Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

Immunology and Infection

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Chen, C. W., Chang, C. Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J. Vis. Exp. (121), e55417, doi:10.3791/55417 (2017).

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Abstract

Die Identifizierung eines antigenes Epitop von dem Immunsystem ermöglicht das Verständnis des Schutzmechanismus von neutralisierenden Antikörpern, die die Entwicklung von Impfstoffen und Peptid-Medikamente können erleichtern. Peptid-Scanning ist eine einfache und effiziente Methode, die ohne weiteres das lineare Epitop durch einen monoklonalen Antikörper (mAb) erkannt abbildet. Hier präsentieren die Autoren ein Epitop Bestimmung Methodik seriell verkürzten rekombinanten Proteinen, synthetischen Peptid-Design und Dot-Blot-Hybridisierung für die Antigen-Erkennung von Nerven Nekrose-Virus-Hüllprotein mit einem neutralisierenden mAb beteiligt sind. Diese Technik beruht auf dem Dot-Blot-Hybridisierung von synthetischen Peptiden und mAbs auf einem Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran. Die minimale antigen Bereich eines viralen Hüllprotein vom RG-M56 mAb erkannt durch die Schritt-für-Schritt-getrimmten Peptidkartierung auf ein 6-mer-Peptid-Epitops eingegrenzt werden. Zusätzlich Alanin-Scanning-Mutagenese und Rückstands substitution kann die Bindungs ​​Bedeutung jeder Aminosäurerest, aus denen das Epitop charakterisieren, durchgeführt werden. Die Reste, die die Epitop-Website flankieren, wurden gefunden kritische Rollen in Peptidkonformation Regulation zu spielen. Das identifizierte Epitop-Peptid kann verwendet werden, um Kristalle von Epitop-Peptid-Antikörper-Komplexe für eine Röntgenbeugungsuntersuchung zu bilden und funktionellen Wettbewerb oder für Therapeutika.

Introduction

Im Immunsystem, die Rekombination von V-, D- und J - Segmente können für Antikörper für die Bindung an verschiedene Antigene enorme Variationen von komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) zu erzeugen , die Host von pathogenen Infektion zu schützen. Die neutralisierende Abwehr von Antikörpern gegen Antigene hängt von der räumlichen Komplementarität zwischen den CDRs der Antikörper und die Epitope der Antigene. Daher wird ein Verständnis dieser molekularen Wechselwirkung prophylaktischen Impfstoff-Design und therapeutischen Peptid Arzneimittelentwicklung unterstützen. Jedoch kann diese Neutralisation Wechselwirkung sowohl aus einem einzigen Antigen und durch mehrere CDRs von Antikörpern durch multiple antigene Domänen beeinflußt werden, die somit das Epitop Bestimmungsprozess komplexer machen. Glücklicherweise ist die Entwicklung der Hybridom-Technologie, die einzelnen Antikörper-produzierenden Zellen mit Myelomzellen verschmilzt, ermöglicht eine ständig Dividieren Charge von Zellen secrete einem spezifischen Antikörper, bekannt als ein monoklonaler Antikörper (mAb) 1. Hybridomzellen produzieren diese reine, hochaffine mAb an einem einzigen Antigen-Domäne eines spezifischen Antigens zu binden. Mit der Beziehung des Antigen-Antikörper festgestellt, mehrere Ansätze, einschließlich Peptid-Scanning, verwendet werden, um das Epitop eines Antigens zu bestimmen seinen entsprechenden mAb verwendet. Die jüngsten Entwicklungen in der synthetischen Peptid-Technologie haben die Peptid-Scanning-Technik zugänglicher und bequemer gemacht auszuführen. Kurz gesagt, werden gemäß einer Zielantigensequenz einen Satz von überlappenden synthetischen Peptiden hergestellt und zu einem Feststoff-Trägermembran für mAb Hybridisierung verbunden. Peptid-Scanning bietet nicht nur eine einfache Möglichkeit, die Antikörper-Bindungsregion auf der Karte, sondern erleichtert auch Aminosäure (aa) Mutagenese durch Rückstands Scannen oder Substitution die Bindungswechselwirkung zwischen jedem aa-Rest des Epitop-Peptid und die CDRs des Antikörpers zu bewerten.

2, 3, 4. Das Protokoll enthält mAb Vorbereitung, Konstruktion und Expression von seriell verkürzten rekombinanten Proteine, synthetische überlappende Peptid Design, Dot-Blot-Hybridisierung, Alanin-Scanning und Substitutionsmutagenese. die hohen Kosten für die Peptidsynthese unter Berücksichtigung, wurde der Schritt des seriell die rekombinanten Proteine ​​eines gewünschten Zielproteins Verkürzen modifiziert und die antigene Region wurde auf etwa 100 bis 200 aa Reste, bevor der synthetische Peptidarray Dot-Blot-Analyse durchgeführt wurde eingeengt.

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Protocol

1. Herstellung des monoklonalen Antikörpers

  1. Kultur die RG-M56 monoklonalen Maus - Hybridomzellen 2 in Serum-freiem Medium in 175T - Kolben bei 37 ° C mit 5% CO 2 zu ergänzen. Die überstehende Flüssigkeit, wenn die Farbe des Mediums nach fünf Tagen Inkubation gelb wird.
    HINWEIS: Hybridoma-Zellen wurden in serumfreiem Medium Antikörper Kontamination aus fötalem Rinderserum zu vermeiden.
  2. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 4.500 × g für 30 min bei 4 ° C und entsorgen die Zelltrümmer Pellet.
  3. In 2 ml Protein G-Agarose (geliefert als eine 50% ige Aufschlämmung) auf eine 5-ml-Säule und ins Gleichgewicht mit 10 Harzvolumina (10 ml) eiskaltem PBS.
  4. Legen Sie 200 ml des Antikörpers Überstand (Schritt 1.2) auf die Säule und entsorgen Sie die Pass-Through.
  5. 10 ml eiskaltem PBS auf die Säule zu waschen. Zweimal wiederholen.
  6. 10 ml 50 mM Glycin, pH 2,7 auf die Säule, die das Protein G-assoziierten Antikörper zu eluieren. ColLect 900 ul-Fraktionen in einem Mikrozentrifugenröhrchen, das 100 ul 10fach Neutralisationspuffer (1 M Tris, 1,5 M NaCl und 1 mM EDTA, pH 8,0).
  7. Lagern Sie das gereinigte Antikörper in 50% Glycerin mit 0,03% NaN 3 bei -20 ºC.

2. Konstruktion und Expression von Abwechselnd Verkürzte rekombinanten Proteine

  1. Bereiten Sie eine PCR - Reaktionsgemisch: 5 ul 10x Pfu - Puffer, 0,2 mM von jedem dNTP, 0,2 & mgr; M Vorwärtsprimer 3, 0,2 uM Reverse - Primer 3, 2 mM MgSO 4, 1 ng pET20b-1A59 3 Plasmid - DNA und 2,5 U ( Einheit) von Pfu DNA - Polymerase; ddH 2 O auf ein Endvolumen von 50 & mgr; l hinzuzufügen.
    1. Führen Proben in einem automatischen Thermocycler mit folgenden Parametern: Zyklus 1 (94 ° C für 5 min); 2-36 Zyklen (94 ° C für 30 s, 63 ºC für 30 s und 72 ° C für 60 s); und Zyklus 37 (72 ºC für 7 min).
  2. Extrahieren der Polymerasekettenreaktion (PCR) Produkte durch eine PCR - Reinigungskits 5 unter Verwendung der folgenden Restriktionsenzym - Verdau zu ermöglichen.
  3. Digest die PCR-amplifizierten DNA - Fragmente mit Nde I und Xho I - Restriktionsenzymen und Ligation jedes dieser DNA - Fragmente in Nde I und Xho I gespalten enzym pET-20b (+) Vektor. Verwandeln Sie die Konstrukte in Escherichia coli DH-5α kompetenten Zellen 6.
    1. Bereiten Sie die Aufschlussmischung in Verdauungspuffer (20 mM Tris-Acetat, 10 mM Mg (CH 3 COO) 2, 50 mM KCH 3 COO und 1 mM DTT, pH 7,9) mit 1 ug PCR-amplifizierte DNA oder pET-20b (+) Vektor - DNA und 2 U von Nde I und Xho I - Restriktionsenzymen in einem Endvolumen von 20 & mgr; l.
    2. Mischen Sie die Verdauung Mischung sanft und schnell drehen nach unten. bei 37 ºC inkubieren für 2 h in einem trockenen Bad die komplette Schneiden der Einschränkung, um sicherzustellen, sitzenes.
    3. Extrahieren Sie die Restriktionsenzym-verdauten DNA - Fragmente unter Verwendung eines PCR - Reinigungs - Kit 5 , um die folgenden Plasmidkonstruktion erleichtern.
    4. Bereiten Sie die Ligierungsmischung in Ligationspuffer (66 mM Tris, 5 mM MgCl 2, 1 mM ATP und 5 mM DTT, pH 7,5) mit 100 ng predigested, PCR-amplifizierte DNA, 10 ng vorverdaut pET-20b (+) Vektor-DNA und 5 U des T4 DNA-Ligase in einem Endvolumen von 10 & mgr; l.
    5. Mischen Sie das Ligierungsgemisch schonend und schnell Spin-Down. bei 16 ºC inkubieren für 18 Stunden in einem Wasserbad.
    6. Setzen Sie 10 ul der Ligationsproben in 100 & mgr; l der DH-5α kompetenten Zellen und vorsichtig mischen, bevor das Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für 30 min platzieren. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen in einem trockenen Bad bei 42 ° C für 90 s Hitzeschock 7 zu induzieren. Unmittelbar übertragen das Rohr auf Eis für 2 min.
    7. Hinzufügen 900 uL Luria-Bertani (LB) Medium (1% Bacto Trypton, 0,5% Bacto Hefe extract, und 0,5% NaCl, pH 7,0) in das Röhrchen. bei 37 ºC inkubieren mit 150 Umdrehungen pro Minute für 45 Minuten schütteln. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 4000 x g für 10 Minuten und den Überstand verwerfen.
    8. Resuspendieren des Pellets mit 50 & mgr; l LB-Brühe und verteilt jede Transformation auf vorgewärmte LB-Platten, enthaltend 100 ug / ml Ampicillin. Die Inkubation bei 37 ° C für 16 Stunden.
    9. Pick-up eine einzelne Kolonie mit einer 200 ul Spitze und legen Sie sie in 3 ml LB-Brühe, die 100 ug / ml Ampicillin in einem lose verschlossen 15 ml-Röhrchen. bei 37 ºC inkubieren mit 150 Umdrehungen pro Minute für 12 h unter Schütteln.
    10. Extrahieren Sie die Plasmid - DNA 8 aus jeder Kultur und sequenzieren es T7 - Promotor und T7 - Terminator - Primer unter Verwendung der Sequenz 9 zu bestätigen.
  4. Nach Sequenzbestätigung, 10 ng DNA aus diesen mit verschiedenen Längen von YGNNV Hüllprotein - Gen in den BL-21 (DE3) -Stamm von E. coli durch uns pET-20b (+) Plasmide transformierening die Hitzeschock - Methode 7. Führen Sie die Schritte 2.3.6-2.3.8 die Transformation durchzuführen.
  5. Übertragen einer einzelnen Kolonie aus jeder transformierten E. coli BL-21 - Zellen in 3 ml LB - Brühe , die 100 ug / ml Ampicillin in einem lose capped 15 ml - Röhrchen. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C mit 150 Umdrehungen pro Minute schütteln.
  6. Man kühlt die Kultur auf 25 ºC , wenn die OD 600 der Kultur etwa 0,6 ist und fügen IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM , die Expression des rekombinanten Proteins zu induzieren. Inkubieren Sie die Kultur für eine zusätzliche 4 h bei 25 ° C mit 200 Umdrehungen pro Minute schütteln.
  7. 1 ml der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 1 min und den Überstand verwerfen.
  8. Zellpellet in 100 ul Denaturierungspuffer (8 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat und 0,5 M NaCl, pH 7,4) durch Auf- und Abpipettieren mit einer Mikropipette. Mischen durch kräftiges Vortexen.
    HINWEIS: Die Probe solutions sollte nun semi-transparent, ein wenig klebrig, und bereit für die Dot-Blot-Hybridisierungstest ist.

3. Entwurf und Synthese von überlappenden Peptiden

  1. Design und Synthese von 3 serielle 20-mer Peptide , die jeder mit seinem Nachfolger überlappen um 10 AS - Reste aus dem 195-338 aa Bereich des YGNNV Hüllprotein des Epitopbereichs von RG-M56 mAb durch Dot - Blot zu verengen.
  2. Design und Synthese von 3 drei 8-mer - Peptide (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 und 199 VLCRWSVR 206) mit einer Überlappung von 6 AS - Reste auf die nächste synthetisches Peptid , das das Epitop Region von 195-206 aa durch Dot - Blot zu verengen.
  3. Design und Synthese von 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 und 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201 und 197 VSVLCR 202) und 5-mer - Peptide (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201 und 198 SVLCR 202) mit einer Überlappung von 6, 5 und 4 aa - Reste jeweils an ihren benachbarten Peptide die zur Minimierung Epitopbereichs durch dot-Blot.

4. Dot-Blot-Hybridisierung

  1. Auflösen jedes synthetisierte Peptid in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 10 mg / mL.
    HINWEIS: Um die vielfältigen Löslichkeit von synthetischen Peptiden zu überwinden, alle synthetischen Peptide sollten in DMSO gelöst werden. DMSO ist ein gutes Lösungsmittel vollständig hydrophob oder hydrophile Peptide lösen.
  2. Genießen Sie die Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran mit Methanol für 2 min.
    HINWEIS: PVDF-Membran ist bis zu 100% beständig DMSO; andere können nicht so sein.
  3. Äquilibrieren die PVDF-Membran mit modifizierten Towbin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin und 0,1% SDS, pH 8,3) für2 Minuten.
    HINWEIS: 10-20% (v / v) Methanol kann modifiziert Towbin Puffer hinzugefügt werden die Übertragungsergebnisse zu verbessern.
  4. Spülen Sie ein Stück Papier Chromatographie mit dem modifizierten Towbin-Puffer. Legen Sie die PVDF-Membran auf die Chromatographie-Papier. Warten, bis der modifizierte Towbin Puffer aus der PVDF Membranoberfläche verschwunden ist, bevor mit dem nächsten Schritt fort.
  5. Fügen Sie 2 ul jeder Peptidprobe an die Membran mit einer 10 & mgr; l Spitze. Der Luft trocknen die PVDF-Membran auf der Chromatographie-Papier für 10 min. Fügen Sie jede Peptidprobe langsam und allmählich auf die Membran zu viel Diffusion zu vermeiden.
  6. Blockieren die Membran in TBST-Puffer (0,05% (v / v) Tween-20, 20 mM Tris und 150 mM NaCl, pH 7,4) mit 5% Magermilch 30 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert.
  7. Hinzufügen RG-M56 mAb bei einer Endverdünnung von 1: 1000 in TBST-Puffer mit 5% fettfreier Milch in die Membran. Inkubieren Sie die Membran bei 37 ºC für 1 h unter leichtem Schütteln.
  8. Entfernen Sie die Antikörper solution. Waschen Sie die Membran in TBST-Puffer für 5 Minuten unter leichtem Schütteln. Zweimal wiederholen.
  9. Fügen der sekundäre Antikörper (Ziege-anti-Maus IgG, Fc, konjugiert mit alkalischer Phosphatase) in einer Endverdünnung von 1: 5000 in TBST-Puffer mit 5% fettfreier Milch in die Membran. Inkubieren Sie die Membran bei 37 ºC für 1 h unter leichtem Schütteln.
  10. Entsorgen Sie die Antikörperlösung. Waschen Sie die Membran in TBST-Puffer für 5 Minuten unter leichtem Schütteln. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal.
  11. Entwickeln der Membran mit BCIP / NBT-Substratlösung während 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Entwicklung durch die Membran mit ddH 2 O gewaschen , wenn das Signal erscheint.
  12. Der Luft trocknen die Membran und erfassen die Dot-Blot-Bild ein Bild System.
  13. Messen der Intensität jedes Dot - Blot unter Verwendung von Bildanalysesoftware 3.

5. Alaninscanning und Substitution

  1. Entwerfen und zu synthetisieren 3 Alanin und methionine Substitutionspeptide. Ersetzen Sie jede aa Rückstand mit Alanin für die 8-mer Peptid 195 VNVSVLCR 202 und synthetisieren Peptide 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 und 195 VNVSVLCA 202 . Ersetzen aa Rest Leucin 200 zu Methionin das SJNNV Genotyp - Epitop - Peptid 195 VNVSVMCR 202 zu schaffen.
  2. Folgen Sie Abschnitt 4 zu Alanin-Scanning und Substitutionsmutagenese durchführen Dotblotting.

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Representative Results

Das Ziel dieses Experimentes war es ein Epitop durch Dot-Blotting unter Verwendung von mAb zu identifizieren. Um schnell und effizient verengen die antigene Region anerkannt durch mAb, die in voller Länge und seriell abgeschnitten YGNNV rekombinanten Hüllproteine mit einem 6xHis Fusions - Tag am C-Terminus wurden aus einem E. coli - PET - Expressionssystem 10 (1A) ausgedrückt. Die resultierenden rekombinanten Proteine ​​wurden auf die PVDF-Membran mit RG-M56 mAb und anti-6xHis Antikörper für Dot-Blot-Hybridisierung gesichtet. Der Punkt Blotting ergab positive Signale gegen 1-338 aa ( in voller Länge), 51-338 aa, und 195-338 aa, aber nicht 1-100 aa oder 1-200 aa rekombinante Proteine (1B). Die Punktanordnung gegen den Antikörper anti-6xHis hybridisiert und bestätigte die Expression aller rekombinanten Proteinen. Diese Daten zeigen, daß das Epitop von RG-M56 mAb Erkennung in einem 144-aa Protein rekombinantes nea liegtr den C-Terminus von YGNNV Hüllprotein (195-338 aa).

Anschließend wurden serielle 20-mer Peptide mit 10 aa-Reste langen Überschneidungen auf ihre Nachbarn wurden aus der Folge von 144-aa rekombinantes Protein für Peptid-Scanning entwickelt und synthetisiert die Epitopbereichs zu verengen. Diese synthetischen Peptide wurden auf eine PVDF-Membran getupft und einer Dot-Blot-Hybridisierung unter Verwendung von RG-M56 mAb. Das Ergebnis zeigte positive Signale nur auf dem Peptid 195-214 aa und der positiven Kontrolle, 195-338 aa rekombinantes Protein (2A). Da das Epitop innerhalb des Peptids 195-214 aa Region, aber nicht das Peptid 205-224 aa Region, drei serielle 8-mer-Peptide mit 6-AS-Reste überlappen von aa Rest 195-206 (Peptide 195-202 aa befindet, 197- 204 aa und aa 199-206) wurden entworfen und synthetisiert. Dot-Blot-Hybridisierung Ergebnisse zeigten positive Signale auf dem Peptid 195-202 aa und die positive Kontrollpeptid 195-214 aa mitRG-M56 mAb (2B).

Alanin - Scanning - Mutagenese und Substitutions wurden durchgeführt , um die Spezifität jedes aa - Rest der 8-mer - Epitop, 195 VNVSVLCR 202 zu bewerten. Jeder aa-Rest der 8-mer-Peptid wurde einzeln durch Alanin ersetzt. Die Array-Alanin-Mutation Peptid wurde dann auf eine PVDF-Membran 195-202 aa als eine Positivkontrolle unter Verwendung von Peptid platziert. Dot-Blot - Analyse zeigte , dass die drei Mutationen ersetzt, V197A, V199A und C201A, die Bindungsaffinität von RG-M56 mAb (3A) aufgehoben. Obwohl aa - Rest 200 im SJNNV Genotyp Epitop Methionin ist, im Gegensatz zu einem Leucin in den anderen vier Betanodavirus Genotyp Epitope, die SJNNV Genotyp Sequenz 195 VNVSVMCR 202 zeigte positive Bindungsaffinität gegen RG-M56 mAb, wie die von der positiven Kontrolle (3A). Dieses Ergebnis zeigt, dass die Epitope of alle Betanodavirus Genotypen können durch RG-M56 mAb erkannt werden. Die Bindungsaffinität jedes aa - Rest an das Epitop Stelle beteiligten weiteren wurde durch Messung der Signalintensität des Dot - Blot jedes Alanin - Substitution unter Verwendung von Bildanalysesoftware (3B) quantifiziert. Die Intensitäten der V197A, V199A und C201A Substitutionen wurden auf 10,2% reduziert, 18,6% und 8,5%, bzw., wenn sie mit denjenigen der positiven Kontrolle verglichen (100%), während die V195A, S198A, L200A, R202A, und L200M Substitutionen zeigten höhere oder ähnliche Intensitäten wie die der positiven Kontrolle. Es ist erwähnenswert, dass die Einflussstärke der N196A Substitution nicht eindeutig ist, mit einer 37,4% igen Reduktion der positiven Kontrolle. Diese Ergebnisse zeigen, dass V197, V199 und C201 sind wesentliche Reste für die Bindung von RG-M56 mAb.

Die Alanin-Scanning-Mutagenese Ergebnisse zeigen, dass die AS-Reste V195, N196 und R202 könnenwerden durch Alanin ersetzt, die weiter könnte die Epitopbereichs an beiden Enden eingegrenzt werden bedeutet, dass. Daher wird der Schritt-für-Schritt getrimmt Peptidkartierung durch 7-mer, 6-mer und 5-mer Schritt synthetischen Peptide wurde entwickelt, um die antigene Region zu minimieren. Das positive Signal vorhanden war auf dem 6-mer synthetisches Peptid 196 NVSVLC 201, aber nicht auf den 7-mer und 5-mer synthetischen Peptiden (Abbildung 4). Diese Daten zeigen , dass das minimale Epitop von NNV Hüllprotein erkannt durch RG-M56 mAb ist das 6-mer - Peptid, 196 NVSVLC 201.

Abbildung 1
Abbildung 1: Die Reduktion der Epitopbereich unter Verwendung seriell abgeschnitten rekombinanter Proteine und monoklonale Antikörper. (A) Karte des seriell verkürzten rekombinanten NNVCPs. NNVCP 1-338 aa ist die in voller Länge Hüllprotein. (B) Dot-blot Analyse rekombinanter NNVCPs. Links: Karte der seriell abgeschnitten YGNNV rekombinanten Hüllproteine ​​auf der PVDF-Membran. Mitte: Die Dot-Blot-Analyse wurde Antikörper anti-6xHis durchgeführt werden. Rechts: Die Dot-Blot-Analyse wurde RG-M56 mAb durchgeführt werden. NNVCP: Nerven Nekrose-Virus-Hüllprotein; aa: Aminosäure; PVDF: Polyvinylidenfluorid; N: N-Terminus; C: C-Terminus; mAb: monoklonaler Antikörper. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Feinkartierung des Epitops Region unter Verwendung von synthetischen Peptiden. (A) Links: Die Aminosäuresequenzen der 20-mer synthetischen Peptide wurden ausgerichtet NNVCP 195-338 aa; jeweils vorhergehenden Peptid hatte eine 10 aa-Reste langen Überlappung mit dem folgenden Peptid. Rechts: Karte des synthetic Peptide auf der PVDF-Membran. Rekombinante NNVCP 195-338 aa wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Dot-Blot-Analyse wurde RG-M56 mAb durchgeführt werden. (B) Links: Die Aminosäuresequenzen der 8-mer synthetischen Peptiden, 195-202 aa, 197-204 aa, und 199-206 aa; jeweils vorhergehenden Peptid hatte eine 6 aa-Reste langen Überlappung mit dem folgenden Peptid. Synthetische Peptid 195-214 aa wurde als positive Kontrolle verwendet. Rechts: Die Dot-Blot-Analyse wurde RG-M56 mAb durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Alanin - Scanning - Mutagenese und Substitution des 195 VNVSVLCR 202 Epitops. (A) Aminosäuresequenzen von Substitutionsmutagenese und Dot-Blot - Analyse. Jede aa residue des Epitopbereichs, 195-202 aa, wurde einzeln durch Alanin ersetzt. L200M Substitution ist die SJNNV Genotyp-Sequenz an der Betanodavirus Hüllprotein Epitopbereichs. Synthetische Peptid 195-202 aa wurde als positive Kontrolle verwendet. Die ersetzten AS-Reste sind unterstrichen. (B) Quantifizierung des Dot - Blot - Signal - Bindungsaffinität. Die Signalintensität der Positivkontrolle (195-202 aa) wurde als 100% bestimmt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Mindest Epitop Bestimmung. Die 7-mer (A), 6-mer (B) und 5-mer (C) synthetische Peptide 195-202 aa wurden verwendet , um die minimale Epitop von RG-M56 mAb erkannt zu identifizieren. Synthetische Peptide 195-202 aa wurde als positive Kontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und einfache Technik, um ein mAb anerkannte lineares Epitop zu identifizieren. Unter Berücksichtigung der Kosten für die Peptidsynthese und die Produktionseffizienz der Synthese von Peptiden wurde die antigene Region des Virus-Hüllproteins reduziert durch serielles trunkierten rekombinanten Proteinen vor Peptid-Scanning-Analyse exprimieren. Als solche wurde die zuverlässig und effizient E. coli pET Expressionssystem diese seriell trunkierten rekombinanten Proteine als rekombinante Proteine mit Molekulargewichten zwischen 10 bis 50 kDa können leicht durch dieses System exprimiert zu erzeugen genutzt werden. Auf diese Weise kann das Epitop leicht auf eine überschaubare 100 bis 200 aa Bereich verengt werden. Die pET-20b (+) Vektor wurde speziell ausgewählt, da es eine Sequenz enthält, das für die Expression von 6xHis-Tags, so dass die erzeugten 6xHis-tag-Fusionsproteine, die eine anti-6xHis Antikörper immunodetected werden mit dem Ausdruck des zu bestätigen rekombinante proteins. Die hergestellten rekombinanten Hüllproteine ​​wurden dann über eine Dot-Blot-Hybridisierungstest-RG-M56 mAb analysiert. Ein alternatives Verfahren zum rekombinanten Protein Epitop Bestimmung der exprimierten rekombinanten Proteine über immobilisierte Metallionen - Affinitätschromatographie 10, trennen die rekombinanten Proteine mit SDS-Polyacrylamid - Gelelektrophorese und Western Blot - Analyse durchzuführen 3 zu reinigen.

Um weiter und feiner die Epitop-Stelle durch die Ergebnisse der Dot-Blot-Hybridisierungsanalyse unter Verwendung seriell trunkierten rekombinanten Proteinen, überlappenden synthetischen Peptiden mit verschiedenen Größen bestimmt Karte wurden entwickelt. Unter den verschiedenen möglichen Längen von synthetischem Peptid zu synthetisieren, 20-mer mit 10 aa-Reste lange überlappende Peptide wurden zuerst in der Peptid Abtastung gewählt, die beide für ihre hohe Synthese Reinheit (bei etwa 90%) und für die Peptidlänge, genug für die Suche nach dem kontinuierlichen epitope durch Antikörper B-Zelle 11 erkannt. Beachten Sie, dass die Genauigkeit und Reinheit der synthetisierten Peptide verschlechtern als das synthetisierte Peptid länger ist. Auf diese Weise wurde der Epitopbereich auf etwa 10 aa Reste lang schnell reduziert. Nach dem seriellen 8-mer überlappende Peptide befragt wurden, wurde der lineare Epitopbereichs definiert 195-202 aa-Peptid. Anschließend zeigt Alanin-Scanning dieses 8-mer-Epitop-Peptid die kritische Bindungsaffinität Stärke jedes aa Rest, die Suche nach dem minimalen Epitop ermöglicht. Die wesentlichen Aufgaben des V197, V199 und C201 AS-Reste bedeutet, dass das lineare Epitopbereichs umfasst mindestens 5 AS-Reste, von 197 bis 201 Außerdem AS-Reste V195, N196 und R202 kann, ohne vollständig zu verlieren Bindung durch Alanin ersetzt werden Affinität, was anzeigt, daß der Epitopbereich kann zu 7, 6, oder sogar 5 aa-Reste in der Länge reduziert werden. Kleine Peptidsequenzen können leicht und wirtschaftlich für die Suche von linearen synthetisiert (continuous) Epitope. Jedoch ist dieses synthetische Peptid - Scanning - Technik zur Bestimmung eines diskontinuierlichen Epitops eines Antikörpers nicht geeignet, wenn es mit Epitop Exzision und massenspektrometrische Analysen kombiniert 12.

In diesem Protokoll wurde ein Dot-Blot-Hybridisierungstechnik verwendet, um die lineare Epitop eines mAb zu suchen. Dot-Blot-Hybridisierung ist eine einfache, aber effektive Methode. Zu Beginn der Suche, wenn der Epitopbereich aus einem großen Gebiet verengt, ist das Hauptanliegen entweder ein positives oder negatives Signal nach der Hybridisierung des Antikörpers an ein Zielmembrangebundenes Protein, da die meisten mAbs zu beobachten, nur binden an ein spezifisches Epitop eines antigenen Proteins (1 und 2). Wenn jedoch unter Verwendung von Dot-Blot-Hybridisierung die Bindungs ​​Verfügbarkeit jedes aa-Rest innerhalb der Epitopbereich gegen den Antikörper, wie beispielsweise durch Alanin-Substitution Mutagenese zu erkunden,die Signalintensität jeder Rest ersetzt aa durch Dot-Blot bestimmt sollten in die Gesamtbindungs ​​Bedeutung berücksichtigt werden. Daß Signalintensität kann leicht unter Verwendung von Bildanalysesoftware (3B) oder ein Densitometer quantifiziert werden. Alternativ kann ein enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) durchgeführt werden 3 den Grad der Bindungsaffinität und die sich ergebende Signalstärke zu quantifizieren.

In der früheren Studie, die einzige Hüllprotein von nicht-Umschlag Nerven Nekrose - Virus war immun anerkannt von 10 mAb mit einem hohen Neutralisationsindexwert zwischen 6,5-4,5 (log 10 NI) 2. Die hochspezifischen Erkennung Fähigkeit der mAbs wurden weiter für die Entwicklung der für den Nachweis von NNV-infizierten Fische 13 in einem Schritt, schnelle immunochromatographic Diagnose - Kit verwendet. Das Antigenepitops nervöser Nekrose-Virus-Hüllprotein wurde von der RG-M18 erkanntmAb als ein 8-mer - Peptid, 195 VNVSVLCR 202 3, durch die ein neuartiges NNV - Rezeptor (nicht veröffentlichte Daten) identifiziert wurde. In der vorliegenden Studie wurde das Epitop des Nerven Nekrose - Virus - Hüllprotein wurde weiter auf einem 6-mer - Peptid verengt, 196 NVSVLC 201, durch den anderen mAb, RG-M56.

Es ist unerwartet , dass zwei 7-mer - Peptide (196 NVSVLCR 202 und 195 VNVSVLC 201) , das 6-mer Peptid 196 NVSVLC 201 nicht erkannt werden von RG-M56 mAb (4A). Eine vernünftige Interpretation ist, dass, obwohl die Umgebungs Reste V195 und R202 können an die Bindungs-Wechselwirkung zwischen dem Epitop und der Antikörper nicht direkt beitragen, die flankierenden Reste, die die Bildung der korrekten Peptidkonformation für die Antikörpererkennung beeinflussen. Das Auftreten von V195 oder R202 an deren flankierende Terminus allein kann das synthetische Peptid verrenkenKonformation für die Antikörper-Erkennung und Bindung. Das Epitop Konformation wird durch die Stärke der beiden Enden angetrieben werden , V195 und R202, die in dem 8-mer synthetisches Peptid , gegeneinander ausgeglichen sind, 195 VNVSVLCR 202, und entgegen in der 6-mer synthetisches Peptid, 196 NVSVLC 201. Die AS-Reste, V195, N196 und R202 können einzeln durch Alanin, ohne vollständig zu verlieren Bindungsfähigkeit ersetzt werden, und somit zeigen die Alanin-Scanning-Mutagenese-Ergebnisse, dass diese drei aa-Reste keine signifikante Rolle bei der Erkennung spielen und die Bindung von RG -M56 mAb. Jedoch nach einem weiteren Rest aus der 6-mer synthetisches Peptid Trimmen, 196 NVSVLC 201, das 5-mer Peptid, 197 VSVLC 201, ohne die N196 in den N-terminal - flankierende Region, verliert die Fähigkeit von RG erkannt und gebunden werden , -M56 mAb (4C). Dieses Ergebnis legt nahe, dass der N196 Rückstand kann auch plegen eine wichtige Rolle in der flankierenden Region des Epitop das korrekte Epitop Konformation zu stabilisieren, um die Erkennung und Bindung von RG-M56 mAb zu erleichtern. Die Bedeutung der flankierenden Reste der Epitopbereich umgebenden hatte auch durch andere Antigen-Antikörper-Bindungsstudien untersucht. Die Bedeutung der aa-Reste flankieren das α-Bungarotoxin Epitopbereich für die Bindung von Antikörpern umgebenden wurde mit verschiedenen aa-Substitutionen innerhalb der gleichen cholinergen subsite sucht. Sie wurden dann entweder als wesentlich beurteilt, einflussreich, oder nicht einfluss 14. Es wurde auch gefunden, daß die Spezifität des Antikörpers erkannten Epitop von Karzinom-assoziierte Mucine epithelial kann weiter durch den flankierenden AS-Reste beeinflußt werden. Diese Wirkungen können Konformationsänderungen Barrieren darstellen, die die Bindung eines Antikörpers an ein Epitop 15 behindern können.

Das 6-mer - Epitop, 196 NVSVLC 201 </ Sub>, hat extrem hydrophoben Eigenschaften, wobei vier hydrophoben Resten, darunter zwei Valine (197 und 199), einer Leucin (200) und ein Cystein (201) (reduzierte Form). Rückstände V197, V199 und C201 sind entscheidend für die RG-M56 mAb Erkennung und Bindung, wie durch Alanin-Scanning-Mutagenese bestimmt. Das Epitop - Region wurde in einer von acht antiparallelen β-Stränge des Shell - Domäne (S-Domäne) des NNV Hüllprotein 16 gelegen. Interessanterweise scheint das Epitop nicht auf der Außenseite Vorsprung Domäne erscheinen, aber versteckt in der Gelee-Rolle Struktur der S-Domäne unter den anderen antiparallele β-Stränge. Das Epitop, mit seiner hohen Hydrophobizität kann eine stabilere Mikroumgebung in dieser Vertiefung erhalten. Darüber hinaus wurde die 195 VNVSVLCR 202 3 Peptid dieses Epitop fand die Ausbreitung des Riesen-Grouper Nerven Nekrose - Virus in Grouper Gehirnzellen zu behindern. Daher wurde dieses Epitop-Peptid vorgeschlagen, eine Co seinmpetitor in der Rezeptor-Bindungsdomäne beteiligt für das Eindringen des Virus erforderlich 3. Es wurde angenommen , dass Peptid - Entry - Inhibitoren, die hydrophobe und / oder amphipatische Reste können die physikalischen Konformation und Chemie der Zellmembran Schnittstellen verändern und die Fusion von zellulären und viralen Membranen 17 behindern können. Darüber hinaus haben viele synthetische Peptid Entry - Inhibitoren stark hemmenden Eigenschaften gegen verschiedene Virusinfektionen 17, 18 gezeigt. Somit kann das identifizierte Epitop-Peptid mit hydrophoben Resten und starke Eintritt Hemmung gegen NNV Infektion die Entwicklung von therapeutischen Peptid Drogen erleichtern.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hybrid-SFM medium Gibco 12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069
Pfu DNA Polymerase  Thermo Scientific  EP0502  Including buffers
T4 DNA Ligase Roche 10799009001 Including buffers
NdeI  New England Biolabs R0111S Including buffers
XhoI  New England Biolabs R0146S Including buffers
pET-20b(+) vector Novagen, Merck Millipore 69739
E. coli DH-5α competent cell RBC Bioscience RH617
E. coli BL-21(DE3) competent cell RBC Bioscience RH217
Ampicillin Amresco 0339-25G
LB broth  Invitrongen 12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) MDBio, Inc. 101-367-93-1
Methanol Merck Millipore 106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T.Baker X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Glycine Amresco 0167-5KG
Tris Affymetrix, USB 75825
NaCl Amresco 0241-1KG
EDTA Amresco 0105-1KG
Glycerol Amresco 0854-1L
NaN3 Sigma S2002-500G
BCIP/NBT PerkinElmer NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody Jackson ImmunoResearch 115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) Merck Millipore IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow Merck Millipore 16-266
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106
UVP BioSpectrum 600 Image System UVP n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 UVP n/a
MyCycler thermal cycler BioRad 1709713

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References

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