Ex Vivo Avbildning av bosatt CD8 T-lymfocytter i menneskelig lunge svulst skiver bruker AC Confocal mikroskopi

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å bilde bosatt svulst-infiltrere CD8 T celler merket med fluorescently kombinert antistoffer i menneskelig lunge svulst skiver. Denne teknikken tillater sanntid analyser av CD8 T celle overføring ved hjelp av AC confocal mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peranzoni, E., Bougherara, H., Barrin, S., Mansuet-Lupo, A., Alifano, M., Damotte, D., Donnadieu, E. Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (130), e55709, doi:10.3791/55709 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

CD8 T celle er sentrale aktører i kampen mot kreft. For at CD8 T celler å drepe kreftceller de må inngå svulsten, overføre i svulst microenvironment og svare tilstrekkelig på svulst antigener. Den siste utviklingen av forbedret tenkelig tilnærminger, som 2-fotonet mikroskopi, og bruk av kraftige musen svulst modeller har kaste lys over noen av mekanismene som regulerer anti-tumor T celle aktiviteter. Mens slike systemer har gitt verdifull innsikt, de ikke alltid forutsi menneskelige svar. I menneskelige kommer vår kunnskap innen hovedsakelig fra en beskrivelse av fast svulst prøver fra menneskelige pasienter, samt i vitro studier. Men i vitro modeller mangler komplekse tredimensjonale svulst miljøet, og derfor er ufullstendig omtrentlige in vivo T celle aktiviteter. Ferske skiver fra explanted vev representerer en kompleks, multi-mobilnettet svulst miljø som kan fungere som et viktig bindeledd mellom co kulturperler studier og dyremodeller. Opprinnelig definert i murine lymfeknuter1 og tidligere beskrevet i en JoVE artikkel2, har dette nå blitt transponert til menneskelig svulster undersøke dynamikken i både belagt3 samt bosatt T celler4.

Her, er en protokoll for utarbeidelse av menneskelig lunge svulst skiver, immunostai-bosatt CD8 T og tumor celler og sporing av CD8 T-lymfocytter i svulst microenvironment bruke AC confocal mikroskopi beskrevet. Dette systemet er unikt plassert til skjermen for romanen immunterapi agenter favoriserer T celle migrasjon i svulster.

Introduction

CD8 T celler spille en nøkkelrolle i kampen mot kreft. Men hindre mange undertrykkende mekanismer T-lymfocytter drepe ondartede celler. De siste årene, er flere lovende strategier som slipper bremsene på T-celler utviklet og brukt i klinikken5. De to tilnærmingene som beholder betydelig oppmerksomhet er immun checkpoint målretting antistoffer, som anti-PD-1 og adopsjon T cellen terapi. Likevel, til tross for nylige suksesser, bare et delsett av pasienter nytte disse behandlingsformer6. En stor utfordring er å identifisere mekanismer for resistens mot kreft immunterapi for å utvikle mer effektive behandlinger. En annen utfordring er å utvikle modellsystemer som romanen terapi kan være preget og testet for deres styrke og sikkerhet. Så langt, er de fleste av disse analyser basert på i vitro celle kultur systemer som dårlig etterligner kompleksiteten av tumor vev.

Ex vivo vev stykker er en lovende teknikk, som det bevarer den opprinnelige vev microenvironment7. Gjennom årene har vi satt opp denne tilnærmingen å spore dynamikken av T-lymfocytter i ulike vev. Våre resultater viser at fluorescently merket T-celler lagt oppå murine lymfeknute skiver migrere til vev og svare på deres aktuelle microenvironmental signaler1,2. T-lymfocytter kledde på menneskelig lunge svulst skiver rekrutteres tilsvarende raskt i svulst stroma3. Bruker denne teknikken, har vi identifisert den ekstracellulære matrisen som et viktig element i å kontrollere distribusjon og migrering av T-celler i menneskelig svulster3,4. Fordi virkemåten til ex vivo renset og belagt T celler gjenspeiler ikke nødvendigvis virkemåten til bosatt intratumoral T-lymfocytter, har vi nylig fornyet dette tilnærming4.

Her beskriver vi en protokoll for å spore bosatt T-lymfocytter i skiver av friske menneskelige lunge svulst. De ulike trinnene består av utarbeidelse av menneskelig lunge svulst skiver (inkludert innebygging av agarose og vibratome snitting av innebygde vev), den flekker av endogene T-celler med fluorescerende antistoffer i frisk svulst skiver og overvåking av disse cellene med AC confocal mikroskop.

Protocol

Menneskelige svulster ble innhentet med avtalen av franske etiske komiteen og ved hjelp Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) i programmet med artikkelen L.1121-1 av franske loven. En skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienter før inkludering i studien.

1. å få menneskelige lunge svulst

  1. Få ferske lunge svulst prøver fra pasienter med fase I-III ikke-småcellet lungekreft som gjennomgikk en komplett kirurgisk fjerning av sin lunge svulst4.
  2. Transport ikke-fast fersk svulst i 15 mL konisk rør som inneholder iskald Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) medium. Avsatt på isen i 30 min før trinn 2.7.
    Merk: Når svulster mottas på ettermiddagen, plasser dem i 4 ° C over natten og prosessen dagen. I dette tilfellet supplement RPMI-1640 media med 5% fosterets bovin serum (FBS).

2. Agarose innebygging og vibratome kutting av menneskelig lunge svulst

Merk: Utføre alle skritt til 2.10 under sterile forhold.

  1. Forberede 5% agarose løsning for innebygging av oppløsende 1 g lav-smeltende punkt agarose i 20 mL steril fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) uten kalsium og magnesium. Mikrobølgeovn denne løsningen til agarose er fullstendig oppløst. Tillat agarose avkjøles på 37 ° C ved å plassere løsningen i en inkubator på 37 ° C i 5 min.
  2. I vev kultur hette, Forbered komplett RPMI-1640 medium (uten fenol rød) som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS), 4 mM L-glutamin og 1 x penicillin og streptomycin.
  3. Legg 1.1 mL komplett RPMI-1640 medium per brønn til en 6-vel celle kultur plate og plassere en 30 mm celle kultur setter i hver brønn. Avsette platen i en inkubator på 37 ° C i 30 min før trinn 2.12.
  4. Sted sterilisert rustfritt stål flat skiver (indre diameter på 5 mm, utenfor på 10 mm og tykkelsen på 1 mm) i en 35 mm plast fat fylte med RPMI komplett medium. Skiver brukes videre til å konsentrere antistoffer vibratome-kutt sektoren.
  5. Plasser den svulst biopsy i 10 cm plast parabol og skjær svulst med en skarp kniv i liten kube form fragmenter av ca 5 x 5 mm lengde.
  6. Ta ut agarose fra inkubator og hell løsningen i en 35 mm plast parabol.
  7. Bruk et par pinsett nøye overføre svulst fragmenter til en vev tørke å fjerne overflødig medium. Fragmenter inn i agarose og plasser dem på bunnen av plast parabolen. La agarose gel på is 5 min å stivne.
  8. Når agarose stivner, invertere plast fatet og bruk en slikkepott til å frigi hele gel.
  9. Bruke en skarp kniv til å klippe den overskytende agarose rundt tumor fragmentet, forlater 3-5 mm av gel rundt vevet.
  10. Montere hver agarose blokk på prøven disken av vibratome med en dråpe giftfri butyl cyanoacrylate vev lim. Fyll bufferbrettet vibratome med sterilt iskald PBS og installere prøven disken i skuffen.
  11. Kutt til agarose innebygde vev i 350 µm tykke skiver. Justere vibratome på en treg rekkevidde hastighet (0,2-0,3 mm/s) og vibrasjonsfrekvens på et middels utvalg (1,5 mm).
  12. Bruke fine tang, nøye samle svulster skiver som de er kuttet og plasseres flatt på celle kultur skivene av en 6-vel plate (trinn 2.3). Overføre 1 skive på hver setter. Bruk stor forsiktighet ved håndtering skiver som de kan lett bli skadet.
  13. Bruk fint tang for å plassere rustfritt stål-skiver på hver enkelt skive. Kontroller skiver er også plassert på agarose rundt tumor vev.
  14. Opprettholde kultur plate på 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator for 10 min. gå videre til immunostaining.

3. Immunostaining bosatt CD8 T celler og kreftceller

  1. Fortynne antistoffer (siste konsentrasjon 10 µg/mL) og kjernefysiske fargestoff (siste konsentrasjon 1 µg/mL) i RPMI-1640 media uten fenol red.
    Merk: Bruk fluorescently kombinert anti-CD8 (murine IgG, klone SK1) og anti-EpCAM (epithelial celle vedheft molekyl) (murine IgG HEA-125) antistoffer mot etiketten CD8 T-lymfocytter og tumor epitelceller, henholdsvis. Bruk fluorescently-kombinert anti-CD90/Thy1 (murine IgG, klone 5E10) mot etiketten fibroblaster og aktivert endotelceller. Bruk 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) merke kjernen av celler med en kompromittert plasma membran for å vurdere vev levedyktighet.
  2. Fjerne kultur platene settefiskanlegg og bruke en pipette inneholder noe væske inne i rustfritt stål-skiver. Ikke Fjern 1.1 mL RPMI-1640 media plassert under celle kultur skivene (trinn 2.3).
  3. Uten berørende skive og bruke en pipette tips, Legg 40 µL av løsningen som inneholder antistoffer til hver svulst skive.
  4. Inkuber platen på 37 ° C i 15 min tillate antistoff flekker.
  5. Med fine tang, fjerne skivene, ta ut skiver og dukkert dem 10 s i RPMI-1640 media uten fenol red. Plassere tilbake skiver på celle kultur skivene og legge en dråpe av fenol red-fri RPMI-1640 middels på hver enkelt skive. Vedlikeholde platen ved 37 ° C i 10 min. Fortsett til bildebehandling.

4. imaging og analyserer bosatt CD8 T celle migrasjon i menneskelig lunge svulst skiver

Merk: AC confocal mikroskopet brukes i denne protokollen er oppreist spinning disk utstyrt med en 25 x vann nedsenking mål (25 x / 0,95 N.A.).

  1. Forbereder mikroskop oppsett
    1. Angi temperaturen på mikroskopet varme-kammer på 37 ° C noen timer før tenkelig økten.
    2. Sett opp et system å stadig perfuse svulst skiver med oksygenert (5% CO2, 95% O2) fenol red-fri RPMI medium (figur 1). Bruk en peristaltiske pumpe å strømme perfusjon media i tenkelig kammeret og inneholder løsningen på en innsamling kolbe.
    3. Kjør peristaltiske pumpen å tillate oksygenrikt løsningen å gå gjennom perfusjon rørene.
  2. Med fine tang, ta ut sektoren fra 6-vel plate og overføre det til 35 mm plast parabolen fylt med fenol red-fri RPMI medium. Nakkens skive med en være 19.7 mm diameter skive anker med 2 mm linjeavstand-tråder. Plass Petriskål på tenkelig scenen av mikroskopet. Koble innløp og utløp tips av perfusjon. Slå på perfusjon systemet og sett infusjonshastigheten media 0,8 mL/min.
  3. Redusere vann nedsenking målet til sektoren. Fokus på sektoren med lyse feltet lys.
Bruk passende lysstoffrør velge et område av interesse som inneholder CD8 T celler, svulst holmer (positivt for EpCAM) og et stroma område (positivt for CD90). Sjekk levedyktigheten til celler i sektoren ved å vurdere DAPI flekker på overflaten kutt og dypere inn i vevet.
Merk: En sunn del inneholder bare et mindretall av DAPI positive cellene på flere mikrometer fra kutt overflaten.
  • Angi en tenkelig økt med følgende.
    1. Avhengig av intensiteten av fluorescerende 3 fluorophores, angi eksponeringstid mellom 50 til 800 ms og laser intensiteten mellom 20 til 40%.
    2. Velg z stabel dybden til bildet i svulst sektoren.
      Merk: Her, 10-12 optisk fly som spenner over en total dybde på 60-70 µm for z-dimensjonen ble tatt.
    3. Velg startposisjonen på ca 10 µm under de første merket CD8 T-cellene.
    4. Definere tidsintervallet mellom hvert z stabel bilde mellom 10 til 30 s og total tid mellom 10 til 30 min.
  • Analysere bosatt CD8 T celle migrasjon som beskrevet i referanse4.
    1. Etter at dataene til en sporing, opprette plasser for hver CD8 T celle i feltet. Justere diameteren på cellene og terskelen gjenkjenning ifølge på fotografert fluorescerende cellene.
    2. Kontroller sporene og fjerne eventuelle irrelevante spor ved å slette dem. Riktig spor av tilkobling og frakobling ulike spor og ulike tidspunkt av de samme sporene. Eksportere dataene (sporet hastighet, spor forskyvning lengde) til et regnearkprogram.
  • Representative Results

    Menneskelige lunge svulst er vanligvis svært infiltrert i CD8 T celler finnes fortrinnsvis i stroma3,4. Ved å følge denne protokollen bør man forvente å visualisere et stort antall immunostained CD8 T i menneskelig lunge svulst skiver. En co merking med anti-EpCAM og anti-CD90 antistoffer bør tillate for å avgrense svulst holmer og stromal områder. Fibrillar kollagen, rikelig i svulst stroma, kan visualiseres uten eksogene flekker ved hjelp av andre harmonisk generasjon på en to-fotonet mikroskop3,4. Merk at noen menneskelige lunge svulst presentere noen klar forskjell mellom tumor holmer og stroma. Slike svulster bør forkastes og prøven presentere store områder av cellen nekrose identifisert av ikke-spesifikk binding av antistoffer og DAPI flekker. Samsvar med publiserte resultatene i menneskelig lunge og eggstokkene kreftsvulster, bosatt CD8 T-celler er mer konsentrert i stroma sammenlignet svulst holmer4. Et representativt eksempel på CD8 T celle fordelingen kreftceller og CD90 er vist i figur 2.

    Skive analysen kan for analyse av bosatt T celle motilitet i forskjellige svulst regioner. Nyttige kriterier for å sammenligne CD8 T celle motilitet i forskjellige regioner inkluderer gjennomsnittlige hastigheten (banelengde delt varighet samplet) og forskyvning lengden (vektor mellom begynnelsen og slutten av et spor). Selv om knappe i svulst holmer, overføre CD8 T celler mer aktivt i denne kupeen sammenlignet med stroma (Figur 3). Gjennomsnittlig bør mener hastigheten individuelle CD8 T-celler være nær 4 µm/min i det svulst stroma med høy innen og mellom tumor variabilities4. I svulst stroma, er motilitet av bosatt T-celler sterkt påvirket av tetthet og retningen på ekstracellulær matrix fiber3,4. En vellykket eksperiment vil resultere i mindre T celler i tett matrix områder i forhold til løs matrix områder, samsvarer med publiserte resultatene3,4.

    Merk at noen menneskelige lunge svulst ha svært høy autofluorescence utelukker bildebehandling av bosatt T-celler. Slike funksjonen er raskt observert i begynnelsen av tenkelig økten. Autofluorescent svulster bør forkastes. Et representativt eksempel på bosatt CD8 T-celler i en autofluorescent svulst er vist i Figur 4.

    Figure 1
    Figur 1: fotografier av perfusjon. A) fenol red-fri RPMI løsningen er beriket i 5% C0295% O2. B) løsningen er deretter parfyme av en peristaltiske pumpe. C) RPMI løsningen inn kultur parabol via innløpet. Ved utløpet, er løsningen pustende av pumpen fra kammeret i en avfallsbeholderen. Merk at aspirasjon spissen er satt på et nivå til å fastsette løsning høyde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2: fordeling av bosatt CD8 T celler i en menneskelig lunge svulst. Representativt bilde av en human lunge svulst skive farget for CD8 (grønn), EpCAM (blå) og CD90 (rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3: motilitet bosatt CD8 t celler i en menneskelig lunge svulst. Baner individuelle bosatt CD8 T-celler i stromal (rød) og svulst celle (blå) regioner av en menneskelig lunge karsinom skive. Stykket var farget med angitte antistoffer og fotografert for 20 min med AC confocal mikroskop. Fibrillary kollagen ble oppdaget på slutten ved hjelp av andre harmonisk generasjon (SHG) på to-fotonet mikroskop. Spor er fargekodet etter CD8 T celle forskyvning lengde. Dette bildet er endret fra 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4: representativt bilde av en autofluorescent menneskelig lunge svulst. Svulst stykket var farget CD8 (grønn) og EpCAM (blå). SHG signalet er i rødt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Discussion

    En enkel, rask og robust teknikk for å generere menneskelige lunge svulst skiver og vurdering av den dynamiske oppførselen av bosatt CD8 T-celler i en bevarte svulst miljøbruk AC confocal mikroskop er beskrevet. Denne protokollen er en avgrensning av en tidligere JoVE artikkel som beskriver overvåking av belagt T-celler på murine lymfeknute skiver2.

    Bleking av fluorescerende fargestoffer må vurderes spesielt med første generasjon fargestoffer som fluorescein isothiocyanate og phycoerythrin. Vi fant at en uttalt photobleaching av direkte-kombinert antistoffer oppstod med to-fotonet mikroskop. Derimot ble minimale photobleaching oppdaget med AC confocal mikroskoper, særlig ved hjelp av lyse fluorescerende fargestoffer nylig utviklet.

    Antistoffer er relativt store molekyler og derfor deres gjennomtrengning i vevet kan være vanskelig. Dette trinnet kan forbedres ved å øke inkubasjon tiden. Dessuten, flekker bruk en mindre reagenser som direkte koblede Fab fragmenter av antistoffer representerer et godt alternativ.

    Alle antistoffer beskrevet i denne protokollen er tidligere godkjent og kjent for å produsere lyse flekker4. Derfor er isotype kontroller ikke nødvendig. Men hvis endringer denne metoden bruker andre antistoffer er ønskelig, anbefales så bruk av isotype kontroll antistoffer.

    Eksperimentell systemet presenterer noen begrensninger. Kutte prosedyren vil skade vev, som kan påvirke CD8 T-celler, spesielt nær kuttet overflaten. I tillegg kan en rekke løselig faktorer (f.eks chemokines) i kontrollere overføringen av T-celler gå tapt. En måte å omgå disse problemene er ved å overvåke T-celler på flere titalls mikrometer fra overflaten i antagelig sunnere områder av vev. Publisert eksperimenter avslører at T-celler lokalisert dyp i vevet migrere mer aktivt enn T-celler lokalisert nær kutte overflate4. Vi har brukt AC confocal mikroskop for våre studier, men det er sannsynlig at to-fotonet mikroskop vil øke romlig oppløsning i dybden.

    Denne tilnærmingen er avhengig av bruken av fluorescently-kombinert antistoffer som ikke nøytral molekyler. Full størrelse antistoffer er mottakelige for påvirker normal funksjon av T-celler på forskjellige måter. Først kan anti-CD8 antistoffer endre T celle migrasjon ved å utløse en intracellulær signalnettverk cascade kan påvirke cytoskeleton av lymfocytter spiller. Andre anti-CD8 antistoffer kan modulerer samspillet mellom CD8 og MHC klasse I molekyler, et viktig skritt i antigen anerkjennelse prosessen. Tredje, intakt antistoffer kan binde til Fc reseptorer uttrykt av mange myeloide celler i svulsten og derfor utsatt å øke uspesifisert signalet. Vi har ingen indikasjon på at et problem påvirket våre data, sannsynligvis fordi Fc reseptorer bosatt myeloide celler er ulikt i kultur, mettet med immunglobuliner stede i svulst miljøet. Faktisk, tillegg av serum under merking prosedyren, gjødsler blokkere gratis Fc reseptorer, ikke endre den immuno-flekker. Likevel Fab fragmenter av antistoffer, blottet for Fc regionen, samt antistoffer mutated i Fc region og Kamelid-avledet antistoff fragmenter8 representerer andre alternative strategier spore bosatt celler med fluorescerende tracers.

    De siste tiårene, er flere modellsystemer utviklet og brukt for sanntids avbilding av T-lymfocytter. Disse inkluderer i vitro preparater av T celler tidligere renset og kultivert med antigen presentere celler. Slike forberedelser har tillatt bemerkelsesverdig fremgang i å definere mekanismer av antigen anerkjennelse og reaksjonsevne. Men mangler de kompleksiteten i vev miljøet. Andre preparater er etablert at mer tett etterligne strukturen i en innfødt vev. For eksempler, tredimensjonale kollagen gel matriser i hvilke renset T-celler har vært innebygd, og kultur av reaggregated vev fragmenter har blitt brukt til å overvåke den dynamiske oppførselen av T-lymfocytter med fluorescerende imaging teknologi9 . Disse systemene dag fordelen av en arkitektur nær innfødt vev, men de mangler andre viktige mobilnettet og løselig faktorer. I mus, har to-fotonet intravital mikroskopi vært ansatt spore T celler i virkelig fysiologiske miljøet i et intakt organ10. Men er slik tilnærming teknisk vanskelig å definere. I tillegg viser musen modeller bemerkelsesverdig forskjellene med menneskelige fysiologi.

    Teknikken er beskrevet i denne protokollen representerer en kompleks, multi-mobilnettet svulst miljø som er unikt posisjonert til å fungere som et viktig bindeledd mellom co kulturstudier og dyremodeller.

    Protokollen beskrevet her kan også brukes til å spore motilitet i andre celler enn CD8 T-lymfocytter som antistoffer er generert. Videre er kan teknikken tilpasses andre menneskelige og murine svulster og vev. For eksempel, har vi kunnet bilde i sanntid dynamikken i B-celler merket med en anti-CD19 antistoff friske menneskelige mandlene.

    Teknikken er beskrevet i denne protokollen gir skjermen terapeutiske molekyler kontrollere T celle motilitet i vev. Tilgjengelighet av kultur-systemet tillater å bruke noen farmakologiske reagenser og teste deres konsekvenser på T celle migrasjon. Det er nå akseptert at i voksende svulster, CD8 T celler ha en lav overføring og redusert kontakter med tumor celler11. Viktigst, knappe tilstedeværelsen av T-celler i svulst celle regioner er forbundet med et dårlig resultat og anses å være en av resistens til T celle-baserte kreft immunterapi. Flere hindringer begrense T celler fra migrering i tumorer har blitt identifisert inkludert en tett ekstracellulær matrix. I denne forbindelse representerer identifikasjon av molekyler kan gjenopprette T celle motilitet og samhandling med ondartede celler et viktig skritt i kreft immunterapi. I en tidligere studie fant vi at en delvis degradering av kollagen med collagenase, akutt på menneskelig lunge skiver, forbedrer kontakt av T-celler med kreftceller.

    Til slutt, muligheten til å holde menneskelige svulst skiver i kultur for opp til flere dager7,12,13 tilbyr en rekke lovende programmer T celler og immunterapi.Men er stabiliteten av modellen under langsiktige kultur en viktig parameter som må vurderes grundig.

    Skaffe frisk og sunn vev er en kritisk faktor å produsere kvalitet skiver med god immunostai-CD8 celler, kreftceller og stromal elementer. Holde svulst biopsi på 4 ° C før behandling er avgjørende.

    Håndtering av skiver med fine tang representerer et viktig skritt i denne protokollen. Dette bør utføres med stor forsiktighet i agarose kan være lett skadet. Et kutt i agarose vil invadere segl laget av rustfritt stål vaskemaskinen resulterer i en lekkasje av antistoffer som inneholder løsninger.

    Disclosures

    Ingen interessekonflikter erklært.

    Acknowledgments

    Vi ønsker å takke Pierre Bourdoncle og Thomas Guilbert av Cochin Imaging (Institut Cochin, Paris) om råd og hjelp med mikroskop. Dette arbeidet var støttes delvis av tilskudd fra den franske Ligue Nationale contre le kreft, av CARPEM (forskning for personlig medisin), av Fondation de France og EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet under grant avtale uten 667980 (KARAT).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Upright confocal microscope Leica The use of a spinning disk confocal is recommended
    Imaris software Bitplane This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration
    Vibratome Leica VT1200S
    Fine Forceps World Precision Instruments 14142
    30 mm Culture inserts Millipore PICM0RG50
    Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 61870010 Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin
    Phosphate-buffered saline (PBS) ThermoFisher 20012019
    Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170088
    Low gelling temperature Agarose, type VII-A Sigma-Aldrich A0701
    Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond 3M 1469
    Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads Warner Instruments 64-1415
    Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter Amazon B004K1FDGQ
    BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1) BD Biosciences 565289
    FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125) Miltenyi Biotec 130-098-113
    BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10) Biolegend 328125
    4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ThermoFisher D1306

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner. J Exp Med. 204, (5), 1167-1179 (2007).
    2. Salmon, H., et al. Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes. J Vis Exp. (53), e3054 (2011).
    3. Salmon, H., et al. Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors. J Clin Invest. 122, (3), 899-910 (2012).
    4. Bougherara, H., et al. Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration. Front Immunol. 6, 500 (2015).
    5. Mandal, R., Chan, T. A. Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy. Cancer Discov. 6, (7), 703-713 (2016).
    6. Wolchok, J. D., et al. Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 369, (2), 122-133 (2013).
    7. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (18), 8352-8356 (2010).
    8. Rashidian, M., et al. Noninvasive imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (19), 6146-6151 (2015).
    9. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20, (8), 931-941 (2009).
    10. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, (6089), 1676-1681 (2012).
    11. Joyce, J. A., Fearon, D. T. T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment. Science. 348, (6230), 74-80 (2015).
    12. Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110, (2), 479-488 (2014).
    13. Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66, (3), 253-255 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics