ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Oligodendrocytes להפוך Myelinating לקדם הפצת פוטנציאל הפעולה מהירה והישרדות עצביים. המתוארים כאן הוא פרוטוקול ספציפי אוליגודנדרוציטים ביטוי של חלבונים פלורסנט ב organotypic פרוסות המוח עם הדמיה בצילום מואץ עוקבות. עוד, מוצג הליך פשוט להמחשת המיאלין וללא רבב.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kennedy, L. H., Rinholm, J. E. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56237, doi:10.3791/56237 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

נוירונים להסתמך על בידוד חשמלי ותמיכה עם מחלות של oligodendrocytes להפוך myelinating. למרות החשיבות של oligodendrocytes להפוך, הכלים המתקדמים בשימוש כיום ללמוד הנוירונים, רק בחלקו ננקטו חוקרי אוליגודנדרוציטים. תא ייחודיים לסוג מכתים על ידי נגיפי התמרה חושית היא גישה שימושית בחקר דינמיקה אברון בשידור חי. מאמר זה מתאר פרוטוקול להמחשת אוליגודנדרוציטים המיטוכונדריה פרוסות המוח organotypic על ידי התמרה חושית בווירוס adeno-הקשורים (AAV) נושאת גנים מיטוכונדריאלי חלבונים פלורסנט יישוב תחת שליטה תעתיק של האמרגן בסיסי חלבון המיאלין. היא כוללת את הפרוטוקול לעשיית organotypic פרוסות המוח העכבר הילתית. בעקבות הליך של הדמיה בצילום מואץ של המיטוכונדריה לאחר מכן. שיטות אלה ניתן להעביר organelles אחרים, עשוי להיות שימושי במיוחד עבור לימוד organelles נדן מיאלין. לבסוף, אנו מתארים טכניקה זמינים עבור ויזואליזציה של מיאלין מוכתם בפרוסות חי על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי השתקפות (CoRe). הליבה דורש אין ציוד נוסף, יכול להיות שימושי לזהות את המיאלין במהלך דימות בשידור חי.

Introduction

חומר לבן של המוח מורכב אקסונים תא העצב עטוף המיאלין, קרום פלזמה מיוחדים המורחבת הנוצרת על-ידי oligodendrocytes להפוך. המיאלין הדרושים לשם הפצת פוטנציאל הפעולה מהירה ואמינה ההישרדות לטווח ארוך של ו דנדריטים, איבוד המיאלין יכול לגרום לבעיות נוירולוגיות. למרות חשיבותם, מאפייני oligodendrocytes להפוך פחות ידוע מושווים עם נוירונים, האסטרוציטים. כתוצאה מכך, פותחו כלים פחות לימוד oligodendrocytes להפוך.

חיים הדמיה של האברונים כגון המיטוכונדריה, רשת endoplasmatic (ER) או מבנים vesicular שונים יכול להיות שימושי ללמוד דינאמי לשינויים organelles לאורך זמן. באופן מסורתי, בוצעה הדמיה של החיים oligodendrocytes להפוך monocultures1,2. עם זאת, oligodendrocytes להפוך ב מונוקולטורה אינם מציגים המיאלין קומפקטי ולאחר organotypic או פרוסות המוח חריפה, לכן, ייתכן אפשרות טובה יותר לומדים לוקליזציה ותנועה של organelles. לוקליזציה של organelles קטן, חלבונים נדן המיאלין יכול להיות מאתגר עקב המרחק הקצר בין סיבי העצב הפעולה באקסון למעטפת מיאלין שמסביב. לפיכך, הנהלים immunostaining מיקרוסקופיים אור לבד אין את הרזולוציה המרחבית להפלות בין organelles נדן המיאלין לבין אלה האקסון סיבי העצב. ניתן לפתור זאת על ידי נגיפי התמרה חושית עם גנים, ממוקדות אברון חלבונים פלורסנט מונע על ידי היזמים ייחודיים לסוג התא. היתרונות הם ביטוי ספציפי תא, דליל, אשר מאפשרת הערכה מדויקת של אברון לוקליזציה ואת הדינמיקה. חיות הטרנסגניים יכול לשמש גם כדי להשיג כזה של אברון, ממוקדות ביטוי ספציפי תא3. עם זאת, הייצור ואת התחזוקה של חיות הטרנסגניים יקר, בדרך כלל אינו מציע הביטוי דליל יכולה להיות מושגת על ידי שיטות ויראלי.

השיטה המתוארת כאן משתמש ויראלי התמרה חושית של oligodendrocytes להפוך עם מיטוכונדריאלי במיקוד חלבונים פלורסנט (dsred או ירוק חלבון פלואורסצנטי, GFP) מונע על ידי האמרגן חלבון בסיסי מיאלין (MBP-mito-dsred או MBP-mito-GFP) לדמיין המיטוכונדריה אוליגודנדרוציטים פרוסות המוח organotypic. בנוסף, ביטוי אחר החלבון הניאון בציטופלסמה (GFP בהם יחד עם mito-dsred או tdtomato עם mito-GFP) משמש כדי לאפשר ויזואליזציה של מורפולוגיה תאים, כולל את תאי cytoplasmic למעטפת מיאלין. הפרוטוקול כולל את ההליך להכנת פרוסות המוח organotypic (גירסה שונה של הפרוטוקול המתואר על ידי דה Simoni, יו, 20064,5). לאחר מכן נתאר את ההליך הדמיה בצילום מואץ ללמוד תנועה מיטוכונדריאלי. הליך זה משתמש מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף עם החלפת רציפה של המדיום הדמיה, מלכודת המאפשרת יישום קל של סמים או שינויים אחרים בינוני במהלך דימות. ההליך הדמיה בצילום מואץ יכול להתבצע על כל מיקרוסקופ קונפוקלי, עם ציוד נוסף לשמירה על החיים פרוסות כמפורט להלן. הפרוטוקול מכיל גם כמה טיפים כדי למטב את ההדמיה ולהפחית את phototoxicity.

לבסוף, מתוארת דרך מהירה ופשוטה כדי להמחיש המיאלין מוכתם על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי השתקפות (CoRe). זה יכול להיות שימושי לזהות את המיאלין במהלך דימות בשידור חי. בשנים האחרונות, מספר טכניקות פותחו המיאלין התמונה ללא כל מכתים נדרש, אך רוב אלה דורשים ספציפי ציוד ומומחיות6,7,8. ההליך המתואר כאן משתמשת במאפיינים רעיוני של למעטפת מיאלין, היא גרסה מפושטת אורך גל יחיד-עירור של השתקפות קונאפוקלית ספקטרלי מיקרוסקופ (ציון, שבו מספר לייזר אורכי גל משולבים להמחיש מיאלין) 9. הליבה יכול להיעשות על כל מיקרוסקופ קונפוקלי 488 ננומטר לייזר ו- 470-500 ננומטר bandpass פליטה מסנן או מסנן פליטה tunable.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליכים המתוארים כאן אושרו על-ידי הרשות מחקר נורבגי בעל חיים. הספקים ומספרים קטלוג עבור מתכלים ופריטים אחרים נדרש ציוד זמינים ברשימת החומרים בסוף המסמך.

1. הכנה של פרוסות Organotypic

הערה: המתכון הזה משתמש שני הגורים העכבר ביום כמחנכת 7-9 (p7-9), אשר תשואות 24 פרוסות organotypic מחולק על שתי מנות תרבות שש-. טוב. אלא אם צוין אחרת, כל הפרוצדורות צריך להיעשות בשכונה סטרילי, nitril או ב- latex הכפפות אמור לשמש. יש להשתמש רק תא תרבות מרכיבים כיתה.

  1. אוטוקלב בקבוקים, כלי חיתוך (מספריים גדולים 1, מספריים קטנים 1, 1 מרית שטוחה גדולה, 1 קטן מרית מעוגל, מחודדים, מלקחיים 1, ראה חומרים רשימת לפרטים), זכוכית פיפטות, טיפים פיפטה והמטליות רקמות המשמש להכנת פרוסה.
  2. כל מחצית פיפטות זכוכית יש להשתמש עם הפתח גדול, מתנתקים הקצה הצר.
    1. את התוצאה עם גם יהלום העט (אם זמין) סביב פיפטה מתחת לנקודה שבה הכוס מתחילה הצטמצמות. ואז למקם הקצה המחודד של פיפטה הכפפות nitrile או דומה. בזהירות שובר לך את הטיפ על ידי כיפוף פיפטה תוך דחיפת זה נגד ספסל עבודה.
    2. לאחר מכן להקהות את הקצה השבור על ידי שפשוף על פיסת נייר או להמיס מעט מבער בונזן. פיפטות שבור משמשים להעברת המוח לחתוך פרוסות עם הקצה השבור הפך את הנורה גומי ו סוף נגיעה את הפתרון/הפרוסות הפתוח הגדול.
      הערה: זה לא עושים את כיסוי סטרילי זה והוא יכול להיעשות מספר ימים מראש.
  3. להכין מאכלים תרבות.
    הערה: ניתן לבצע זאת היום לפני לחתוך או לפחות שעתיים לפני חיתוך.
    1. ממברנות טפלון לחטא (PTFE) (" קונפטי "). להשתמש מלקחיים סטרילי שני כדי להסיר קונפטי אחד מן החלקים הפלסטיק הכחול שמסביב ולחטא בטבילת פעמיים לתוך צלחת פטרי המכיל אתנול 96% (EtOH). ואז הניח קונפטי במול בצלוחית מעוקרים גדולים לייבוש.
      הערה: הקונפטי הם ממברנות PTFE הידרופילית דומה ממברנות הכיסויים תרבות. השימוש של קונפטי מסייע הדמיה חיה כי פרוסות יחיד ניתן בקלות להעביר מהמכסה הגדרת למיקרוסקופ ע י הרמת הקונפטי עם מלקחיים (ראה 4.8. לפרטים). לחלופין, פרוסות המוח יכול להיות תרבותי מבלי הקונפטי (בה הפרוסות יצרף ישירות למוח של תרבות הקדמי). במקרה זה, עליך לבתר את תותב קרום עם איזמל להעביר את הפרוסה לאמבטיה מיקרוסקופ.
    2. להוסיף 1 מ"ל של תרבות בינוני (מתכון של ריאגנטים ' טבלה) כל אחד טוב של המנות תרבות שש-. טוב.
    3. תרבות המקום להוסיף מכל קידוח באמצעות מלקחיים סטרילי. להימנע בועות אוויר בין הוספה של המדיום תרבות.
      הערה: כדי לחסוך את הכסף ואת הסביבה, זה אפשרי לעשות שימוש חוזר את הכיסויים תרבות. זה יכול להיעשות על ידי שטיפה יסודית מזוקקים H 2 O (dH 2 O) ואחריו הדגירה ב 70% EtOH למשך תקופה מינימלית של 24 שעות עד חוזר. בעת הכנת תרבות חדשה, לייבש את הכיסויים בצלחת תרבות תא תחת אולטרה סגול (UV) אור עבור 15-30 דק...
    4. במקום שני קונפטי (מעוקר ויבש) על כל אחד מוסיף התרבות. למקם את הקונפטי לעבר הקצוות של התוספות כדי לקבל חפיפה מינימלית.
    5. ! תחזירו את הצלחות בחממה התרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO 2.
  4. בועה לנתיחה קר בינוני (מתכון של ריאגנטים ' טבלה) בגז bioxide (95% O 2 /5%CO 2). כדי להשאיר את הפתרון סטרילי, להתחבר הצינור של בלון גז מסנן סטרילי מזרק (0.22 µm גודל הנקבוביות). מסנן
    1. כמה הקצה השני של המזרק לרכבת התחתית סטרילי מחובר פיפטה זכוכית סטריליים. מקם את פיפטה מזכוכית בפתרון, לכסות עם מצלמות-מיקרוסקופים והפעל את הגז. לשמור על המדיום לנתיחה על קרח
  5. מארגן את חותך/לנתיחה.
    הערה: באופן אידיאלי, הליך זה צריך להיעשות בשכונה סטרילי. אם הדבר אינו אפשרי, ניתן להשאיר את vibratome על ספסל עבודה. במקרה זה, מומלץ להשתמש מסיכת שיער net והפנים.
    1. באמצעות תער קצוות יחיד, לחתוך חתיכה מלבנית (כ 2 ס"מ x 0.5 ס מ) של agarose ג'ל (מתכון של ריאגנטים ' טבלה) ונדבקים זה לבמה vibratome כך הצד הארוך פונה הלהב vibratome.
    2. נקי כל המשטחים החלקים vibratome עם 70% EtOH ולנגב עם מגבונים רקמות בלוק.
      הערה: חשוב כי כל החלקים יהיה במגע עם רקמת המוח יבשים לחלוטין מאז EtOH עלולה לגרום נזק לתאים.
    3. סכין גילוח סטרילי לצרף vibratome ולבצע בדיקת רטט אם vibratome יש פונקציה זו.
    4. המקום כלי חיתוך בלוק בשכונה יחד עם רקמות בלוק מגבונים, ארבע צלחות פטרי קטן, אזמל קצה עגול, 2 פיפטות זכוכית עם גומי נורות, פיפטות זכוכית open-end שני (ראה pt. 1.1), סופר דבק (ריסס עם EtOH).
    5. יוצקים בינוני לנתיחה מבעבע בתוך הסירה vibratome, פטרי קטן של ארבעה.
      הערה: שלב זה צריך להיעשות רק מיד לפני ניתוח מאז בינוני מנקודה זו ואילך אינו מבעבע או שמר על קרח
  6. Dissect ו הר המוח.
    הערה: כדי לקבל פרוסות בריא, שלב זה חייב להתבצע במהירות ובדייקנות. קצת תרגול נחוץ.
    1. המתת חסד חיה #1 על ידי שיבוש neckor בהתאם להנחיות מקומיות, ואז לערוף עם גדול המספריים.
    2. שימוש קטן, מספריים, מסירים את העור על ידי ביצוע חתך הסאגיטלי מן הצוואר האף ובמהירות למשוך הצידה כדי לחשוף את הגולגולת.
      1. חתך לאורך התפר המשונן ואחריו חתכים לרוחב על החלק הפנימי של עצמות המצח, את התפר lamboid (הגבול בין המוח הגדול, המוח הקטן).
      2. להשתמש מלקחיים לכופף פתיחת הגולגולת בכל צד. עצבי מנותקים מן המוח על-ידי הוספת מרית מעוגל, חדה תחת בצד הגחוני של המוח בעדינות העברה רוחבית המרית.
    3. להשתמש תער קצוות יחיד כדי להפוך הפרונטליים לחתוך rostral במוח הקטן.
      הערה: החתך הזה יקבע את הזווית שבה נחתכים לפרוסות. יש, לכן, להפוך את זווית ישרה-
    4. להעיף המוח מתוך הגולגולת, לתוך צלחת פטרי קטן המכיל לנתיחה בינונית.
    5. חזור על צעדים 1.6.1.-1.6.4. חיה #2, המקום לחלק את המוח הזה ב פטרי השני.
      הערה: בעלי החיים אינם סטריליים. לבצע את הקרע בצד אחד של מכסה המנוע ולאחר מכן להעביר לצד השני, נקי, ברגע השכל הוסרו ממנו הגולגולת.
    6. לשנות כפפות.
    7. המוח צרף לשלב vibratome: להוסיף שכבה דקה של דבק סופר על הבמה מול הג'ל agarose הנטען. . תחזיק את המוח #1 עם גדול שטוח מרית עם טרי חתוך (סימטרית) נוגע המרית ו את מול הצד הבטני (ולהיות הכי קרוב ככל האפשר כדי) הג'ל agarose.
      1. אז הנח בעדינות את המוח על גבי הדבק על-ידי דחיפתו את המרית ערכת מלקחיים. ודא שהשארת מספיק מקום עבור המוח #2-
        הערה: זה חשוב כי המוח מחוברים היטב על הבמה, אך ללא דבק מוגזמת, כמו זה יכול לחסום החיתוך.
    8. מיד לאחר הרכבה של המוח #1, השתמש המרית גדול כדי להוסיף כמה טיפות של דיסקציה בינוני על המוח. זה להחזיק את המוח לח, להקשיח את הדבק, למנוע ממנה נדבקות צידי המוח.
    9. חזור על שלבים 1.6.7 ו 1.6.8. למוח #2-
    10. לצרף את הבמה על גבי הספינה vibratome.
  7. גזור 230 מיקרומטר עבה הילתית פרוסות עם משרעת 1-1.5 מ מ, תדירות של 85 הרץ והמהירות של 0.2 מ מ/s. פרוסות לאסוף כ בין 1.4 מ מ rostral מ מ 2.1 סימטרית כדי Bregma.
    1. פרוסות לאסוף לאחר כל פרוסה נחתך באמצעות זכוכית open-end מכשור ניסוי ברטט (pt. 1.1). העברה פרוסות צלחת פטרי המכילות בינוני לנתיחה. השימוש אזמל מעוגל לחתוך לפרוסות לשני חלקים, חלוקת את שתי ההמיספרות.
  8. כאשר כל הפרוסות נחתכים, מניחים פרוסות לתוך הכלים תרבות.
    1. לקחת את המנה תרבות (אחד בכל הפעם) מתוך החממה.
    2. באמצעות פיפטות זכוכית open-end את, להעביר בזהירות פרוסה אחת לכל אחד הקונפטי.
      הערה: הפרוסות כדאי להשתטח באמצע הקונפטי. פעולה זו דורשת מיומנות מסוימת. עם זאת, אם כמה פרוסות אינם מושלמים, עדיף להשאיר אותם מאשר לבלות זמן. בניסיון להעביר אותם כפי זה חשוב לקבל את כל הפרוסות לתוך החממה מהר ככל האפשר.
    3. להשתמש פיפטה מזכוכית (החוד) כדי להסיר בעדינות עודף בינונית מבלי לגעת הפרוסה.
      הערה: פרוסות צריך לא להיות שקוע בנוזל בתקופת הדגירה. לכן, עליך להיות aspirated בינוני עודף כך הפרוסות חשופים לאוויר (בשכבה דקיקה של מדיום עדיין יכסה את הפרוסות). פרוסות שנותרו שקוע בנוזל בדרך כלל להיות לא בריא או למות (4 ו התצפיות).
    4. להעביר את המנה חזרה בחממה, ברגע כל הקונפטי פרוסה אחת.
    5. חזור על שלבים 1.7.8.-1.8.4. עבור המנה #2-
  9. לשנות את המדיום תרבות.
    הערה: זה צריך להיעשות יום לאחר בציעת (יום 1 במבחנה, DIV1) ולאחר מכן כל 2-3 ימים.
    1. מחממים תרבות בינוני באמבט מים או החממה.
    2. בשכונה סטרילי, להשתמש שאיבה ואקום או פיפטה רגיל עם טיפ סטרילי מחוק לגמרי תרבות בינוני מכל קידוח. זאת על-ידי בעדינות המפנה את המנה (על-ידי כ- 30 מעלות), הצבת את הטיפ פיפטה בקצה תותב תרבות.
    3. להסיר כ 800 µL מכל קידוח (להשאיר רק מספיק בינוני לשמור בתחתית תותב מכוסה בינוני). לאחר מכן, באמצעות פיפטה נקי, להוסיף 800 µL של המדיום מחומם מראש מכל קידוח. ואז למקם את הכלים בחזרה בחממה התרבות התא.

2. התמרה חושית נגיפי

AAVs
  1. רכישה או לעשות עם פלסמיד עניין, כפי שתואר לעיל 10 , 11-
    הערה: פרוטוקול זה מתאר את השימוש של AAV serotype 2/8 (AAV 2/8) נושאת מיטוכונדריאלי ממוקד dsred או ה-GFP כמו גן כתב תחת שליטה תעתיק של יזם חלבון בסיסי 12 מיאלין (AAV2/8 MBP_mito_dsred או AAV2 / MBP_mito_GFP 8) לדמיין אוליגודנדרוציטים המיטוכונדריה. AAV 2/8 לשאת GFP או tdtomato מדווח מונע על ידי האמרגן חטיבתי כללי (AAV 2/8 CAG_GFP או AAV 2/8 CAG_tdtomato) משמש כדי להמחיש אוליגודנדרוציטים הציטופלסמה. לפיכך, השילוב של MBP_mito_dsred AAV2/8 עם AAV 2/8 CAG_GFP נותן המיטוכונדריה אדום הציטופלסמה ירוק ב oligodendrocytes, ואילו שילוב AAV2/8 MBP_mito_GFP AAV 2/8 CAG_tdtomato נותן המיטוכונדריה ירוק ו אדום הציטופלסמה. המבנים מתוארים יותר פירוט במקום 13.
  2. ביום 7 במבחנה (DIV7), מגלי oligodendrocytes להפוך עם AAVs.
    שים לב: בצע את תקנות הבטיחות לעבודה עם AAVs. ודא שיש האימונים הנכונים ואישור רמת אבטחה הנדרש. כל הנקודות הבאות צריכה להתבצע ב- cabinet אבטחה Class II שימוש בכפפות עור חלוק המעבדה. כאן, יישום של AAV אל אזור בקליפת המוח הפרוסות מתואר, כי זה אזור המציג את ההתאוששות הטובה ביותר.
    1. Dilute AAV ב מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) תרבות בינוני. דילולים סביב 2 × 10 9 הגנום עותקים/mL (GC/mL) מומלץ להגיע עם דלילה התמרה חושית של oligodendrocytes להפוך המאפשרת הדמיה של תאים בודדים בתוך הפרוסה. עם זאת, טייס באמצעות titers שונים צריך להיעשות כדי להבטיח צפיפות של oligodendrocytes להפוך transduced מתאים הניסויים ספציפיים. אם שני AAVs שונים משמשים, שהם צריכים להיות מעורב הפתרון אותו ולא להוסיף הפרוסה בו זמנית.
    2. להוסיף µL בסביבות 1.3 מדולל AAV כל פרוסה: לוודא החיצוני של קצה פיפטה יבש. פיפטה 1.3 µL מדולל AAV והחזק את פיפטה מעל קליפת המוח, קרוב ככל האפשר מבלי לגעת הפרוסה עם קצה פיפטה (בערך 1 מ משם).
    3. ואז לאט לדחוף פתרון מחוץ פיפטה. כאשר הפתרון נוגע הפרוסה, הזז את הטיפ פיפטה מעל קליפת להפיץ את הפתרון מעל האזור כולו קליפת-
      הערה: הליך זה צריך להיעשות מהר ככל האפשר כדי להימנע שומרים את הפרוסות למכסה במשך זמן ארוך מהנדרש. לעשות את זה על צלחת אחת באותו הזמן, להחזיר את המנה הראשונה החממה לפני תחילת על צלחת #2. כדי לקבל בהתפלגות משביע רצון של AAV ללא גרימת נזק לרקמת דורש קצת תרגול, יד יציבה.
  3. אם במיקרוסקופ פלורסצנטיות זקוף זמין במעבדה תא, ביטוי חלבונים ניתן לבדוק בזמן בתרבות על-ידי הצבת המנה תחת המיקרוסקופ.
    הערה: המנה לא צריך להישמר מחוץ החממה במשך יותר מ 2-5 דקות.

3. הדמיה זמן לשגות

הערה: ההדמיה יכולה להתבצע בכל פעם רמות הביטוי של הסמנים פלורסנט הן מספקות הפרוסות נראה בריא (בדרך כלל DIV11-14).

  1. לוודא המיקרוסקופ, זלוף וחימום מוגדרות כראוי כך פתרון דימות מבעבע מחומם, יכול להיכנס ולצאת האמבט.
    הערה: פתרונות שונים קיימים עבור חדרי אמבט. גרסה פשוטה מוצג כאן.
    1. הפוך בועודפים של האמבטיה על ידי קהות מחטי מזרקים (בנט על ~ 45°) המצורפים אל צידי האמבטיה על ידי blu-טקטיקה/fun נעץ.
    2. להבטיח כי אבובים ועובר בקבוק מבעבע ברציפות פתרון דימות, דרך משאבת סחרור, דרך הצינורית חימום של יחידת חימום ולאחר מכן כדי מחט מזרק כניסת באמבטיה.
    3. צינור אחר להתחבר לשקע מחט מזרק. הצינור הזה ואז עובר דרך את משאבת סחרור, חזרה אל הבקבוק של הדמיה פתרון (או בקבוק פסולת).
  2. בועה הדמיה פתרון (מתכון של ריאגנטים ' טבלה) בגז bioxide.
    הערה: זה אמור להיות started לפחות 15 דקות לפני הדמיה ולהמשיך לאורך כל הניסוי.
  3. התור על משאבת סחרור, דוד שמש, פתרון לרוץ דרך האמבטיה להשגת טמפרטורה אופטימלית אמבט (37 ± 0.5 ° C). להבטיח כי החיישן מדחום מחובר יחידת הטמפרטורה שקוע בפתרון אמבטיה-
  4. להפעיל את המיקרוסקופ, קרינה פלואורסצנטית המנורה ואת לייזרים המתאים.
  5. סט למעלה אור מתאים נתיב עבור המדגם.
    הערה: זה משתנה בהתאם בדיקה וההתקנה של מיקרוסקופ. הידע הכללי של אופן השימוש מיקרוסקופ קונפוקלי נדרש, לא יטופל כאן.
  6. השתמש מטרה טבילה במים עם הגדלה המתאים ואת מפתח נומרי (נ. א). אנו משתמשים מטרה תוכנית-עדשה אפוכרומטית טבילה במים (נ. א. 1.0) 40 x.
  7. פתח חריר להשגת מקטע אופטי של-2-2.5 מיקרומטר עבור צילומי הווידאו. זה מקטין את המופע של המיטוכונדריה לזוז בפוקוס במהלך זמן לשגות.
  8. העברת organotypic פרוסה לאמבטיה:
    1. להוסיף טיפה של הדמיה פתרון או תרבות בינוני פלסטיק קטן פטרי.
    2. בשכונה סטרילי, להשתמש מלקחיים סטרילי כדי להעביר פרוסה אחת organotypic הקרום להוסיף עד הטיפה. המלקחיים צריך רק לגעת הקונפטי, לא את הפרוסה.
    3. לשים את המכסה הפטרי.
    4. מיד לשים את המנה תרבות המכיל את שאר הפרוסות בחזרה בחממה.
    5. להביא צלחת פטרי המכילות פרוסה על המיקרוסקופ.
    6. לבטל את משאבת סחרור בעת העברת פרוסה מיקרוסקופ לאמבטיה. תחילה, השתמש מלקחיים להרים קונפטי עם פרוסה של פטרי לחלק העליון של בית המרחץ (הקונפטי יצוף). ואז המקום את שני קצות המלקחיים בכל צד של הקונפטי, כך הם נוגעים הקונפטי בלי לגעת הפרוסה, ודחף את הקונפטי דרך הפתרון לתחתית האמבט. מרכז הקונפטי באמצע האמבטיה.
    7. להשתמש מלקחיים כדי למקם את נקודת העיגון hold-down (נבל) על גבי הקונפטי בלי לגעת הפרוסה.
      הערה: נבל הוא עוגן הפלטינה בצורת פרסה המשמש כדי למנוע את הפרוסה צף או נסחף באמבטיה. עבור פרוסות חריפה, פתילים דקות לרוץ מצד אחד של הנבל השני (דמוי נבל מוזיקה). פרוסות organotypic, הנבל צריך להיות שהראת, שיתאים לגודל הקונפטי בצורה כזאת, כי זה יכול. להניח על גבי הקונפטי בלי לגעת הפרוסה.
    8. להדליק משאבת סחרור.
  9. להוריד את המטרה עד המדגם.
  10. בחר תא ואת אזור התמונה.
    הערה: להימנע מחשיפה מוגזמת של התאים לייזר אור כמו זה יכול לגרום תא רעילות (ראה טיפים הנקודות להלן).
    1. להשתמש עיניות, את מנורת פלורסנט כדי למצוא אוליגודנדרוציטים בריאים למראה עם הביטוי הנכון. בדרך כלל, oligodendrocytes להפוך שיש להם ביטוי חזק של החלבון הניאון מופיעים לא בריא. Oligodendrocytes להפוך לא בריא יהיו תהליכים עם מראה הנטול צורה, וכל המיטוכונדריה יופיעו בקיעים. Oligodendrocytes בריאה, סומא והתהליכים מופיעים חלק ויש המיטוכונדריה באורכים שונים (אם כי בדרך כלל הרבה יותר קצר מאשר נוירונים, האסטרוציטים 13 , 14 , 15).
    2. למקם את התא של הריבית באמצע שדה הראייה.
    3. שימוש " חיים " לתפקד בתוכנה (עבור לייקה, Zeiss מיקרוסקופים) כדי לזהות את התא על המסך, בחר אזור מעניין, למשל, חלק של התא המכיל מספר תהליכי הראשי או עטיפות המיאלין, או תהליך יחיד או מעטפת המיאלין.
      הערה: כדי להיות מסוגל תמונה כמו הרבה של התהליכים/מרתה ככל האפשר, בחר אזורים שמכיל שתהליכים שכב יחסית שטוח בכיוון x-y.
    4. להגדיל תחום התעניינות (בדרך כלל לייצר תמונה בגודל פיקסל של 0.14 - 0.30 מיקרומטר).
    5. שימוש " אזורים " הכלי, צייר מלבן מסביב לאזור ובחר את האפשרות לסרוק רק האזור הנבחר. סריקה זמן, ובכך חשיפה ללייזר, הוא מופחת על ידי רק לסרוק את האזור הנבחר.
      הערה: אזורים אופקיים מלבני ייסרקו מהר יותר אזורים אנכי עקב מספר קצר של קווים סרוקים הדרושים. אם אזור המלבנית האנכית נסרק, הפעם סריקה יכול להיות מופחת על ידי סיבוב השדה סריקה ב- 90 מעלות (באמצעות הכלי סיבוב).
  11. כוונון עוצמת הלייזר ורווח כדי לקבל תצפית טובה על המיטוכונדריה.
    הערה: השתמש את עוצמת הלייזר מינימלי הדרוש. במידת האפשר, הפעל את רווח במקום הגדלת עוצמת הלייזר. בנוסף לגרימת תא רעילות, עוצמת הלייזר גבוהה מדי מלבין את האובייקטים שבעורך לאורך זמן, וכך מצריכים עלייה נוספת של עוצמת הלייזר או לצבור במהלך סריקה. עוצמת הלייזר נדרשת ורווח יהיה תלוי את רמת הביטוי של המיקרוסקופ. עם מיקרוסקופ קונפוקלי LSM700, אנו משתמשים בלייזר nm 555-כוח של 20-40 µW תמונה dsred או tdtomato, 488 ננומטר לייזר משמש ב- 20-30 µW לשיקוף GFP (לייזר כוח נמדד על הפתח האחורי של המטרה). רווח שוכן גבוה עבור הדמיה בשידור חי, בדרך כלל בטווח של 800-700 עבור ה-GFP, 850-980 עבור dsred ו- tdtomato. רווח גבוה עלול לגרום רעש רקע נוסף, אשר יוסר על ידי הגדלת ההיסט דיגיטלי (אופסט ערכים להניח בדרך כלל בין 0 ל- 15). מניסיוננו, שימוש MBP_mito_GFP מספק יותר טוב אות לרעש מאשר MBP_mito_dsred.
  12. בחר מהירות הסריקה.
    הערה: לצמצם את זמן סריקה באמצעות סריקה במהירות גבוהה, על ידי ציור של אזור הסריקה קטן (ראה הצבע 4.10.5 להלן). . זה גם ניתן להציל סריקה הזמן על ידי ביצוע סריקה דו-כיווניים. עם זאת, לא מומלץ עקב באיכות התמונה.
  13. סט התדירות והמשך של הקלטה זמן לשגות, למשל לכידת תמונות כל 2 שניות עבור סכום כולל של 20 דקות עבור הדמיה מיטוכונדריאלי ב oligodendrocytes להפוך.
    הערה: התדירות והמשך צריך להיות מוגדר על פי הניידות של האובייקטים של ריבית. תדר גבוה יותר תחשוף את הדגימה יותר לייזר אור, אבל עצמים הנעים מהר יותר גם דורשים משך סה כ קצר יותר של קטעי וידאו בצילום מואץ (למשל במיטוכונדריה נוירונים, אשר לנוע בתדירות גבוהה יותר במהירות גבוהה יותר מאשר במיטוכונדריה oligodendrocytes, בדרך כלל הם צילמו כל שנייה עבור סכום כולל של 2 דקות 16)-
  14. להתחיל בצילום מואץ ההקלטה.
    הערה: המיטוכונדריה עשויה לנוע מחוץ לפוקוס ו/או להיסחף מהאזור שבעורך במהלך ההקלטה. כדי למזער את התנודות והתנועה, להתאים בועודפים של האמבטיה להפחית מהירות המשאבה במידת הצורך. שינויים קטנים בפוקוס בדרך כלל עדיין מתרחשות. לפיכך, ניטור רציף של המסך במהלך דימות נדרש, עם שינויים קטנים של המוקד במהלך ההקלטה.
  15. ללכוד את z-בערימה של התא כולו עבור זיהוי עתידי של התא, עם תמונה תהליך.
    הערה: עבור רזולוציה טובה יותר, חריר מאופס 1 יחידה אוורירי עבור z-המחסנית.
  16. אופציונלי: לדמיין את המיאלין וללא רבב.
    הערה: ב oligodendrocytes transduced עם GFP (cytoplasmic), עטיפות המיאלין בדרך כלל ניתן לזהות כקווים ישרים של הציטופלסמה (הרכסים cytoplasmic) מחובר לתהליך העיקרי (ראה איור 2 A ו- B). עם זאת, אם הביטוי GFP חלש מדי או סמן cytoplasmic אינו בשימוש, זה אפשר לדמיין את המיאלין על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי השתקפות (CoRe) כפי שמוסבר כאן.
    1. להגדיר נתיב אור חדש בתוכנה עם לייזר עירור-488 ננומטר וללכוד הנפלטים אור סביב אותו גל, למשל 470-500 ננומטר.
    2. התאם לייזר כוח ולהשיג עד המיאלין יהיה גלוי (עיין בדוגמה < מחלקה חזקה = "xfig "> איור 3). באמצעות מיקרוסקופ LSM 510 Meta, בדרך כלל נשתמש בחזקת לייזר µW 7-12 (נמדד על הפתח האחורי של המטרה).
  17. אופציונלי: הכנה של פרוסות immunostaining.
    1. אם התא שבעורך חייב להיות מזוהה לאחר immunostaining, לכידה של תמונת הגדלה נמוכה (10 x) של התא ולציין את מיקומו בתמונה על ידי ציור חץ או דומה. כדי לסייע בזיהוי של התא, מומלץ גם לשרטט מפה ידנית של כל פרוסה, המציין את מיקומו של התא.
    2. תיקון פרוסה ב 4% paraformaldehyde (PFA) על שייקר למשך שעה בטמפרטורת החדר.
      התראה: PFA מזיק. להשתמש מגן ללבוש ולהשתמש רק בשכונה מאוורר.
    3. לדלל 1:10 ב- PBS מקבע ולהשאיר ב 4° C עד לתחילת אימונוהיסטוכימיה כמתואר 17.
      הערה: למרות פרוסות יכולים להישאר לשבועיים מדוללת למשך מספר שבועות, קרינה פלואורסצנטית עשויה לדהות. ביצוע אימונוהיסטוכימיה תוך 10 ימים קיבוע מומלץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוסות המוח Organotypic היו תרבותי, transduced כמתואר לעיל הראה בהתפלגות דלילה של קורטיקלית oligodendrocytes להפוך לבטא mito_dsred ו- GFP. Immunostaining עם נוגדנים נגד Olig2 ו- MBP אישר כי הביטוי היה ספיציפית oligodendrocytes להפוך (איור 1).

עבור הדמיה בשידור חי, transduced oligodendrocytes להפוך זוהו על ידי שלהם מורפולוגיה אופיינית של כמה עטיפות המיאלין הפעלה במקביל (איור 1 , איור 2A). על ידי ביצוע הדמיה בצילום מואץ על oligodendrocytes להפוך transduced, זה אפשרי לפקח על התנועה של המיטוכונדריה תהליכים ראשיים, עטיפות מיאלין (איור 2B-D).

תאים עם ביטוי GFP נמוך, למעטפת מיאלין יכול להיות מזוהה במהלך דימות בשידור חי על-ידי הארת המדגם-488 ננומטר ולכידת הנפלטים אור 470-500 ננומטר (איור 3 א). זו טכניקה מיקרוסקופית (CoRe) השתקפות קונאפוקלית עבד גם על כדורגלן קבוע, רקמת immunostained, למרות המיאלין המעטים הופיעו עמעם (איור 3B-C). על ידי immunostaining עם נוגדנים נגד חלבון המיאלין הבסיסי (MBP), מצאנו כי ל 100 אחוז של עטיפות המיאלין הנחת אופקי אל המטוס הדמיה (מסומן על ידי חץ, איור 3B-C) גלויים עם ליבה, ואילו המיאלין המעטים מאונך להטיל את שדה הראייה (מסומן על ידי כוכביות, איור 3B-C) הם פחות או בכלל לא נראה לעין. למרות כמעט כל פרקי הגבעולים הם דמיינו, פרקי הגבעולים רבים מופיעות מקוטע, עם חלקים קטנים של נדן לא להיות גלוי (איור 3 א insert). אלה קטן "פערים" המיאלין יכול להיות מלא על ידי הדמיה עם שלושה אורכי גל משלימים, ניקוד כביכול9.

Figure 1
איור 1 : אימונוהיסטוכימיה מאשר MBP-mito-dsred מתבטאת באופן סלקטיבי oligodendrocytes להפוך כי הם מערכת החיסון חיובית עבור Olig2 ו- MBP...  תמונות יהיו מתוך קליפת של פרוסות המוח תרבותי. העכבר transduced עם (AAV2/8) MBP-mito-dsred (סמן אדום, מיטוכונדריאלי), החטיבה-GFP (ירוק, ציטוזול). הפרוסות היו immunolabeled כדי להפוך את המיאלין סמן חלבון המיאלין הבסיסי (MBP, כחול) Olig2 (אוליגודנדרוציטים שושלת היוחסין תא גרעיני מרקר, מגנטה). (דמות שונה ההתייחסות13) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : הדמיה בצילום מואץ כדי לעקוב אחר תנועת מיטוכונדריאלי oligodendrocytes להפוך. (א) השלכה של z-ערימת (סעיף אופטי 10.35 מיקרומטר) אוליגודנדרוציטים transduced עם MBP_mito_dsred (אדום המיטוכונדריה), CAG_GFP (ירוק קרינה פלואורסצנטית). (B) קונאפוקלית תמונה בודדת (סעיף אופטי 1.04 מיקרומטר) באותו התא. כיכר מציינת אזור שנבחרה עבור הדמיה בצילום מואץ (C), הקווים שצוירו כדי להפוך kymographs (קים) ב (ד) מסומנים. (ג) תמונות בצילום מואץ הקלטה בתא A ו- B נלקח בנקודות זמן שונות. נעה המיטוכונדריה הם המצוין (חצים אדומים). (ד) Kymographs מ מסלולים שצוינו (B). המיטוכונדריה נייח נתפסים קווים אנכיים ישר, המיטוכונדריה נע נתפסים קווים אלכסוניים. כפי שניתן לראות את kymographs, וכן את התמונות כמובן זמן (C), עוברים רק המיטוכונדריה בתהליך הראשי המסומן Kymograph 1 (קים 1). במיטוכונדריה kymographs שלושה אחרים הם נייחים במהלך ההקלטה זמן לשגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : ויזואליזציה של מיאלין מוכתם על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי השתקפות (CoRe). (א) השלכה של z-מחסנית (סעיף אופטי 10.35 מיקרומטר) מ קליפת פרוסת המוח organotypic בשידור חי. הביטוי GFP ב אוליגודנדרוציטים המוצגת כאן (גוף התא הירוק) מעומעם מדי עבור זיהוי של תהליכים ראשיים ונרתיקים מיאלין. במקום זאת, עטיפות המיאלין היו דמיינו ידי עירור-488 ננומטר, לכידת האור הנפלט-470-500 ננומטר (מוצג במגנטה). חלק paranodes ציטופלזמה עשירה של אוליגודנדרוציטים GFP + ניתן לראות בקצה פרקי הגבעולים מיאלין (חיצים). הוספה: חלק מוגדל של מיאלין מראה כי המיאלין דמיינו עם ליבה מופיע "אחידה" או מקוטע (ראה הטקסט העיקרי לקבלת פרטים). (בג) קונאפוקלית תמונות סטריאטום (B), שכבה radiatum של ההיפוקמפוס CA1 (C) של פרוסה מוח העכבר חריפה זה תוקנה ב- 4% כדורגלן ו immunostained עבור חלבון המיאלין הבסיסי (MBP). עטיפות המיאלין Horisontal (חץ) גלויים עם ליבה, ואילו מעילי פרווה הנמצאים בניצב שדה הראיה (כוכביות) לרוב לא יהיו גלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה של ריאגנטים: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול להכנת organotypic תרבויות המתוארים כאן הוא הגירסה ששונתה18 של הפרוטוקול המתואר על ידי דה Simoni יו (2006)5. השינויים החשובים ביותר יש כבר המתוארים להלן. טריס מאגר נוסף המדיום תרבות, אשר משפר את ההישרדות של הפרוסות כאשר מחוץ החממה במהלך התמרה חושית ויראלית ושינוי של המדיום התא. תהליך עיקור עבור קונפטי גם משתנה. בעוד פרוטוקולים אחרים לחטא קונפטי מאת autoclaving, לא מומלץ זה משום שהיא תגרום מספר הקונפטי להתכרבל. הימנעו משימוש קונפטי מסולסל פרוסות גדל על אלה נוטים להיות פחות בריא. פרוטוקול שלנו משתמשת עכברים, חולדות לא, משתנה כך תרבות קליפת ההיפוקמפוס, במקום שבו נמצא עובד היטב עם פרוסות דק (230 מיקרומטר לעומת 300 מיקרומטר). כפי myelination פיקס סביב כמחנכת יום 10-20 עכברים, חולדות19, תרבויות זני עכברים-p7-9 (וגם בתרבית ואז 11-14 ימים) הם אופטימליים ללימוד oligodendrocytes להפוך myelinating. ב 11-14 ימים במבחנה, התרבויות להכיל מספר oligodendrocytes להפוך בוגרת עם עטיפות המיאלין קומפקטי13. תרבויות זני עכברים צעירים תכיל פחות בוגר oligodendrocytes להפוך בסוף תקופת תרבות, ואילו תרבויות זני עכברים בוגרים הראו יותר מאתגר לשמור בריא20.

ההליך להכנת פרוסות organotypic כרוך במספר שלבים קריטיים. הקרע הרכבה של המוח, וכן הצבת פרוסות על גבי קונפטי, חייב להיעשות מהר ודורשת מיומנות מסוימת. בדרך כלל, הניסיונות הראשונים שהופך organotypic פרוסה תרבויות הם פחות מוצלח, אבל 2-3 סיבובים של אימון צריך להיות מספיק כדי לרכוש את הכישורים הדרושים להכנת תרבויות בריא. חשוב לשמור על סביבה סטרילית לאורך כל ההליך כדי למנוע זיהום של התרבויות. יתר על כן, כאשר עובדים עם תאים חיים, זה תמיד הכרחי כדי להבטיח pH נכונה osmolality של פתרונות לשמירה על בריאות. לכן, עצה טובה לבדוק osmolality (צריך להיות 270-310 mOsm/kg) ו- pH של כל הפתרונות המשמשים על הפרוסות, במיוחד כאשר אין עושים את הניסוי בפעם הראשונה. פתרונות תרבות, חיתוך תרבויות organotypic מכילות מחוון ה-pH (פנול אדום), אבל הסרום הצהוב במדיום תרבות יכול לתת רושם של נמוך יותר מאשר ה-pH בפועל. המדיום תרבות כוללת פניצילין, סטרפטומיצין ניסטטין כדי למזער את הסיכויים לזיהום. ולכן מומלץ להשתמש אלה אנטיביוטיקה, antimycotics בעת הגדרת הטכניקה התרבות פרוסה organotypic במעבדה, אך ניתן מאוחר יותר הם להימנע כאשר הטכניקה aseptic מומחה מוחל. בפרוטוקול הנוכחי משתמש תא מורפולוגיה להערכת הכדאיות התא. עבור בדיקה כמותית יותר, פרוסות יכול להיות עמוסה propidium יודיד או צבע דומה כפי שמתואר במקום אחר21. עם זאת, חשוב להיות מודעים כי ספקטרום הפליטה של יודיד propidium חופף dsred, tdtomato ומחוונים אדום אחרים. מגבלה נוספת של יודיד propidium, ריאגנטים דומה הוא שהם לא בקלות להיכנס ועליית של הפרוסה, ובכך יגביל ובחינת הכדאיות תא לשכבה העליונה של תאים5.

מגוון שיטות קיימת עבור המסירה הגן. היתרונות העיקריים של שימוש AAV התמרה חושית של תרבויות פרוסה organotypic לדמיין organelles הן כדלקמן: התמרה חושית AAV יש שיעור הצלחה טובים יותר עבור oligodendrocytes להפוך postmitotic לעומת שיטות של תרביות תאים נגיפי22. עוד, בתרבויות organotypic כל סוגי תאים במוח קיימים, ויש oligodendrocytes להפוך של המורפולוגיה דומה כי ראיתי ויוו, כולל המיאלין קומפקטי13. זה שונה oligodendrocytes להפוך ב מונוקולטורה, חוסר התקשורת עם אקסונים, ולכן לא עושים המיאלין קומפקטי. דימות in vitro קל מושווה ויוו , ומציע כדאי רזולוציה מרחבית, וזה עניין מיוחד כאשר הדמיה organelles קטנים כמו המיטוכונדריה. למחקר עתידי ישאפו להיות התמונה ויוו, אך פנים נהדר אתגר עם סטיות אופטי הנגרמת על ידי למעטפת מיאלין עתירי שומנים בדם. יתר על כן, AAV serotype tropism, יזם ירידה לפרטים עשויות להיות שונות בין ב- vivo ו- in vitro לקשרי תנאים13,23. בפרוטוקול המובאת כאן, MBP_mito_dsred AAV2/8 ו- AAV2/8 MBP_mito_GFP משמש כדי להמחיש אוליגודנדרוציטים המיטוכונדריה. AAV serotype 2/1 נבדקה גם עם MBP_mito_dsred אך נגוע מספר נמוך יותר של oligodendrocytes להפוך פרוסות organotypic (לא מוצג). CAG_GFP AAV2/8 ו- AAV2/8 CAG_tdtomato שימש כדי להמחיש אוליגודנדרוציטים הציטופלסמה. למרות שימוש האמרגן חטיבתי כללי זה, AAV 2/8 CAG_GFP ו- CAG_tdtomato נגועה באופן סלקטיבי oligodendrocytes, עם כמות קטנה של האסטרוציטים, נוירונים להידבק (אלה יכול להיות בקלות מזוהה על ידי מורפולוגיה אופיינית שלהם). הסלקטיביות הזאת עבור oligodendrocytes להפוך נובעת ככל הנראה tropism של serotype 2/8 AAV24. אולם, לביטוי, ממוקדות אברון, התא-יחודיות גבוהה מושגת עם MBP - או אחרות היזמים אוליגודנדרוציטים ספציפי מומלץ. אחרים אשר נגרמו מהזנים אליהם נבדק עם CAG_GFP על ידינו היו AAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, ביותר אשר נגועים בעיקר נוירונים, האסטרוציטים (לא מוצג).

בהתאם הבונה את התנאים ניסיוני, יהיה צורך שינוי של התמרה חושית התא. אם התאים transduced מופיעים עמום מדי, נסה יותר זמן במבחנה לאחר התמרה חושית כדי להגדיל את הביטוי. אם התאים מופיעים בהיר אבל לא בריא, לצמצם את הזמן לאחר התמרה חושית. אם תאים מעטים מאוד הם transduced, ניתן להגדיל את ריכוז AAV. עם זאת, זה גם אפשרי כי הזמן במבחנה לאחר התמרה חושית היא יותר מדי זמן, תאים transduced מתו... המבנה המשמש כאן, היו רמות הביטוי אופטימלית 4-6 ימים לאחר התמרה חושית. ב- 7-8 ימים לאחר התמרה חושית, תאים הופיעו פחות בריא, עם תהליכים הנטול צורה, 10 ימים לאחר התמרה חושית, רק כמה תאים transduced היו גלויים (לא מוצג).

פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ זקוף ההדמיה בשידור חי של פרוסות organotypic. זה שונה ביותר מונו- ותרבויות שיתוף זה בדרך כלל להשתמש במיקרוסקופ הפוכה. . זה שיוצרת להשתמש במיקרוסקופ הפוך כאן כי הפרוסות ואז לפעול עם הקונפטי כלפי מעלה, הגורמת יש להניח את פרוסות יהיה פחות בריא. אחד היתרונות של המיקרוסקופ זקוף הוא האפשרות להוסיף אלקטרופיזיולוגיה ההתקנה. יתר על כן, השימוש של משאבה לשינוי בינוני אומר כי פתרונות סמים יכול בקלות להיות נוספו והוסרו במהלך ההדמיה זמן לשגות. חיסרון עם המשאבה היא בעיות שמירה על מיקוד נגרם על-ידי תנודות וזרמים באמבטיה. תחת המיקרוסקופ, התאים בהדרגה יהיה פחותבריא. לכן נמשיך פרוסות מתחת למיקרוסקופ לכל היותר 1 שעה. פרוסות שבעורך נזרקים משם (פסולת מיוחד). כדי להבטיח התנאים הדמיה אופטימלית, הדמיה של תאים שליטה, שבה התנועה מיטוכונדריאלי מתאפיין כבר היטב, צריכה לפעול במקביל. כי למשל, התנועה מיטוכונדריאלי אקסונים או דנדריטים יכולים לדימות מאת transducing פרוסות עם AAV Syn_mito_dsred 2/1 (ב- dsred איזה ביטוי מונעת על ידי יזם synapsin הנוירון ספציפי) או AAV CAG_mito_dsred 2/1 (ואחריו immunostaining כדי לאשר תא זהות). ניתוח תנועה מיטוכונדריאלי יכול להיעשות באמצעות הכלי kymograph מרובים ב- ImageJ כמתואר25.

כאן נתאר הליבה להדמיה של מיאלין מוכתם במהלך דימות בשידור חי. לעומת ציון9, אשר משתמשת שלושה אורכי גל עירור, הליבה רק משתמש אחד (488 ננומטר), ולכן הוא יותר פשוט ליישום. ציון, שלושה אורכי הגל כל חושפים "יצירות שונות" למעטפת מיאלין, ביחד נותן תמונה מלאה של נדן. בנוסף, הציון יכול לשמש כדי לזהות מיאלין מבנים כגון cytoplasmic כיסים. עם אורך הגל יחיד בשימוש הליבה, ניתנת תצוגה מפורטת פחות ואת מעילי פרווה עשויים להופיע מגורען או מקוטע (איור 3). למרות זאת, הליבה מדמיין בקרבת מקום ל- 100% של עטיפות המיאלין שנמצאים אופקית את שדה הראייה. לפיכך, הליבה שימושית לצורך זיהוי של עטיפות המיאלין, אך לא עבור ניתוח של מבנים המיאלין או שלמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

אנו מודים לינדה הילדגרד Bergersen ו Magnar Bjørås עבור גישה לתא מעבדה וציוד, צוות משאבים משותפים של ביולוגיה מולקולרית Janelia עבור פלסמיד והפקה וירוס, קואן Vervaeke לקבלת סיוע עם מדידות חשמל לייזר. עבודה זו מומן על ידי איגוד הבריאות נורבגי, המועצה מחקר נורבגי, הציוד מיקרוסקופ מומן על ידי Norbrain.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose  Sigma  A9539
BD Microlance 19G BD 301500 Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas AGA 105701
Brand pipette bulbs Sigma-Aldrich Z615927 Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner) VWR 89038-530
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments 64-0106  Temperature controller - thermometer part
CaCl2 Fluka 21100
CO2  AGA 100309 CO2 for incubator
Cover glass, square Corning Thermo  Fischer Scientific 13206778 To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Delicate forceps Finescience 11063-07 For dissection
Diamond scriber pen Ted Pella Inc. 54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm VWR 612-1702 Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade Electron Microscopy Sciences #7200 Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco-Invitrogen 24010-043
Filter paper circles Schleicher & Schuell 300,220 Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack Loctite 1270884 Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2 Katrin 344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber, Warner Instruments  64-1418 Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3 Sigma H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2 Heto-Holten 96004000M Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated Gibco-Invitrogen 26050-088
KCl Sigma P9541
LCR Membrane, PTFE,  Millipore FHLC0130 Confetti 
Leica VT1200 Leica 14048142065 Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES Thermo  Fischer Scientific 42360024
MgCl2 R.P. Normapur 25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B Electron Microscopy Sciences 62411-B Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit Millipore SLGPM33RA Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm Millipore PICM03050 Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module GILSON F155001 Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaHCO3 Fluka 71628
Nunclon Delta Surface Thermo  Fischer Scientific 140675 Culture plate
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC  Zeiss 441452-9900-000  Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm VWR 291-1211
Paraformaldehyde, granular Electron Microscopy Sciences #19208
PC-R perfusion chamber SiSkiYou  15280000E Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15070-063
Petri dish 140 mm  Heger 1075 Large Petri dish 
Petri dish 92x16 mm  Sarstedt  82.1473 Medium Petri dish 
Petridish 55x14,2 mm VWR 391-0868 Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417 PBS tablets
R2 Two Channel Head  GILSON F117800 Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Large spatula for dissection
Sand paper VWR MMMA63119 Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm Finescience 14130-17 Large scissors for dissection
Scissors, 8,5  Finescience 14084-08 Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade Electron Microscopy Sciences #71972 Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm Millipore SCGPT05RE Filter to sterilize solutions
Super glue precision Loctite 1577386
Surgical scalpel blade no. 22 Swann Morton Ltd. 209 Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B Warner Instruments 64-0100 Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base Sigma  T1503
Trizma HCl Sigma T3253
Water jacketed incubator series II Forma Scientific 78653-2882 Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11, (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics