔류 검사 또는 교체를 통해 아미노산 (AA) 돌연변이를 용이 아닙니다.

2, 3, 4를 이용하여 노란색 그루퍼 신경 괴사 바이러스 (YGNNV) 외피 단백질의 선형 에피토프의 효율적인 식별을위한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 단클론 항체 제조, 건설, 직렬로 절단 된 재조합 단백질의 발현, 합성 중복 펩티드 디자인, 도트 오 하이브리드, 알라닌 검색 및 치환 돌연변이를 포함한다. 펩티드 합성의 높은 비용을 고려하면, 연속적으로 소망하는 목적 단백질의 재조합 단백질을 절단하는 단계는, 수정하고, 합성 펩티드 배열 도트 블롯 분석이 수행되기 전에 항원 성 영역은 약 100 내지 200 AA 잔기 좁혀졌다.

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Protocol

단일 클론 항체의 1. 준비

  1. 배양 5 % CO 2 보충 37 ºC에서 175T 플라스크에서 무 혈청 배지에서 RG-M56 마우스 단클론이 하이 브리 도마 세포. 매체의 색상은 배양 5 일 후 노란색으로 바뀌면 뜨는를 수집합니다.
    주 : 하이 브리 도마 세포를 소 태아 혈청으로부터 항체의 오염을 피하기 위해, 무 혈청 배지에서 배양 하였다.
  2. 4 ºC에서 30 분 동안 4,500 XG에 뜨는을 원심 분리기와 세포 파편 펠렛을 폐기합니다.
  3. 5 mL의 컬럼 (50 % 슬러리로 제공) 단백질 G 아가로 오스의 2 mL를 넣고 얼음처럼 차가운 PBS의 10 수지 볼륨 (10 mL)로 평형.
  4. 항체 상층 액의로드 200 ㎖ 칼럼 상 (단계 1.2) 및 통과를 폐기합니다.
  5. 그것을 씻어 칼럼에 얼음처럼 차가운 PBS의 10 ML을 추가합니다. 두 번 반복합니다.
  6. 단백질 G-관련된 항체를 용출 컬럼에 50 mM의 글리신, 산도 2.7의 10 ML을 추가합니다. 안부[선택] 배 중화 완충액 100 μL (1 M 트리스, 1.5 M의 NaCl, 및 1 mM의 EDTA, pH를 8.0)를 함유하는 마이크로 원심 튜브에 900 μL 분획.
  7. -20 ºC에서 0.03 % NaN의 3 50 % 글리세롤에서 정제 된 항체를 저장합니다.

2. 건설 및 직렬로 잘린 재조합 단백질의 발현

  1. (10 배의 Pfu 완충액 5 μL, 각각의 dNTP, 0.2 mM의 0.2 μM 정방향 프라이머 3, 0.2 μM 역방향 프라이머 3, 2 mM의 황산, pET20b-1A59 3 플라스미드 DNA 1 NG 및 2.5 U : PCR 반응 혼합물을 제조 부)의 Pfu DNA 중합 효소; 50 μL의 최종 볼륨 O DDH 2를 추가합니다.
    1. 자동 열 자전거 타는 사람에 실행 샘플 다음 매개 변수를 사용하여 : 사이클 1 (5 분 94 ° C); 사이클 2-36 (30 초 94 ºC, 30 초 63 ºC, 60 초 동안 72 ° C); 사이클 37 (7 분 72 ° C).
  2. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 다음 제한 효소 절단을 용이하게하기 위해 PCR 정제 키트 (5)를 사용하여 제품을 추출한다.
  3. 이니까 I 및 I을 XhoI 제한 효소로 PCR 증폭 된 DNA 단편을 Nde I 소화하고을 XhoI 효소 절단 된 애완도 20b (+) 벡터에 이러한 DNA 단편을 각각 결찰. 대장균 DH 5α-6-적격 세포로 구조 변환.
    1. 소화 버퍼 소화 혼합물을 제조 (20 mM 트리스 - 아세테이트, 10 mM의 마그네슘 (CH 3 COO) 2, 50 mM의 KCH 3 COO, 1 mM의 DTT, pH를 7.9)으로 한 PCR 증폭 된 DNA 또는 애완 동물 (20b)의 μg의 이니까 I 및 I을 XhoI 제한의 (+) 벡터 DNA 및 2 U 20 μL의 최종 부피 효소.
    2. 부드럽게 소화 혼합물을 혼합하고 신속하게 스핀 다운. 제한의 완전 절단 앉아 보장하기 위해 건조 욕조에 2 시간 동안 37 ºC에서 품어에스.
    3. 다음 플라스미드의 구축을 용이하게하기 위해 PCR 정제 키트 (5)를 이용하여 제한 효소 소화 DNA 단편을 추출 하였다.
    4. 결찰 완충액 결찰 혼합물을 준비한다 (66 mM 트리스, 5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 ATP, 5 mM의 DTT, pH를 7.5) predigested, PCR 증폭 된 DNA 100 ng를, predigested 애완 20B 10 NG와 (+) 벡터 DNA, 10 μL의 최종 부피의 5 U T4 DNA 리가.
    5. 부드럽게 결찰 혼합물을 혼합하고 신속하게 스핀 다운. 수조에서 18 시간 동안 16 ºC에서 품어.
    6. 지명 타자-5α-유능한 세포 100 μL에 결찰 샘플의 10 μL를 넣고 30 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 배치하기 전에 가볍게 섞는다. 열 충격 (7)을 유도하기 위해 90 초 동안 42 ºC에서 건조 욕조에 microcentrifuge 관을 넣습니다. 즉시 2 분 동안 얼음에 튜브를 전송합니다.
    7. 0.5 % 박토 효모 extrac 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 (1 % 박토 트립 톤의 900 μL를 추가튜브에 t, 0.5 % 염화나트륨, pH를 7.0). 150 rpm으로 45 분 동안 진탕 37 ºC에서 품어. 10 분 동안 4000 x g에서 원심 분리하여 세포를 펠렛과 상층 액을 버린다.
    8. LB의 국물의 50 μL와 펠렛을 재현 탁하고 100 μg의 / ML의 암피실린을 포함하는 미리 예열 LB 플레이트에 각각의 변환을 확산. 16 시간 37 ºC에서 번호판을 품어.
    9. 200 μL 팁을 사용하여 단일 콜로니를 선택하고 느슨하게 덮인 15 mL의 튜브에 100 μg의 / ㎖의 암피실린을 포함하는 3 ㎖의 LB의 국물에 배치합니다. 150 rpm으로 12 시간 동안 진탕 37 ºC에서 품어.
    10. 각 문화 플라스미드 DNA (8)을 추출하고 순서 9를 확인 T7 프로모터 및 T7 터미네이터 프라이머를 사용하여 시퀀스.
  4. 서열 확인 후, 이러한 애완 동물 20B에서 DNA 10ng의 (+) 회사에 의해 대장균의 BL-21 (DE3) 균주에 YGNNV 코트 단백질 유전자의 다양한 길이를 가진 플라스미드를 변형열 쇼크 방법 7 보내고. 단계에 따라 2.3.6-2.3.8 변환을 수행 할 수 있습니다.
  5. 느슨하게 덮인 15 mL의 튜브에 100 μg의 / ㎖의 암피실린을 포함하는 3 ㎖의 LB의 국물로 각각 형질 전환 된 대장균 BL-21 세포에서 하나의 식민지를 전송합니다. 150 rpm으로 흔들면서 37 ºC에서 문화를 품어.
  6. 배양액의 OD (600)는 약 0.6 일 때 25 ºC로 배양을 냉각시키고, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 0.4 mM의 최종 농도로 IPTG를 추가한다. 200 rpm으로 흔들면서 25 ºC에서 추가로 4 시간 동안 문화를 품어.
  7. 미세 원심 관에 문화의 한 ML을 전송합니다. 1 분 12,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛과 상층 액을 버린다.
  8. 마이크로 피펫 최대 피펫 팅 다운 변성 완충액 100 μL (8 M 우레아, 20 mM 인산 나트륨, 0.5 M 염화나트륨, pH 7.4의)에서 세포 펠렛을 재현 탁. 활발한 텍싱에 의해 섞는다.
    참고 : 샘플 졸용액 사용은 이제 도트 오 하이브리드 분석을 위해, 반투명 약간 끈적하고 준비해야한다.

겹치는 펩타이드 3. 설계 및 합성

  1. 디자인 및 각 도트 블로 팅에 의해 RG-M56 단클론 항체의 에피토프 영역을 좁힐 수있는 YGNNV 코트 단백질의 195-338 AA 지역에서 10 AA 잔류 물에 의한 후속과 겹쳐 3 직렬 20 머 펩티드를 합성.
  2. 설계 및 합성 3 세 8 머 펩티드 (202 195 VNVSVLCR, 197 VSVLCRWS 204, 199 VLCRWSVR 206) 다음의 합성 펩티드 상 6 AA 잔류의 중복과 도트 블로 팅에 의해 195-206 금주의 에피토프 영역을 좁힐 수 있습니다.
  3. 디자인과 3 ~ 7 머를 합성 (196 NVSVLCR 202, 195 VNVSVLC 201), 6- 메르 (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC (201), 1을 최소화하기 위해 자신의 이웃 펩티드 상에 각각 6, 5의 중복, 4 AA 잔류, 97 VSVLCR 202), 5 머 펩티드 (202 195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, 198 SVLCR) 도트 블로 팅에 의해 에피토프 영역입니다.

4. 도트 오 하이브리드

  1. 10 mg / ml의 최종 농도로 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 각 합성 펩티드를 녹인다.
    주 : 합성 펩티드의 용해도 변화를 극복하기 위해, 모든 합성 펩티드를 DMSO에 용해한다. DMSO 완전히 소수성 또는 친수성 펩티드를 용해하는 양 용매이다.
  2. 2 분 동안 메탄올과 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인을 담근다.
    주 : PVDF 막은 DMSO에 내성이 100 %까지이다; 다른 사람들은 그렇게하지 않을 수 있습니다.
  3. 수정 Towbin 버퍼 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % SDS, pH를 8.3) 용으로 PVDF 막 평형2 분.
    주 : ~ 20 % (V / V)의 메탄올는 전송 결과를 개선하기 위해 수정 Towbin 완충액에 첨가 할 수있다.
  4. 개질 Towbin 완충액 크로마토 종이를 헹군다. 크로마토 그래피 종이 위에 PVDF 막 놓습니다. 수정 Towbin 버퍼가 다음 단계를 계속하기 전에 PVDF 막 표면에서 사라질 때까지 기다립니다.
  5. 10 μL 팁으로 막에 각각의 펩타이드 샘플 2 μL를 추가합니다. 10 분 동안 크로마토 그래피 용지에 PVDF 멤브레인을 공기 - 건조. 지나치게 확산을 방지하기 위해 막에 천천히 그리고 점차적으로 각 펩타이드 샘플을 추가한다.
  6. 부드러운 흔들림 실온에서 30 분 동안 5 % 탈지 우유 TBST 버퍼 막 (0.05 % (v / v)의 트윈 20, 20 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.4) 차단.
  7. 막에 5 % 무 지방 우유 TBST 버퍼에서 1000 : 1의 최종 희석에 RG-M56 단클론 항체를 추가합니다. 부드러운 흔들림과 1 시간 동안 37 ºC에서 막을 품어.
  8. 그래서 항체를 제거lution. 부드러운 흔들림 5 분 동안 TBST 버퍼에 막 씻으십시오. 두 번 반복합니다.
  9. 멤브레인을 5 % 탈지 우유 TBST 버퍼에서 5000 : 1의 최종 희석 차 항체 (염소 항 - 마우스 IgG, 된 Fc 공액 알칼리성 포스파타제)을 추가한다. 부드러운 흔들림과 1 시간 동안 37 ºC에서 막을 품어.
  10. 항체 솔루션을 폐기하십시오. 부드러운 흔들림 5 분 동안 TBST 버퍼에 막 씻으십시오. 두 번 세척 단계를 반복합니다.
  11. 어둠 속에서 15 분 동안 실온에서 BCIP / NBT 기질 용액으로 막을 개발. 신호가 나타날 때 DDH 2 O로 막을 세척하여 현상을 중지합니다.
  12. 멤브레인을 공기 - 건조 이미지 시스템을 사용하는 도트 블롯 이미지를 캡처.
  13. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 3 점 블롯의 강도를 측정한다.

5. 알라닌 스캐닝 및 교체

  1. 디자인과 3 알라닌과 methi을 합성onine 대체 펩티드. VAVSVLCR (202), (195) VNASVLCR (202), (195) VNVAVLCR (202), (195) VNVSALCR (202), (195) VNVSVACR (202), (195) VNVSVLAR (202) 8 메르 펩타이드 195 VNVSVLCR 202 알라닌 각각 AA 잔류 물을 교체하고 합성 펩타이드 195 ANVSVLCR 202, 195, 195 VNVSVLCA (202) . SJNNV 유전자형 에피토프 펩타이드 195 VNVSVMCR (202)를 만드는 메티오닌하는 AA 잔류 류신 (200)를 교체합니다.
  2. 알라닌 검색 및 치환 돌연변이가 블로 팅 도트 수행하기 위해 제 4 절을 따르십시오.

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Representative Results

이 실험의 목표는 단클론 항체를 이용하여 블롯을 통해 도트 에피토프를 확인 하였다. 신속하고 효율적으로 단클론 항체에 의해 인식되는 항원 영역을 좁히기 위해, C 말단에 6xHis 융합 태그의 전체 길이와 직렬로 절단 YGNNV 재조합 코트 단백질은 대장균 PET 발현 시스템 (10) (도 1a)에서 발현되었다. 생성 된 재조합 단백질은 도트 블롯 혼성화를 위해 RG-M56 단클론 항체 및 항 6xHis 항체를 이용하여 PVDF 막에 발견되었다. 도트 블롯은 1-338 AA (전체 길이), 51-338 AA 및 195-338 aa는 있지만 1-100 AA 또는 1-200 aa는 재조합 단백질 (그림 1B)에 대해 긍정적 인 신호를 한 것으로 밝혀졌습니다. 도트 배열 항 6xHis 항체에 대해 혼성화 모든 재조합 단백질 발현을 확인 하였다. 이러한 데이터는 RG-M56 단클론 항체 인식의 에피토프는 144-AA 재조합 단백질 NEA에 위치하고 있음을 나타냅니다R C- 말단 YGNNV의 외피 단백질 (195-338 AA).

자신의 이웃 설계 및 에피토프 영역을 좁힐 펩타이드 스캔 144-AA 재조합 단백질의 서열로부터 합성에이어서, 10 AA-잔류 긴 직렬 20 메르 펩티드는 겹칩니다. 이 합성 펩티드는 PVDF 막에 발견 및 RG-M56 단클론 항체를 사용하여 도트 오 하이브리드을 실시 하였다. 결과는 펩티드 195-214 AA 및 양성 대조군, AA 195-338 재조합 단백질 (도 2a)에 양 신호를 보였다. 에피토프가 펩타이드 195-214 AA 영역이 아니라 펩타이드 205-224 단 지역, 6-AA 잔류 세 직렬 8 머 펩티드에 위치한 바와 같이 197-, AA 잔류 물 195-206 (펩타이드 195-202 AA에서 중복 (204) AA 및 199-206 AA)를 설계하고 합성 하였다. 도트 블롯 혼성화 결과를 사용하여 펩티드 195-202 AA와 포지티브 컨트롤 펩티드 195-214 AA 긍정적 인 신호를 보여 주었다RG-M56 단클론 항체 (그림 2B).

알라닌 스캐닝 및 치환 돌연변이는 8 량체 에피토프 각각 AA 잔기 195 VNVSVLCR 202의 특이성을 평가하기 위해 수행 하였다. 8 머 펩타이드 각각 AA 잔류 개별적으로 알라닌으로 대체되었다. 알라닌 돌연변이 펩타이드 배열은 양성 대조군으로서 펩티드 195-202 AA를 이용한 PVDF 멤브레인 상에 놓았다. 도트 블랏 분석은 세 치환 돌연변이, V197A은 V199A 및 C201A, RG-M56 단클론 항체 (도 3a)의 결합 친화도를 폐지 것으로 나타났다. SJNNV 유전자형 에피토프의 AA 잔기 200 메티오닌이지만 다른 네 Betanodavirus 유전자형 에피토프에 류신 반대로, 상기 SJNNV 유전자형 서열 195 VNVSVMCR (202)는 포지티브 제어처럼, RG-M56 단클론 항체에 대한 양성 결합 친화도를 보였다 (그림 3A). 이 결과는 그 에피토프 O 나타낸다모든 F Betanodavirus 유전자형은 RG-M56 단클론 항체에 의해 인식 될 수있다. 에피토프 부위에 참여하는 각 단 잔기의 결합 친화력 상기 이미지 분석 소프트웨어 (도 3b)을 이용하여 각각의 알라닌 치환 도트 블롯의 신호 강도를 측정함으로써 정량 하였다. V197A, V199A 및 C201A 치환의 농도는 10.2 %, 18.6 %, 8.5 %로 감소되었다 각각, 양성 대조군 (100 %)의 것과 비교할 때 V195A 반면, S198A, L200A, R202A 및 L200M 치환은 양성 대조군의 것과 유사한 높은 강도를 나타내었다. N196A 대체의 영향을 미치는 강도가 양성 대조군에서 37.4 % 감소로, 모호한 것을 주목할 필요가있다. 이러한 결과는 V197, V199, 및 C201은 RG-M56 단클론 항체의 결합에 필수적인 잔류 물이 있음을 나타냅니다.

알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 결과는 금주 모임 잔류 V195, N196, 및 R202 할 수있는 공개에피토프 영역은 상기 두 말단에서 좁아 될 수 있음을 의미 알라닌으로 치환 될 수있다. 따라서, 단계별 7 - 메 르, 6 메 르, 5-메르 합성 펩티드 단계를 통해 펩타이드 맵핑을 손질는 항원 영역을 최소화 할 수 있도록 설계되었다. 긍정적 인 신호는 있지만 7 메르 5 머 합성 펩티드에 (그림 4) 6 메르 합성 펩티드 (196) NVSVLC (201)에 존재했다. 이러한 데이터는 RG-M56 단클론 항체에 의해 인식 NNV 코트 단백질의 최소한의 에피토프는 6 량체 펩티드, 196 NVSVLC 201임을 나타낸다.

그림 1
도 1 : 직렬로 절단하고 재조합 단백질 모노클로 날 항체를 사용하여 에피토프 영역의 감소. 직렬로 절단 된 재조합 NNVCPs의 (A)지도. NNVCP 1-338 단은 전장 외피 단백질이다. (B) 도트 BLO재조합 NNVCPs의 t 분석. 왼쪽 다음 PVDF 막에 연속적으로 절단 YGNNV 재조합 코트 단백질의지도. 중간 : 도트 - 블롯 분석 안티 6xHis 항체를 사용하여 수행 하였다. 오른쪽 : 도트 - 블롯 분석을 RG-M56 단클론 항체를 사용하여 수행 하였다. NNVCP : 신경 괴사 바이러스 외피 단백질; AA : 아미노산; PVDF : 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드; N : N 말단; C : C 말단; 단클론 항체 : 단클론 항체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 합성 펩티드를 사용하여 에피토프 영역의 고급 매핑. (A) 왼쪽 : 20 량체 합성 펩티드의 아미노산 서열 NNVCP 195-338 AA 정렬시켰다 각 앞의 펩타이드는 다음과 같은 펩타이드와 10 AA-잔류 길이의 중복을했다. 오른쪽 :의지도PVDF 막에 ynthetic 펩티드. 재조합 NNVCP 195-338 AA는 양성 대조군으로 사용 하였다. 도트 블랏 분석은 RG-M56 단클론 항체를 사용하여 수행 하였다. (B) 왼쪽 : 8 메르 합성 펩티드, 195-202 AA, 197-204 AA 및 199-206 AA의 아미노산 서열; 각 앞의 펩타이드는 다음과 같은 펩타이드와 6 AA-잔류 길이의 중복을했다. 합성 펩티드 195-214 AA는 양성 대조군으로 사용 하였다. 오른쪽 : 도트 - 블롯 분석을 RG-M56 단클론 항체를 사용하여 수행 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 195 VNVSVLCR (202) 에피토프의 알라닌 검색 및 치환 돌연변이 유발. 치환 돌연변이 유발 및 점 블랏 분석 (A) 아미노산 서열. 각 단 연구에피토프 지역, 195-202 AA의 esidue은, 알라닌 개별적으로 대체되었다. L200M 대체는 Betanodavirus 코트 단백질 에피토프 영역에서 SJNNV 유전자형의 순서입니다. 합성 펩티드 195-202 AA는 양성 대조군으로 사용 하였다. 교체 된 AA 잔류 물은 밑줄. 도트 오 신호 결합 친화의 (B) 정량. 양성 대조군 (195-202 AA)의 신호 강도를 100 %로 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 최소 에피토프 결정. 195-202 AA에서 7 량체 (A), 6- 머 (B), 5 량체 (C)의 합성 펩티드 RG-M56 단클론 항체에 의해 인식되는 에피토프의 최소를 식별하는데 사용되었다. 합성 pepti드 195-202 단은 양성 대조군으로 사용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜은 단클론 항체 인식 선형 에피토프를 확인하기위한 신속하고 간단한 기술을 제공한다. 고려 펩티드 합성 및 합성 펩티드의 생산 효율의 비용을 고려하여 바이러스 코트 단백질의 항원 성 영역은 펩타이드 주사 분석 전에 연속적으로 절단 재조합 단백질 발현을 감소시켰다. 50-10 사이의 분자량이 kDa의 재조합 단백질은 쉽게 시스템을 통해 표현 될 수 있으므로 따라서, 안정적이고 효율적인 E. 콜라이 애완 동물 발현 시스템이 순차적으로 절단 된 재조합 단백질을 생산하는 데 사용되었다. 이러한 방식으로, 에피토프는 쉽게 관리하기 100~200 AA 영역까지 좁아 질 수있다. 그것은 제조 6xHis 태그 융합 단백질 허용 6xHis-태그의 발현에 대한 코드의 발현을 확인하기 위해 항 6xHis 항체를 사용 immunodetected되도록하는 서열을 함유로서 애완 동물 (20B) (+) 벡터를 구체적으로 선택되었다 재조합 페이지roteins. 생성 된 재조합 코트 단백질은했다 도트 블롯 혼성화 분석을 통하여 RG-M56 단클론 항체를 이용하여 분석 하였다. 재조합 단백질 에피토프 결정하는 다른 방법으로, 고정화 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 (10)를 통해 발현 된 재조합 단백질을 정제 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동으로 재조합 단백질을 분리하고, 웨스턴 블롯 분석 (3)을 수행하는 것이다.

더욱 더 미세하게 절단 된 직렬 재조합 단백질을 이용하여 도트 블롯 혼성화 분석의 결과에 의해 결정되는 에피토프의 위치를 ​​맵핑하기 위해, 서로 다른 크기로 중복 합성 펩티드를 고안 하였다. 합성하는 합성 펩티드의 다른 가능한 길이 중, 충분히 (약 90 % 수준)과 펩타이드 기간 동안 높은 합성 순도 모두 10 금주 모임 - 잔류 길이 중복 펩타이드는 펩타이드 검사에서 첫번째 선택되었다 20은 메르 연속 전자에 대한 검색pitope는 B 세포의 항체 (11)에 의해 인식. 합성 펩타이드 이상으로 합성 된 펩타이드의 정확성과 순도가 저하합니다. 이러한 방식으로, 에피토프 영역은 급속 길이는 약 10 잔기 AA 감소되었다. 직렬 8 량체 중첩 펩티드 조사시킨 후, 상기 선형 에피토프 영역은 195-202 AA 펩티드를 정의 하였다. 이어서,이 8 량체 에피토프 펩티드 알라닌 스캐닝 최소 에피토프에 대한 검색을 가능하게 각각 AA 잔기의 임계 결합 친화도의 강도를 알 수있다. V197, V199, 및 C201 단 잔기의 본질적인 역할은 선형 에피토프 영역이 완전히 결합 손실없이 197에서 또한, AA 잔기 V195, N196, 및 R202는 알라닌으로 치환 될 수있다 (201)에, 적어도 5 단 잔기를 포함 함을 의미 친화력 에피토프 영역의 길이가 7, 6, 5 또는 AA 잔기로 감소 될 수 있음을 나타낸다. 작은 펩타이드 서열은 용이하게 그리고 경제적으로 선형 검색 (CO 위해 합성 될 수있다ntinuous) 에피토프. 이 에피토프 절제술과 결합 질량 분석 (12)를 해석하지 않는 그러나, 이러한 합성 펩티드 스캐닝 기술은 항체의 불연속 에피토프의 결정에 적합하지 않다.

이 프로토콜에서, 도트 블롯 혼성화 기술은 단클론 항체의 선형 에피토프를 검색하기 위해 사용 하였다. 도트 오 하이브리드는 간단하지만 효과적인 방법이다. 에피토프 영역은 대규모 풍경에서 조여져, 검색의 시작에서, 주요 관심사는 대부분의 모노클로 날 항체와 같이 표적 막 결합 단백질에 대한 항체의 혼성화 후 포지티브 또는 네거티브 신호를 관찰 할 수있다 유일한 항원 단백질의 특정 에피토프 (도 1 및도 2)에 결합한다. 그러나, 알라닌 치환 돌연변이로 항체에 대한 에피토프 영역 내의 각 단 잔기의 결합 가능성을 탐색 도트 블롯 혼성화를 사용할 때도트 블 롯팅에 의해 결정된 각 치환 AA 잔기의 신호 강도는 전체 결합 의미로 고려되어야한다. 그 신호 강도는 이미지 분석 소프트웨어 (도 3b) 또는 농도계를 사용하여 용이하게 정량 할 수있다. 대안 적으로, 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)을 결합 친화도의 정도 및 생성 된 신호 강도 (3)을 정량화하기 위해 수행 될 수있다.

이전 연구에서, 비 - 외피 신경 괴사 바이러스 단독 코트 단백질이었다 면역 인식 (10 NI 로그) 4.5 내지 6.5 높은 중화 지수 값 10 모노클로 날 항체에 의해이. 모노클로 날 항체의 매우 구체적인 인식 능력은 더 NNV 감염된 어류 (13)의 검출을위한 한 단계 신속한 면역 크로마토 그래피 진단 키트의 개발에 사용 하였다. 신경 괴사 바이러스 코트 단백질의 항원 성 에피토프가 RG-M18에 의해 인식 된단클론 항체 소설 NNV 수용체 (게시되지 않은 데이터)를 확인 하였다 통해 8 메르 펩타이드, 195 VNVSVLCR (202) 3 등. 본 연구에서는 신경 괴사 바이러스 외피 단백질의 에피토프가 추가로 6 량체 펩타이드로 좁혀하고, 196 NVSVLC (201) 다른 단클론 항체, RG-M56에 의해.

6 량체 펩타이드 196 NVSVLC (201)가 포함이 7 머 펩티드 (196 NVSVLCR 202, 195 VNVSVLC 201) RG-M56 단클론 항체 (그림 4A)에 의해 인식되지 않습니다 그것은 예기치 않은 것입니다. 합리적인 해석 주변 잔기 V195 및 R202 직접 항원과 항체 간의 결합 상호 작용에 기여하지 않을 수 있지만, 플 랭킹 잔기가 항체 인식에 대한 올바른 펩타이드 형태의 형성에 영향을 미치는 점이다. 자신의 측면 말단 V195 또는 R202의 모양은 혼자 합성 펩티드를 곡해 할 수있다항체 인식 및 바인딩 형태. 에피토프의 형태는, VNVSVLCR (202) (195), 8 메르 합성 펩티드 서로에 대한 균형을 모두 말단, V195 및 R202의 힘에 의해 구동 및 NVSVLC (201) (196), 6 메르 합성 펩티드에 상쇄. 금주 모임 잔기, V195, N196, 및 R202은 각각 완전히 상실 결합능없이 알라닌으로 치환 될 수 있고, 따라서, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 결과는 이러한 세 AA 잔기 인식에 중요한 역할을하지 않을 수도 있음을 나타내며, RG 결합 -M56 단클론 항체. 그러나, 6- 메르 합성 펩티드의 하나 이상의 잔기를 트리밍 한 후, 196 NVSVLC (201)는 N 말단 측면 영역에서 N196없이 5 량체 펩티드 197 VSVLC 201, RG에 의해 인식되고 결합 될 수있는 능력을 잃는다 -M56 단클론 항체 (그림 4C). 이 결과는 그 N196 잔기 수도 또한 P 제안인식 및 RG-M56 단클론 항체의 결합을 용이하게하기 위해 정확한 에피토프 입체 구조를 안정화하는 에피토프의 측면 영역에서 중요한 역할을 누워. 에피토프 영역을 둘러싸 플 랭킹 잔기의 중요성은 다른 항원 - 항체 결합 연구에 의해 탐구되었다. 항체의 결합에 대한 α-bungarotoxin 에피토프 영역을 둘러싸 AA 잔기 측면의 의미는 동일한 하위 콜린성 내의 다른 단 치환을 사용하여 조사 하였다. 그런 다음, 중요한 영향력, 또는 14 영향력하지 중 하나로 평가 하였다. 또한, 암 관련 상피 뮤신 항체 에피토프 인식의 특이성은 상기 측면 AA 잔기에 의해 영향을받을 수 있음을 발견 하였다. 이러한 효과는 15 에피토프에 대한 항체의 결합을 방해 할 수있는 구조적인 장벽을 제공 할 수있다.

6 머 에피토프, 196 NVSVLC 201 </ 서브>, 매우 소수성 기능을 가지고, 두 valines (197 및 199), 일 류신 (200), 하나 시스테인 (201) (환원 형) 등 4 소수성 잔기와. 알라닌 스캐닝 돌연변이에 의해 결정되는 잔류 V197, V199 및 C201은 RG-M56 단클론 항체 인식 및 결합을 위해 중요하다. 에피토프 영역은 NNV 코트 단백질 쉘 (16)의 영역 (S 영역)의 여덟 역 평행 β 가닥 중 하나의 위치에 있었다. 흥미롭게 에피토프 외측 돌출부 영역에 표시하지만, 다른 반 평행 β 가닥 하에서 S 도메인의 젤리 롤 구조 숨겨 않는다. 에피토프는, 높은 소수성으로,이 우울증보다 안정적인 미세 환경을 얻을 수있다. 또한,이 에피토프의 195 VNVSVLCR (202) 3 펩타이드는 식용 뇌 세포의 거대 그루퍼 신경 괴사 바이러스의 전파를 방해하는 것으로 밝혀졌다. 따라서,이 에피토프 펩티드 공동 것으로 시사되었다mpetitor 바이러스 항목 3에 필요한 수용체 결합 도메인에 참여. 이 펩티드 엔트리 억제제 세포막 인터페이스의 물리적 형태 및 화학적 성질을 변경할 수 소수성 및 / 또는 양쪽 성 잔기를 포함하는 세포 및 바이러스 성 멤브레인 (17)의 융착을 방해 할 수 있다고 가정 하였다. 또한, 많은 합성 펩티드 항목 억제제는 다양한 바이러스 감염 (17), (18)에 강한 방청 특성을 증명하고있다. 따라서, 소수성 잔기 및 NNV 감염에 대한 강한 억제 엔트리로 식별 된 에피토프 펩티드는 펩티드 치료 약물의 개발을 용이하게 할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hybrid-SFM medium Gibco 12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069
Pfu DNA Polymerase  Thermo Scientific  EP0502  Including buffers
T4 DNA Ligase Roche 10799009001 Including buffers
NdeI  New England Biolabs R0111S Including buffers
XhoI  New England Biolabs R0146S Including buffers
pET-20b(+) vector Novagen, Merck Millipore 69739
E. coli DH-5α competent cell RBC Bioscience RH617
E. coli BL-21(DE3) competent cell RBC Bioscience RH217
Ampicillin Amresco 0339-25G
LB broth  Invitrongen 12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) MDBio, Inc. 101-367-93-1
Methanol Merck Millipore 106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T.Baker X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Glycine Amresco 0167-5KG
Tris Affymetrix, USB 75825
NaCl Amresco 0241-1KG
EDTA Amresco 0105-1KG
Glycerol Amresco 0854-1L
NaN3 Sigma S2002-500G
BCIP/NBT PerkinElmer NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody Jackson ImmunoResearch 115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) Merck Millipore IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow Merck Millipore 16-266
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106
UVP BioSpectrum 600 Image System UVP n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 UVP n/a
MyCycler thermal cycler BioRad 1709713

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References

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