والتصور وتصوير مباشر من العضيات أوليجوديندروسيتي في المخ أورجانوتيبيك الشرائح باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد والفحص المجهري [كنفوكل]

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

ميليناتينج oligodendrocytes تعزيز النشر السريع العمل المحتملة وبقاء الخلايا العصبية. بروتوكول للتعبير أوليجوديندروسيتي محددة من البروتينات الفلورية في أورجانوتيبيك شرائح المخ بتصوير مرور الزمن اللاحقة الموضحة هنا. علاوة على ذلك، يرد إجراء بسيط لتصور المايلين أونستينيد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kennedy, L. H., Rinholm, J. E. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56237, doi:10.3791/56237 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الخلايا العصبية تعتمد على العزل الكهربائي، والدعم التغذوي من أوليجوديندروسيتيس ميليناتينج. وعلى الرغم من أهمية oligodendrocytes، الأدوات المتقدمة المستخدمة حاليا بدراسة الخلايا العصبية، جزئيا فقط قد اتخذت على الباحثين أوليجوديندروسيتي. خلية تلطيخ بتوصيل الفيروسي نوع معين نهجاً مفيداً لدراسة ديناميات عضية حية. وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لتصور oligodendrocyte الميتوكوندريا في شرائح المخ أورجانوتيبيك بتوصيل مع الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) يحمل جينات المتقدرية البروتينات الفلورية المستهدفة تحت سيطرة النسخي مروج البروتين الأساسية المايلين. ويشمل البروتوكول لصنع أورجانوتيبيك شرائح المخ الماوس الاكليلية. ويتبع إجراء لتصوير الوقت الفاصل بين الميتوكوندريا ثم. هذه الطرق يمكن نقلها إلى العضيات الأخرى، وقد تكون مفيدة بشكل خاص لدراسة العضيات في غمد المايلين. وأخيراً، يصف لنا تقنية متاحة بسهولة لتصور المايلين أونستينيد في معيشة الشرائح بالانعكاس [كنفوكل] مجهرية (الأساسية). الأساسية يتطلب أي معدات إضافية، ويمكن أن تكون مفيدة لتحديد غمد المايلين أثناء التصوير الحي.

Introduction

المسألة الأبيض في الدماغ تتكون من محاور الخلايا العصبية عصبية ملفوفة في المايلين، غشاء البلازما موسعة متخصصة التي شكلتها oligodendrocytes. المايلين المطلوب لنشر سريعة وموثوق بها من إمكانات العمل والبقاء الطويل الأجل لمحاور عصبية myelinated، ويمكن أن يسبب خسارة في المايلين الخلل في الجهاز العصبي. على الرغم من أهميتها، خصائص oligodendrocytes أقل شهرة مقارنة مع الخلايا العصبية وأستروسيتيس. ونتيجة لذلك، استحدثت أدوات أقل لدراسة أوليجوديندروسيتيس.

ويعيش تصوير العضيات في الخلية مثل الميتوكوندريا والشبكة اندوبلاسماتيك (ER) أو هياكل حويصلية مختلفة يمكن أن يكون مفيداً لدراسة التغيرات الدينامية في العضيات مرور الوقت. تقليديا، قد أنجز تصوير أوليجوديندروسيتيس الذين يعيشون في الزراعات الأحادية1،2. ومع ذلك، oligodendrocytes في الأحادية لا تقم بعرض الاتفاق المايلين، وأورجانوتيبيك أو شرائح الدماغ الحادة، ولذلك، يكون خيار أفضل عند دراسة التعريب وحركة العضيات. يمكن أن يكون التعريب العضيات الصغيرة والبروتينات في غمد المايلين تحديا نظراً لبعد المسافة القصيرة بين إكسون myelinated وغمد المايلين المحيطة بها. وهكذا، إجراءات إيمونوستينينج المجهري الخفيفة وحدها لا تملك القرار المكانية تميز بين العضيات في غمد المايلين وتلك الموجودة في محور عصبي ميليناتيد. وهذا يمكن حلها بواسطة توصيل الفيروسية مع الجينات للبروتينات الفلورية استهدفت عضية مدفوعا بالخلية المحددة بنوع المروجين. المزايا هي تعبير خلية على حدة ومتفرق، التي تمكن من تقييم دقيق للتعريب عضية والديناميات. يمكن أيضا استخدام الحيوانات المحورة وراثيا لتحقيق مثل هذا تعبير الخاصة بالخلية المستهدفة عضية3. ومع ذلك، إنتاج وصيانة الحيوانات المحورة وراثيا مكلفة ولا تقدم عادة متفرق التعبير الذي يمكن تحقيقه بأساليب الفيروسية.

يستخدم الأسلوب الموصوفة هنا توصيل الفيروسية من أوليجوديندروسيتيس مع البروتينات الفلورية المتقدرية المستهدفة (دسريد أو أخضر نيون البروتين، التجارة والنقل) مدفوعا بالمروج البروتين الأساسية المايلين (MBP-ميتو-دسريد أو MBP-ميتو-التجارة والنقل) تصور أوليجوديندروسيتي الميتوكوندريا في شرائح المخ أورجانوتيبيك. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم تعبير آخر بروتين فلوري في السيتوبلازم (بروتينات فلورية خضراء تستخدم جنبا إلى جنب مع ميتو دسريد أو تدتوماتو المستخدمة مع ميتو-التجارة والنقل) لتمكين التصور مورفولوجيا الخلايا، بما في ذلك المقصورات هيولى من غمد المايلين. ويشمل البروتوكول الإجراء لجعل شرائح المخ أورجانوتيبيك (نسخة معدلة من البروتوكول التي وصفها دي سيموني ويو، 20064،5). ثم يصف لنا الوقت الفاصل بين إجراء التصوير دراسة حركة المتقدرية. يستخدم هذا الإجراء مجهر [كنفوكل] تستقيم مع تبادل مستمر للتصوير المتوسطة، إعداد التي تمكن سهلة التطبيق للمخدرات أو غيرها من التغييرات متوسطة أثناء التصوير. الوقت الفاصل بين التصوير يمكن إجراء على أي مجهر [كنفوكل]، مع بعض المعدات الإضافية للحفاظ على معيشة الشرائح كما هو موضح أدناه. ويتضمن البروتوكول أيضا العديد من النصائح لتحسين التصوير والحد من الضيائية.

وأخيراً، يرد وصف لطريقة سريعة وبسيطة لتصور المايلين أونستينيد طريق الانعكاس [كنفوكل] مجهرية (الأساسية). وهذا يمكن أن تكون مفيدة لتحديد غمد المايلين أثناء التصوير الحي. في السنوات الأخيرة، تم تطوير العديد من التقنيات المايلين الصورة دون أي تلطيخ المطلوبة، ولكن معظم هذه تتطلب محددة المعدات والخبرة6،،من78. الإجراء الموضح هنا يستخدم الخصائص الانعكاسية غمد المايلين، وهو نسخة مبسطة للطول موجي الإثارة واحدة من "الانعكاس [كنفوكل] طيفية" مجهرية (يتم الجمع بين نقاط، والذي عدة الليزر الأطوال الموجية لتصور المايلين) 9-الأساسية يمكن القيام به على أي مجهر [كنفوكل] يحتوي 488 نانومتر ليزر و 470-500 نانومتر ممر الموجه مرشح انبعاثات أو عامل تصفية انبعاثات الانضباطي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الإجراءات المذكورة هنا أن تقرها "هيئة بحوث الحيوان النرويجية". الموردين وإعداد النشرة المصورة للمواد الاستهلاكية وغيرها تتطلب معدات متوفرة في قائمة المواد في نهاية المستند.

1. "إعداد شرائح أورجانوتيبيك"

ملاحظة: تستخدم هذه الوصفة اثنين الماوس الجراء عند الولادة يوم 7-9 (p7-9)، مما يسفر عن 24 أورجانوتيبيك شرائح مقسمة على اثنين ستة آبار ثقافة الأطباق. ما لم ينص على خلاف ذلك، ينبغي القيام بجميع الإجراءات بغطاء معقم ويجب استخدام قفازات نيتريل أو المطاط. ينبغي أن تستخدم المكونات الصف ثقافة الخلية فقط.

  1. زجاجات اﻷوتوكﻻف، أدوات تشريح (1 مقص كبير ومقص صغير 1, 1 ملعقة مسطحة كبيرة، 1 ملعقة صغيرة مدورة وشحذ والملقط 1، انظر المواد قائمة لمزيد من التفاصيل)، الزجاج الماصات ونصائح ماصة ومناديل الأنسجة المستخدمة لإعداد شريحة.
  2. كما ينبغي أن تستخدم نصف الماصات الزجاجية مع افتتاح كبير، قطع نهاية الضيقة.
    1. نقاط مع خطاط الماس القلم (إذا توفرت) حول ماصة أسفل نقطة حيث يبدأ الزجاج تضييق. ثم ضع نهاية مدبب الماصة في قفازات النتريل أو ما شابه. قطع بعناية غيض من الانحناء ماصة بينما يدفع أنه ضد هيئة عمل.
    2. ثم
    3. بلانت نهاية المقطوعة بفرك على قطعة من الورق الرمل أو تذوب قليلاً على موقد بنسن. الماصات المكسورة تستخدم لنقل شرائح المخ قطع مع نهاية كسر تحولت إلى لمبة المطاط وفتح كبير نهاية لمس الحل/الشرائح.
      ملاحظة: هذا لا يتم بغطاء معقم ويمكن أن يتم قبل عدة أيام-
  3. إعداد أطباق الثقافة.
    ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك في اليوم قبل التقطيع أو 2 ساعة على الأقل قبل التقطيع.
    1. تترافلوروايثيلين تعقيم (PTFE) الأغشية (" حلويات "). استخدام الملقط المعقم اثنين لإزالة قصاصات ورق واحدة من القطع البلاستيكية الزرقاء المحيطة وتعقيمها قبل غمس مرتين في طبق بتري يحتوي على 96 ٪ الإيثانول (EtOH). ثم وضع حلويات شقة في طبق بتري كبيرة عقيمة لتجف.
      ملاحظة: هي قصاصات ورق ماء PTFE الأغشية مشابهة للأغشية في إدراج الثقافة. يساعد استخدام قصاصات ورق التصوير الحي لشرائح مفردة يمكن نقلها بسهولة من الإدراج للإعداد المجهر برفع قصاصات من الورق بالملقط (انظر 4.8. لمزيد من التفاصيل). وبدلاً من ذلك، يمكن مثقف شرائح المخ دون حلويات (الذي سيتم إرفاق الشرائح مباشرة إلى الغشاء لإدراج الثقافة). وفي هذه الحالة، يجب قطع إدراج غشاء مع مشرط بنقل الشريحة إلى حمام المجهر.
    2. إضافة 1 مل من الثقافة المتوسطة (الوصفة في الكواشف ' الجدول) لكل بئر من أطباق الثقافة ستة آبار.
    3. إدراج
    4. مكان ثقافة واحدة في كل بئر باستخدام الملقط العقيمة. تجنب فقاعات الهواء بين الإدراج والمتوسطة الثقافة-
      ملاحظة: لتوفير المال والبيئة، من الممكن لإعادة إدراج الثقافة. يمكن أن يتم ذلك قبل الشطف دقيق في المقطر ح 2 س (dH 2 س) تليها الحضانة في 70% EtOH لمدة 24 ساعة حتى إعادة استخدامها. عند التحضير لثقافة جديدة، الجاف لتدرج في صفيحة ثقافة خلية تحت الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضوء على 15-30 دقيقة
    5. إدراج
    6. مكان حلويات (معقمة وجافة) اثنان في كل ثقافة. ضع حلويات نحو الحواف من إدراج للحصول على الحد الأدنى من التداخل-
    7. وضع اللوحات في حاضنة الثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية مع 5% CO 2-
  4. فقاعة تشريح الباردة المتوسطة (الوصفة في الكواشف ' الجدول) مع بيوكسيدي الغاز (95% O 2/5%CO 2). لإبقاء الحل العقيمة، الاتصال الأنبوب من اسطوانة غاز إلى عامل تصفية المحاقن معقمة (حجم المسام ميكرومتر 0.22). تصفية
    1. الزوجين الطرف الآخر من المحاقن لأنبوب عقيمة متصلاً ماصة زجاجية معقمة. ضع ماصة زجاجية في الحل، وتغطي مع بارافيلم وتشغيل الغاز. تبقى متوسطة تشريح على مدت
  5. تعد المنطقة/تشريح تشريح.
    ملاحظة: من الناحية المثالية، هذا الإجراء ينبغي أن يتم بغطاء معقم. إذا لم يكن هذا ممكناً، يمكن أن تترك فيبرتوم على مقعد في عمل. وفي هذه الحالة، من المستحسن استخدام قناع الشبكة والوجه شعر.
    1. باستخدام شفرة حلاقة حافة واحدة، قطع قطعة مستطيلة الشكل (حوالي 2 × 0.5 سم) من [اغروس] هلام (الوصفة في الكواشف ' الجدول) والصق هذا على خشبة المسرح فيبرتوم أن تواجه الجانب البعيد بليد فيبرتوم.
    2. تنظيف جميع الأسطح وأجزاء فيبرتوم مع 70% EtOH ومسح مع مناديل الأنسجة يعقم.
      ملاحظة: من المهم أن جميع القطع التي سوف تكون على اتصال بأنسجة المخ جافة تماما منذ EtOH يمكن أن تلحق الضرر الخلايا-
    3. إرفاق شفرة حلاقة عقيمة فيبرتوم وإجراء فحص الاهتزاز إذا كان فيبرتوم هذه الدالة.
    4. مناديل أدوات تشريح يعقم مكان في هود جنبا إلى جنب مع أنسجة يعقم، أربعة أطباق بيتري الصغيرة، مشرط الحافة المستديرة، الماصات الزجاجية 2 مع المصابيح المطاطية، الماصات الزجاجية انفك اثنين (انظر نقطة 1.1) وسوبر الغراء (رش مع EtOH)-
    5. من أجل تشريح فقاعات المتوسطة إلى القارب فيبرتوم وفي أربعة أطباق بيتري الصغيرة-
      ملاحظة: هذه الخطوة ينبغي أن يتم إلا مباشرة قبل تشريح منذ المتوسطة من هذه النقطة لا bubbled أو أبقى على مدت
  6. ديسيكت وجبل العقول.
    ملاحظة: للحصول على شرائح صحية، هذه الخطوة يجب أن يتم بسرعة ودقة. هناك حاجة إلى بعض الممارسات.
    1. Euthanize الحيوان #1 بتفكك نيكر وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية وثم قطع رأس مع مقص كبير.
    2. الصغيرة، واستخدام مقص حاد، بسرعة إزالة الجلد بجعل شق السهمي من الرقبة للأنف وسحب جانبا للكشف عن الجمجمة.
      1. قص على طول خياطة السهمي، تليها شقوق جانبية على الجزء الداخلي من العظام أمامي وخياطة لامبويد (الحدود بين المخ والمخيخ).
      2. استخدام الملقط لثني فتح الجمجمة على كل جانب. يتم اقتطاع الأعصاب من المخ بإدراج ملعقة مدورة، حادة تحت الجانب البطني للدماغ، وتتحرك برفق الملعقة أفقياً.
    3. استخدام شفرة حلاقة حافة واحدة لجعل كرونال قطع روسترال إلى المخيخ-
      ملاحظة: هذا الخفض سوف تحدد الزاوية التي تقطع الشرائح. ، ولذلك ينبغي أن بزاوية مستقيمة.
    4. الوجه المخ خارج الجمجمة وإلى طبق بتري صغيرة تحتوي على تشريح المتوسطة-
    5. كرر الخطوات 1.6.1--1.6.4. للحيوان #2 ومكان طبق هذا الدماغ في بتري ثاني.
      ملاحظة: الحيوانات ليست عقيمة. إجراء التشريح على جانب واحد من غطاء محرك السيارة وثم الانتقال إلى الجانب الآخر، نظيفة بمجرد العقول قد أزيلت من الجمجمة.
    6. تغيير القفازات.
    7. إرفاق الدماغ لمرحلة فيبرتوم: إضافة طبقة رقيقة من الغراء سوبر إلى مرحلة فقط أمام المركبة [اغروس] هلام. عقد الجانب الدماغ #1 مع كبير مسطح ملعقة مع قطع طازجة (والذيلية) لمس الملعقة وتواجه الجانب البطني (ويجري أقرب ما يكون إلى) [اغروس] هلام.
      1. ثم ضع برفق في الدماغ على الغراء بدفعها قبالة الملعقة مع مجموعة من الملقط. تأكد من ترك مساحة كافية للدماغ #2-
        ملاحظة: من المهم أن العقول موصولة جيدا للمرحلة، ولكن دون الغراء المفرطة، كهذا يمكن أن يعرقل القطع.
    8. مباشرة بعد تركيب الدماغ #1، استخدم ملعقة كبيرة لإضافة بعض قطرات من تشريح المتوسطة أعلى الدماغ. هذا سيتم الحفاظ على الدماغ رطبة وتتصلب الغراء ومنعه من الالتصاق بالجانبين من العقول.
    9. كرر الخطوتين 1.6.7 و 1.6.8. للدماغ #2-
    10. إرفاق المرحلة على القارب فيبرتوم.
  7. قطع 230 ميكرومتر سميكة الاكليلية شرائح مع سعة 1-1.5 مم، وتواتر 85 هرتز وسرعة من 0.2 مم/س. شرائح جمع تقريبا بين 1.4 روسترال و 2.1 ملم والذيلية إلى بريجما-
    1. جمع شرائح بعد قطع كل شريحة باستخدام الماصات الزجاجية انفك (بنط 1.1). نقل الشرائح إلى طبق بتري يحتوي على تشريح المتوسطة. استخدام مشرط مدورة لقص الشرائح إلى جزئين، تقسيم نصفي.
  8. عندما يتم قطع جميع الشرائح، وضع الشرائح في أطباق الثقافة-
    1. أخذ الطبق الثقافة (في الوقت واحد) خارج الحاضنة.
    2. بعناية استخدام الماصات الزجاجية المضربين، نقل شريحة واحدة لكل من حلويات.
      ملاحظة: يجب وضع الشرائح المسطحة في منتصف قصاصات من الورق. وهذا يتطلب بعض المهارة. ومع ذلك، إذا بعض شرائح ليست مثالية، فمن الأفضل أن تترك لهم من قضاء الوقت في محاولة لنقل لهم كما أنها هامة للحصول على كافة الشرائح في حاضنة أسرع وقت ممكن.
    3. استخدام
    4. ماصة زجاجية (نهاية مدبب) لإزالة الزائدة المتوسطة بلطف دون لمس الشريحة.
      ملاحظة: شرائح ينبغي أن لا تكون مغمورة في سائل أثناء الاحتضان. وهكذا، يجب أن يستنشق المتوسطة الزائدة أن الشرائح تتعرض للهواء (طبقة رقيقة من المتوسطة سوف لا تزال تغطي الشرائح). الشرائح التي ما زالت مغمورة في سائل عادة ما تكون غير صحية أو يموت (4 وملاحظاتنا).
    5. تحريك الطبق مرة أخرى في الحاضنة بمجرد حلويات كل شريحة واحدة-
    6. كرر الخطوات 1.7.8.-1.8.4-للطبق #2-
  9. تغيير المتوسطة الثقافة.
    ملاحظة: يجب أن يتم هذا اليوم بعد تشريح (اليوم الأول في المختبر، DIV1) وبعد ذلك كل 2-3 أيام.
    1. يسخن المتوسطة الثقافة في حمام مائي أو الحاضنة.
    2. في غطاء عقيمة، استخدام شفط فراغ أو ماصة انتظام مع تلميح عقيمة لنضح المتوسطة الثقافة من كل بئر. ويتم ذلك بلطف البقشيش الطبق (بحوالي 30 درجة) ووضع طرف الماصة عند الحافة من إدراج الثقافة-
    3. إزالة ما يقرب من 800 ميليلتر من كل بئر (ترك فقط ما يكفي المتوسطة للحفاظ على الجزء السفلي من إدراج المشمولة في المتوسط). ثم، باستخدام ماصة نظيفة، إضافة 800 ميليلتر من المتوسط قبل ساخنة لكل بئر. ثم ضع الأطباق مرة أخرى في حاضنة الثقافة الخلية.

2. توصيل الفيروسية

آفس
  1. ، أو شراء مع بلازميد اهتمام، كما هو موضح سابقا 10 ، 11-
    ملاحظة: يصف هذا البروتوكول الاستخدام من النمط المصلي المسيطر إف 2/8 (إف 2/8) تحمل المتقدرية مستهدفة دسريد أو بروتينات فلورية خضراء كجينات مراسل تحت سيطرة المروج البروتين الأساسية المايلين 12 النسخي (AAV2 أو MBP_mito_dsred AAV2/8/ 8 MBP_mito_GFP) لتصور oligodendrocyte الميتوكوندريا. إف 2/8 تحمل بروتينات فلورية خضراء أو تدتوماتو كمراسل الجينات مدفوعا بالمروج المساعدة النقدية العامة (إف 2/8 CAG_GFP أو إف 2/8 CAG_tdtomato) يستخدم لتصور oligodendrocyte السيتوبلازم. وبالتالي، يعطي المزيج من MBP_mito_dsred AAV2/8 مع CAG_GFP إف 2/8 الميتوكوندريا الأحمر والأخضر السيتوبلازم في oligodendrocytes، بينما الجمع بين MBP_mito_GFP AAV2/8 و 2/8 إف CAG_tdtomato يعطي الميتوكوندريا الأخضر والأحمر السيتوبلازم. بنيات موصوفة في المزيد من التفاصيل في مكان آخر 13-
  2. في يوم 7 في المختبر (DIV7)، ترانسدوسي أوليجوديندروسيتيس آفس.
    تنبيه: يرجى اتباع قواعد السلامة للعمل مع آفس. تأكد من أن يكون التدريب السليم والموافقة على مستوى السلامة المطلوبة. ينبغي أن تنفذ جميع النقاط التالية في خزانة السلامة الأحيائية "الصف الثاني" باستخدام قفازات ومعطف المعمل. هنا، يرد تطبيق إف إلى منطقة اللحاء الشرائح، وهذا هو المجال الذي يظهر انتعاش أفضل. متوسط الثقافة
    1. ديلوت إف في مياه دافئة قبل (37 درجة مئوية). ينصح بتخفيف حوالي 2 × 10 9 الجينوم نسخ/مل (GC/mL) للحصول توصيل متفرق من أوليجوديندروسيتيس الذي يتيح لتصوير خلايا مفردة داخل الشريحة. ينبغي أن يتم بيد تجريبية باستخدام التتر مختلفة لضمان كثافة oligodendrocytes ترانسدوسيد التي مناسبة لتجارب محددة. إذا استخدمت اثنين آفس مختلفة، وينبغي مختلطة في نفس الحل وإضافتها إلى الشريحة في نفس الوقت.
    2. إضافة
    3. ميليلتر حوالي 1.3 المخفف إف لكل شريحة: تأكد من خارج طرف ماصة جافة. "الماصة؛" ميليلتر 1.3 المخفف إف وعقد الماصة فوق القشرة، أقرب وقت ممكن دون لمس الشريحة بنصيحة ماصة (حوالي 1 مم في بعيداً).
    4. ثم دفع
    5. ببطء الحل خارج الماصة. عند الحل يلامس الشريحة، تلميح ماصة حرك القشرة لنشر الحل على منطقة اللحاء كله.
      ملاحظة: هذا الإجراء ينبغي القيام بأسرع وقت ممكن لتجنب حفظ الشرائح من غطاء محرك السيارة لمدة أطول من اللازم. القيام بذلك على صحن واحد في الوقت ووضع الطبق أول مرة أخرى في الحاضنة قبل البدء في الطبق #2. للحصول على توزيع إف بصورة مرضية دون إتلاف الأنسجة يتطلب بعض الممارسة ومطرد من ناحية.
  3. إذا كان متوفراً مجهر الأسفار تستقيم في مختبر الخلية، يمكن التحقق من التعبير البروتين أثناء الوقت في الثقافة عن طريق وضع صحن تحت المجهر.
    ملاحظة: الطبق ينبغي لا أن تبقى خارج الحاضنة لأكثر من 2-5 دقائق-

3. الوقت الفاصل بين التصوير

ملاحظة: يمكن إجراء التصوير كلما تكفي مستويات التعبير من علامات مضيئة والشرائح تبدو صحية (عادة 14-DIV11).

  1. ضمان مجهر ونضح وتدفئة يتم إعدادها بشكل صحيح حيث أن حل التصوير فقاعات ساخنة ويمكن الدخول والخروج من الحمام.
    ملاحظة: توجد حلول مختلفة للدوائر حمام. ويرد هنا صيغة بسيطة.
    1. منافذ للحمام بابر المحاقن يتثلم (بنت في ~ 45°) المرفقة بالجانبين من الحمام حسب تك بلو-تك/متعة وتقديم في--
    2. التأكد من أن أنابيب يمر من زجاجة من حل التصوير فقاعات باستمرار، عن طريق مضخة تمعجية، من خلال أنبوب تدفئة سخان وحدة، ومن ثم إلى مدخل إبرة المحقن في الحمام-
    3. ربط أنبوب آخر إلى منفذ إبرة المحقن. ثم يذهب هذا الأنبوب عن طريق مضخة تمعجية والعودة إلى الزجاجة من التصوير الحل (أو باستخدام زجاجة نفايات).
  2. فقاعة التصوير الحل (الوصفة في الكواشف ' الجدول) مع الغاز بيوكسيدي.
    ملاحظة: يجب أن يكون هذا staرتيد على الأقل 15 دقيقة قبل التصوير وتستمر طوال التجربة.
  3. بدوره على مضخة تمعجية وسخان وتشغيل الحل عن طريق الحمام للحصول على درجة الحرارة المثلى حمام (37 ± 0.5 درجة مئوية). التأكد من أن جهاز استشعار الحرارة متصل بوحدة درجة الحرارة هي غارقة في حل حمام.
  4. تشغيل المجهر والأسفار مصباح أشعة الليزر المناسبة.
  5. مسار
  6. مجموعة ضوء مناسب للعينة.
    ملاحظة: هذا سوف تختلف تبعاً للإعداد مجهر والتحقيق. المعارف العامة عن كيفية استخدام المجهر [كنفوكل] مطلوب ولن يتم تناول هنا.
  7. استخدام
  8. هدفا غمر مياه مع التكبير المناسبة والفتحة العددية (السلطة الوطنية). ونحن نستخدم 40 x الماء غمر أبوتشرومات خطة هدف (n.a. 1.0)-
  9. فتح الثقب لتحقيق قسما بصري من حوالي 2-2.5 ميكرون للفيديو الوقت الفاصل بين. وهذا يقلل من حدوث الانتقال من التركيز خلال الوقت الفاصل بين الميتوكوندريا-
  10. نقل شريحة أورجانوتيبيك للحمام:
    1. إضافة قطره من التصوير الحل أو مستنبت لبلاستيك صغيرة طبق بيتري.
    2. في غطاء عقيمة، إدراج استخدام الملقط العقيمة لنقل شريحة أورجانوتيبيك واحدة من الغشاء إلى الانخفاض. ينبغي إلا اللمس الملقط قصاصات من الورق ولا الشريحة.
    3. وضع الغطاء على طبق بيتري.
    4. فورا بوضع الطبق الثقافة التي تحتوي على بقية الشرائح مرة أخرى في الحاضنة.
    5. صحن "جلب بيتري" الذي يحتوي على شريحة للمجهر.
    6. إيقاف مضخة تمعجية حين نقل الشريحة إلى حمام المجهر. أولاً، استخدام الملقط لرفع حلويات مع شريحة من طبق بيتري إلى الجزء العلوي من الحمام (سوف تطفو قصاصات من الورق). ثم ضع النصائح اثنين الملقط على كل من جانبي قصاصات من الورق بحيث أنهم على اتصال حلويات دون لمس الشريحة، ودفع حلويات من خلال الحل إلى الجزء السفلي من الحمام. مركز حلويات في وسط الحمام.
    7. استخدام الملقط مكان الربط هولددوون (القيثارة) على رأس قصاصات من الورق دون لمس الشريحة.
      ملاحظة: هو قيثارة مرساة البلاتين على شكل حدوة حصان يستخدم لمنع الشريحة من العائمة أو الانجراف في الحمام. لشرائح الحادة، تشغيل سلاسل رقيقة من جانب واحد من القيثارة إلى أخرى (تشبه قيثارة موسيقى). لشرائح أورجانوتيبيك، ينبغي أن سترينجلس القيثارة وتناسب حجم قصاصات من الورق في مثل هذه طريقة أنه يمكن أن تضع على رأس حلويات دون لمس الشريحة.
    8. إعادة تشغيل مضخة تمعجية.
  11. أدنى هدف وصولاً إلى العينة.
  12. حدد الخلية والمنطقة إلى الصورة.
    ملاحظة: تجنب التعرض المفرط للخلايا لضوء الليزر وهذا يمكن أن يسبب سمية الخلية (انظر نصائح في النقاط الواردة أدناه).
      استخدام
    1. العدسات والمصابيح الفلورية للعثور أوليجوديندروسيتي صحية يبحث مع التعبير الصحيح. عادة، تظهر أوليجوديندروسيتيس التي تحتوي overexpression قوي من البروتينات الفلورية غير صحية. أوليجوديندروسيتيس غير صحية العمليات مع مظهر تضع،، وسوف تظهر الميتوكوندريا مجزأة. في oligodendrocytes صحية، سوما والعمليات التي تظهر متجانسة والميتوكوندريا لها أطوال مختلفة (على الرغم من أن عادة أقصر بكثير من الخلايا العصبية وأستروسيتيس 13 ، 14 ، 15)-
    2. مكان خلية الفائدة في منتصف مجال الرؤية.
    3. استخدام " يعيش " تعمل في البرمجيات (لمجاهر إيكا وزايس) لتحديد الخلية على الشاشة واختيار مجال يحظى باهتمام، مثلاً، جزء من الخلية التي تحتوي على العديد من العمليات الأساسية أو اﻷغماد المايلين، أو عملية واحدة أو غمد المايلين.
      ملاحظة: ليتمكن من الصورة كجزء كبير من العمليات/مانعات قدر الإمكان، اختيار المناطق التي تحتوي على العمليات التي تقع نسبيا شقة في الاتجاه س-ص.
    4. التكبير والتصغير في ميدان المصالح (عادة إنتاج صورة ذات حجم بكسل من 0.14-0.30 ميكرون).
    5. استخدام " المناطق " أداة ورسم مستطيل حول المنطقة واختيار الخيار لمسح المنطقة المحددة فقط. المسح الضوئي الوقت، وبالتالي التعرض لليزر، يتم تقليل بمسح المنطقة المحددة فقط-
      ملاحظة: سيتم تفحص مناطق مستطيلة أفقية أسرع من المناطق العمودية بسبب عدد الأسطر الممسوحة ضوئياً بحاجة أقصر. إذا يتم تفحص منطقة مستطيل رأسي، يمكن تقليل وقت المسح بالتناوب في مجال المسح الضوئي بمقدار 90 درجة (باستخدام أداة الاستدارة).
  13. ضبط الليزر السلطة وتحقيق مكاسب للحصول على عرض جيد في الميتوكوندريا.
    ملاحظة: استخدم قوة الليزر الحد الأدنى اللازم. إذا كان ذلك ممكناً، بدوره كسب بدلاً من زيادة الليزر الطاقة. بالإضافة إلى تسبب سمية الخلية، سوف التبييض الكائنات المصورة على مر الزمن، مما يتطلب زيادة السلطة الليزر طاقة الليزر مرتفعة جداً أو اكتساب أثناء المسح الضوئي. قوة الليزر المطلوبة وكسب سيتوقف على مستوى التعبير والمجهر. مع مجهر [كنفوكل] LSM700، يمكننا استخدام ليزر نانومتر 555 في سلطة من 20-40 µW للصورة دسريد أو تدتوماتو و 488 نانومتر ليزر يستخدم في 20-30 µW الصورة في التجارة والنقل (الليزر الطاقة تقاس في الفتحة الخلفية للهدف). يتم تعيين مكاسب عالية للتصوير، ويعيش عادة في حدود 700-800 للتجارة والنقل و 850-980 دسريد وتدتوماتو. مكاسب عالية قد يسبب بعض المزيد من الضوضاء الخلفية، الذي يتم إزالته عن طريق زيادة الإزاحة الرقمي (الإزاحة القيم عادة ما تقع بين 0 و 15). في تجربتنا، استخدام MBP_mito_GFP يعطي أفضل إشارة إلى ضجيج من MBP_mito_dsred-
  14. تحديد سرعة المسح الضوئي-
    ملاحظة: تقليل وقت المسح الضوئي باستخدام سرعة المسح ضوئي ورسم منطقة مسح صغيرة (انظر النقطة 4.10.5 أدناه). من الممكن أيضا لحفظ المسح الضوئي الوقت بإجراء المسح الضوئي ثنائي الاتجاه. ومع ذلك، هذا غير مستحسن بسبب جودة الصورة الأكثر فقراً-
  15. مجموعة تواتر ومدة تسجيل الوقت الفاصل، مثل التقاط الصور كل 2 ثانية لمدة 20 دقيقة لتصوير المتقدرية في أوليجوديندروسيتيس-
    ملاحظة: يجب تعيين تواتر ومدة وفقا لتنقل كائنات الفائدة. تردد أعلى وسوف يعرض العينة ضوء الليزر أكثر، ولكن تتطلب الكائنات تتحرك بشكل أسرع كما تمتد فترة أقصر من الوقت الفاصل بين أشرطة الفيديو (مثل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية، التي تتحرك على نحو أكثر تواترا وسرعة أعلى بكثير من الميتوكوندريا في oligodendrocytes، يتم عادة تصوير كل ثانية لما مجموعة 2 دقيقة 16)-
  16. بدء تسجيل الوقت الفاصل بين-
    ملاحظة: قد الميتوكوندريا الانتقال من التركيز أو الانجراف خارج المنطقة المصورة أثناء التسجيل. للتقليل من الاهتزازات والحركة، ضبط في-ومنافذ للحمام وتقليل سرعة المضخة إذا لزم الأمر. تحدث التغييرات الصغيرة في التركيز لا يزال عادة. وهكذا، الرصد المستمر للشاشة أثناء التصوير المطلوب، مع تعديلات بسيطة للتركيز أثناء التسجيل-
  17. التقاط z-كومة من خلية كاملة لتحديد المستقبل من الخلية وتصوير عملية-
    ملاحظة: لأفضل قرار، يجب إعادة تعيين الثقب لوحدة مهواة 1 z-مكدس.
  18. اختياري: تصور المايلين أونستينيد.
    ملاحظة: في أوليجوديندروسيتيس ترانسدوسيد مع التجارة والنقل (هيولى)، اﻷغماد المايلين يمكن عادة تحديد كخطوط مستقيمة من السيتوبلازم (التلال هيولى) متصل بعملية الأولية (انظر الشكل 2 أ وب). ومع ذلك، إذا كان التعبير بروتينات فلورية خضراء ضعيفة جداً أو لا يتم استخدام علامة هيولى، أنه من الممكن تصور غمد المايلين بالانعكاس [كنفوكل] مجهرية (الأساسية) كما هو موضح هنا.
    1. إعداد مسار ضوء جديد في البرنامج مع الإثارة الليزر في 488 نانومتر والتقاط ينبعث الضوء حول الطول الموجي نفسه، مثلاً 470-500 نانومتر.
    2. ضبط الليزر السلطة وكسب حتى مرئياً المايلين (راجع المثال في < طبقة قوية = "إكسفيج "> 3 الرقم). استخدام مجهر الفوقية 510 LSM، نحن عادة استخدام قوة ليزر µW 7-12 (يتم قياسها في الفتحة الخلفية للهدف)-
  19. اختياري: إعداد شرائح إيمونوستينينج. التقاط صورة تكبير منخفضة (10 x) من الخلية
    1. إذا كان يجب تحديد الخلية المصورة بعد إيمونوستينينج، وتشير إلى موقعها في الصورة عن طريق رسم سهم أو ما شابه ذلك. للمساعدة في الكشف عن الخلية، من المستحسن أيضا رسم خريطة يدوية لشريحة كاملة، مما يشير إلى موقع الخلية.
    2. إصلاح شريحة في بارافورمالدهيد 4% (PFA) على شاكر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة-
      تنبيه: منهاج عمل بيجين ضار. استخدام ملابس واقية واستخدام فقط في غطاء التهوية.
    3. تمييع مثبت 01:10 في برنامج تلفزيوني وترك عند 4 درجة مئوية حتى تبدأ إيمونوهيستوتشيميستري كما هو موضح في مكان آخر من 17-
      ملاحظة: على الرغم من أن يمكن أن تترك شرائح في مثبت المخفف لعدة أسابيع، قد تتلاشى الأسفار. يوصي بإجراء إيمونوهيستوتشيميستري في غضون 10 أيام تثبيت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

شرائح المخ أورجانوتيبيك مثقف وترانسدوسيد كما هو موضح أعلاه تبين توزيع oligodendrocytes القشرية الإعراب عن mito_dsred والتجارة والنقل بصورة متفرقة. إيمونوستاينينج مع الأجسام المضادة ضد Olig2 و MBP أكدت أن التعبير معين إلى oligodendrocytes (الشكل 1).

لتصوير حية، اعترف بهم مورفولوجيا مميزة من عدة اﻷغماد المايلين التي تعمل على التوازي (الشكل 1 و الشكل 2 ألف) أوليجوديندروسيتيس ترانسدوسيد. عن طريق إجراء تصوير مرور الزمن على أوليجوديندروسيتيس ترانسدوسيد، فمن الممكن رصد حركة الميتوكوندريا في العمليات الأولية والأغماد المايلين (الشكل 2-د).

وفي الخلايا مع انخفاض بروتينات فلورية خضراء التعبير، يمكن تحديد غمد المايلين أثناء التصوير الحي بإضاءة العينة في 488 نانومتر والتقاط ينبعث ضوء 470-500 نانومتر (الشكل 3A). هذا الأسلوب الانعكاس [كنفوكل] مجهرية (الأساسية) وعملت أيضا في منهاج العمل الثابتة والأنسجة إيمونوستينيد، على الرغم من أن اﻷغماد المايلين تبدو باهتة (الشكل 3B-ج). قبل إيمونوستينينج مع الأجسام المضادة ضد بروتين الأساسية المايلين (MBP)، وجدنا أن ما يقرب من 100 ٪ اﻷغماد المايلين زرع الأفقي للطائرة التصوير (المشار إليها بواسطة رؤوس الأسهم، الشكل 3-ج) مرئية مع الأساسية، بينما اﻷغماد المايلين أن وضع عمودي مجال الرؤية (المشار إليها بواسطة العلامات النجمية، الشكل 3-ج) أقل أو مرئية لا تعمل على الإطلاق. على الرغم من أن يتم تصور ما يقرب من جميع إينتيرنوديس، تظهر العديد من إينتيرنوديس متقطع، مع أجزاء صغيرة من غمد لا يجري مرئية (إدراجالشكل 3A ). يمكن ملء هذه الصغيرة "الثغرات" في المايلين بالتصوير مع ثلاثة أطوال موجية تكميلية، ما يسمى نقاط9.

Figure 1
الشكل 1 : ويؤكد إيمونوهيستوتشيميستري بشكل انتقائي أعرب MBP-ميتو-دسريد في أوليجوديندروسيتيس التي إيجابية محصنة ضد Olig2 و MBP.  الصور هي من اللحاء الجديد شرائح المخ الماوس مثقف ترانسدوسيد مع (AAV2/8) MBP-ميتو-دسريد (العلامة الحمراء، الميتوكوندريا) وكاج-التجارة والنقل (الأخضر، سيتوسول). كانت الشرائح إيمونولابيليد ماركر المايلين "المايلين البروتين الأساسية" (MBP، الأزرق) و Olig2 (أوليجوديندروسيتي النسب النووية علامة خلية، أرجواني). (الرقم معدلة من المرجع13) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : الوقت الفاصل بين التصوير لتعقب حركة المتقدرية في أوليجوديندروسيتيس- (أ) إسقاط z-المكدس (قسم الضوئية 10.35 ميكرومتر) من أوليجوديندروسيتي ترانسدوسيد مع MBP_mito_dsred (الأحمر الميتوكوندريا) و CAG_GFP (الفلورية الخضراء). (ب) [كنفوكل] صورة واحدة (قسم الضوئية 1.04 ميكرومتر) من نفس الخلية. ساحة يشير إلى المنطقة التي تم تحديدها للوقت الفاصل بين التصوير (ج) وترد الخطوط المرسومة لجعل كيموجرافس (كيم) في (د). (ج) صور من تسجيل الوقت الفاصل بين الخلية في ألف وب المتخذة في نقاط زمنية مختلفة. تتحرك الميتوكوندريا هي المشار إليها (الأسهم الحمراء). (د) كيموجرافس من المسارات المشار إليها في (ب). تعتبر الميتوكوندريا ثابتة كخطوط عمودية مباشرة وتعتبر الميتوكوندريا نقل خطوط قطرية. كما يمكن أن ينظر في كيموجرافس، وفي الصور الوقت-الدورة التدريبية في (ج)، تتجه فقط من الميتوكوندريا في العملية الأساسية التي تم وضع علامة كيموجراف 1 (كيم 1). الميتوكوندريا في كيموجرافس الثلاثة الأخرى ثابتة أثناء تسجيل الوقت الفاصل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تصور المايلين أونستينيد بالانعكاس [كنفوكل] مجهرية (الأساسية)- (أ) إسقاط z-المكدس (قسم الضوئية 10.35 ميكرومتر) من اللحاء الجديد شريحة الدماغ أورجانوتيبيك حية. تعبير بروتينات فلورية خضراء في أوليجوديندروسيتي هو موضح هنا (جسم الخلية الخضراء) قاتمة جداً لتحديد العمليات الأساسية والأغماد المايلين. بدلاً من ذلك، كانت تصور اﻷغماد المايلين بالإثارة في 488 نانومتر والتقاط الضوء المنبعثة في 470-500 نانومتر (مبين في أرجواني). يمكن رؤية بعض بارانوديس الغنية بالسيتوبلازم للتجارة والنقل + أوليجوديندروسيتي على نصائح internodes المايلين (الأسهم). إدراج: تضخيم جزء من غمد المايلين يظهر أن المايلين تصور الأساسية مع ظهور "غير مكتمل" أو متقطع (انظر النص الرئيسي للحصول على التفاصيل). (ب-ج) [كنفوكل] صور من المخطط (ب) والطبقة رادياتوم من الحصين CA1 (ج) شريحة الدماغ الماوس الحادة التي قد تم إصلاحها في 4% منهاج عمل بيجين وإيمونوستينيد للبروتين الأساسية المايلين (MBP). اﻷغماد المايلين هوريسونتال (رؤوس) مرئية مع الأساسية، بينما مانعات متعامدة إلى مجال الرؤية (العلامات النجمية) في أغلب الأحيان غير مرئية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول الكواشف: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول المتعلق بجعل الثقافات أورجانوتيبيك الموصوفة هنا هو نسخة معدلة18 بروتوكول وصف سيموني دي ويو (2006)5. وقد أوجزت أهم التغييرات أدناه. يتم إضافة تريس المخزن المؤقت إلى متوسط الثقافة، مما يحسن من بقاء الشرائح عند خارج الحاضنة أثناء توصيل الفيروسية وتغيير الوسط الخلية. يتم أيضا تغيير إجراءات التعقيم قصاصات من الورق. بينما البروتوكولات الأخرى تعقيم حلويات بالتعقيم، نحن لا ننصح بذلك لأنه سوف يسبب العديد من قصاصات ورق تجعيد. تجنب استخدام قصاصات ورق الكروشيه شرائح نمت هذه تميل إلى أن تكون أقل صحية. لدينا بروتوكول يستخدم الفئران والجرذان لا، وهو تعديل للثقافة قشرة بدلاً من قرن آمون، الذي نجد يعمل جيدا مع شرائح أرق (230 ميكرومتر مقابل 300 ميكرومتر). كما مييلينيشن قمم حول الولادة يوم 10-20 في الفئران والجرذان19، الثقافات مصنوعة من الفئران في p7-9 (ومثقف ثم لأيام 11-14) الأمثل لدراسة أوليجوديندروسيتيس ميليناتينج. 11-14 يوما في المختبر، يحتوي على الثقافات عدة oligodendrocytes ناضجة مع ضغط المايلين مانعات13. سوف تحتوي على أقل نضجاً oligodendrocytes في نهاية فترة الثقافة الثقافات من الفئران الأصغر سنا، بينما الثقافات مصنوعة من الفئران الأكبر سنا قد أظهرت أكثر تحديا للحفاظ على صحة جيدة20.

ويشمل الإجراء لجعل الشرائح أورجانوتيبيك عدة خطوات حاسمة. تشريح وتركيب للعقول، فضلا عن وضع شرائح على قصاصات من الورق، ويجب أن يتم بسرعة، وتتطلب بعض المهارات. بشكل عام، المحاولات الأولى في صنع أورجانوتيبيك شريحة الثقافات أقل نجاحا، ولكن 2-3 جولات من الممارسة ينبغي أن تكون كافية لاكتساب المهارات اللازمة لصنع ثقافات صحية. من المهم الحفاظ على بيئة معقمة طوال فترة الإجراءات لتفادي تلوث الثقافات. وعلاوة على ذلك، عند العمل مع الخلايا الحية، من الضروري دائماً التأكد من الرقم الهيدروجيني الصحيح و osmolality الحلول للحفاظ على صحة الخلايا. أنها، لذلك، نصيحة جيدة للتحقق من أوسمولاليتي (يجب أن يكون موسم 270-310/كغ) ودرجة الحموضة من جميع الحلول التي يتم استخدامها على الشرائح، خاصة عند القيام بهذه التجربة للمرة الأولى. حلول الثقافة وتشريح للثقافات أورجانوتيبيك تحتوي على مؤشر الرقم الهيدروجيني (الفينول الأحمر)، ولكن المصل الأصفر في الأجلين المتوسط والثقافة يمكن أن تعطي انطباعا بأقل من درجة الحموضة الفعلية. المتوسط الثقافة يحتوي على البنسلين والستربتوميسين والنيستاتين لتقليل احتمالات الإصابة. ولذلك ينصح باستخدام هذه المضادات الحيوية وأنتيميكوتيكس عند إعداد شريحة أورجانوتيبيك الثقافة التقنية في المختبر، ولكن أنها يمكن تجنبها في وقت لاحق عندما يتم تطبيق الأسلوب العقيم الخبراء. يستخدم البروتوكول الحالي مورفولوجيا الخلايا لتقييم إمكانية بقاء الخلية. لإجراء فحص أكثر من كمية، شرائح يمكن تحميل مع يوديد propidium أو صبغات مشابهة كما هو موضح في مكان آخر21. ومع ذلك، من المهم أن تكون على علم أن طيف انبعاث يوديد propidium التداخل مع دسريد، تدتوماتو وغيرها من المؤشرات الحمراء. قيد آخر يوديد propidium والكواشف مماثل أن هم لا يدخل سهولة طبقات أعمق من الشريحة، مما يحد من تقييم سلامة الخلية إلى الطبقة العليا من الخلايا5.

توجد مجموعة متنوعة من الأساليب لتوصيل الجينات. المزايا الرئيسية لاستخدام تنبيغ إف أورجانوتيبيك شريحة الثقافات لتصور العضيات كما يلي: توصيل إف بمعدل نجاح أفضل ل oligodendrocytes بوستميتوتيك مقارنة ب أساليب غير الفيروسية تعداء22. علاوة على ذلك، موجودة في الثقافات أورجانوتيبيك جميع أنواع الخلايا في الدماغ، وأوليجوديندروسيتيس مورفولوجيا مشابهة لتلك المشاهدة في فيفو، بما في ذلك الاتفاق المايلين13. وهذا يختلف عن أوليجوديندروسيتيس في الأحادية، التي تفتقر إلى التواصل مع محاور عصبية، وهكذا لا تجعل الاتفاق المايلين. التصوير في المختبر هو أسهل بالمقارنة مع فيفو وتوفر دقة مكانية أفضل، الذي يحظى باهتمام خاص عند التصوير العضيات الصغيرة مثل الميتوكوندريا. البحث المستقبلي سيهدف إلى الصورة في فيفو، لكنها تواجه تحديا كبيرا مع الانحرافات الضوئية الناجمة عن غمد المايلين الغنية بالدهون. وعلاوة على ذلك، قد تختلف إف النمط المصلي المسيطر انتحاء ومروج خصوصية بين في الجسم الحي وفي المختبر الشروط13،23. في البروتوكول المعروضة هنا، يستخدم MBP_mito_dsred AAV2/8 و MBP_mito_GFP AAV2/8 لتصور oligodendrocyte الميتوكوندريا. كما تم اختبار مع MBP_mito_dsred النمط المصلي المسيطر إف 2/1 لكن المصابين عددا أقل من أوليجوديندروسيتيس في شرائح أورجانوتيبيك (غير معروضة). واستخدمت لتصور السيتوبلازم أوليجوديندروسيتي CAG_GFP AAV2/8 و CAG_tdtomato AAV2/8. على الرغم من استخدام المروج المساعدة النقدية العامة لهذا، CAG_GFP إف 2/8 و CAG_tdtomato المصابة بشكل انتقائي oligodendrocytes، مع سوى عدد قليل من أستروسيتيس والعدوى من الخلايا العصبية (هذه يمكن أن تكون بسهولة التي حددتها على مورفولوجيا المميزة). ويرجع يفترض انتحاء النمط المصلي المسيطر 2/8 إف24هذه الانتقائية ل oligodendrocytes. بيد للتعبير استهدفت عضية، حققت أعلى الخلية-الخصوصية مع MBP-أو من المستحسن المروجين oligodendrocyte محددة أخرى. وكانت اللقاح الأخرى اختبار مع CAG_GFP لنا إف 2/1، 2/2، 2/5، 2/7، 2/9، أكثر منها المصابة أساسا من الخلايا العصبية و astrocytes (غير معروضة).

اعتماداً على بنية وظروف تجريبية، ستكون هناك حاجة إلى تعديل لتوصيل الخلية. إذا كانت الخلايا ترانسدوسيد تبدو قاتمة جداً، حاول أطول وقت في المختبر بعد توصيل لزيادة التعبير. إذا كانت الخلايا تظهر مشرقة ولكن غير صحية، تقليل الوقت بعد توصيل. إذا كان يتم ترانسدوسيد الخلايا قليلة جداً، ويمكن زيادة تركيز إف. ومع ذلك، من الممكن أيضا أن الوقت في المختبر بعد توصيل طويل جداً وأن الخلايا ترانسدوسيد قد لقوا حتفهم. لثوابت المستخدمة هنا، كانت مستويات التعبير الأمثل 4-6 أيام بعد توصيل. في 7-8 أيام بعد توصيل، ظهرت خلايا صحية أقل، مع العمليات تضع،، وعشرة أيام بعد توصيل، سوى عدد قليل من الخلايا ترانسدوسيد كانت مرئية (غير معروضة).

يستخدم هذا البروتوكول مجهر تستقيم لتصوير مباشر من شرائح أورجانوتيبيك. وهذا يختلف عن معظم مونو-والثقافات المشتركة التي تستخدم عادة مجهر مقلوب. ودون المستوى الأمثل لاستخدام مجهر مقلوب هنا لأنه يجب تشغيل الشرائح ثم مع حلويات تواجه صعودا، الذي يفترض أن يسبب الشرائح لتكون أقل صحية. ميزة واحدة من المجهر تستقيم هو إمكانية إضافة الكهربية للإعداد. وعلاوة على ذلك، استخدام مضخة لتغيير المتوسطة يعني أن الحلول المخدرات يمكن بسهولة إضافة وإزالة خلال الوقت الفاصل بين التصوير. عيب مع المضخة مشاكل الحفاظ على التركيز بسبب الاهتزازات والتيارات في الحمام. تحت المجهر، سوف تصبح الخلايا تدريجيا أقلصحية. ولذلك نضع شرائح تحت المجهر لمدة أقصاها ساعة واحدة. الشرائح المصورة التي ألقيت بعيداً (النفايات الخاصة). ولضمان ظروف التصوير الأمثل، يجب تشغيل تصوير الخلايا التحكم، الذي يتصف الفعل جيدا حركة المتقدرية، جنبا إلى جنب. ليمكن تصويرها مثلاً، حركة المتقدرية في محاور عصبية أو dendrites التي ترانسدوسينج شرائح مع إف Syn_mito_dsred 2/1 (الذي دسريد في التعبير محكوم بالمروج سينابسين الخاصة بالخلايا العصبية) أو إف CAG_mito_dsred 2/1 (متبوعاً إيمونوستاينينج إلى تأكيد هوية الخلية). يمكن أن يتم تحليل حركة المتقدرية باستخدام أداة كيموجراف متعددة في إيماجيج كما هو موضح في مكان آخر من25.

هنا يصف لنا الأساسية لتصور المايلين أونستينيد أثناء التصوير الحي. مقارنة مع نقاط9، الذي يستخدم ثلاثة أطوال موجية الإثارة، الأساسية يستخدم فقط واحدة (488 nm) وبالتالي فهي أبسط لتنفيذ. في النتيجة، تكشف موجات ثلاث مختلفة "القطع" من غمد المايلين ومعا تعطي صورة كاملة عن غمده. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام نقاط للكشف عن هياكل غمد المايلين مثل جيوب هيولى. مع الطول الموجي واحدة تستخدم في الأساسية، يتم إعطاء وجهة نظر أقل تفصيلاً ومانعات قد تظهر حبيبات أو متقطع (الشكل 3). ومع ذلك، يتصور الأساسية قرب 100% اﻷغماد المايلين التي الأفقية لمجال الرؤية. وهكذا، الأساسية مفيد للكشف عن اﻷغماد المايلين، ولكن ليس لتحليل الهياكل المايلين أو سلامتها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ونحن نشكر ليندا هايدغارد بيرجيرسين ومنير Bjørås للوصول الخلية المختبرات والمعدات و "الموارد المشتركة البيولوجيا الجزيئية جانيليا" الموظفين بلازميد وإنتاج الفيروس وستحدده كوين للمساعدة مع قياسات الطاقة الليزر. تم تمويل هذا العمل من قبل "جمعية الصحة النرويجية"، مجلس البحوث النرويجي ومعدات الفحص المجهري وقد مولت نوربرين.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose  Sigma  A9539
BD Microlance 19G BD 301500 Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas AGA 105701
Brand pipette bulbs Sigma-Aldrich Z615927 Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner) VWR 89038-530
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments 64-0106  Temperature controller - thermometer part
CaCl2 Fluka 21100
CO2  AGA 100309 CO2 for incubator
Cover glass, square Corning Thermo  Fischer Scientific 13206778 To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Delicate forceps Finescience 11063-07 For dissection
Diamond scriber pen Ted Pella Inc. 54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm VWR 612-1702 Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade Electron Microscopy Sciences #7200 Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco-Invitrogen 24010-043
Filter paper circles Schleicher & Schuell 300,220 Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack Loctite 1270884 Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2 Katrin 344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber, Warner Instruments  64-1418 Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3 Sigma H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2 Heto-Holten 96004000M Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated Gibco-Invitrogen 26050-088
KCl Sigma P9541
LCR Membrane, PTFE,  Millipore FHLC0130 Confetti 
Leica VT1200 Leica 14048142065 Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES Thermo  Fischer Scientific 42360024
MgCl2 R.P. Normapur 25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B Electron Microscopy Sciences 62411-B Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit Millipore SLGPM33RA Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm Millipore PICM03050 Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module GILSON F155001 Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaHCO3 Fluka 71628
Nunclon Delta Surface Thermo  Fischer Scientific 140675 Culture plate
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC  Zeiss 441452-9900-000  Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm VWR 291-1211
Paraformaldehyde, granular Electron Microscopy Sciences #19208
PC-R perfusion chamber SiSkiYou  15280000E Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15070-063
Petri dish 140 mm  Heger 1075 Large Petri dish 
Petri dish 92x16 mm  Sarstedt  82.1473 Medium Petri dish 
Petridish 55x14,2 mm VWR 391-0868 Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417 PBS tablets
R2 Two Channel Head  GILSON F117800 Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Large spatula for dissection
Sand paper VWR MMMA63119 Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm Finescience 14130-17 Large scissors for dissection
Scissors, 8,5  Finescience 14084-08 Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade Electron Microscopy Sciences #71972 Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm Millipore SCGPT05RE Filter to sterilize solutions
Super glue precision Loctite 1577386
Surgical scalpel blade no. 22 Swann Morton Ltd. 209 Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B Warner Instruments 64-0100 Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base Sigma  T1503
Trizma HCl Sigma T3253
Water jacketed incubator series II Forma Scientific 78653-2882 Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11, (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics