バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術 * These authors contributed equally

Immunology and Infection

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Summary

この原稿は、一連の生化学的アッセイに加えて、適切なビブリオコレラ(Vibrio cholerae)の維持技術を説明し、臨床的および環境的V間の迅速かつ確実な区別のために集合的に利用される。 コレラバイオタイプは実験室環境で使用されます。

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Brumfield, K. D., Carignan, B. M., Ray, J. N., Jumpre, P. E., Son, M. S. Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates. J. Vis. Exp. (123), e55760, doi:10.3791/55760 (2017).

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Abstract

水生グラム陰性菌であるビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)は、感染性胃腸疾患コレラの病原体である。この病気の世界的な有病率および重症度のために、 Vコレラは環境および実験室の環境の両方で広範に研究されており、適切な維持および培養技術が必要である。古典とエルトールは、 Vを構成する2つの主要なバイオタイプです。 コレラ菌 O1血清群であり、それぞれがバイオタイプの特徴付けのための信頼性のある機構を提供するユニークな遺伝子型および表現型特性を示し、培養条件を誘導する特異的ビルレンスを必要とする。所与の感染またはアウトブレイクの原因となる菌株のバイオタイプに関わらず、この疾患の標準的な治療には、抗生物質のレジメンを補充した再水和療法が含まれる。しかしながら、バイオタイプの分類は、実験室研究に必要であり、生物医学分野においてより広い影響を及ぼす可能性がある。2000年代初期には、古典的およびEl Torバイオタイプの両方からの遺伝子型および表現型形質を示す臨床分離株が同定された。 El Tor変異体と呼ばれる新しく同定されたハイブリッドは、従来の伝統的な単一アッセイ同定プロトコールよりも臨床的および環境的な分離生物型同定をより複雑にしている。 Vを記述することに加えて。 ( ctxBおよびtcpA )PCRベースの遺伝子スクリーニングおよび表現型アッセイ(ポリミキシンB耐性、クエン酸代謝、タンパク質分解活性、溶血活性、運動性、およびグルコース代謝)を、Voges- Proskauerアッセイ)は、古典的なタイプとEl Torのバイオタイプを特徴付けるおよび/または区別するために集合的に使用された。一緒に、これらのアッセイは、代用品として、または加えて、特徴的な費用のかかる労働集約的実験に使用される効率的な体系的アプローチを提供するVの コレラ(臨床的および環境的)分離株。

Introduction

コレラ(Cholera)は、水生グラム陰性細菌であるコレラ菌(Vibrio cholerae)を含む汚染された食物または水の消費によって引き起こされる遠位小腸の病気である。 コレラの症状には、吐き気や制御不能な水様の下痢があり、重度の脱水症状につながり、適切に治療しなければ死に至る。 V。 コレラは、細胞表面リポ多糖O-抗原の構造に基づいて200を超える血清群に分けることができる。しかし、O1とO139の2つの血清群のみが、流行またはパンデミックの可能性1,2を示している。さらに、血清群O139は、主に東南アジア3、4に単離され、血清群O1は世界中に分布している。さらに、O1血清群は、2つの主なバイオタイプに分類することができる:クラシックおよびエル・トール。古典的なバイオタイプは、最初の6つのコレラパンデミック進行中の第七のパンデミックは、環境の古典的バイオタイプを世界的に置き換えたEl Torバイオタイプの結果である5,6,7 。最近、古典的およびエルトールバイオタイプ8,9,10,11,12,13,14,15,16,17の両方の顕著な特徴を含む株が生じており、以来、El Torバリアント13,17と呼ばれている。一部のEl Tor変異体は、以前に観察されたものよりも迅速かつ重度の疾患進行を伴って病原性能力の上昇を示しており、代理人の特定と疾病の予防と治療に対するより包括的なアプローチの必要性8,9,18。バイオタイプの同定は治療を即座に指示しないが、ワクチン開発および将来の治療剤のさらなる進歩は、バイオタイプの区別の恩恵を受ける可能性がある。

ここに記載された最初の一連のプロトコルは、研究者がVを適切に維持することを可能にする。実験室環境でのコレラ菌株。一貫性およびその後の分析には、バイオタイプに依存しない分離物のストック調製および増殖が必要である。しかし、病原性遺伝子発現を最適に誘導するためには、独立した生物型特異的培養技術が必要とされる19 。さらに、様々な遺伝的および生化学的アッセイのための準備がこの原稿に概説されている。

コレラトキシン(CT)と毒素が共存する( V)の両方のバイオタイプにおいて、マスターレギュレーターToxTによって制御される2つの主要なビルレンス因子である。 コレラ O1血清群20 。 CTは、5つのCtxB 単一のCtxAサブユニットを取り囲むサブユニットであり、コレラに伴う急速な電解質損失を引き起こす。 TCPは、 tcpオペロン( tcpABQCRDSTEF )によってコードされるIV型線毛であり、遠位小腸の付着およびコロニー形成に関与する。 tcpAは、線毛8の構築に必須の個々のピリンサブユニットをコードするtcpオペロンの最初の遺伝子である。 ctxAの遺伝子配列は、古典型とEl Torのバイオタイプの間で完全に保存されていますが、 ctxBtcpAは2つのバイオタイプで異なりますが、各バイオタイプ8内で保存されています。 ctxBは、2塩基posi以外のバイオタイプ間で完全に保存されている(115と203)。 El Torバイオタイプでは、チミンは塩基番号115および203に存在し、古典的なバイオタイプはこれらの塩基にシトシンを含む。 tcpAは、各バイオタイプ内で完全に保存されているが、バイオタイプ間の複数の塩基で異なる。これらの遺伝子の区別は、一次バイオタイプ同定マーカーとして役立ち、これらの部位を含むポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅産物の配列決定後、野生型(WT)古典的O395またはWT El Tor N16961と比較して、 CTおよびTCPの、それぞれ、 V. cholerae分離株における。

古典的およびEl Torバイオタイプ21,22,23の間の表現型の特徴を特徴付けるために、多数のプロトコルが開発されている。ポリミキシンBは、グラム陰性菌の外細胞膜の完全性を危うくするペプチド抗生物質であるテリアおよびポリミキシンB耐性は、ポリミキシンB耐性アッセイ21を介して視覚化することができる。クエン酸塩はクレブスサイクルの主要な基質であり、唯一の炭素源としてクエン酸塩を代謝する能力は、クエン酸代謝アッセイ22を用いて決定することができる。 hapR は、様々なプロモーター領域に結合し、遺伝子およびオペロンの発現を調節する、 V. cholerae、 HapRのグローバルレギュレーターおよびマスタークオラムセンシングレギュレーターをコードする24V. choleraeのいくつかの病原性株は、 病原性遺伝子発現のこの密度依存的調節を失わせたhapR遺伝子に天然に存在するフレームシフト突然変異を有する24,25 。乳寒天培地を用いてHapR調節プロテアーゼ活性を測定することにより、研究者は、特定の単離物が機能的HapR 23を含むかどうかを同定することができる。ザ赤血球を溶解する溶血酵素を分泌する株の能力についての溶血アッセイ試験;血液寒天プレート23上に溶血の程度を視覚化することができる。運動性はしばしばコレラ菌の病原性に関連し、運動性寒天プレート23を用いて分析することができる。 Voges-Proskauerアッセイは、唯一の炭素源としてグルコースを発酵させ、副産物アセトイン21を産生する株の能力を試験する。 El Tor変異体の出現により、広範な遺伝子型スクリーニングなしに、およびVのバイオタイプバックグラウンドを推定する前に、任意の表現型アッセイの結果を予測することは困難である。 コレラ菌単離物の場合、アッセイ23のこのアセンブリを実施し、その結果を表2のような参照株と比較することが推奨される。

ここでは、一連のプロトコルを進めており、これらのプロトコルをまとめて使用していますVを特徴付けるためのより包括的なアプローチのための遺伝子型および表現型アッセイを提供する。 コレラバイオタイプ。さらに、我々は既知のVの遺伝子型と表現型の区別を述べた。 (WT古典的なO395、WT El Tor C6706、およびWT El Tor N16961; 表1 )と比較して、コレラエルEl Tor変異体(MQ1795およびBAA-2163)を使用した。 El Tor変異体の出現は、以前に採用された単一アッセイバイオタイプの特徴付けプロトコルの信頼性に対する課題を提示した。しかしながら、この複数のアッセイ同定システムは、臨床的および環境的Vのより信頼性の高い特徴付けを可能にする。 コレラ分離株。

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Protocol

注:各アッセイの時間の考慮事項は、個々の培地調製が異なる時間を必要とするために行う必要があります。例えば、固体寒天プレート培地は、十分に冷やして乾燥させるべきである(1~2日)。追加の時間の考慮( すなわち、単一コロニーおよび一晩の培養増殖)は、各プロトコルの下で特定され、 表2に見られる。

1.メディアの準備

  1. 1×リン酸緩衝食塩水(PBS)
    1. 4.0gのNaCl、0.1gのKCl、0.72gのNa 2 HPO 4 、および0.12gのKH 2 PO 4を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、脱イオン水で容量を500mLに調整し、pH計を用いてpHを7.2に調整し、HClを溶液に滴下し、0.22μmフィルターを用いてオートクレーブまたはフィルターで滅菌する。 1x PBSは室温で無期限に保存できます。
      注意:HClは濃酸ですので、施設、地方、州、および連邦の規制に適用されます。適切な取り扱いガイドラインについては、製造元が提供する安全性データシートを参照してください。
  2. Luria-Bertani(LB)ブロス
    1. 5.0gのトリプトン、2.5gの酵母エキス、および2.5gのNaClを計量する。構成成分を1Lボトルに混合し、脱イオン水、オートクレーブで容量を500mLに調整し、室温で最大6ヶ月間保存する。古典的なバイオタイプ毒性誘発条件については、オートクレーブする前にHClを用いてpHを6.5に調整する。
  3. 0.03%(w / v)のNaHCO 3を含有するAKI培地
    1. 成分1(AKI培地)について:ペプトン7.5g、酵母エキス2.0g、NaCl 2.5gを計量する。構成成分を1Lボトルに混合し、脱イオン水およびオートクレーブで容量を450mLに調整する。 AKI培地は、室温で最大6ヶ月間保存することができます。
    2. 成分2(NaHCO 3 )の場合:1.5gのNaHCO 3を秤量し、滅菌ベシクル中の脱イオン水で50mLに希釈する。 0.22μmフィルターを使用してNaHCO 3を濾過滅菌する。 NaHCO 3は、使用直前に調製しなければならない。
    3. 使用前にコンポーネント2をコンポーネント1にフィルタリングすることにより、1:10の比率を作成する2つのコンポーネントを無作為に組み合わせます。
  4. Luria-Bertani(LB)寒天プレート
    1. 5.0gのトリプトン、2.5gの酵母エキス、2.5gのNaCl、および7.5gの寒天を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、脱イオン水、オートクレーブで容量を500mLに調整し、標準サイズの100mm×15mm滅菌ペトリ皿で調製する。メッキされた培地は、最大6ヵ月間プラスチックで包まれ、4℃で蓋の上に保管されます。
  5. ポリミキシンBを補充したLB寒天プレート
    1. 成分1(LB寒天)の場合:5.0gのトリプトン、2.5gの酵母エキス、2.5gのNaCl、および7.5gの寒天を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコに混合し、容量を500mLに調整する脱イオン水およびオートクレーブに入れた。
    2. 成分2(ポリミキシンB)の場合:ポリミキシンBを脱イオン水に滅菌2 mL微量遠心チューブで50,000 IU /μLの濃度で溶解し、0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌する。
    3. 成分1が触ってもまだ凝固していないが、凝固していない場合は、無菌的に成分2に500μLを加えて最終濃度50IU /μLとし、完全に混合する。混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、標準サイズの100mm×15mmの滅菌ペトリ皿で調製する。メッキされた培地は、3ヵ月まではプラスチックで包まれ、4℃では蓋の上に保管されます。
  6. 最小クエン酸培地寒天培地
    1. 成分1(ブロモチモールブルーを含む寒天):7.5gの寒天と0.02gのブロモチモールブルーを計量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、脱イオン水で容量を450mLに調整し、混合物をオートクレーブする。
    2. コンポーネント2(10x VBMM)の場合:10.06gのMgSO 4・ 7H 2 O、10.0gのクエン酸H 2 O、50.0gの無水K 2 HPO 4 、および17.5gのNaNH 4 HPO 4・ 4H 2 Oを含む.1L三角フラスコ中の成分を合わせ、500mL 0.22μmのフィルターを用いて脱イオン水およびオートクレーブまたはフィルターで滅菌する。 10x VBMMは室温で6ヶ月まで保存できます。
    3. 成分1に50mgの成分2を添加し、混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、標準サイズの100mm×15mm滅菌ペトリ皿で調製する。メッキされた培地は、最大6ヵ月間プラスチックで包まれ、4℃で蓋の上に保管されます。
  7. ミルク寒天プレート
    1. 構成成分1(ミルク)の場合:1リットル三角フラスコ中で脱脂粉乳8.0gを秤量し、脱イオン水およびオートクレーブで容量を200mLに調整する。
    2. 成分2(脳心臓注入を伴う寒天):脳心臓注入物3.68gおよび寒天6.0gを秤量する。コンバインド500 mLの三角フラスコに入れ、脱イオン水とオートクレーブで容量を200 mLに調整する。
    3. オートクレーブ後、成分2を成分1に注ぎ、2つの成分を混合し、完全に混合する。 150mm×15mmの無菌ペトリ皿で調製する。ミルクプレートは、プラスチックで包まれた1週間まで保存することができ、リッド側は4℃で保存することができます。混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、150mm×15mmの無菌ペトリ皿で調製する。
  8. 運動性寒天プレート
    1. 成分1(LB寒天)について:5.0gのトリプトン、2.5gの酵母抽出物、2.5gのNaCl、および2.0gの寒天を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコに入れ、脱イオン水とオートクレーブで容量を500mLに調整する。
    2. 成分2(1%(w / v)塩化トリフェニルテトラゾリウム; TTC):0.25gのTTCを秤量する。滅菌ベシクル内の脱イオン水で25 mLに調整し、0.22μmフィルターを使用してフィルターを滅菌します。室温で6ヶ月間保管してください光の暴露を最小限にするために箔で覆われています。
    3. 2.5mLの1%(w / v)滅菌TTCをオートクレーブした培地に加える。
    4. 大150 mm×15 mmの滅菌ペトリ皿に培地をできるだけ厚く(≧50 mL /プレート)注ぎます。メッキされた培地は、1週間までプラスチックに包まれ、4℃で蓋が上になるように保管することができます。混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、150mm×15mmの無菌ペトリ皿で調製する。
  9. ヴォーグ・プロスカウアー(VP)
    1. 成分1(Methyl Red-Voges-Proskauer broth; MR-VP):500mLの三角フラスコ中で1.7gのMR-VP培地を秤量し、脱イオン水およびオートクレーブで100mLに調整する。無菌MR-VPブイヨンは、室温で最大6ヶ月間保存することができます。
    2. 成分2(5%(w / v)アルファ(α)ナフトール):滅菌ベシクル中で1.0gのα-ナフトールを秤量し、95%エタノールで20mLに調整する。 α-ナフトールは、光を最小限に抑えるために、ホイルで包んだ最長1週間室温で保存することができますオスレ。
    3. 成分3(40%(w / v)水酸化カリウム; KOH):滅菌ベシクル中で20.0gのKOHを秤量し、滅菌脱イオン水で50mLに調整する。 KOHはプラスチック容器内で室温で6ヶ月まで保存することができます。

2. Vの維持と成長コレラ菌株

  1. 凍結ストック培養物の調製および使用
    1. 滅菌2 mL微量遠心管内で遠心分離(≧8,600 xg)により2分間、1.8 mLの液体一晩培養し、上清を除去し、新鮮なLBブロス900μLにピペットで再懸濁する。
    2. 滅菌60%(v / v)グリセロール900μLを培養液に加え、ボルテックスで混合する。
    3. 混合物を滅菌2 mL極低温チューブに移し、無期限に-80°Cで保存します。
    4. 使用するには、滅菌接種ループを使用して少量の凍結ストックを除去し、LB agarプレート。培養物が完全に解凍するのを防ぐため、使用後は直ちに凍結保存液を-80℃に戻します。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。
  2. 液体培地中での一夜培養の増殖
    1. 凍結ストックからLB寒天プレート上への単一コロニー(セクション2.1.4による)についてのストリーク。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。
    2. 無菌のアプリケータースティックで単一のコロニーの表面に触れ、コロニーを液体ブロスに移すことによって、単一のコロニーを有する滅菌10mL培養チューブ中に液体LBブロス4mLを接種する。
    3. 37℃で12〜16時間、225rpmでのシェーカーインキュベーター中での通気によりインキュベートする。
  3. 成長曲線
    1. プロトコール2.2に記載されているように、液体LB培地で一晩培養します。
    2. 250μLの一晩培養液を2に移すことによって一晩培養物を1:100に希釈する滅菌250mL三角フラスコ中の5mLの新鮮なLBブロス。
    3. 接種時(T 0 )に開始する毎時600nm (OD 600 )の液体培養物の光学密度を測定する。
    4. 37℃で30時間まで225rpmのシェーカーインキュベーター中で、または培養物が最大密度に達するまで、1:100希釈の一晩培養物をインキュベートする。
    5. OD 600対時間をグラフ化し、線形回帰を使用して各株のおよそ2倍の時間を決定する。
  4. El Tor Biotype毒性誘導条件
    1. 凍結ストックからLB寒天プレート上への単一コロニーの連鎖。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。
    2. 0.03%(w / v)のNaHCO 3を含む10mLのAKI培地に単一のコロニーを接種する。
    3. 通気せずに37℃で3.5時間培養物をインキュベートする。
    4. 7 mLの培養液を除去し、残りの3 mLの培養液をインキュベートする。さらに4時間225rpmでシェーカーインキュベーター内で通気させる。
  5. 古典的なバイオタイプの病原性誘導条件
    1. 凍結ストックからLB寒天プレート上への単一コロニーの連鎖。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。
    2. 単一のコロニーを有する4mL液体LBブロス(pH6.5)を接種する。
    3. 30℃で12〜16時間225rpmでシェーカーインキュベーター中で通気してインキュベートする。
  6. 1×PBS中で細胞ペレットを洗浄する
    1. 滅菌2 mL微量遠心管内で遠心分離(≧8,600 xg)により2分間、1.8 mLの一晩培養し、ピペットを用いて上清を除去する。ピペッティングにより1.8mLの1×PBS中で細胞ペレットを再懸濁する。
    2. 洗浄手順を3回繰り返した後、1.8mLの1×PBSで最終的に再懸濁する。

3. Vのキャラクタリゼーション。 コレラバイオタイプ

  1. PctxBおよびtcpAを用いたCRベースの遺伝的スクリーニング
    1. ctxBおよびtcpAの翻訳開始および停止部位の上流および下流にそれぞれ約50〜70bpをアニールするプライマーセットを設計する。
    2. プロトコール2.2に記載されているように、液体LB培地で一晩培養します。
    3. グラム陰性細菌用に設計された市販のキットを用いて染色体DNAを単離する。精製された染色体DNAは、-20℃で無期限に保存することができます。市販のキットを用いた染色体DNA単離は、一般に約4時間かかる。
    4. 微量分光光度計を使用して、染色体DNAサンプルが高品質であることを確認します(A 260/280 > 1.8)。
    5. 各染色体DNA単離物について、滅菌200μLPCRチューブ中で氷上でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、標準PCR成分を用いてctxBおよびtcpAの領域を増幅する: Taqポリメラーゼおよびbuffer(または等価物)、dNTP溶液、およびフォワード/リバースプライマーを含む。標準的なPCRパラメータを使用する(約3時間)。たとえば、次のプロトコルを使用します。
      1. 95℃で120秒間の初期変性。
      2. 95℃で60秒間変性させる。
      3. 60℃で45秒間アニールプライマー。
      4. 72℃で90秒間伸長する。
      5. 手順3.1.5.2〜3.1.5.4を34サイクル繰り返します。
      6. 最終伸長は72℃で600秒。
      7. 4℃で無限に保持する。
    6. 標準的な6×DNAゲルローディング色素を用いて5μLのそれぞれのPCR産物を染色し、1×トリス - ボレート-EDTA(TBE)中の1%アガロースゲル上に約10μLの1kbラダーおよび10μLのPCR産物を負荷する。バッファ。
    7. 染料フロントがゲルの末端に到達するまで(130分)、130Vでゲル電気泳動を行う(約90分)。一定の監視は電圧として推奨され、実行時間は機器によって異なります。
    8. 確認時期待されるサイズでのPCR増幅が成功したら、市販のDNAクリーン&コンセントレーターキットを使用して残りの45μLPCR産物を精製する。
    9. PCR増幅に使用したのと同じプライマーを用いてPCR産物を精製し、局所シーケンシング施設のガイドラインに従って調製する。
    10. 各単離物からの遺伝子配列のFASTAフォーマットと、NCBIウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)で入手可能な公開配列とを、検索クエリーボックス内の以下の受託番号を検索することによって比較する。
    11. ctxB :VC0395_A1059からVC0395_A1060(El Tor)までの(古典的な)領域VC_1456
    12. tcpA :(古典的)VC0395_A0353(エル・トール)VC_0828
  2. スポッティングによる生物型分類のための表現型アッセイ
    1. プロトコール2.2に記載されているように、液体LB培地で一晩培養します。
    2. プロトコル2.6で指定されているように細胞ペレットを洗浄する。
    3. ピペットを使用して洗浄した培養液1μLをそれぞれの培地にスポットする。培地の選択およびインキュベーションの仕様については、表2を参照してください。
  3. 運動性アッセイ
    1. プロトコール2.2に記載されているように、液体LBブロス中で一晩培養液を調製する。
    2. プロトコル2.6で指定されているように細胞ペレットを洗浄する。
    3. 接種したスタブを洗浄した液体培養物に挿入し、培地中に垂直に「刺す」ことにより、運動性寒天プレートに接種する。各接種の間に、ブンゼンバーナーを用いてワイヤースタブを滅菌し、寒天を刺したら接種したスタブが曲がらないようにしてください。
    4. 37℃で14〜24時間、プレートの蓋を上にしてインキュベートする。 14時間後、運動性プレートを密接にモニターして、培養物の過剰増殖を防ぐ。
  4. Voges-Proskauer(VP)アッセイ
    1. プロトコール2.2に記載されているように、液体LBブロス中で一晩培養液を調製する。
    2. 接種4前もって調製した一晩培養物10μLを滅菌培養チューブ中の4mLのMR-VPブロス中にピペッティングし、シェーカー・インキュベーター中で225rpmで12〜16日間曝気してインキュベートすることにより、メチルレッド・ボージュ・プロスカウアー、 hで37℃でインキュベートした。
    3. 滅菌培養管中でMR-VP一晩培養の1mLアリコートに5%(w / v)α-ナフトール150μLおよび40%(w / v)KOH50μLをそれぞれ添加する。
    4. 短時間ボルテックスして、色の変化が生じるまで室温で4時間まで放置する。

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Representative Results

任意の細菌株の適切な維持および使用のために、目的の株の倍加時間を知ることが推奨される。ここでは、一般に使用されるVの変化する成長速度が、 コレラ菌株は増殖曲線により示され、近似倍化時間は線形回帰を用いて計算された。 WT El Tor N16961およびEl Tor変異体MQ1795は、WT古典的O395(〜2時間)より短い倍加時間(それぞれ〜1時間および〜1時間)を示した( 図1 ; 表2 )。

V. choleraeの遺伝子操作およびその後の分析は、しばしばバイオタイプ間を適切に区別する能力に依存する。 PCRに基づく遺伝子スクリーニングおよび表現型アッセイは、 Vのバイオタイプ背景を区別するための信頼性の高いシステムとして集合的に実施された。臨床的および環境的コレラソレート;生物型参照株(WT古典的O395、WT El Tor C6706、およびWT El Tor N16961)および代表的なEl Tor変異体(MQ1795およびBAA-2163)が含まれていた( 表1 )。 WT古典的O395は、古典的なctxBおよびtcpA配列を示した。逆に、WT El Tor株N16961およびC6706は、El Tor ctxBおよびtcpA配列を実証した。興味深いことに、MQ1795およびBAA-2163は、O395に匹敵する古典的バイオタイプctxBサブユニットを含有したが、両方のEl Tor変異体は、El Tor生物型バックグラウンドを示すtcpAを含んでいた( 表1 )。 WT El Tor変異株(C6706およびN16961)は耐性を示し、ポリミキシンBを補充したLB寒天プレート上で増殖を示したが、WT古典的バイオタイプ株O395はポリミキシンBに対する感受性を示した。代表的なEl Tor変異株(MQ1795およびBAA-2163) WT El Torバイオタイプ株と比較して抗生物質に対する同様の耐性(C6706およびN16961)( 図2 ; 表2 )。 WT古典的バイオタイプ株O395は最小のクエン酸培地で増殖しなかったが、WT El Tor株(C6706およびN16961)はクエン酸を炭素源として利用でき、最小限のクエン酸培地で増殖を示した。代表的なEl Tor変異型バイオタイプ株(MQ1795およびBAA-2163)は、WT El Torバイオタイプ株(C6706およびN16961)の増殖に匹敵する増殖を示した( 図3 ; 表2 )。 WT古典的株O395およびWT El Tor株N16961は、非機能的HapRを有し、したがってHapR調節プロテアーゼ活性を示さなかった。 WT El Tor株C6706、および代表的なEl Tor変異体(MQ1795およびBAA-2163)は、 接種の点から出現するクリアランスの領域としてhapR陽性視覚化される( 図4 ; 表2 )。 WT古典的菌株O395は溶血酵素を分泌せず、そのためであった(C6706およびN16961)および代表的なElTor変異株(MQ1795およびBAA-2163)は、接種点を囲む赤血球を完全に溶解し、β溶血を示す溶血酵素を分泌する( 図2)。 5 ; 表2 )。運動性は、バイオタイプ株の種類によって異なる。しかし、WT El Tor株N16961およびEl Tor変異体(MQ1795およびBAA-2163)は、比較的運動性の低いWT古典的株O395およびWT E1 Tor株C6706と比較して、過運動性を示した( 図6 ; 表2 )。 WT古典的株O395および代表的なEl Tor変異体はグルコースを代謝してアセトインを生成しなかったが、WT El Torバイオタイプ株はグルコース発酵の副産物としてアセトインを生成した(Voges-Proskauerアッセイ中に深い赤色の発色によって示される)。 ; 表2 )。

ひずみ ctxB遺伝子 tcpA 参照
ベース115 ベース203 バイオタイプ バイオタイプ
O395 C C クラシッククラシック 8
C6706 T T エルトールエルトール 8
N16961 T T エルトールエルトール 8
MQ1795 C C クラシックエルトール 13
BAA-2163 C C クラシックエルトール 8

表1: Vibrio cholerae 参照株の バイオタイプ依存性遺伝的相違 この表に示すのは、DNA塩基変化および遺伝子ctxBおよびtcpAにおける相対位置である。 WT古典的O395株およびWT El Tor株N16961およびC6706は、一般に使用されるバイオタイプ参照株である。 MQ1795およびBAA-2163は、El Tor変異体として知られている。

アッセイ 応用 中選択 インキュベーション 予想された結果
O395 C6706 N16961 MQ1795 BAA-2163
2.3)成長曲線27 様々なコレラ菌株の倍加時間を決定する 1.2)液体LBブロス 30時間まで(エアレーションで37℃) 約2時間 ND * 〜1時間 〜1時間 ND *
3.1)ctxBおよびtcpAを用いたPCRに基づく遺伝子スクリーニング8 ctxBの古典的なタイプとEl Torのバイオタイプの背景を区別する N / A N / A クラシックエルトールエルトールクラシッククラシック
tcpAの古典的なタイプとEl Torのバイオタイプの背景を区別する N / A N / A クラシックエルトールエルトールエルトールエルトール
3.2)ポリミキシンB抵抗21 抗生物質ポリミキシンBに対する感受性 1.5)ポリミキシンBを添加したLB寒天プレート 18時間(37℃) - + + + +
3.2)クエン酸代謝22 唯一の炭素源としてクエン酸を代謝する能力 1.6)最小クエン酸培地寒天プレート 24時間(37℃) - + + + +
3.2)カゼイン加水分解23 HapR調節プロテアーゼ活性 1.7)ミルク寒天プレート 18時間(37℃) - - + + +
3.2)溶血23 溶血活性測定血液寒天プレート 48時間(37℃) ガンマベータベータベータベータ
3.3)運動性23 運動性の程度の測定 1.8)運動性寒天プレート 14〜24時間(37℃) 10 mm 15 mm 21 mm 25 mm 29 mm
3.4)ヴォーグ・プロスカウアー21 グロコースを発酵させ、アセトインを副生物として生成する能力を測定する 1.9)液体Voges-Proskauer培地最大4時間(室温) - + + - -
注:「ND *」は決定されていないことを示します。 「+」は陽性の結果を示し、 「 - 」は否定結果

表2:使用された遺伝的および表現型アッセイの要約 Vibrio cholerae バイオタイプの区別。この表は、この研究で使用された古典的およびエルトル生物型を区別するために集合的に使用される種々の遺伝的および表現型アッセイ、適用および期待される結果をまとめたものである。プロトコール番号および特定のプロトコールへの参照は、アッセイの欄に示されています。 「ND *」は未決定を意味する。 「+」は陽性の結果を示し、 「 - 」は否定的な結果を示す。

図1
図1: V 。 WTクラシックO395、WT El Tor N16961、およびEl TorバリアントMQ1795のコレラ増殖曲線。 37℃で通気したLBブロス中で増殖させたバイオタイプ参照株(WT古典的O395およびWT El Tor N16961)および代表的なEl Tor変異体MQ1795の増殖率を、OD 600 eT0で始まる非常に時間。増殖曲線を8つの独立した実験的反復で行い、各反復は各試行の独立した培養事象を表した。 WT El Tor株N16961およびEl Tor変異体MQ1795は、より長い倍加時間によって観察されるように、WT古典的株O395(約2時間)と比較して、より短い倍加時間(それぞれ約1時間および約1時間)を実証した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2
図2:ポリミキシンBを補充したLB寒天を用いたポリミキシンB抵抗の測定ペプチド抗生物質ポリミキシンBに対する耐性は、50IU /μLのポリミキシンBを補充したLB寒天上で増殖する能力によって決定した.WT古典的なO395株は、 supplポリミキシンBを補充し、抗生物質に対して感受性であると考えられた。 WT El Tor株(C6706およびN16961)および代表的なEl Tor変異体(MQ1795およびBAA-2163)は、抗生物質の存在下で増殖を示し、ポリミキシンBに対して耐性であると考えられた。プレートを37℃で18時間インキュベートした。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3
図3:最小クエン酸塩培地を用いたクエン酸代謝の測定唯一の炭素源としてクエン酸塩を利用する能力は、単離物が最小限のクエン酸塩培地で増殖する能力によって決定された。 WT古典的株O395は、最小のクエン酸培地で増殖しなかった(陰性)。成長はすべてのWT El Tor株(C6706およびN16961)および代表的なElTor変異体(MQ1795およびBAA-2163)であり、クエン酸塩を唯一の炭素源として利用する能力を示した(陽性)。プレートを37℃で18時間インキュベートした。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4
図4:ミルク寒天培地を用いたHapR調節タンパク質分解カゼイン加水分解の測定。 HapR調節プロテアーゼ活性によるカゼイン加水分解は、ミルク寒天上の接種点を囲むクリアランスの視覚的ゾーンによって決定した。 WT古典的菌株O395およびWT El Tor株N16961のような非機能的HapRを含む株は、接種点を囲むクリアランス領域を生成しなかった( hapR陰性)。 WT El Tor株C6706および代表的なEl Tor変異体(MQ1795およびBAA-2163)は、機能的なHapRを含み、これは、様々なサイズのクリアランスゾーン( hapR陽性)として視覚化することができる。プレートを37℃で18時間インキュベートした。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5
図5:血液寒天培地を用いた溶血活性の測定。溶血活性は、ヒツジの血液を補充した寒天プレートを用いて測定した。 WT古典的菌株O395は、赤血球を溶解する酵素(γ溶血性)を分泌しない。 WT El Tor株(N16961およびC6706)および代表的なEl Tor変異体(MQ1795およびBAA-2163)は溶血酵素を分泌し、その結果、接種点を取り囲むクリアランスの半透明ゾーン(β-溶血性)が生じた。プレートを37℃でインキュベートした°Cで48時間。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図6
図6:運動性寒天プレートを用いた運動性の決定。運動のゾーンは、代謝時に透明から赤に変わる塩TTCの視覚的な色の変化によって示され、細菌がどこに移動したかを示している。 El Tor株N16961(21mm)および代表的なEl Tor変異体(MQ1795(25mm)およびBAA-2163(29mm))は、WT古典株O395(10mm)およびWT El Tor株C6706(15mm) )は、O395およびC6706と比較して高度運動性を示した。プレートを37℃で18時間インキュベートした。 クリックしてくださいここではこの図のより大きなバージョンを見ることができます。

図7
図7:Voges-Proskauerアッセイ。グルコース発酵によるアセトイン生成を、Voges-Proskauerアッセイを用いて決定した。 WT古典的株O395および代表的なEl Tor変異体(MQ1795およびBAA-2163)は、グルコース発酵の結果としてアセトインを産生しなかった(陰性)。 WT El Tor株(N16961およびC6706)は、副生成物アセトインを生成し、深赤色変色(陽性)によって視覚化することができる。管を室温で4時間インキュベートした。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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Discussion

200以上の識別されたVのうち、 コレラ血清型、O1およびO139のみが流行の可能性がある。 O1血清群は、古典的およびエル・トールという2つのバイオタイプに分類することができる。しかしながら、El Tor変異体13,17と呼ばれるハイブリッド株は、El Torバイオタイプの背景を有し、古典的な特徴8,9,10,11,12,13,14,15,16,17を有する。この原稿に記載されているプロトコルは、 V. choleraeの様々な臨床分離株および非臨床分離株の特性決定および/または区別に関心を持つ研究者に、信頼できるマルチアッセイ同定システム。代案として信頼できるマルチアッセイ同定システムを使用することは、以前に確立された単一アッセイ同定システムおよび労働集約的な遺伝子スクリーニングを上回る改善である。すべての遺伝子型および表現型アッセイは、比較のためにWT古典的株O395およびWT E1 Tor株C6706およびN16961を含むべきである( 表1 )。我々の研究に含まれているMQ1795やBAA-2163などの単離株は、バイオタイプ( 図2図3図4図5図6 、および図7)の表現型プロフィールを表示することができる。 図7 ; 表2 )、信頼できる特性決定のための複数の遺伝子型および表現型形質の分析の必要性を示している。すべてのプロトコルは無菌で行う必要があります特に明記しない限り、室温で26V。 コレラは、潜在的に致命的な胃腸疾患コレラの病原体であるバイオセーフティーレベル2(BSL-2)病原体である。施設、地域、州、および連邦規制ごとに、すべての材料および廃棄物の適切な処理および処分を実施する必要があります。

すべての培地および試薬の調製は、最小感度18MΩ-cmに脱イオン化された分析グレードの試薬および超純水を使用して実施する必要があります。処理する前に、培地を調製し、十分に乾燥させる(1-2日間)。プレートは、寒天の表面上に残留液体が存在しない場合、十分に乾燥していると考えられる。運動性の範囲と細菌増殖を取り囲むクリアランスゾーンのために、運動性とミルクプレートは、1枚あたり50 mLまでの大きなペトリ皿(150 mm x 15 mm)で調製し、1週間までプラスチックで包むことができます、リ4ºCでd面を下にします。さらに、運動性プレートの寒天濃度は、運動性を減速させるように調節することができる。しかし、500mL溶液あたり3gを超えることは推奨しません。これは、全体的な運動性を大幅に低下させ、その違いが観察されないようにするためです。他のプレート培地はすべて、標準サイズのペトリ皿(100 mm x 15 mm)で1プレートあたり約25 mLに調製し、4ºCで蓋側をプラスチックで包んで6ヵ月間保存することができます。ポリミキシンBプレートを調製するには、ポリミキシンBを添加する前にオートクレーブ後に溶融培地を冷却することが重要です。過剰な熱は抗生物質を分解する可能性があるためです。 Polymyxin Bプレートは、3ヵ月までプラスチックで包まれ、蓋の側が4℃で保存できます。この原稿で議論されたアッセイは、一晩の培養(12-16時間)の成長のための一日のコロニー増殖(12-16時間)、遺伝子型の検討のための三日目(染色体DNA単離および〜3時間のPCR)または表現型アッセイ(18〜48時間; 表2 )。この原稿に記載されている表現型アッセイの生化学的分析に先立って、培養物は、残留培養培地のキャリーオーバーがスキュー結果から生じるのを防ぐために、1×PBSで洗浄しなければならない。さらに、ポリミキシンB、クエン酸塩、プロテアーゼ活性、溶血アッセイおよび運動アッセイを、単一の洗浄された一晩培養液を用いて同時に接種することができる。プレートメディウムをスポッティングすると、培養液の飛散が起こり、菌株間の交差汚染を引き起こす可能性があります。飛散を防ぐために、ピペットから培養液を完全に排出しないでください。代わりに、ピペットの最初の停止時に培養液の排出を停止してください。さらに、インキュベーション前にスポットを寒天表面に完全に吸収させ、寒天を穿刺しないように注意してください。結果に影響を与える可能性があります。クリアランスのゾーンをもたらす表現型アッセイ( 図4 ; 図5 ; 表2)および/または運動性( 図6 ; 表2 )は、比較分析のためにそれぞれの直径を測定することができる、クリアランスまたは成長の領域の合併を防ぐために最大間隔でなければならない。示されたインキュベーション時間の後、バイオタイプ参照株(WT古典的O395、WT El Tor C6706、およびWT El Tor N16961)と比較して、単離物を画像化および分析することができる。

この原稿で概説したシークエンシングによるPCRベースの遺伝子スクリーニングを用いて、初期PCR増幅後にctxBおよびtcpAに関する分離株のバイオタイプのバックグラウンドを同定することができる。標準的なシークエンシングガイドラインでは、増幅された領域( ctxBの場合は580bp、tcpAの場合は1420bp )のサイズに応じて特定の量のPCR産物が必要であり、反応のセットアップには確立されたプロトコールを守ることができます。手短に言えば、個々の前方およびr逆シークエンシング反応は、3〜5ピコモルのプライマー/反応液を用いて調製し、1.5mLの微量遠心管内で滅菌超純水で20μLに調整する必要があります。 PCR増幅および配列決定の両方のためのプライマー設計の助けとして、NCBIプライマー設計ツールhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/を利用することができる。 ctxBおよびtcpAの増幅およびシークエンシングの成功は、以下のプライマー(5 '→3')を用いて達成された: ctxB-フォワードGGGAATGCTCCAAGATCATCGATGAGTAATAC、 ctxB-逆CATCATCGAACCACAAAAAAGCTTACTGAGG、 tcpA-フォワードCCGCACCAGATCCACGTAGGTGGG、tcpA-逆GTCGGTACATCACCTGCTGTGGGGGAG。 ctxBの全コード領域は、塩基位置115および203(El Torの古典およびチミンの両方のシトシン)を除いて、両方のバイオタイプにわたって保存されていることに留意すべきである。さらに、 tcpAにおいて、複数の塩基変化が、dバイオタイプを区別するのに役立つ2つのバイオタイプ( 表1 )を超えているかどうかを判断する。

モデル生物Vを含む多くの実験研究では、 コレラ 、適切な維持および培養技術が重要である27 。一般的に使用されているVの成長速度。 WT古典的株O395およびWT El Tor株N16961のようなコレラバイオタイプ参照株は、ElTor変異体単離物の特徴付けに有用な洞察を提供し得る( 図1 ; 表2 )。 Vを横切って変化する成長率のために。 コレラ菌分離株では、培養液が後期定常期に最大濁度に達するまで毎分分光光度計の吸光度測定値を取ることが重要です。中期から後期の死期は、過剰な細胞破片に起因する濁りの高原により視覚化されないことがある。培養物の無菌Lへの1:4希釈吸光度測定値がOD 600 ≒1.0でピークになるため、完全な増殖曲線を得て、装置の精度を維持するためにBブロスを実施する必要があります。複数の系統について増殖曲線を作成する場合は、各系統について約5分間隔で吸光度を読み取る必要があります。 Vの理解コレラの生物型の成長速度は、病原性遺伝子発現研究、代謝活性の分析、および適切な培養および保存条件を含む多くの研究にとって重要である。その後の分析のために、細胞増殖を最大にし、細胞の完全性を維持するために、一晩培養物を増殖の遅い段階(12-16時間)まで後期対数で処理しなければならない。

しかしながら、古典的およびEl Torバイオタイプ株の培養条件は、 Vにおける病原性遺伝子発現の分析と同様である。 コレラはバイオタイプ特異的ビルレンス誘発条件を必要とする例えば、El Tor毒性誘導条件下で、ToxTは全細胞抽出物を処理することによって分析することができる(例えば、 WCE)または細胞ペレットを3.5時間で処理する一方で、無細胞上清およびWCEを7.5時間処理することによってCTおよびTCP発現を分析することができる(それぞれ、8,20)。この原稿を通して示された様々な遺伝子型および表現型形質は、多様なV. コレラバイオタイプが可能であり、以前に使用された単一アッセイバイオタイプの特徴付けの代替物の必要性が示される。

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Disclosures

著者は何も開示することはない。

Acknowledgements

New Hampshire-INBREの支援を受け、NIHの全米医科学研究所の施設開発賞(IDeA)、P20GM103506によって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60% Glycerol Calbiochem 356352 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
Agar Becto, Dickinson and Co. 214030 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agar with brain-heart infusion Becto, Dickinson and Co. 237500 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agarose Peqlab 732-2789 https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+&currentLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
Anhydrous K2HPO4 Fisher Scientific P288-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
Blood Agar Plates Remel R01200 Store at 4 °C;  http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Boric Acid Fisher Scientific A73-500 https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Bromothymol Blue Fisher Scientific B388-10 https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Cirtric acid ·H2O Fisher Scientific S72836-3 https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit New England Biolabs N0446S Store at -20 °C;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
Disodium EDTA Fisher Scientific S311-500 https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit Zymo Research D4007 http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Nucleic Acid Stain Biotium 41005 https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/
Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer Thermo Scientific 840-208100 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit Qiagen 158567 https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HCl Fisher Scientific A144-212 Corrosive;  https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KCl Fisher Scientific P217-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOH Fisher Scientific P250-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le Loop Decon Labs Inc. MP190-25 http://deconlabs.com/products/leloop/
Le Stab Decon Labs Inc. MP186-5 http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4·7H2O Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System Bio Rad Labs 1704406 http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373
MR-VP Broth Difco 216300 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
NaCl Fisher Scientific S271-10 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
NaHCO3 Fisher Scientific S233-500 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID
NaNH4HPO4·4H2O Fisher Scientific S218-500 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID
NanoDrop Lite Spectrophtometer Thermo Scientific ND-LITE-PR https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
Nonfat dry milk Nestle Carnation N/A N/A
Peptone Becto, Dickinson and Co. 211677 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch
Petri Dishes (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
Petri Dishes (150 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875714 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
Polymyxin B sulfate salt Sigma-Aldrich P1004-10MU Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&region=US
Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0273S Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Taq Reaction Buffer New England Biolabs M0273S Store at -20 °C;  https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™  Bio Rad Labs 1840148 http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
Triphenyltetrazolium chloride Alfa Aesar A10870 https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
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