Espectroscopía de RMN como una herramienta robusta para la Evaluación Rápida del perfil lipídico de los suplementos de aceite de pescado

Chemistry

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Summary

Aquí, de alta resolución 1 H y 13 C de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) se utilizó como una herramienta rápida y fiable para el análisis cuantitativo y cualitativo de suplementos de aceite de pescado encapsuladas.

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Williamson, K., Hatzakis, E. NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements. J. Vis. Exp. (123), e55547, doi:10.3791/55547 (2017).

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Abstract

La dieta occidental es deficiente en n -3 ácidos grasos, por lo tanto, se recomienda el consumo de suplementos de aceite de pescado para aumentar la ingesta de estos nutrientes esenciales. El objetivo de este trabajo es demostrar el análisis cualitativo y cuantitativo de los suplementos de aceite de pescado encapsuladas usando de alta resolución 1 H y 13 C espectroscopía de RMN utilizando dos instrumentos de RMN diferentes; un 500 MHz y un instrumento de 850 MHz. Tanto de protones (1 H) y carbono (13 C) Los espectros de RMN se pueden utilizar para la determinación cuantitativa de los constituyentes principales de los suplementos de aceite de pescado. Cuantificación de los lípidos en los suplementos de aceite de pescado se logra mediante la integración de las señales de RMN correspondientes en los espectros 1D relevante. Los resultados obtenidos por 1 H y 13 C RMN están en buen acuerdo con el uno al otro, a pesar de la diferencia en la resolución y la sensibilidad entre los dos núcleos y los dos instrumentos. Oferta 1 H RMNsa análisis más rápido en comparación con el 13 C RMN, como el espectro se puede grabar en menos de 1 min, en contraste con 13 análisis de RMN de C, que dura de 10 min a una hora. El espectro de RMN 13 C, sin embargo, es mucho más informativo. Puede proporcionar datos cuantitativos para un mayor número de ácidos grasos individuales y se puede utilizar para determinar la distribución posicional de los ácidos grasos en el esqueleto de glicerol. Ambos núcleos pueden proporcionar información cuantitativa en un solo experimento sin la necesidad de purificación o separación pasos. La fuerza del campo magnético afecta principalmente a los espectros de RMN 1 H debido a su menor resolución con respecto a 13 C RMN, sin embargo, los instrumentos de RMN incluso menor costo se pueden aplicar eficientemente como un método estándar por los laboratorios de la industria alimentaria y de control de calidad.

Introduction

El consumo de n -3 ácidos grasos en la dieta ha demostrado ser beneficioso contra varias condiciones tales como trastornos del corazón 1, 2, 3, enfermedades inflamatorias 4 y diabetes 5. La dieta occidental es considerada pobre en ácidos grasos n -3 y por lo tanto se recomienda el consumo de suplementos de aceite de pescado para mejorar la n -6 / n -3 equilibrio en la nutrición de los consumidores 1. A pesar del reciente aumento en el consumo de suplemento de aceite de pescado, sigue habiendo dudas sobre la seguridad, la autenticidad y la calidad de algunos de estos productos. El análisis de la composición rápida y precisa de los suplementos de aceite de pescado es esencial para evaluar adecuadamente la calidad de estos productos comerciales y garantizar la seguridad del consumidor.

Las metodologías más comunes para la evaluación de suplemento de aceite de pescados son la cromatografía de gases (GC) y espectroscopia infrarroja (IR). Si bien estos son métodos altamente sensibles, sufren de varios inconvenientes 6. El análisis de GC es que consume tiempo (4-8 h), ya que la separación y la derivatización de compuestos individuales se requiere 7 y la oxidación de lípidos se pueden producir durante el análisis 8, 9. Aunque la espectroscopia de IR puede ser cuantitativa, se requiere un modelo de predicción a ser construido usando regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR), aunque hay excepciones en el que bandas de IR puede ser atribuida a un solo compuesto 10. PLSR requiere el análisis de un gran número de muestras, lo que aumenta el tiempo del análisis 11. Por esta razón, hay un interés creciente en el desarrollo de nuevas metodologías analíticas que permiten un análisis preciso y rápido de un gran número de muestras de aceite de pescado. Organizaciones como la OfiOficina de Suplementos Dietéticos (ODS) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) han colaborado con la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC) para desarrollar estos nuevos métodos 12, 13.

Uno de los métodos analíticos más prometedores para la detección y la evaluación de las matrices de múltiples componentes, tales como suplementos dietéticos, es la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) 14, 15. espectroscopía de RMN tiene varias ventajas: es una técnica no destructiva y cuantitativa, se requiere un mínimo o ningún preparación de la muestra, y se caracteriza por una excelente precisión y reproducibilidad. Además, la espectroscopía de RMN es una metodología respetuosa del medio ambiente, ya que utiliza sólo pequeñas cantidades de disolventes. El principal inconveniente de la espectroscopía de RMN es su sensibilidad relativamente baja en comparación con otros analytimétodos Cal, sin embargo, los recientes avances tecnológicos en la instrumentación, como los campos más fuertes magnéticos, sondas criogénicas de varios diámetros, procesamiento de datos avanzado, y secuencias de pulsos versátiles y técnicas han aumentado la sensibilidad hasta el rango de nM. Mientras RMN instrumentación es de alto costo, el tiempo de vida de los espectrómetros de RMN y las muchas aplicaciones de RMN reducir el costo de los análisis en el largo plazo. Este protocolo de vídeo detallada está destinada a ayudar a los nuevos practicantes en el campo evitar los errores asociados con la 1 H y 13 C RMN análisis espectroscópico de suplementos de aceite de pescado.

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Protocol

1. Preparación de la muestra de RMN

Nota: Precaución, consulte todas las hojas de datos de seguridad (MSDS) antes de usar. Cloroformo deuterado (CDCl3) usado en la preparación de muestras es tóxico. Por favor, use todas las prácticas apropiadas de seguridad al realizar la preparación de muestras que incluye el uso de una campana de humos y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, cerrado-dedo del pie zapatos).

  1. Preparación de 1 H y 13 C muestras
    1. Extracto de 120 l (~ 110 mg) de aceite de pescado a partir de una cápsula de la dieta utilizando una jeringa y colocarlo en un vial de vidrio de 4 ml. Anotar el peso del aceite de pescado.
    2. disolución de la muestra
      1. Disolver aproximadamente 120 l de aceite de pescado en 500 l de CDCl 3 que contiene 0,01% de tetrametilsilano (TMS) que se utiliza como una referencia para el 1 H y 13 turnos C químicas.
        NOTA: TMS es el usod Sólo para la calibración de desplazamiento químico (ver números de paso 2.2.1.2.7 y 2.2.2.2.7), no para la cuantificación (ver números de paso 2.2.1.3 y 2.2.2.3) fines.
      2. Preparar un 2,6-di- terc-butil-4-metilfenol (BHT) solución madre, si la cuantificación expresa en mg / g se desea, disolviendo aproximadamente 220 mg de BHT y 15 mg de acetilacetonato de cromo (III) (Cr ( acac) 3) en 20 ml de CDCl 3 que contienen 0,01% de TMS. Utilice 500 l de la solución madre para disolver 100 mg (± 10 mg) de aceite de pescado.
    3. Después de disolver el aceite (esto tarda unos pocos segundos), la transferencia de la totalidad de la solución directamente en una alta calidad tubo de RMN de 5 mm y adjuntar una tapa. Analizar las muestras dentro de las 24 h después de preparar las muestras.

la preparación 2. Instrumento RMN

Nota: Precaución, ten en cuenta que la presencia de fuertes campos magnéticos producidos por los instrumentos de RMN puede afectar a los dispositivos médicos y implhormigas, tales como marcapasos y prótesis quirúrgicas, así como artículos electrónicos tales como tarjetas de crédito, relojes, etc. se requiere precaución adicional cuando el análisis se realiza usando imanes no apantallamiento. Dos instrumentos de RMN se usan para la adquisición de 1 H y 13 espectros de RMN de C; un espectrómetro opera a 850,23 MHz y 213,81 MHz para 1H y 13 núcleos de C, respectivamente, equipado con una inversa de triple resonancia de helio-enfriada (TCI) sonda de 5 mm y un espectrómetro de operando a 500,20 MHz y 125,77 MHz para 1H y 13C núcleos, respectivamente, equipado con una amplia banda observada (BBO) enfriado con nitrógeno sonda de 5 mm. Todos los experimentos se realizaron a 25 ± 0,1 ºC y los espectros se procesaron por un paquete de datos de RMN adquisición análisis y el software de procesamiento estándar (ver Lista de Materiales).

  1. Preparación para la adquisición de los espectros de RMN
    Nota: 1 H y 13 C espectros de RMNpueden ser adquiridos en consecuencia, sin necesidad de retirar la muestra del instrumento.
    1. Introduce el tubo de RMN en una turbina spinner (ver Lista de Materiales).
    2. Coloque el spinner y el tubo en la parte superior de un calibre de profundidad graduada y empuje suavemente la parte superior del tubo hasta que su parte inferior toca la parte inferior del indicador.
    3. Coloque la muestra de RMN en un lugar abierto de la SampleCase. Tenga en cuenta el número de ranura de la muestra se coloca en.
    4. Para cargar la muestra en la RMN, vuelva a la computadora de control y el tipo 'sx #', donde # es la ranura de la SampleCase la celebración de su muestra.
    5. Esperar a que la señal de deuterio de CDCl3 a aparecer en la pantalla de la ventana de bloqueo. Si no aparece automáticamente, escriba "lockdisp". Tan pronto como la señal de deuterio es visible, tipo "de bloqueo" en la línea de comandos y seleccione "CDCl 3" de la lista del disolvente con el fin de bloquear la muestra usando la resonancia de deuterio CDCl 3.
      NOTA: El deuterio signal no puede aparecer si el usuario anterior usa un disolvente diferente. El usuario debe esperar a que el indicador de que la muestra se ha reducido, a continuación, bloquear.
    6. Tipo "bsmsdisp" en la línea de comandos para asegurarse de giro no está activo. Si el botón "SPIN" es verde, haga clic para desactivar la hilatura.
    7. Escriba el comando "nuevo" para crear un nuevo conjunto de datos. Introduzca un nombre para el conjunto de datos en la ficha "Nombre" y el número de experimento en la pestaña "EXPNO". Usar número "1" en la pestaña "PROCNO". En la pestaña "Experimento", pulse "Seleccionar" y seleccione el archivo de parámetros "Proton". Escribe el título del experimento en la pestaña "TITLE". Haga clic en Aceptar."
    8. Tipo "getprosol" en la línea de comandos para obtener los parámetros estándar para la sonda de RMN actual y el disolvente.
    9. Repita el paso 2.1.7 para 13 C, la selección de la secuencia de pulsos "C13IG" en la pestaña "Experimento" para la 1D 13 C inversa gado desacoplado experimento.
    10. Tipo "getprosol" en la línea de comandos para obtener los parámetros estándar para la sonda de RMN actual y el disolvente.
    11. Escriba el comando "Atma" para llevar a cabo la sintonización automática y la congruencia de la sonda para ambos núcleos de carbono y protones.
    12. Realizar gradiente unidimensional shimming para lograr un campo magnético de gran homogeneidad, y forma de la línea de este modo óptimo para las señales de RMN.
      1. Utilice el procedimiento automático estándar para 1D calce, simplemente mediante la ejecución secuencial de los comandos "qu topshim 1dfast ss", "qu topshim tuneb ss," e "Informe qu topshim" en la línea de comandos.
  2. optimización de parámetros
    1. calibración 90 ° pulso
      1. Crear un nuevo conjunto de datos para 1 H (consulte los pasos 2.1.7 y 2.1.8).
      2. Escriba el comando "paropt" en la línea de comandos para iniciar el programa de automatización para la calibración del Pul 90 °se. Seleccione la duración del pulso, p1, como el parámetro a modificar.
      3. Comienzan con "2" mu s como el valor inicial de p1, introduzca "2" microsiemens incrementos y realizar experimentos de "16".
      4. Crear un nuevo conjunto de datos para 13 C (véase la etapa 2.1.9) y repetir el proceso para 13 núcleos C (consulte los pasos 2.2.1.2 y 2.2.1.3).
    2. T 1 de medición medido por el método nulo 16 para 1 H
      NOTA: El método nulo utiliza la secuencia de impulsos de recuperación de inversión, que consiste en un seguimiento 180 ° pulso por un retraso (tau), para permitir la relajación a lo largo del eje z y una final 90 ° de impulsos que crea la magnetización transversal observable.
      1. Crear un nuevo conjunto de datos para 1 H (consulte los pasos 2.1.7 y 2.1.8).
      2. Tipo "t1ir1d pulprog" para cambiar la secuencia de pulsos para el experimento de inversión-recuperación.
      3. Escriba los siguientes comandos en el commanlínea d para configurar la anchura espectral en ppm, el centro del transmisor de RF, el número de exploraciones el número de exploraciones ficticias y el número de puntos de datos "SW 8", "O1P 3.8", "ns 2" ", DS 2" y "64K td".
      4. "P1 (valor)" Tipo e introduzca los valores de duración de pulso de 90º como se determina mediante la calibración de impulsos (véase el paso 2.2.1) y tipo "p2 (valor)" para el impulso de 180 ° (el valor de duración para los 180 ° pulso es la duración 90 ° pulso multiplicado por dos).
      5. Ajuste el retraso de reciclado a un valor muy grande, tal como 10 s escribiendo "d1 10".
      6. Establecer un valor de tau a corto, como por ejemplo 10 ms, 10 ms escribiendo "d7" en la línea de comandos.
      7. Ajuste la ganancia del receptor (RG) a un valor apropiado usando los "RGA" comando para el cálculo automático de la RG.
      8. Ejecutar un espectro escribiendo el comando "ZG".
      9. Ejecutar Fourier transformación escribiendo "EFP"en la línea de comandos.
      10. Realizar la corrección automática de fase escribiendo los "apk" comando en la línea de comandos. Si se requieren ajustes de fase adicionales para mejorar aún más el espectro, haga clic en la pestaña "Procesos" y haga clic en el icono de "Ajuste de la fase" para entrar en el modo de corrección de fase.
        1. Utilice el de orden cero (0) y los iconos de primer orden (1) de corrección de fase arrastrando el ratón hasta que todas las señales están en modo de absorción negativa. Aplicar y guardar los valores de corrección de fase haciendo clic en el botón "Retorno y Guardar" para salir del modo de corrección de fase.
      11. Aumentar la tau hasta que todos los picos son positivos o anulado repitiendo los pasos 2.2.2.6-2.2.2.9. Para determinar el valor T1, simplemente divida el valor de tau en el que el pico se anula con LN2.
    3. T 1 de medición medido por el método nulo 16 para 13 C
      1. Crear un nuevo conjunto de datos para 13 C (véase la etapa 2.1.9)
      2. Type "t1irpg pulprog" para cambiar la secuencia de pulsos para el experimento de inversión-recuperación para los núcleos de carbono.
      3. Escriba los comandos siguientes en la línea de comandos para configurar la anchura espectral en ppm, el centro del transmisor de RF, el número de exploraciones, el número de exploraciones ficticias y el número de puntos de datos: "sw 200", "O1P 98" , "ns 8", "ds 2" y "64K td".
      4. "P1 (valor)" Tipo e introduzca los valores de duración de pulso de 90º como se determina mediante la calibración de impulsos (véase el paso 2.2.1) y "P2 (valor)" de tipo para el pulso de 180 ° (el valor de duración es los 90 ° duración de pulso multiplicado por dos).
      5. Ajuste el retraso de reciclado a un valor muy grande, tal como 100 s escribiendo "d1 100".
      6. Conjunto de tau a un valor corto, por ejemplo, 100 ms 100 ms escribiendo "d7" en la línea de comandos.
      7. Ajuste el reciganancia er (RG) a un valor apropiado usando los "RGA" comando para el cálculo automático de RG.
      8. Ejecutar un espectro escribiendo el comando "ZG".
      9. Ejecutar Fourier transformación escribiendo "EFP" en la línea de comandos.
      10. Realizar la corrección automática de fase escribiendo los "apk" comando en la línea de comandos. Si se requieren ajustes de fase adicionales para mejorar aún más el espectro, haga clic en el icono de "Ajuste de la fase" y los iconos de corrección de fase de orden cero (0) y la fase (1) corrección de primer orden.
        1. Mientras que hacer clic en los iconos de corrección de orden cero y de fase de primer orden, arrastre el ratón hasta que todas las señales están en modo de absorción negativa. Aplicar y guardar los valores de corrección de fase haciendo clic en el botón "Retorno y Guardar" para salir del modo de corrección de fase.
      11. Aumentar la tau hasta que todos los picos son positivos o anulado repitiendo los pasos 2.2.3.6-2.2.3.9. Para determinarel valor T 1, simplemente dividir el valor tau donde el pico se anula con ln2.
  3. Unidimensional (1D) espectros de RMN
    1. Los espectros de 1 H-RMN
      1. Adquisición de los datos de RMN
        1. Ir al conjunto de datos 1 H creado en el paso 2.1.7 y utilizar la secuencia estándar "pulse-adquirir" pulso "zg", escribiendo "pulprog zg" en la línea de comandos.
        2. Escriba los comandos siguientes en la línea de comandos para configurar la anchura espectral en ppm, el centro del transmisor de RF, el número de exploraciones, el número de exploraciones ficticias, el número de puntos de datos y la duración del pulso para un ángulo de 90 ° de impulsos : "sw 8", "O1P 3.8", "ns 2", "ds 2", "64K td" y "P1 (como determinado por calibración pulso)" (véase la etapa 2.2.1).
          NOTA: 32K puntos de datos se pueden utilizar para el instrumento de 500 MHz.
        3. Establecer un retraso de relajación de 7 s para el instrumento de 500 MHz o 9 s para el instrumento de 850 MHz escribiendo "7s D1" o "D1" 9s, respectivamente, en la línea de comandos.
        4. Ajuste la ganancia del receptor (RG) a un valor apropiado usando los "RGA" comando para el cálculo automático de la RG.
        5. Tipo "baseopt digmod" para adquirir un espectro con la mejora de la línea de base.
        6. Iniciar la adquisición escribiendo el impulso de adquirir comando "ZG" en la línea de comandos.
      2. El procesamiento de los datos de RMN
        1. Tipo "64K si" en la línea de comandos para aplicar cero relleno y establecer el tamaño del espectro real a 64K.
        2. Ajuste el ensanchamiento de línea de parámetros a 0,3 Hz escribiendo "lb 0,3" en la línea de comandos para aplicar una función de ponderación (decaimiento exponencial) con una línea de factor de ensanchamiento de 0,3 Hz antes de la transformada de Fourier.
        3. Ejecutar Fourier transformación escribiendo "EFP" en el comandolínea.
        4. Realizar la corrección automática de fase escribiendo los "apk" comando en la línea de comandos. Si se requieren ajustes de fase adicionales para mejorar aún más el espectro, haga clic en la pestaña "Procesos" y haga clic en el icono de "Ajuste de la fase" y los iconos de corrección de fase de orden cero (0) y de primer orden (1) corrección de fase .
          1. Mientras que hacer clic en los iconos de corrección de orden cero y de fase de primer orden, arrastre el ratón hasta que todas las señales están en modo de absorción positiva. Aplicar y guardar los valores de corrección de fase haciendo clic en el botón "Retorno y Guardar" para salir del modo de corrección de fase.
        5. Aplicar una función de cuarto orden polinomial para la corrección de línea de base en la integración escribiendo el comando "abs n".
          NOTA: Esto asegura una línea de base espectral plana con una intensidad mínima.
        6. Turnos Informe químicos en ppm a partir de TMS = 0). Haga clic en la calibración ( "Calib. Axees "icono), y coloque el cursor con la línea roja en la parte superior de la señal de RMN TMS (pico cercano a 0). Haga clic izquierdo y el tipo de '0'.
      3. Análisis de los datos de RMN
        1. Integrar la región espectral de δ 1,1 a delta 0,6, así como los picos a δ 4,98, δ 5,05 y δ 5,81 usando el icono "Integrar" (en la pestaña "Proceso") y el punto culminante ( "Definir nueva Región") icono. Izquierda haga clic y arrastre a través de las integrales.
          NOTA: Si existe la necesidad de concentrarse en una región, haga clic en el icono resaltado a desactivar y haga clic izquierdo y arrastrar el ratón para hacer zoom en la región. Para ajustar la intensidad umbral, utilice el botón central del ratón, si es necesario. Haga clic en el icono resaltado de nuevo para hacer la función de integración activa, a continuación, pasar a la siguiente pico.
          1. Normalizar la suma de las integrales anteriores a 100 haciendo clic derecho sobre el valor integral que aparecens bajo la señal y seleccionar "Normalizar suma de integrales". Introduzca el valor "100" en el cuadro y haga clic en el "Retorno y Guardar" para salir del modo de integración.
        2. Cuando se utiliza BHT como un estándar interno, integrar el pico a δ 6,98 y establecer la integral iguales a los milimoles de BHT por 0,5 ml de la solución madre.
        3. Incorporar los picos de interés (véase el paso 2.3.1.3.1) que se extiende 10 Hz de cada lado del pico, cuando sea posible.
        4. Proceder a realizar 13 C-RMN adquisición y procesamiento de espectros de una manera similar.
    2. Los espectros de 13C-RMN
      1. Adquisición de los datos de RMN
        1. Ir al conjunto de datos 13 C y el uso de la secuencia de impulsos desacoplado inversa cerrada, "zgig" escribiendo "pulprog zgig" en la línea de comandos.
          NOTA: Para ejecutar un experimento de carbono con el estándar de banda ancha Decousecuencia de pulsos PLED, tipo "pulprog zgpg" en la línea de comandos.
        2. Escriba los comandos siguientes en la línea de comandos para configurar la anchura espectral en ppm, el centro del transmisor de RF, el número de exploraciones, el número de exploraciones ficticias, el número de puntos de datos y la duración del pulso para un ángulo de 90 ° de impulsos : "sw 200", "95 O1P", "ns 16" "ds 2", "64K td" y "P1 (como determinado por calibración pulso)" (véase la etapa 2.2.1.4).
        3. Establecer un retraso de relajación de 35 s para el instrumento 500 MHz o 45 s para el instrumento 850 MHz escribiendo "35s D1" o "45s D1", respectivamente, en la línea de comandos. Cuando se utiliza BHT, retraso de relajación debe ser de 50 s en el instrumento 500 MHz y 60 s en el instrumento de 850 MHz.
        4. Ajuste la ganancia del receptor (RG) a un valor apropiado usando los "RGA" comando para el cálculo automático de la RG.
        5. Tipo "baseopt digmod" en la línea de comandos para adquirir un espectro wla línea de base mejorada i-ésimo.
        6. Iniciar la adquisición escribiendo el impulso de adquirir comando "ZG" en la línea de comandos.
      2. El procesamiento de los datos de RMN
        1. Tipo "64K si" en la línea de comandos para aplicar cero relleno y establecer el tamaño del espectro real a 64K.
        2. Ajuste el ensanchamiento de línea de parámetros a 1,0 Hz escribiendo "lb 1,0" en la línea de comandos para aplicar una función de ponderación (decaimiento exponencial) con una línea de factor de ensanchamiento de 1,0 Hz antes de la transformada de Fourier.
        3. Ejecutar Fourier transformación escribiendo "EFP" en la línea de comandos.
        4. Realizar la corrección automática de fase escribiendo los "apk" comando en la línea de comandos. Si se requieren ajustes de fase adicionales para mejorar aún más el espectro, haga clic en la pestaña "Procesos" y haga clic en el icono de "Ajuste de la fase" y los iconos de corrección de fase de orden cero (0) y la fase (1) corrección de primer orden .
            NOTA: Para obtener espectros de carbono registró en la frecuencia de Larmor de 214 MHz (el instrumento 850 MHz) la corrección de los errores dependientes de la frecuencia (de primer orden) puede ser difícil y consume tiempo para los usuarios menos experimentados debido a las grandes efectos fuera de resonancia de la 90 ° pulso.
        5. Aplicar una función de cuarto orden polinomial para la corrección de línea de base en la integración escribiendo el comando "abs n" en la línea de comandos.
        6. Turnos Informe químicos en ppm a partir de TMS = 0). Haga clic en el icono de calibración ( "Calib. Axis"), y coloque el cursor con la línea roja en la parte superior de la señal de RMN que se hace referencia. clic izquierdo y el tipo de "0".
      3. Análisis de los datos de RMN
        1. Integrar la región espectral de δ 175 a 171 delta usando el icono de "integrar" (en la pestaña "Proceso") y el más destacado ( "Definir nueva Región") icono. Izquierda haga clic y arrastre a través de las integrales.
          NOTA: Si existe la necesidad de concentrarse en una región, haga clic en el icono resaltado a desactivar y haga clic izquierdo y arrastrar el ratón para hacer zoom en la región. Haga clic en el icono resaltado de nuevo para hacer la función de integración activa, a continuación, pasar a la siguiente pico.
          1. Establecer la integral a 100 haciendo un clic derecho sobre el valor de la integral que aparece debajo de la señal y seleccione "Calibrar Corriente Integral". Introduzca el valor "100" en el cuadro y haga clic en el "Retorno y guardar" para salir del modo de integración.
        2. Cuando se utiliza BHT como un estándar interno, integrar el pico a δ 151,45 y establecer la integral igual alos milimoles de BHT por 0,5 ml de la solución madre.
        3. Incorporar los picos de interés se extiende 5 Hz de cada lado del pico (véase el paso 2.3.2.3.1).

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Representative Results

1 H y 13 espectros de RMN C se recogieron para los suplementos de aceite de pescado comercialmente disponibles utilizando dos instrumentos de RMN; un 850 MHz y un espectrómetro de 500 MHz. Estos espectros se pueden utilizar para la determinación cuantitativa de los componentes del aceite de pescado, como el ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA), así como otros compuestos tales como n -1 cadenas de acilo y el índice importante nutricionalmente, tales como el n -6 / n -3 ratio. La cuantificación se puede realizar incluso sin el uso de un estándar interno, sin embargo, los resultados cuantitativos se expresan como porcentajes molares relativas. Cuando necesitan ser expresados ​​en valores absolutos (mg / g) de los datos, se requiere un estándar interno. Los resultados obtenidos por RMN son altamente reproducibles con desviaciones estándar relativas (RSD) que van desde 0,3% a 2% para el análisis de RMN de 13C y de 0,5% a 2,5% para el análisis de 1H RMN, en función de t que los lípidos. La RSD ligeramente mayor para 1 H RMN se observa a menudo porque los espectros de protones tienden a ser superpobladas, que afecta a la exactitud del análisis, especialmente para las resonancias que tienen una señal inferior a ruido (S / N). Se encontró una muy buena concordancia entre el 850 MHz y el instrumento 500 MHz con RSDs que van del 1% al 4%. Se observaron relativamente altos RSDs (hasta 8%) al comparar los resultados obtenidos por 1 H y 13 C, especialmente para los compuestos que aparecen en las concentraciones más bajas, tales como n -1 cadenas de acilo. espectroscopia de RMN ha sido validado previamente como una herramienta para el análisis de lípidos, incluyendo la determinación de algunos componentes de aceite de pescado. Los resultados mostraron que está en buen acuerdo con los métodos tradicionales, tales como la CG 17, 18.

Análisis 1 H RMN

"xfig"> Figura 1 compara los espectros de RMN de 1H adquirido en (A) un 850 MHz y (B) un instrumento de 500 MHz. El espectro de 850 MHz se caracteriza por una resolución más alta, sin embargo, los componentes principales del aceite de pescado, incluyendo DHA, EPA, y n -6 / n -3 relación también puede determinarse a partir del espectro de 500 MHz. Las señales de 1H-RMN de los ácidos grasos de aceite de pescado que se pueden utilizar para los propósitos de cuantificación se muestran en la Tabla 1, mientras que la asignación de RMN completa del espectro de RMN 1H de aceite de pescado se puede encontrar en otro lugar 19.

1 H RMN dio datos fiables para la cuantificación de la cantidad total de n -3, n -6, DHA, ácidos grasos trans, n -1 cadenas de acilo, y ácidos grasos saturados (SFA). Para el análisis de RMN 1H, se requiere el uso de relaciones adecuadas porque la mayoría de la signals pertenecen a grupos de protones que son comunes a diferentes ácidos grasos y lípidos. Por esa razón, en la mayoría de casos, la concentración de ácidos grasos en el aceite de pescado puede ser determinado sólo por combinación de varias señales de 1 H RMN, incorporado en las relaciones apropiadas. Además, estas ecuaciones contienen coeficientes aritméticas que normalizan el diferente número de protones asociados con cada grupo. Cuando se usa un estándar interno de la siguiente ecuación se debe considerar: C = I / I es × N IS / N × A × MW / m (1), donde C es la concentración del analito en mg / g de aceite de pescado, I es la integral de una resonancia que se atribuye únicamente al lípido de interés, i es es el área de una señal de protones que pertenece únicamente al patrón interno, N es el número de protones del grupo funcional que se analiza,N IS es el número de protones del patrón interno que se utilizan para el análisis, A es el milimoles de patrón interno, MW es el peso molecular del ácido graso (expresado en ésteres de metilo), y m es la cantidad de aceite de pescado expresada en g.

Ejemplo 1, DHA: La proporción de DHA se determina por la ecuación C DHA = ¾ I DHA / S, donde I DHA es la integral de la señal en δ 2,39 que pertenece a los H alpha y H protones beta de DHA, y S es la suma de las integrales de los protones metílicos de SFA, n -6, -9 n, n -3, los ácidos grasos trans además de las integrales de los picos de n -1 acilo cadenas en δ 4,98, delta 5,05 y 5,81 δ. La integral I DHA es Normalized multiplicando por 3/4 porque corresponde a cuatro protones, mientras que el S integral corresponde a tres protones. 1 H RMN no es capaz de dar información sobre la distribución posicional de los ácidos grasos sobre el esqueleto de glicerol y por lo tanto sólo se puede utilizar para la cuantificación de la cantidad total de ácidos grasos. El análisis de RMN 1H de un suplemento de aceite de pescado encapsulado mostró que consta de 10,5% de DHA. Se encontró que la concentración de DHA en la misma muestra usando BHT ser 105,23 mg / g. Estos valores están muy cerca de los valores obtenidos con 13 C RMN (véase el ejemplo 2 para 13 el análisis C).

Ejemplo 2, n -1 acilo cadenas: la concentración de N -1 acilo cadenas viene dado por la relación C n-1 = 3 I n-1 / S, donde I n-1 es la integral de la señal en δ 5.818. Estaseñal corresponde a un protón y por lo tanto necesita ser normalizado por multiplicación por tres. Cuando se utiliza BHT, n -1 cadenas de acilo se determinan por la ecuación C n-1 = 2 I n-1 / I BHT. Los resultados no se pueden expresar en mg / g debido a que el MW de n -1 cadenas de acilo es desconocida.

Ejemplo 3, n -6 / n -3 ratio: Este índice importante se puede calcular a partir de la relación de las intensidades normalizadas de la resonancia a δ 2,77, que corresponde a los protones-bis alílico de n -6 cadenas de acilo (dos protones) sobre el triplete a δ 0,97 que pertenece a los ácidos n -3 grasos y corresponde a tres protones. La relación es C n-6 / n-3 C = 3/2 I A / I B, donde A y I B son las integrales de las señalesen δ 2,77 y δ 0,97, respectivamente. n -6 ácidos grasos se determinan a partir de la relación C n-6 = 3 / 2I n-6 / S, donde I n-6 es integral de los protones bis-alílicos en δ 2,77.

Ejemplo 4, los ácidos grasos trans: Los ácidos grasos trans se puede calcular de la ecuación C trans = I trans / S, donde I trans es la integral de la señal en δ 0,91. La presente muestra contenía 3,07% de ácidos grasos trans, según se determina mediante RMN de 1H usando el instrumento de 850 MHz. Se encontró que la misma muestra analizada en un instrumento de 500 MHz para contener 3,03% de ácidos grasos trans.

Ejemplo 5, ácidos grasos saturados (SFA): La concentración de SFA puede ser calculado partir de la ecuación C SFA = S - C n-3 - C n-6 - C n-9 - C n-1 - C trans. n -9 ácidos grasos (principalmente ácido oleico) se puede cuantificar de acuerdo con la ecuación C n-9 = (3/4 Q - 3/2 I n-6) / S, donde Q es la integral de los protones alílicos de n -6 y n -9 a δ 2,01. Se encontró que la cantidad de SFA en una muestra de aceite de pescado comercialmente disponible para ser 36,1%. Se encontró que la misma muestra analizada con 13 C RMN para contener 33,8% SFA. SFA representan un grupo de varios FA (por ejemplo, esteárico y palmítico) con diferente MW y de este modo su concentración si el aceite de pescado no se puede expresar en mg / g.

Ejemplo 6, esteroles totales: La cantidad de esteroles totales (libre y esterificado) se puede determinar por el signal de los protones de metilo en el carbono 18 que aparece en δ 0,68, utilizando la ecuación C = I STE / S. Se encontró que la relación molar de esteroles totales en una muestra de aceite de pescado comercialmente disponible para ser 0,32%. BHT también se puede utilizar para la determinación de la concentración absoluta de esteroles. Los principales esteroles en el aceite de pescado son el colesterol y vitamina D (o su precursor 7-dehidrocolesterol) y, a menudo se añaden en los suplementos. Estos compuestos tienen un MW muy similar. Por lo tanto, los resultados se pueden expresar en mg / g y se calculan según la ecuación C = 2/3 I STE / I es un × STE MW / m, donde STE MW es la masa molecular (386) de colesterol, que constituye la mayoría de la fracción esterólico en aceite de pescado 20. La cantidad de esteroles en la misma muestra usando BHT era 3,8 mg / g de aceite de pescado. La determinación individual de colesterol (δ 0.678) es factible en un instrumento de 850 MHz después de la aplicación de una función de ventana para la mejora de resolución.

Análisis RMN de 13C

La Figura 2 ilustra los espectros de RMN de 13C adquirido en (A) un 850 MHz y (B) un instrumento de 500 MHz en la zona de carbono carbonilo. Los dos espectros son muy similares y pueden proporcionar la misma cantidad de información. El espectro de RMN 13 C puede utilizarse con éxito para el análisis de ácidos grasos adicionales tales como estearidónico (SDA) y ácidos eicosatetraenoicos (ETA), se requieren sin embargo más exploraciones para muestras en las que estos ácidos se encuentran en concentraciones más bajas. Los espectros de 13 C se caracterizan por alta resolución debido a la gran anchura espectral y la aplicación de desacoplamiento de banda ancha, queelimina el efecto del acoplamiento escalar y produce singletes. Por esta razón, no se limita la superposición, incluso cuando se utiliza un instrumento de 500 MHz.

El espectro de RMN 13 C es mucho más informativo en comparación con el H espectro RMN 1 y puede proporcionar datos cuantitativos más completos porque menos solapamiento de señal se observa (Figuras 1 y 2). La región espectral más útil del espectro 13 C es la región carbono del carbonilo, ya que proporciona información cuantitativa para un gran número de ácidos grasos, así como para su distribución posicional en el esqueleto de glicerol 19, 21, 22. El área de grupo metilo de δ 14,5 a 13,5 delta se puede utilizar para la determinación rápida de la cantidad total de n -3, n -6, -9 n y grasos saturadosácidos (SFA), así como ácidos grasos trans. Sin embargo, en el espectrómetro de RMN de 500 MHz, hay una superposición parcial de la n -6 y n -9 ácidos grasos saturados (SFA). La aplicación de una función de ventana para la mejora de la resolución puede resolver este problema aunque el instrumento de 850 MHz todavía se considera una opción más fiable. La región olefínico del espectro de carbono se puede utilizar para la cantidad total de n -3 y n -1 cadenas de acilo, así como para la determinación de ácidos grasos individuales, tales como DHA, EPA, ácido araquidónico (AA), linolénico (Ln) n -3, y ácido oleico (OL) (véase la Tabla 2). 13 C RMN también se puede aplicar para la caracterización de aceite de pescado procedente de otras fuentes, tales como suplementos ricos en ésteres de etilo (EE) utilizando las señales de carbono en δ 14,31 (metilo) y δ 60,20 (metileno).

Para el análisis de carbono, los ácidos grasos pueden ser determined dividiendo la integral de los alifáticos, olefínicos, y señales de carbonilo apropiado con la integral total de todas las cadenas de acilo, de acuerdo con la relación general C = I / S (2), donde C es la concentración del analito en moles (% ), I es la integral de una resonancia que se atribuye únicamente al lípido de interés, y S es la integral total de la señal (s) que representa el contenido total de lípidos de la muestra. El S integral total de cadenas de acilo puede ser determinada mediante la integración de la región de δ 175 a delta 171 y se establece en 100.

La cuantificación de los ácidos grasos en mg / g de aceite de pescado se realiza utilizando un estándar interno sobre la base de la siguiente relación: C = I / I es × A × MW / m (3), donde C es la concentración del analito en mg / gde aceite de pescado, I es la integral de una resonancia que se atribuye únicamente al lípido de interés, i es es el área de una señal de carbono que pertenece únicamente al estándar interno, A es el milimoles de patrón interno, MW es el molecular peso del compuesto de interés (por ácidos grasos expresados en ésteres de metilo), y m es la cantidad de aceite de pescado en g. Las 13 señales C-NMR de ácidos grasos de aceite de pescado que se pueden utilizar para los propósitos de cuantificación se muestran en la Tabla 2, mientras que la asignación de RMN completa del espectro de RMN de 13C se puede encontrar en otro lugar 19.

Ejemplo 1, la EPA en la posición sn -2: La cantidad (%) de EPA en la posición sn -2 se calcula dividiendo la integral de la señal en δ 172,56 por S. La cantidad de EPA en la posición sn -2 en un commercially se encontró muestra disponible para ser 3.4% usando el instrumento de 850 MHz. Usando el mismo espectrómetro y BHT como un estándar interno, la cantidad de EPA en la posición sn -2 expresa en mg / g de aceite de pescado es 29,73 mg / g. Se encontró que la misma muestra analizada en un instrumento de 500 MHz para contener 3,6% o 31,39 mg / g de EPA en la posición sn -2. Resultados similares se pueden obtener cuando el cálculo de las proporciones moleculares relativos de la EPA en sn -2 utilizando un espectro completamente desacoplado. Esto es porque el carbono del carbonilo de EPA se ve afectada por desacoplamiento de protones en el mismo grado insignificante como los otros carbonos de carbonilo, que se utilizan como referencia. Sin embargo, se observan grandes desviaciones utilizando BHT, porque el carbono de BHT en δ 151,45, que se utiliza para la cuantificación, recibir una potenciación NOE diferente en comparación con los carbonos de carbonilo de ácidos grasos. Por esa razón, el espectro totalmente desacoplado debe evitarse utilizando estándares internos o integrar carbons con diferentes multiplicidades.

Ejemplo 2, la cantidad total de DHA: La cantidad total (%) de DHA se calcula simplemente mediante la adición de las cantidades de DHA en sn -1,3 y la posición sn -2 según lo determinado por las señales de RMN a δ 172,48 y δ 172,08, respectivamente. La misma muestra analizada con 1 H RMN (véase el ejemplo 1 de análisis 1 H) se encontró que contenía 10,3% de DHA de acuerdo con 13 el análisis C RMN. La cantidad de DHA también se puede expresar en mg / g mediante el uso de un estándar interno y la Ecuación 3. La cantidad total de DHA era 103,25 mg / g.

Ejemplo 3, la cantidad total de SDA: La cantidad total (%) de SDA se determina mediante la adición de las integrales de las señales en δ 172,99 y 172,60 δ que pertenecen a los carbonos carbonilo de SDA en la posición sn -1,3 ysn -2, respectivamente, a continuación, dividiendo la suma por S. Se encontró que la muestra analizada para contener 3,93% SDA o 34,54 mg / g.

Ejemplo 4, n -3 Ln: n -3 Ln (%) se puede determinar dividiendo la integral de la señal en δ 131.85 con el S integral. La relación molar de n -3 Ln en la muestra de aceite de pescado analizado fue de 0,7%. La concentración absoluta usando BHT se calculó como 5,5 mg / g.

Ejemplo 5, los ácidos grasos trans: La relación molar de los ácidos grasos trans se determina dividiendo la integral de la señal en δ 13,80 con S. El análisis de la misma muestra que se analizó con 1 H RMN y se encontró que era 3,07% de trans FA, también se analizó con 13 C RMN y se encontró que su contenido de ácidos grasos trans para ser 3,42%. Tél 13 C RMN análisis de la misma muestra en un instrumento de 500 MHz mostró un contenido de 3,64% de ácidos grasos trans. La cantidad de trans FA en mmol / g de aceite de pescado puede ser determinada usando BHT como un estándar interno y la ecuación C = I / I es × A / m, sin embargo los resultados no se pueden expresar en mg / g debido a que el pico a δ 13,80 corresponde a diversos ácidos grasos trans, principalmente DHA trans y trans EPA, con diferente MW.

Ejemplo 6, EE: La concentración de EE en una muestra de aceite de pescado se calcula dividiendo la integral de la zona espectral de δ 60,50 a delta 60,00, que corresponde a los carbonos de metileno de la EE de diversos ácidos grasos, con S. El análisis de una muestra de aceite EE fish mostró que consistía en 100% EE. Cabe señalar que en las muestras de EA, la EPA can ser calculado ya sea por el pico de carbonilo a δ 173,60 o por el carbono de metileno EE en δ 60,20, mientras que el DHA puede ser calculada usando la señal en δ 60,31 y / o la señal en δ 173,09.

Una lista completa de las señales de diagnóstico que se pueden utilizar para los propósitos de cuantificación con 13 C y análisis de RMN 1 H se puede encontrar en las Tablas 1 y 2, respectivamente, mientras que una descripción detallada de las ecuaciones que se pueden utilizar para este análisis se puede encontrar en otra parte 19.

RMN adicionalmente se puede aplicar para la evaluación del estado de oxidación de los suplementos de aceite de pescado. La Figura 3 compara el 1 H espectros de RMN de una muestra de aceite de pescado bajo dos condiciones de oxidación; la exposición a la calefacción y la exposición a los rayos ultravioleta (UV)ligero. La oxidación de lípidos es un proceso complicado, y la composición de productos de oxidación depende de las condiciones de oxidación. Los principales productos de oxidación son hidroperóxidos (delta 8,0 a 8,8), dienos conjugados hidroperóxidos 5.4-6.7) y aldehídos (delta 9,0 a 10).

Figura 1
Figura 1. El análisis RMN 1H. 850,23 (A) y 500,20 MHz (B) espectro de 1H-RMN de un suplemento de aceite de pescado en solución CDCl3. Se muestran las señales de RMN de EPA y DHA que se pueden utilizar para su determinación. El pico a δ 0,97 se puede utilizar para la determinación de la cantidad total de n -3 ácidos grasos. La envoltura en δ 1,39-1,20 se recorta, ya que pertenece a los protones de metileno de toda cadena grasas y no se puede utilizar para fines de identificación o cuantificación. El espectro de RMN 1 H se caracteriza por una anchura espectral más estrecha (SW) en comparación con el espectro de RMN de 13C y por lo tanto por la menor resolución espectral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
La Figura 2. El análisis RMN de 13C. 213,81 (A) y 125,77 MHz (B) espectro de 13C-NMR de un suplemento de aceite de pescado en 3 solución de CDCl en la región de carbono del carbonilo. Se muestran las señales de RMN de EPA y DHA en sn -1,3 y sn -2 posición. Estas señales se pueden utilizar para la determinación cuantitativa de EPA y DHA. A pesar de la SPEctra registrado a 213,81 MHz se caracterizan por una mayor resolución y sensibilidad, los espectros de 125,77 MHz también se puede utilizar para la determinación de los principales compuestos. La aplicación de desacoplamiento en el experimento de RMN de 13C elimina el efecto del acoplamiento escalar entre los núcleos de carbono y de hidrógeno y por lo tanto las señales aparecen como singletes hacer el análisis más fácil en comparación con el espectro de 1H RMN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. La oxidación del aceite de pescado. El espectro de RMN 1 H de aceite de pescado oxidado depende de las condiciones de oxidación. Las resonancias atribuidas a hidroperóxidos (delta 8,0 a 8,8), cse muestran dienos onjugated hidroperóxidos 5.4-6.7), y aldehídos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ppm δ Protón Compuesto
0,677 CH 3 (18) Colesterol
0,678 CH 3 (18) 7-dehidrocolesterol
0.88 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,27 Hz n -9, SFA cadenas de acilo
0,883 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,08 Hz n -6 cadenas de acilo
0,911 CH 2 CH 3 (t), J ω; 1, ω2 = 7,65 Hz Cadenas de acilo trans
0,973 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,63 Hz n -3 cadenas de acilo
1.25 CH 2 CH 3 (t), J = 7,20 Hz ésteres etílicos
1,697 OCOCH2CH 2 (t), J H α, Η β = Hz cadena de acilo EPA
2,391 OCOCH 2 CH 2 (t) cadena de acilo DHA
2.772 CH = CHCH 2 CH = CH n -6 cadenas de acilo
2.81 CH = CHCH 2 CH = CH n -3 cadenas de acilo
3,593 3'a-CH 2 OCO El glicerol de 1-MAG
3,722 3'a, 3217; b-CH 2 OCO (br) El glicerol de 1,2-DAG
4,073 2 '-CHOH (br) El glicerol de 1,3-DAG
4.121 CH 2 CH 3 multiplete ésteres etílicos
4.173 1'b, 3'b-CH 2 OCO (dd) El glicerol de 1,3-DAG
4.238 1'a-CH 2 OCO (dd) El glicerol de 1,2-DAG
4.329 1'b-CH 2 OCO (dd) El glicerol de 1,2-DAG
4,989 -CH = CH 2 cis (dd) n -1 cadenas de acilo
5,052 -CH = CH 2 trans (dd) n -1 cadenas de acilo
5,082 2 'CHOCO El glicerol de 1,2-DAG
5.268 2'; -choco De glicerol de TAG
5,436 CH = CHCH 2 CH = CH 2 n -1 cadenas de acilo
5,818 -CH = CH 2 n -1 cadenas de acilo

Tabla 1: La asignación del espectro de RMN de 1H. los Se presentan 1 H-RMN desplazamientos químicos de las señales de ácidos grasos de aceite de pescado que se pueden utilizar para los propósitos de cuantificación en solución CDCl3. Los desplazamientos químicos se miden en ppm y proporcionan información sobre el entorno químico de los núcleos.

ppm δ Carbón
173.24 C1 SFA (sn -1,3)
172,21 C1 OL, LO (sn -1,3)
C1 ETA (sn -1,3)
173.13 C1 DPA (sn -1,3)
173.03 C1 SDA (sn -1,3)
172,97 C1 EPA (sn -1,3)
172,73 C1 ETA (sn -2)
172.69 C1 DPA (sn -2)
172,61 C1 SDA (sn -2)
172.56 C1 EPA (sn -2)
172,48 C1 DHA (sn -1,3)
172.08 C1 DHA (sn -2)
136,8 Cω1, n -1
131,85 Cω3 LN
130,37 C15 AA
130,11 C9 LN
130,06 C13 LO
129,54 C5 DHA sn -2
129.47 -1,3 C5 DHA sn
128,94 C5 EPA
128,76 C6 EPA
128,45 C17 n -3
127,71 n -3
127,53 C4 DHA sn -2
127,5 -1,3 C4 DHA sn
126,86 Cω4, todo n -3
114,71 Cω2, n -1
60.08 Ésteres de DHA, etilo
59.96 EPA, ésteres de etilo
59,95-59,85 Otros ésteres FA, etilo
33.48 C2 EPA sn -2
33.32 -1,3 C2 EPA sn
31.44 C3 n -1
27.05 Alílica n -6
26.49 -1,3 C4 EPA sn
26.47 C4 EPA sn -2
24.6 C3 EPA
24.48 C3 SDA -1,3 sn
24.44 C3 SDA sn -2
14.27 Cω1, todo n -3
14.13 Cω1, SFA
14.11 Cω1, OL
14.07 Cω1, LO
13.8 Cω1, FA trans

Tabla 2: La asignación del espectro de RMN de 13C. Los desplazamientos químicos 13 C-RMN de señales de ácidos grasos de aceite de pescado que se pueden utilizar para la cuantificación purpse presentan los sistemas operativos en solución CDCl3.

Adicional Figura S1: Comparación entre el 13 C RMN espectros adquiridos usando el estándar de banda ancha de desacoplamiento (A) y la inversa de desacoplamiento (B) secuencias de impulsos. Los espectros se registraron para la misma muestra con el mismo número de exploraciones, procesados ​​con los mismos parámetros de procesamiento y se muestran con el mismo factor de escala. Haga clic aquí para descargar esta figura.

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Discussion

Modificaciones y estrategias para la solución de problemas

Calidad espectral. La anchura de línea de la señal de RMN y por lo tanto la resolución del espectro de RMN depende de cuñas, que es un proceso para la optimización de la homogeneidad del campo magnético altamente. Para el análisis de rutina, 1D calce es adecuada y no se requiere un calce 3D, dado que se lleva a cabo por el personal de RMN sobre una base regular. Si este no es el caso, un calce 3D debe realizarse antes del análisis usando una muestra que contiene 0,6 ml de H 2 O: D 2 O (90:10). Para conseguir un mejor y más rápido de calce, la muestra necesita ser centrada en la región de excitación / detección de la bobina de radiofrecuencia (RF), usando el medidor de profundidad graduada, antes de que se coloca en la cavidad del imán. Otro factor que afecta calce es girar la muestra a una velocidad de rotación de 10-20 Hz. Aunque girar la muestra a esta velocidad de giro mejora las cuñas radiales (X, Y, XY, XZ, YZ, X 2 -Y 2, etc.), que generalmente no se recomienda con el fin de evitar la aparición de bandas laterales de giro de la primera o de orden superior. Sin embargo, cuando se trabaja en instrumentos que operan en Larmor frecuencias más bajas que 400 MHz, se recomienda de hilado para los experimentos 1D de RMN.

Resolución, así como la sensibilidad, se ven afectados por la ganancia del receptor (RG) de valor. Los valores bajos de la ganancia del receptor reducir la sensibilidad, mientras que valores superiores a desbordamiento causa apropiada del convertidor de analógico a digital (ADC). resultados ADC de desbordamiento en no simétrica alineación formas y las señales no se pueden usar para fines cuantitativos porque los primeros puntos de la decadencia de inducción libre (FID) se pueden perder. En la mayoría de los casos, el "RGA" comando calcula un valor de RG apropiado. Sin embargo, en algunos casos, el valor rg calculada por el software es mayor que el valor ideal y hay una distorsión en la forma de Lorentz de la señal de RMN. Ental caso, el usuario debe introducir manualmente un valor rg menor escribiendo "rg (valor)" en la línea de comandos. Un valor RG típica para las muestras que analizó con este protocolo es 8.

A menudo, al usar enfriado criogénicamente sondas de RMN con un alto factor de calidad (factor Q), un gran retardo (tiempo muerto)> 200us entre el último pulso y el período de detección se requiere para evitar artefactos tales como una joroba alrededor de la frecuencia del transmisor y rodando en la línea base del espectro. Sin embargo, un retraso tan largo provoca un error de fase negativo grande de primer orden, que también puede introducir un laminado en la línea de base y grandes caídas alrededor de la base de las señales fuertes. En estos casos, una secuencia de pulsos de eco de espín z-restaurado se puede utilizar para producir un espectro de RMN significativamente con mejores líneas de base, aunque una pequeña reducción de sensibilidad puede ocurrir 23.

Fosfolípidos. Además del análisis de aceite de pescadomuestras ricas en triglicéridos y ésteres de etilo, RMN se pueden utilizar para el análisis de muestras de aceite de pescado rico en fosfolípidos (PL). Sin embargo, se requiere un cuidado especial para este tipo de muestras, ya PLs forman agregados, los cuales pueden causar una reducción significativa en la resolución espectral y sensibilidad. Para el análisis de estas muestras, una mezcla disolvente de cloroformo deuterado: metanol (CDCl3: CD3OD) en una proporción de 70:30 se requiere para obtener espectros de alta calidad.

Patrón interno. BHT fue seleccionado como un estándar interno en este estudio debido a que es una molécula altamente simétrica con sencillo 1 H y 13 C espectros RMN y ninguna de sus picos se solapan con las de los constituyentes de aceite de pescado. BHT tiene una señal en el espectro de 1H RMN, que aparece como un singlete a δ 6,97 y pertenece a los dos protones equivalentes aromáticos (párr - posición en respecto al grupo OH) y una señal enδ 151,45 en el espectro de RMN de 13C que pertenece al carbono cuaternario aromático que lleva el grupo -OH. Ambas de estas señales tienen ninguna superposición con cualquiera de los componentes en el aceite de pescado, y por lo tanto se puede utilizar para los propósitos de cuantificación. Otros compuestos tales como 1,2,4,5-tetracloro-3-nitrobenceno (TCNB) o cloruro de etileno también se pueden utilizar como patrones internos alternativa, sin embargo, se caracterizan por largos valores T 1.

Limitaciones de la técnica

La cuantificación de varios ácidos grasos y lípidos en los suplementos de aceite de pescado se logra mediante la integración de las señales de RMN de diagnóstico correspondientes en los espectros de 1D. Tales señales deben pertenecer solamente a un componente de la muestra específica y deben tener ninguna interferencia con señales de otros compuestos. Esto puede ser un problema para análisis de RMN 1H puesto que el espectro RMN 1H se caracteriza por baja resolución debido a la corta gama de cheMical turnos. Además, la presencia de acoplamiento escalar (J) produce multipletes y hace que el análisis más complicado. Por ejemplo, ésteres de etilo (EE) se pueden cuantificar usando 1 H RMN por el triplete de característica (J = 7,20 Hz) del grupo de metilo a δ 1,25 y el multiplete a δ 4,12, que pertenece a los protones de metileno del grupo éster. Sin embargo, cuando el uso de instrumentos de RMN que operan en Larmor frecuencias más bajas que 850 MHz, el análisis de EE usando 1 H RMN debe evitarse debido a la superposición parcial del pico a δ 4,12 con el pico a δ 4,14 de TGs, y la superposición de la señal en δ 1,25 con la señal ancha de los protones de metileno alifáticos en δ 1,23-1,35. Grandes desviaciones también se observaron entre el 1 H y 13 C análisis de EPA en algunas muestras, 13 C RMN estaba más cerca de la composición de la etiqueta proporcionado por tél fabricante. Esto es probablemente debido a la superposición de la señal en δ 1,69, que se utiliza para el análisis de EPA, con las señales de otros compuestos que aparecen en algunos tipos de suplementos de aceite de pescado. errores adicionales en cuantificaciones pueden surgir cuando se utiliza un estándar interno debido a la pureza incierto del patrón interno y de los errores en la pesada.

El análisis de la composición se puede expresar en concentraciones molares relativas sin el uso de un patrón interno. Si los resultados necesitan ser expresados ​​en concentraciones absolutas, por ejemplo como miligramo de ácido graso por gramo de aceite (mg / g), se requiere el uso de un patrón interno. Sin embargo, en los casos en que la señal de RMN de interés pertenece a varios compuestos con pesos moleculares diferentes, los resultados pueden no ser expresadas como mg / g incluso cuando se utiliza un patrón interno. Además, el uso de estándar interno por lo general aumenta la longitud del análisis debido a que la s interna más común ORMAS, tales como BHT, son pequeñas moléculas con simetría molecular alto, lo que resulta en tiempos de relajación largos. Puesto que el tiempo de repetición (retardo entre pulsos + tiempo de adquisición) se establece de acuerdo con el tiempo de relajación más largo T 1 en la muestra, el uso de un patrón interno se incrementará la duración de los experimentos ya que se requieren retardos más largos entre los impulsos. Este es un factor especialmente importante para los 13 análisis de RMN de C debido a la excepcionalmente largo tiempo de relajación T1 de los núcleos de carbono. La adición de un compuesto paramagnético tal como Cr (acac) 3 puede reducir eficientemente el tiempo de relajación T 1. La concentración recomendada de Cr (acac) 3 es de 0,75 mg / ml de solución. Mayores concentraciones de Cr (acac) 3 pueden ser considerados para la reducción adicional de T 1, sin embargo, se requiere precaución con el fin de evitar el descenso de la S / N debido a la ampliación de la línea.

ntent "> Aunque el 13 C RMN se caracteriza por una resolución espectral mucho más alta en comparación con 1 H, la sensibilidad del experimento de RMN de 13C es significativamente menor debido a la baja abundancia natural (1,1%) y la baja relación giromagnética (67,26 10 6 rad s -1 T -1) de 13 núcleos C. Además, la larga T 1 tiempos de relajación de 13 C aumentan la longitud del análisis. Esto puede ser un problema cuando el aceite disponible para el análisis es limitado, debido a un mayor número de barridos se debe utilizar para lograr una señal razonable a ruido.

Las limitaciones en la sensibilidad y la resolución de los espectros de RMN impiden el análisis de muchos compuestos de menor importancia en el aceite de pescado que pueden ser analizados con otras técnicas como la GC. Por ejemplo, 1 Η RMN es incapaz de separar esteroles individuales o ácidos grasos (por ejemplo palmítico y esteárico), mientras que 13 Cno es capaz de determinar los compuestos que aparecen en muy baja concentración en el aceite de pescado como el ácido dodecanoico y mirístico, que se superponen con las señales de todos los ácidos grasos saturados en δ 173,24 y δ 172,82. Aunque el aumento de la cantidad de muestra que se analiza hace que el análisis de algunos compuestos menores factibles, se requiere precaución para muestras muy concentradas, debido a su mayor viscosidad. Soluciones muy viscosas que contienen más de 150 mg de aceite debe ser evitado porque hay una disminución de S / N debido a la ampliación de la línea causada por los spin-spin T 2 tiempos de relajación reducidos. Además, se requiere que los retrasos más largos entre los impulsos debido a la camiseta ya 1 y hay varias cuestiones en cuñas y por lo tanto en la resolución.

Todos los compuestos analizados en el aceite de pescado con RMN se pueden cuantificar simultáneamente en una instantánea sin usar ningún paso de separación o purificación. La una RMNÁLISIS es rápida como el espectro 1 H se puede grabar en menos de un minuto, mientras que la adquisición 13 C RMN dura 10 min. Cabe señalar, sin embargo, que hay algunos factores que afectan el tiempo de adquisición de datos. En concreto, para 13 C RMN, el tiempo de ejecución 10 min sólo se puede lograr sin el uso de estándares internos, y con el uso de sondas criogénicamente enfriados, en el que la bobina de RF y el preamplificador se enfrían y por lo tanto se minimiza el ruido térmico. A 10-15 veces mayor en el tiempo experimental se debe esperar para el 13 análisis de RMN de C cuando se utilizan sondas (convencionales) la temperatura ambiente.

Importancia con respecto a los métodos existentes

espectroscopía de RMN demostró ser una herramienta poderosa para la determinación cualitativa y cuantitativa de la composición de suplementos de aceite de pescado, y debido a su rapidness que tiene el potencial para ser aplicado para el cribado de alto rendimiento de un vasto nu mber de muestras de aceite de pescado. espectroscopía de RMN es por definición una metodología cuantitativa ya que el área de la señal es directamente proporcional al número de núcleos que causan la señal. Si bien se requieren productos químicos altamente tóxicos para preparar muestras de RMN, este método es el medio ambiente debido a que tales pequeñas cantidades de este productos químicos (por ejemplo, CDCl3) se utilizan a diferencia de otros métodos que requieren grandes cantidades de disolvente para eluir las muestras. Además, NMR tiene varias ventajas en comparación con otros métodos analíticos. No calibración con patrones se requiere antes del análisis, y una preparación mínima de la muestra sin ninguna etapa de separación y purificación es generalmente adoptada, lo que hace RMN una herramienta analítica muy rápido. Además, 13 C RMN es la mejor metodología disponible para determinar la distribución posicional de diversos ácidos grasos en el esqueleto de glicerol. Mientras que la hidrólisis enzimática se ha utilizado como una alternativa no siempre es fiable= "xref"> 24. Esto es de importancia específica porque hay un gran interés en el estudio de la regioespecificidad de varios ácidos grasos en los alimentos, ya que se ha encontrado que esto afecta a su función en la dieta humana 25, 26.

Las aplicaciones futuras

A pesar del acuerdo entre el análisis de RMN y la etiqueta de los productos, así como el hecho de que hay algunos estudios que demuestran acuerdo entre GC y RMN, creemos que es necesario realizar estudios intra-laboratorio más rigurosos y exhaustivos para examinar el acuerdo entre RMN y tradicional metodologías para el análisis de constituyentes de aceite de pescado utilizando un número mayor de muestras, los productos de aceite de pescado de diferentes orígenes, y soluciones estándar certificados.

Otra aplicación importante en el futuro de RMN en análisis de aceite de pescado será la determinación de los productos de oxidación. Además de la determinaciónde los principales compuestos en el aceite de pescado, varios productos de oxidación primarios y secundarios en el aceite de pescado, tales como aldehídos y peróxidos, están presentes. 1 H RMN puede aplicarse potencialmente para la evaluación del estado de oxidación en los suplementos de aceite de pescado, bajo diferentes condiciones de oxidación, como se muestra en la Figura 3. El mayor desafío en este análisis será la asignación de RMN y la identificación de los productos de oxidación individuales. Los avances en la sensibilidad del hardware RMN también permitirán la identificación de esteroles individuales utilizando 13 C RMN. espectroscopía de RMN se puede aplicar también para el análisis de tejidos de peces en su conjunto incluso sin ninguna extracción mediante el uso de alta Magic Angle Spinning Resolución RMN (HR-MAS).

Los pasos críticos dentro del Protocolo

Dos de los pasos más críticos que afectan a la exactitud de los espectros de RMN cuantitativos implican la selección de un impulso de 90 ° y el uso de un retraso entre la PULSES ≥ 5 × T 1. El ángulo de impulsos es proporcional al ancho de pulso que es un parámetro RMN calibrado que depende de la instrumentación y la muestra. Un pulso de 90 ° es esencial para la conversión completa de la magnetización longitudinal (z) a la magnetización transversal observable (xy). Es importante observar que antes de la calibración de pulso, la RMN sondeó necesita estar bien afinado y emparejado. Esto optimizará la transferencia de la potencia de RF a la muestra y por lo tanto maximizar S / N y garantizar un desacoplamiento eficaz. La afinación sonda se ve afectada principalmente por la constante dieléctrica de la muestra, así que si hay diferencias en la concentración entre muestras, repetir el proceso de ajuste para cada uno. El 1D 13 experimento C RMN implica tanto 13 C y 1 canales H de sintonización de modo automático y la coincidencia es necesario que ambos núcleos.

Un retraso entre pulsos de más de 5 × T 1 asegura la rec completaovery de la magnetización neta a su valor inicial. Si todas las resonancias en el espectro no han completamente relajado antes de cada pulso, la señal es parcialmente suprimida y esto conduce a inexactitudes en la integración. T 1 valor es un factor crítico que afecta a la duración del experimento y que depende de la intensidad de campo magnético, así como la viscosidad de la muestra. Dado que la viscosidad entre las muestras es similar, los tiempos de relajación T1 deben determinarse para cada instrumento sólo en el comienzo de la sesión de análisis.

Otra característica importante del análisis aceite de pescado con 13 C RMN es la selección de la secuencia de impulsos correspondiente. El método más fiable para el análisis 13 C cuantitativa es la inversa cerrada experimento de desacoplamiento, en donde sólo se aplica desacoplamiento de protones de banda ancha durante el período de adquisición y por lo tanto no hay transferencia de polarización desde 1 H a 13C a través del efecto Overhauser nuclear (NOE). Sin embargo, mientras que el experimento de RMN completamente desacoplado se puede usar para fines cuantitativos, se requiere precaución cuando se utiliza este experimento porque hay diferentes factores NOE entre carbonos con diferentes multiplicidades y comparación por lo tanto, integral entre metilo, metileno, metano y carbonilo carbonos deben ser evitados. A pesar de esto, cuando sólo carbonos de multiplicidad similar y ambiente químico se consideran en el análisis, el método totalmente desacoplado es fiable. Un ejemplo de esto es carbonos de carbonilo de ácidos grasos que se han encontrado para tener diferencias significativas en los factores NOE después de desacoplamiento 27. Además, para los carbonos que llevan los protones, el experimento completamente desacoplado proporciona una mayor sensibilidad debido a las contribuciones de NOE en la intensidad de la señal de RMN. Una comparación entre los espectros adquiridos con las dos secuencias de pulsos se muestra en la Figura S1.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por los alimentos para la salud descubrimiento temático en la Universidad Estatal de Ohio y el Departamento de Ciencia y Tecnología de Alimentos de la Universidad Estatal de Ohio. Los autores desean agradecer a las instalaciones de RMN en la Universidad Estatal de Ohio y la facilidad de RMN en la Universidad Estatal de Pensilvania.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avance III 850 NMR instrument Bruker
Avance III 500 NMR instrument Bruker
TCI 5 mm probe Bruker Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N)
BBO prodigy 5 mm probe Bruker Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P)
Spinner turbin Bruker NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place
Topspin 3.5 Bruker
deuterated chloroform Sigma-Aldrich  865-49-6 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol Sigma-Aldrich  128-37-0 purity >99%
Fish oil samples
NMR tubes New Era NE-RG5-7 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube
BSMS Bruker Bruker Systems Management System; control system device

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