Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Myelinating oligodendrocytes hızlı aksiyon potansiyeli yayılması ve nöronal hayatta kalma teşvik. Burada açıklanan bir oligodendrocyte özel mesaj organotypic floresan proteinlerin beyin dilimleri ile sonraki zaman hata görüntüleme iletişim kuralıdır. Ayrıca, günahı miyelin görüntülenmesi için basit bir prosedür sunulur.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kennedy, L. H., Rinholm, J. E. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56237, doi:10.3791/56237 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nöronlar elektrik izolasyon ve myelinating oligodendrocytes trofik desteğiyle güveniyor. Önemini oligodendrocytes rağmen şu anda nöronlar, eğitim için kullanılan gelişmiş araçlar yalnızca kısmen atılmıştır oligodendrocyte araştırmacılar tarafından. Hücre türüne özgü tarafından viral iletim boyama canlı organel dynamics eğitim için yararlı bir yaklaşımdır. Bu kağıt ile adeno ilişkili virüs (AAV) transkripsiyon kontrolü altında mitokondrial hedeflenen floresan proteinler için gen taşıyan iletim tarafından oligodendrocyte mitokondri organotypic beyin dilimleri içinde görüntülenmesi için bir iletişim kuralı açıklar miyelin temel protein organizatörü. Koronal fare beyin dilimler organotypic yapmak için iletişim kuralı içerir. Bir yordam için hızlandırılmış düşsel mitokondri, sonra arkasından gelir. Bu yöntem diğer organelleri için transfer edilebilir ve organelleri miyelin kılıf içinde çalışmak için özellikle yararlı olabilir. Son olarak, Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından yaşam dilimleri içinde günahı miyelin görselleştirme için hazır bir tekniği tarif. Çekirdek hiçbir ekstra ekipman gerektirir ve canlı görüntüleme sırasında miyelin kılıf tanımlamak yararlı olabilir.

Introduction

Beynin beyaz madde sinir hücresi aksonlar miyelin, oligodendrocytes tarafından kurulan özel bir genişletilmiş plazma zarı sarılı oluşur. Miyelin hızlı ve güvenilir aksiyon potansiyeli yayılması ve myelinated akson uzun vadeli yaşam için gereklidir ve nörolojik disfonksiyon miyelin kaybına neden olabilir. Önemine rağmen oligodendrocytes özelliklerini daha az bilinen neurons ve astrocytes ile karşılaştırılır. Sonuç olarak, daha az araçları oligodendrocytes eğitimi için geliştirilmiştir.

Mitokondri, endoplasmatic retikulum (ER) veya farklı veziküler yapıları organelleri dinamik değişiklikleri zaman içinde eğitim yararlı olabilir gibi hücre organelleri görüntüleme yaşıyor. Geleneksel olarak, oturma oligodendrocytes görüntüleme monocultures1,2' gerçekleştirdi. Ancak, Monokültür oligodendrocytes kompakt miyelin görüntülenmez ve organotypic veya akut beyin dilimleri bu nedenle, daha iyi bir seçenek Yerelleştirme ve organelleri hareketin okurken olabilir. Yerelleştirme küçük organelleri ve miyelin kılıf protein myelinated akson ve çevresindeki miyelin kılıf arasında kısa bir mesafe nedeniyle zor olabilir. Böylece, ışık mikroskopik immunostaining yordamlar yalnız organelleri miyelin kılıf içinde ve bu myelinated akson arasında ayırımcılık Uzaysal çözünürlük var mı. Bu viral iletim flüoresan proteinler organel hedef hücre türüne özgü rehberleri tarafından tahrik için genleri olan tarafından çözülebilir. Avantajları dinamiği ve organel yerelleştirme doğru değerlendirme sağlar bir hücre özgü ve seyrek ifade vardır. Transjenik hayvanlar böyle bir hücre özgü ifade organel hedefli3elde etmek için de kullanılabilir. Ancak, üretim ve bakım Transjenik hayvanlar, pahalı ve genellikle viral yöntemlerle elde edilebilir seyrek ifade sunmuyor.

Yöntem tanımlamak burada miyelin temel protein düzenleyici tarafından (MBP-mito-dsred veya MBP-mito-GFP) görselleştirmek için tahrik oligodendrocytes floresan proteinler (dsred veya yeşil flüoresan protein, GFP) mitokondriyal hedefli ile viral iletim kullanır organotypic beyin dilimleri içinde oligodendrocyte mitokondri. Buna ek olarak, ifade (mito-dsred ile birlikte kullanılan GFP veya mito-GFP ile kullanılan tdtomato) sitoplazmada başka bir floresan proteinin hücre morfolojisi, miyelin kılıf sitoplazmik bölümler de dahil olmak üzere görselleştirme etkinleştirmek için kullanılır. Protokol organotypic beyin dilimleri (De Simoni ve Yu, 20064,5tarafından açıklanan protokol değiştirilmiş bir sürümü) yapmak için yordam içerir. Biz o zaman mitokondrial hareketi eğitim için hızlandırılmış görüntüleme açıklayınız. Bu yordam, sürekli bir değişim görüntüleme orta, uyuşturucu veya diğer Orta değişiklikleri görüntüleme sırasında uygulama kolaylığı sağlar bir kurulum ile dik bir confocal mikroskop kullanır. Hızlandırılmış görüntüleme yordam confocal herhangi bir mikroskopla aşağıda açıklandığı gibi yaşam dilimleri korumak için bazı ekstra ekipman üzerinde gerçekleştirilebilir. Protokol Ayrıca görüntüleme optimize etmek ve fototoksisite azaltmak için birkaç ipucu içerir.

Son olarak, günahı miyelin Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından görselleştirmek için hızlı ve basit bir şekilde açıklanmıştır. Bu miyelin kılıf canlı görüntüleme sırasında tanımlamak yararlı olabilir. Son yıllarda, gerekli herhangi bir boyama olmadan görüntü miyelin için çeşitli teknikler geliştirilmiştir, ancak bunların çoğu özel ekipman ve uzmanlık6,7,8gerektirir. Burada açıklanan yordamı kullanır miyelin kılıf yansıtıcı özellikleri ve spektral Confocal yansıma mikroskobu Basitleştirilmiş tek-uyarma dalga boyu sürümüdür (skor, içinde birkaç lazer dalga boyu miyelin görselleştirmek için birleştirilir) 9. çekirdek 488 nm lazer ve 470-500 nm bant emisyon filtre veya bir akort emisyon filtre vardır herhangi bir confocal mikroskobunun yapılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

burada açıklanan yordamları Norveçli hayvan araştırma yetkilisi tarafından onaylanmıştır. Tedarikçiler ve Katalog numaraları için sarf malzemeleri ve diğer gerekli belgenin sonundaki malzemeler listede kullanılabilir bağlantı donanımıdır.

1. hazırlık Organotypic dilim

Not: Doğum sonrası gün 7-9 (p7-9), hangi altı-şey kültür tabağı üzerinde bölünmüş 24 organotypic dilimleri verim iki fare pups bu tarifi kullanır. Aksi belirtilmediği sürece, tüm yordamları steril bir mahallede yapılmalı ve nitril veya lateks eldiven kullanılmalıdır. Yalnızca hücre kültür sınıf malzemeler kullanılmalıdır.

  1. Basınçlı kap şişeler, diseksiyon araçları (1 büyük makas, 1 küçük makas, 1 büyük düz spatula, 1 küçük yuvarlak ve keskinleşmiş spatula ve 1 forseps, bkz: malzeme listesi Ayrıntılar için), cam Pipetler, pipet ipuçları ve dilim hazırlanırken kullanılan doku mendil.
  2. Cam Pipetler yarısı-meli var olmak kullanılmış ile büyük açılış, dar ucunu break.
    1. Puan ile bir elmas scriber pipet cam daralma başladığı puanın altına çevresinde (varsa) kalem. O zaman pipet sivri sonu nitril eldiven içine veya benzer yer. Dikkatle tezgah karşı iterek süre pipet bükme tarafından ihbar kırmak.
    2. Sonra zımpara kağıdı bir parçası üzerinde sürtünme kırık sonuna künt veya hafif bir Bunsen brülör eritebilir. Kırık Pipetler kesme beyin dilimleri Lastik ampul döndü kırık ucuyla aktarmak için kullanılır ve büyük açık çözüm/dilimleri dokunmadan son.
      Not: Bu steril bir mahallede yapılmaz ve önceden birkaç gün yapılabilir.
  3. Kültür yemekleri hazırlamak.
    Not: Bu gün Dilimleme önce veya Dilimleme önce en az 2 saat yapılabilir.
    1. Sterilize politetrafloroetilin (PTFE) membranlar (" konfeti "). İki steril forseps çevreleyen mavi plastik parçalar tek konfeti kaldırmak ve iki kez bir % 96 etanol (alkol) içeren Petri daldırma tarafından sterilize etmek için kullanın. Sonra düz bir steril büyük kuru kabında konfeti yatıyordu.
      Not: Konfeti hidrofilik PTFE membranlar kültür ekler membranlar benzer vardır. Konfeti kullanımı tek dilimleri kolayca gelen Ekle mikroskop Kur Forseps ile konfeti kaldırarak transfer edilebilir çünkü canlı görüntüleme yardımcı olur (4,8 bkz. ayrıntılı bilgi için). Alternatif olarak, beyin dilimleri (hangi doğrudan kültür Ekle membran için dilimleri eklenecektir) konfeti olmadan kültürlü. Bu durumda, membran eklemek dilim mikroskop Kaplıcalar'a aktarmak için bir neşter ile kesmek gerekir.
    2. Kültür orta 1 mL ekleyin (reaktifler tarifte ' tablo) her şey altı-şey kültür yemekleri.
    3. Yer bir kültür steril forseps kullanarak her kuyuya yerleştirin. Hava kabarcıkları ekleme ve kültür orta arasında kaçının.
      Not: para ve çevre kaydetmek için bu kültür ekler yeniden kullanmak mümkündür. Bu kapsamlı distile H 2 O (dH 2 O) durulama tarafından yapılabilir kuluçka % 70 ardından alkol yeniden kadar 24 saat en az. Bir hücre kültür plaka ultraviyole (UV) 15-30 dk. için ışık altında ekler yeni kültür için hazırlanırken, Kuru
    4. Yer iki (steril ve kuru) konfeti her kültür ekler. Konfeti en az örtüşme almak için ekler kenarlara doğru yerleştirin.
    5. Hücre kültür kuluçka %5 CO 2 37 ° C'de plakaları koymak.
  4. Kabarcık soğuk diseksiyon orta (reaktifler tarifte ' tablo) ile bioxide gaz (% 95'i O 2 /5%CO 2). Çözüm steril tutmak için tüp gaz silindir steril enjektör filtre (0,22 µm gözenek boyutu) bağlanmak.
    1. Çift öteki son-in belgili tanımlık tenkıye filtre steril tüp için steril cam pipet bağlı. Cam pipet çözüm içinde yer, parafilm ile kapak ve gaza açın. Diseksiyon orta buz üzerinde tutmak
  5. Diseksiyon/Dilimleme alan hazırlamak.
    Not: İdeal olarak, bu yordamı steril bir mahallede yapılmalıdır. Bu mümkün değilse, vibratome bir tezgah üzerinde bırakılabilir. Bu durumda, bu saç net ve yüz maskesi kullanmak için tavsiye edilir.
    1. Bir tek uçlu tıraş bıçağı kullanılarak kesme bir dikdörtgen parça özel jel (yaklaşık 2 cm x 0.5 cm) (reaktifler tarifte ' tablo) ve vibratome bıçak uzun yüzü öyle ki bu vibratome sahneye tutkallayın.
    2. Temiz tüm yüzeyler ve %70 alkol ile vibratome parçaları ve autoclaved doku mendil ile silin.
      Not: Bu alkol hücreleri zarar verebilir beri beyin dokusu ile temas halinde olacak tüm parçaları tamamen kuru olduğundan önemlidir.
    3. Steril bir jilet vibratome için iliştirin ve vibratome bu işlevi varsa titreşim denetimi yap.
    4. Yer autoclaved diseksiyon araçları ile birlikte autoclaved doku başlıklı mendil, dört küçük Petri yemekler, yuvarlak kenarlı neşter, kauçuk ampuller, iki open-end cam Pipetler (bkz: pt. 1.1) ile 2 cam Pipetler ve süper yapıştırıcı (alkol ile püskürtülür).
    5. Vibratome tekne ve dört küçük Petri yemekler içine kabarcıklanma diseksiyon orta dökün.
      Not: Şu andan itibaren orta değil bubbled veya buz üzerinde tutulur beri bu adımı yalnızca hemen önce diseksiyon yapılmalıdır
  6. Teşrih ve mount beyin.
    Not: sağlıklı dilimleri elde etmek için bu adımı ve hassas yapılması gerekir. Biraz pratik gereklidir.
    1. Neckor yerel esaslarına göre çıkığı tarafından hayvan #1 ötenazi ve büyük makasla başını kesmek.
    2. Kullanma küçük, keskin makas yeniden, hızlı bir şekilde cilt burun boyun sagittal bir kesi yaparak çıkarın ve bir kenara çek kafatası ortaya çıkarmak için.
      1. Tarafından yanal insizyon frontal kemik ve lamboid dikiş (cerebrum ve beyincik arasında sınır) iç parçası üzerinde takip sagittal dikiş boyunca kesin.
      2. Forseps açık eğmek için kafatasının her iki tarafta kullanın. Kranial sinirler beyinden beyin ventral yan altında yuvarlak, keskin bir spatula ekleme ve yavaşça spatula yanal hareket kesiliyordu.
    3. İçin beyincik rostral kesilmiş bir koronal yapmak için bir tek uçlu jilet kullanın.
      Not: Bu kesik hangi dilimler kesin açısını belirler. Bu nedenle, bir düz açıyla yapılması gereken.
    4. Beyin kafatası ve diseksiyon orta içeren bir küçük Petri flip.
    5. Yinele adımları 1.6.1.-1.6.4. hayvan #2 ve yer için ikinci bir Petri bu beyinde çanağı.
      Not: Hayvanlar steril değildir. Diseksiyon başlık bir tarafında gerçekleştirmek ve beyni kafatasından kaldırılmış bir kez daha sonra diğer, temiz kayar mı.
    6. Değiştirmek eldiven.
    7. Ekle beyin vibratome aşamasına: süper yapıştırıcı ince bir tabaka takılı özel jel önünde sahne alanı ekleyin. Beyin #1 büyük düz spatula ile taze kesilmiş (Kaudal) ile yan tutun spatula ve ventral yan bakan dokunmadan (ve mümkün olduğunca yakın) özel jel.
      1. Sonra yavaşça beyin tutkal üzerine spatula ile bir dizi forseps kapalı iterek yerleştirin. Beyin #2 için yeterli alan bıraktığınızdan emin olun.
        Not: Bu kesim engel olarak beyin de sahne ama aşırı tutkal, bağlı olduğu önemlidir.
    8. Sonra hemen montaj beyin #1 büyük spatula diseksiyon orta beyin üzerine birkaç damla eklemek için kullanın. Bu beyin nemli tutmak tutkal sertleşmesine ve beyin taraf için yapışmasını önlemek.
    9. Tekrar adım 1.6.7 ve 1.6.8. beyin #2 için.
    10. Vibratome tekne sahneye takın.
  7. 230 µm kalınlığında koronal dilim bir genlik ile 1-1.5 mm, 85 Hz frekans ve 0.2 mm bir hız kesme/s. toplamak dilimleri arasında yaklaşık 1.4 mm rostral ve 2.1 mm Bregma için Kaudal. Her dilimin open-end cam Pipetler (pt. 1.1) kullanarak kestikten sonra
    1. toplamak dilimleri. Dilimleri diseksiyon orta içeren bir Petri kabına aktarın. İki hemisferlerin bölen iki parçaya dilimleri kesmek için yuvarlak bir neşter kullanın.
  8. Tüm dilimler kestiğinizde, kültür yemekleri dilimleri yerleştirin.
    1. Kültür çanak (bir zaman) dışında da kuluçka alın.
    2. Open-end cam Pipetler kullanarak dikkatli bir şekilde transfer bir dilim her konfeti.
      Not: Dilimleri düz ortasında konfeti ara vermeliyiz. Bu biraz beceri gerektirir. Bazı dilimleri mükemmel değildir, ancak, tüm dilimler kuluçka makinesi mümkün olduğunca çabuk almak önemli olduğu gibi onları taşımak zaman harcamak daha onları bırakmak daha iyi olur.
    3. Yavaşça dilimi dokunmadan aşırı orta kaldırmak için bir cam pipet (sivri uç) kullanın.
      Not: Dilimleri sıvı kuluçka sırasında dalmış değil. Böylece, dilimleri (orta ince bir film hala dilimleri kapsayacak) havaya maruz öyle ki aşırı orta emişli gerekir. Sıvı içinde dalmış kalır dilimleri genellikle sağlıksız veya ölmek (4 ve gözlemlerimiz).
    4. Tüm konfeti bir kez tek bir dilim bulaşık kuluçka makinesi içeri taşıyın.
    5. Tekrar adımları 1.7.8.-1.8.4. yemek #2 için.
  9. Kültür orta değiştirin.
    Not: Bu gün (gün 1 in vitro DIV1) Dilimleme sonra yapılmalıdır ve sonra 2-3 günde.
    1. Onceden kültür orta bir su banyosu veya kuluçka makinesi.
    2. Steril bir başlık, vakum emme veya düzenli bir pipet steril ucu ile her şey kültür ortamından Aspire için kullanın. Bu yavaşça çanak (yaklaşık 30 derece) devrilme ve pipet ucu kültür Ekle kenarında yerleştirerek yapılır.
    3. (Orta kaplı Ekle alt tutmak için yeterli orta bırakarak) her şey yaklaşık 800 µL kaldırın. O zaman, temiz bir pipet kullanarak, Önceden ısıtılmış orta 800 µL her şey için ekleyin. Bulaşıkları geri hücre kültür kuluçka makinesine görüntülenmemesini.

2. Viral iletim

  1. satın almak ya da yapmak AAVs ile ilgi, 10 , 11 daha önce açıklandığı gibi bir plazmid.
    Not: Bu protokolü açıklar AAV serotip 2/8 (AAV 2/8) mitokondrial taşıyan dsred veya GFP miyelin temel protein organizatörü 12 transkripsiyon kontrolü altında bir muhabir gen olarak hedef (AAV2/8 MBP_mito_dsred veya AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) oligodendrocyte mitokondri görselleştirmek için. AAV 2/8 GFP ya da tdtomato olarak genel CAG düzenleyici tarafından tahrik muhabir gen taşıyan (AAV 2/8 CAG_GFP veya AAV 2/8 CAG_tdtomato) oligodendrocyte sitoplazma görselleştirmek için kullanılır. Böylece, AAV2/8 MBP_mito_dsred AAV 2/8 CAG_GFP ile kombinasyonu verir kırmızı mitokondri ve yeşil sitoplazma oligodendrocytes, AAV2/8 MBP_mito_GFP ve AAV 2/8 birleştiren ise yeşil mitokondri ve kırmızı sitoplazma CAG_tdtomato verir. Yapıları içinde açıklanan daha ayrıntılı başka bir yerde 13.
  2. Gün 7 tüp bebek (DIV7), AAVs ile oligodendrocytes transduce.
    Uyarı: AAVs ile çalışmak için güvenlik kuralları izleyin. Uygun eğitim ve biyogüvenlik düzeyi onay gerekli olduğundan emin olun. Aşağıdaki noktaları eldiven ve önlük kullanarak bir sınıf II Biyogüvenlik dolapta yapılmalıdır. AAV uygulama korteks alanı dilimler için bu en iyi kurtarma göründüğü alana kadar burada anlatılan.
    1. Dilute AAV Önceden ısıtılmış (37 ° C) olarak kültür orta. Dilutions 2 × 10 9 genom kopya/mL (GC/mL) etrafında dilimi içindeki tek hücreleri görüntüleme sağlayan bir seyrek iletim, oligodendrocytes almak için tavsiye edilir. Ancak, farklı titreleri kullanarak bir pilot belirli deneyler için uygundur transduced oligodendrocytes yoğunluğunu sağlamak için yapılmalıdır. İki farklı AAVs kullandıysanız, onlar aynı çözüm içinde karışık olmalı ve aynı anda dilimi eklendi.
    2. Ekle yaklaşık 1.3 µL seyreltilmiş AAV her dilim için: pipet ucu dışarıda kuru olduğundan emin olun. 1.3 µL pipet AAV seyreltilmiş ve korteks, yukarıda pipet pipet ucu (yaklaşık 1 mm uzakta) ile dilim dokunmadan mümkün olduğunca yakın tutun.
    3. Daha sonra yavaş yavaş çözüm pipet dışarı itin. Çözüm dilimi dokunduğunda, pipet ucu çözüm tüm korteks alana yayılmış korteks üzerinde hareket ettirin.
      Not: Bu yordam dilimlerini dışarı mahalle için gerekli daha uzun tutmak önlemek için mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır. Bunu bir tabak üzerinde zaman ve ilk tabak çanak #2 başlamadan önce geri da kuluçka makinesine koy. Doku zarar bazı uygulama ve sabit bir el gerektirir olmadan AAV tatmin edici bir dağıtım almak için.
  3. Hücre laboratuarda bir dik Floresans mikroskobu varsa, protein ifade süre kültür içinde mikroskop altında yemek vermek suretiyle kontrol edilebilir.
    Not: Bulaşık kuluçka makinesi dışında 2-5 dakikadan fazla tutulmalıdır değil.

3. Hızlandırılmış görüntüleme

Not: görüntüleme her floresan işaretleri ifade düzeyde yeterli ve dilimleri sağlıklısın gerçekleştirilebilir (genellikle DIV11-14).

  1. Kabarcıklanma yansıma çözümü ısıtılır ve böylece girin ve banyo çıkmak mikroskop, perfüzyon ve Isıtma doğru ayarlandığından emin olun.
    Not: Banyo Odalar için çeşitli çözümler mevcut. Basit bir versiyonu burada sunulmaktadır.
    1. Olun içinde - ve çıkışları banyo taraf için blu-çakmak/eğlenceli çakmak tarafından eklenen körelmenin şırınga iğneleri ~ 45 ° (bent) tarafından Bath.
    2. Boru Peristaltik pompa Isıtma boru ve sonra giriş şırınga iğne banyo Kalorifer Ünitesi ile üzerinden sürekli kabarcıklanma yansıma çözümü bir şişe gider.
    3. Başka bir tüp şırınga iğne prizine takýn. Bu tüp sonra Peristaltik pompa yoluyla ve geri çözüm görüntüleme (veya atık şişe) şişe gider.
  2. Çözüm Imaging kabarcık (reaktifler tarifte ' tablo) ile bioxide gaz.
    Not: Bu sta olmalıdırrted en az 15 dakika önce görüntüleme ve deney boyunca devam.
  3. Dönüş Peristaltik pompa ve ısıtıcı ve çalışma solution'ı en iyi banyo sıcaklığı (37 ± 0,5 ° C) elde etmek için banyo. Sıcaklık birimine bağlı termometre sensörü banyo çözümde batık olun.
  4. Mikroskop, floresan lamba ve uygun lazerler açın.
  5. Kümesi kadar uygun bir ışık yolunu örnek.
    Not: Bu mikroskop kurulum ve yoklama bağlı olarak değişir. Confocal mikroskop kullanmak hakkında genel bilgi gereklidir ve burada ele değil.
  6. Uygun büyütme ve sayısal diyafram (n.a.) ile bir su daldırma hedefi kullanın. 40 x su daldırma planı-apochromat amaç (n.a. 1.0) kullandığımız.
  7. Açık iğne deliği yaklaşık 2-2.5 µm hızlandırılmış video için optik bir bölümünü elde etmek için. Bu odak dışında sırasında hızlandırılmış taşıma mitokondri azaltır.
  8. Transfer organotypic dilim banyo için:
    1. görüntüleme çözümü veya kültür orta bir damla küçük bir plastik Petri kabına ekleyin.
    2. Steril bir başlık, bir organotypic dilim membran aktarmak için kullanmak steril forseps eklemek için açılan. Forseps sadece konfeti ve dilim dokunmamalı.
    3. Kapak Petri kabına koyun.
    4. Hemen dilimler kuluçka makinesi olarak geri kalanını içeren kültür yemek koymak.
    5. Mikroskop dilime içeren getirmek Petri kabına.
    6. Dilim mikroskop Kaplıcalar'a transfer ederken Peristaltik pompa kapatmak açmak. Öncelikle, forseps Petri kabına dilimden (konfeti yüzer olacak) banyo üst konfeti kaldırmak için kullanın. O zaman dilimi dokunmadan konfeti dokundukları her iki tarafta konfeti forseps iki uçları yerleştirin ve konfeti çözümü üzerinden banyo altına itin. Banyo ortasında konfeti Merkezi.
    7. Dilim dokunmadan üzerine konfeti hold-down çapa (ARP) yerleştirmek için kullanım forseps.
      Not: Bir harp yüzen veya banyoda sürüklenen dilim önlemek için kullanılan bir at nalı şeklinde Platin noktadır. Akut dilimler için ince dizeleri ARP bir kenarından diğer (bir müzik harp benzeyen) çalıştırın. Organotypic dilimler için ARP stringless olmalı ve böyle bir şekilde bu dilimi dokunmadan üzerine konfeti düzenleyebilirsiniz konfeti boyutuna uygun.
    8. Peristaltik pompa yeniden açın.
  9. Amaç örnek aşağı düşürmek.
  10. Hücre ve görüntü bölgesine seçin.
    Not: Bu hücre toksisite neden olabilir gibi ışık lazer hücrelerinin aşırı maruz önlemek (ipuçları noktaları aşağıda bakınız).
    1. Doğru ifade ile sağlıklı görünümlü oligodendrocyte bulmak için göz mercekleri ve floresan lamba kullanır. Genellikle, floresan protein güçlü bir overexpression var oligodendrocytes sağlıksız görüntülenir. Sağlıksız oligodendrocytes süreçleri boğum bir görünüme sahip olacak ve mitokondri parçalanmış görünecektir. Sağlıklı oligodendrocytes içinde soma ve işlemler düzgün görünür ve mitokondri var çeşitli uzunluklarda (her ne kadar genellikle çok daha kısa, sinir hücreleri ve astrocytes 13 ,- 14 , 15).
    2. görüş alanı ortasında ilgi yerleştirin.
    3. Kullanım " canlı " işlev (Leica ve Zeiss mikroskoplar için) yazılım hücrenin üstünde belgili tanımlık perde belirlemek ve ilgi, Örneğin, bir alan bir parçası birkaç birincil işlemler veya miyelin kılıf veya tek bir işlem içeren hücreyi seçin veya miyelin kılıf.
      Not: işlemler/kaplamalar kadar mümkün olduğunca görüntü edebilmek için nispeten yatıyordu işlemleri içeren alanları düz x-y yönde seçin.
    4. İlgilendiğiniz alanı yakınlaştırmak (genellikle 0,14 - piksel boyutu ile bir görüntü üreten 0.30 µm).
    5. Kullanma " bölgeler " aracı, alanın çevresinde bir dikdörtgen çizin ve yalnızca seçili bölge inceden inceye gözden geçirmek için seçeneği seçin. Zaman ve böylece lazer pozlama, tarama yalnızca seçili bölge tarayarak düşürülür.
      Not: Yatay dikdörtgen bölgeler daha kısa gerekli taranan satır sayısı nedeniyle dikey bölgeleri daha hızlı taranacaktır. Eğer dikey dikdörtgen bölge inceden inceye gözden geçirmek, scanning zaman tarama alanı (Döndürme aracı kullanarak), 90 derece döndürerek azaltılabilir.
  11. Ayarlama lazer güç ve kazanç mitokondri iyi bir görünüm elde etmek için.
    Not: gerekli en az lazer güç kullanın. Mümkünse, artan lazer güç yerine kazanç açın. Hücre toksisite neden ek olarak, çok yüksek lazer gücü görüntülü nesneleri zaman içinde böylece bir artış daha lazer güç gerektiren çamaşır suyu veya tarama sırasında kazanmak. Gerekli lazer güç ve kazanç ifade düzey ve mikroskop bağlı olacaktır. Bir LSM700 confocal mikroskobu ile 555 nm lazer gücü 20-40 µW görüntü dsred için kullandığımız veya tdtomato ve 488 nm lazer 20-30 µW at GFP (lazer güç amaç arka diyafram açıklığında ölçülen) görüntü için kullanılır. Genellikle kazanç 700-800 GFP ve 850-980 dsred ve tdtomato için skalasında canlı görüntüleme için yüksek ayarlanır. Yüksek kazanç (uzaklık değerleri genellikle 0 ve 15 arasında yatıyordu) dijital ofset artırarak kaldırılır biraz daha fazla arka plan gürültü neden olabilir. Deneyim, MBP_mito_GFP kullanarak bir daha iyi sinyal-gürültü MBP_mito_dsred daha verir.
  12. Select inceden inceye gözden geçirmek hız.
    Not: tarama süresini hızlı bir tarama hızlı ve küçük bir tarama bölgenin çizim en aza indirmek (bkz: 4.10.5 aşağıdaki üzerine gelin). Bir çift yönlü tarama gerçekleştirerek zaman tarama kaydetmek mümkündür. Ancak, bu yoksul görüntü kalitesi nedeniyle önerilmez.
  13. Kümesi sıklığı ve hızlandırılmış kayıt, örneğin yakalama yansımaları her 2 saniyede oligodendrocytes mitokondri görüntüleme için 20 dakika olmak üzere toplam süresi.
    Not: Sıklığı ve süresi nesneleri ilgi hareketliliğini göre ayarlamanız gerekir. Yüksek sıklığı daha ışık lazer numune neden olur, ancak daha hızlı hareketli nesneler de hızlandırılmış videoları (örneğin mitokondri daha sık ve mitokondri içinde daha çok daha yüksek bir hızda hareket nöronlar içinde kısa bir toplam süresi gerektirir 2 Toplam 16 dakika için oligodendrocytes, genellikle her saniye görüntüsü).
  14. Hızlandırılmış kayıt başlatmak.
    Not: Mitokondri odak dışında hareket ve/veya kayıt sırasında görüntülü bölge dışına kayması. Titreşim ve hareketi en aza indirmek için içinde - ayarlayın ve çıkışları Bath ve gerekirse pompa hızını düşürür. Odak genellikle hala küçük değişiklikler gerçekleşir. Böylece, sürekli ekranda görüntüleme sırasında izlenmesi, odak ufak değişiklikler kayıt sırasında ile gereklidir.
  15. z yığını bütün hücre hücre gelecekteki tanımlanması için esir alma ve işlem görüntüsü.
    Not: daha iyi çözünürlük için iğne deliği ve sondaj 1 havadar birimine z-yığınının sıfırlanması.
  16. İsteğe bağlı: günahı miyelin görselleştirmek.
    Not: (sitoplazmik) GFP ile transduced oligodendrocytes içinde miyelin kılıfı genellikle düz çizgiler sitoplazma (sitoplazmik sırtlar), bir birincil işlemi için (bkz: 2 şekil A ve B) bağlı olarak tanımlanabilir. Ancak, GFP ifade çok zayıfsa veya sitoplazmik işaret kullanılmaz, miyelin kılıf confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından burada açıklandığı şekilde görselleştirmek mümkündür.
    1. Yazılım ile lazer uyarma 488 adlı yeni bir ışık yolu ayarlayın nm ve yakalama yayılan ışık aynı dalga boyu, örneğin 470-500 nm.
    2. Ayarlama lazer güç ve miyelin görünene kadar kazanç (örneğe bakın < güçlü sınıfı = "XFig "> şekil 3). Bir LSM 510 Meta mikroskop kullanarak, genellikle (amaç arka diyafram açıklığında ölçülür) 7-12 µW lazer gücünü kullanın.
  17. İsteğe bağlı: dilimleri hazırlanması immunostaining.
      Görüntülü cep immunostaining sonra tanımlanması gerekir Eğer
    1. hücre düşük büyütme resim (10 x) yakalama ve bir ok çizerek yerini görüntü göstermek veya benzer. Algılama hücrenin yardımcı olmak için bu aynı zamanda el ile hücrenin konumunu gösteren tüm dilim çizin önerilir.
    2. Saptamak için 1 saat içinde oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde (PFA) üzerinde shaker içinde dilim.
      Dikkat: PFA zararlıdır. Koruyucu giyim ve sadece havalandırılmış bir mahallede kullanır.
    3. 1:10 PBS sabitleştirici sulandırmak ve başka bir yerde 17 açıklandığı gibi immünhistokimya başlangıç kadar 4 ° C'de bırakın.
      Not: dilimleri seyreltilmiş sabitleştirici birkaç hafta sol rağmen Floresans yavaş yavaş. İmmünhistokimya fiksasyon 10 gün içinde performans önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kültürlü ve yukarıda açıklandığı gibi transduced Organotypic beyin dilimleri kortikal oligodendrocytes mito_dsred ve GFP ifade seyrek bir dağılım gösterdi. Immunostaining Olig2 ve MBP karşı antikorlar ile ifade oligodendrocytes (şekil 1) belirli olduğunu doğruladı.

Canlı görüntüleme için transduced oligodendrocytes (şekil 1 ve şekil 2A) paralel olarak çalışan birkaç miyelin kılıf karakteristik onların morfolojisi tarafından kabul. Transduced oligodendrocytes zaman hata görüntüleme gerçekleştirerek, mitokondri birincil süreçleri ve miyelin kılıfı (şekil 2B-D) hareketi izlemek mümkündür.

Düşük GFP ifade ile hücrelerde, miyelin kılıf canlı görüntüleme sırasında örneği 488'aydınlatıcı tarafından teşhis edilebileceğini nm ve yayılan yakalayan ışık 470-500 nm (şekil 3A). Bu Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tekniği de çalıştı PFA sabit ve immunostained doku, miyelin çıktı dimmer (şekil 3B-C) kaplamalar olmasına rağmen. Miyelin temel protein (MBP) karşı antikor ile immunostaining tarafından miyelin kılıf döşeme % 100 yakın yatay (tarafından ok uçları, şekil 3B-Cbelirtilir) görüntüleme uçağa bulduk miyelin kaplamalar ise çekirdek ile görülebilir o yatıyordu dikey (tarafından yıldız, şekil 3B-Cbelirtilir) görüş alanı olarak daha az veya hiç de görünür vardır. Neredeyse tüm internodes görselleştirildiği rağmen birçok internodes görünür değil varlık kılıf (3A şekil Ekle) küçük bir kısmı ile kesintili, görüntülenir. Bu küçük "boşluklar" miyelin yanında düşsel üç tamamlayıcı dalga boylarında, sözde Puan9ile doldurulabilir.

Figure 1
Resim 1 : İmmünhistokimya MBP-mito-dsred seçmeli olarak Olig2 ve MBP için bağışıklık olumlu olan oligodendrocytes, ifade onaylar.  Transduced (AAV2/8) ile MBP-mito-dsred (kırmızı, mitokondrial marker) ve CAG-GFP (yeşil, sitozol) kültürlü fare beyin dilimleri yeni korteksimiz görüntülerdir. Dilimleri miyelin marker miyelin temel Protein (MBP, mavi) ve Olig2 için immunolabeled idi (oligodendrocyte silsilesi hücre nükleer marker, macenta). (Şekil başvuru13güncelleme) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Oligodendrocytes mitokondrial hareketi izlemek için hızlandırılmış Imaging. Z-yığın (optik Bölüm 10,35 µm) oligodendrocyte MBP_mito_dsred (kırmızı mitokondri) ve CAG_GFP (yeşil floresan) ile transduced(a)projeksiyon. (B) tek confocal görüntüsü (optik Bölüm 1.04 µm) aynı hücreyi. Kare zaman hata görüntüleme (C) için seçilen bölge gösterir ve kymographs (kym) yapmak için (D) çizilmiş satırları gösterilir. (C) imge--dan a hücrenin hızlandırılmış kayıt ve farklı zaman zamanlarda alınan B. Hareketli mitokondri belirtilen (Kırmızı oklar) vardır. Yörüngeler dan (D) Kymographs (B) gösterilir. Sabit mitokondri düz dikey çizgiler olarak görülür ve hareketli mitokondri çapraz çizgiler görülmektedir. Kymographs ve (C) zaman ders Albümdeki görüldüğü gibi yalnızca mitokondri Kymograph 1 (Kym 1) işaretli birincil süreç içinde hareket ediyor. Mitokondri içinde diğer üç kymographs hızlandırılmış kayıt sırasında sabit vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından günahı miyelin görselleştirme. Z-yığından (optik Bölüm 10,35 µm) yeni korteksimiz bir canlı organotypic beyin dilim(a)projeksiyon. Burada gösterilen (yeşil hücre vücut) oligodendrocyte GFP ifadede çok için birincil süreç ve miyelin kılıf tanımlama karanlık. Bunun yerine, miyelin kılıf 488 nm, uyarma ve 470-500 nm (magenta içinde gösterilmiştir) yakalama verilmiş ışık tarafından görüntülenmiştir. GFP + oligodendrocyte sitoplazma zengini paranodes bazıları miyelin internodes (oklar) ipuçları görülebilir. Ekle: Büyütülmüş kısmını miyelin kılıf çekirdek ile görüntülenmiştir miyelin görünür "düzensiz" veya kesintili gösterir (bkz: ayrıntılı bilgi için ana metin). (B-C) Confocal görüntülerini striatum (B) ve stratum radiatum Hipokampus CA1, (C) Akut fare beyin dilimlerden %4 PFA ve immunostained miyelin temel protein (MBP) için sabit olmuştur. Görüş alanı için (yıldızlar) dik kaplamalar genellikle görünür değildir, ancak yatay miyelin kılıfı (ok uçları) çekirdek ile görülebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Reaktifler tablo: Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan organotypic kültürler yapmak için De Simoni ve Yu (2006)5tarafından açıklanan Protokolü'nün bir anlam değiştirici yorum18 iletişim kuralıdır. En önemli değişiklikler aşağıda açıklanan olmuştur. Tris arabellek dilimleri dışında da kuluçka viral iletim sırasında yaşama ve hücre orta değiştirerek geliştirir kültür ortamına eklenir. Sterilizasyon yordam konfeti için de değiştirilir. Diğer protokoller konfeti tarafından ısıyla sterilize iken, konfeti kıvırmak için birkaç neden olur çünkü biz bu tavsiye etmiyoruz. Bunlar üzerinde yetiştirilen dilimleri daha az sağlıklı olma eğilimi gibi kıvrılmış konfeti kullanmaktan kaçının. Bizim protokol fareler kullanır, değil fareler ve korteks hipokampüs, yerine kültür için modifiye biz bulmak de ince dilimleri (230 µm vs 300 µm) ile çalışır. Doğum sonrası gün yaklaşık 10-20 fareler ve sıçanlar19, kültürler içinde yapılmış myelination doruklarına gibi fareler p7-9 (ve ardından kültürlü 11-14 gün) myelinating oligodendrocytes çalışmak için en uygun değildir. 11-14 gün tüp bebek, kültürler kompakt miyelin kılıf13ile birkaç olgun oligodendrocytes içerir. Genç farelerde yapılan kültürler daha az olgun oligodendrocytes kültür dönemin sonunda içerir, kültürler büyük fareler yapılmış ise sağlıklı20tutmak için daha zorlu göstermiştir.

Organotypic dilim yapmak için yordamı birkaç kritik adımları içerir. Diseksiyon ve beyinlerinin montaj yanı sıra dilimleri konfeti, üzerine yerleştirerek yapılması gereken hızlı ve biraz beceri gerektirir. Genelde organotypic dilim kültürler yaparak ilk deneme daha az başarılı, ancak 2-3 mermi pratik sağlıklı kültürler kurmak için gerekli beceriler elde etmek için yeterli olacaktır. Steril bir ortam kültürlerin kirlenmesini önlemek için yordam boyunca tutmak önemlidir. Ayrıca, canlı hücreler ile çalışırken, bu her zaman doğru pH ve osmolalite hücre sağlığını korumak için çözümler sağlamak için zorunludur. Olduğunu, bu nedenle, osmolalite (270-310 mOsm/kg olmalıdır) ve özellikle ilk kez deneme yaparken dilimleri üzerinde kullanılan tüm çözümler pH kontrol etmek için iyi bir tavsiye. Organotypic kültürler için kültür ve diseksiyon çözümler pH göstergesi (fenol red) içerir, ama kültür orta sarı serum daha düşük bir izlenimi verebilir daha gerçek pH. Kültür orta penisilin, streptomisin ve nistatin enfeksiyon olasılığını en aza indirmek için içerir. Bu nedenle bu antibiyotikler ve antimycotics organotypic dilim kültür Teknik laboratuarda ayarlarken kullanmak için tavsiye edilir, ama uzman aseptik teknik uygulandığında daha sonra önlenebilir. Hücre canlılığı değerlendirmek için hücre morfolojisi geçerli protokolünü kullanır. Daha nicel bir muayene için dilimleri propidium iyodür veya açıklandığı gibi benzer Boyar maddeler ile başka bir yerde21yüklenebilir. Ancak, propidium iyodür emisyon spektrumu dsred, tdtomato ve diğer kırmızı göstergeleri ile çakışıyor farkında olmak önemlidir. Başka bir propidium iyodür ve benzer Kimyasalları onlar kolayca böylece hücre canlılığı hücreleri5üst tabakası için değerlendirilmesi sınırlayıcı dilim, derin katmanları girmeyin kısıtlamasıdır.

Gen teslim edilmek üzere çeşitli yöntemler bulunmaktadır. AAV iletim organotypic dilim kültürlerin organelleri görselleştirmek için kullanmanın ana avantajları aşağıdaki gibidir: AAV iletim için postmitotic oligodendrocytes non-viral transfection yöntemleri22ile karşılaştırıldığında daha iyi başarı oranına sahiptir. Ayrıca, organotypic kültürlerde tüm beyin hücre türlerinin bulunduğunu ve kompakt miyelin13de dahil olmak üzere bu görülen vivo içindeiçin benzer bir Morfoloji oligodendrocytes var. Bu hangi aksonlar ile iletişim eksikliği ve böylece kompakt miyelin yapmazlar Monokültür içinde oligodendrocytes farklıdır. Vitro Imaging vivo içinde ile daha kolay karşılaştırılır ve mitokondri gibi küçük organelleri Imaging zaman özel ilgi olan bir daha iyi Uzaysal çözünürlük, sunmaktadır. Gelecekteki araştırma görüntü vivo içindeama lipid zengini miyelin kılıf tarafından neden olduğu optik anomalileri ile büyük bir meydan yüzler amacı olacak. Ayrıca, AAV serotip tropism ve organizatörü özgüllük arasında in vivo ve in vitro koşulları13,23farklı olabilir. Burada sunulan iletişim kuralında, AAV2/8 MBP_mito_dsred ve AAV2/8 MBP_mito_GFP oligodendrocyte mitokondri görselleştirmek için kullanılır. AAV serotip 2/1 de MBP_mito_dsred ile test edildi ama oligodendrocytes (gösterilmez) organotypic dilimleri içinde daha düşük bir sayı bulaşmış. AAV2/8 CAG_GFP ve AAV2/8 CAG_tdtomato oligodendrocyte sitoplazma görselleştirmek için kullanıldı. Genel CAG organizatörü istimal bu için rağmen AAV 2/8 CAG_GFP ve CAG_tdtomato seçmeli olarak enfekte oligodendrocytes, yalnızca az sayıda astrocytes ve varlık bulaştırmak nöronlar ile (bunlar kolayca onların karakteristik Morfoloji tarafından belirlenmiştir). Bu seçicilik oligodendrocytes için muhtemelen AAV 2/8 serotip24tropism nedeniyle var. Ancak, ifade, organel hedefli için daha yüksek hücre özgüllüğü MBP - elde veya diğer oligodendrocyte özgü rehberleri tavsiye edilir. CAG_GFP ile tarafımızca test diğer serotipleri AAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, en hangi esas olarak sinir hücreleri ve astrocytes (gösterilmez) enfekte edildi.

Yapý ve deneysel koşullar bağlı olarak, hücre iletim değişiklik gerekli olacaktır. Transduced hücreler çok karanlık görünür, daha uzun bir zaman vitro hedefidirler sonra ifadeyi artırmak için deneyin. Hücreleri parlak ama sağlıksız görünüyorsa azaltmak belgili tanımlık zaman iletim sonra. Çok az sayıda hücre transduced AAV konsantrasyonu artırılabilir. Ancak, iletim sonra tüp bebek zaman çok uzun ve transduced hücreleri öldüğünü mümkündür. Burada kullanılan yapıları için ifade düzeyleri en iyi 4-6 gün sonra iletim olduğunu. 7-8 gün sonra iletim, hücreler daha az sağlıklı, boğum oluşum ile ortaya çıktı ve 10 gün sonra iletim, yalnızca bir kaç transduced hücreleri (gösterilmez) görünür.

Bu iletişim kuralı bir dik mikroskop organotypic dilimleri canlı görüntüleme için kullanır. Bu en düşük mono farklıdır- ve genellikle ters bir mikroskop kullanır ortak kültürler. Dilimleri sonra muhtemelen daha az sağlıklı olmak dilimleri neden yukarı, bakacak konfeti ile açık olması gerekir çünkü bir ters mikroskobu burada kullanmak için suboptimal. Bir dik mikroskop avantajı Elektrofizyoloji eklemeye imkanı vardır. Ayrıca, orta değiştirmek için bir pompa kullanımı uyuşturucu çözümleri kolayca eklenebilir ve hızlandırılmış görüntüleme sırasında kaldırılmış olduğunu anlamına gelir. Titreşim ve banyoda akımları nedeniyle odak bakımını yapma sorunları pompa ile bir dezavantajdır. Mikroskop altında hücrelerin yavaş yavaş olacak daha azsağlıklı. Bu nedenle dilimleri en fazla 1 saat için mikroskop altında tutuyoruz. Görüntülü dilimleri (özel atık) atılır. Görüntüleme koşulları en iyi durumda emin olmak için kontrol hücreleri, hangi zaten iyi mitokondrial hareketi karakterizedir, görüntüleme paralel olarak çalıştırılması gerekir. Transducing 2/1 Syn_mito_dsred (hangi dsred nöron özel synapsin düzenleyici tarafından ifade sürülür) veya AAV AAV ile örneğin, akson veya dendrites mitokondrial hareketi tarafından yansıması için 2/1 CAG_mito_dsred (immunostaining için ve ardından dilim hücre kimliğini onaylamak). Mitokondrial hareket analizi-ebilmek kılınmak içinde başka bir yerde25açıklandığı gibi ImageJ birden fazla kymograph aracını kullanarak.

Burada günahı miyelin görüntüleme sırasında canlı görüntüleme için çekirdek açıklayın. Üç uyarma dalga boylarında kullanan, skor9' la karşılaştırıldığında çekirdek sadece bir kullanır (488 nm) ve böylece uygulamak kolaydır. Puanı, her üç boyları farklı "parçalar" miyelin kılıf ve birlikte kılıf tam bir görüntü vermek ortaya koyuyor. Ayrıca, Puan miyelin kılıf yapıları sitoplazmik cepler gibi algılamak için kullanılabilir. Çekirdek içinde kullanılan tek dalga boyu ile daha az ayrıntılı bir görüş verilir ve kaplamalar toz veya kesintili görünebilir (Res. 3). Bununla birlikte, çekirdek için görüş alan yatay miyelin kılıfı % 100'ünü yakınındaki görüntüler. Bu nedenle, çekirdek miyelin kılıf tespiti için ancak miyelin yapıları ve bütünlük analizi için yararlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Acknowledgements

Biz Linda Hildegard Bergersen ve Magnar Bjørås erişim için laboratuar ve donanımları, plazmid ve virüs üretim için Janelia moleküler biyoloji paylaşılan kaynak personel ve Koen Vervaeke lazer gücü ölçümleri hakkında yardım almak için hücre için teşekkür ederim. Bu eser Norveç sağlığı Derneği, Norveç Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi ve mikroskopi ekipman Norbrain tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose  Sigma  A9539
BD Microlance 19G BD 301500 Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas AGA 105701
Brand pipette bulbs Sigma-Aldrich Z615927 Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner) VWR 89038-530
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments 64-0106  Temperature controller - thermometer part
CaCl2 Fluka 21100
CO2  AGA 100309 CO2 for incubator
Cover glass, square Corning Thermo  Fischer Scientific 13206778 To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Delicate forceps Finescience 11063-07 For dissection
Diamond scriber pen Ted Pella Inc. 54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm VWR 612-1702 Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade Electron Microscopy Sciences #7200 Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco-Invitrogen 24010-043
Filter paper circles Schleicher & Schuell 300,220 Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack Loctite 1270884 Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2 Katrin 344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber, Warner Instruments  64-1418 Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3 Sigma H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2 Heto-Holten 96004000M Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated Gibco-Invitrogen 26050-088
KCl Sigma P9541
LCR Membrane, PTFE,  Millipore FHLC0130 Confetti 
Leica VT1200 Leica 14048142065 Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES Thermo  Fischer Scientific 42360024
MgCl2 R.P. Normapur 25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B Electron Microscopy Sciences 62411-B Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit Millipore SLGPM33RA Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm Millipore PICM03050 Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module GILSON F155001 Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaHCO3 Fluka 71628
Nunclon Delta Surface Thermo  Fischer Scientific 140675 Culture plate
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC  Zeiss 441452-9900-000  Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm VWR 291-1211
Paraformaldehyde, granular Electron Microscopy Sciences #19208
PC-R perfusion chamber SiSkiYou  15280000E Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15070-063
Petri dish 140 mm  Heger 1075 Large Petri dish 
Petri dish 92x16 mm  Sarstedt  82.1473 Medium Petri dish 
Petridish 55x14,2 mm VWR 391-0868 Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417 PBS tablets
R2 Two Channel Head  GILSON F117800 Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Large spatula for dissection
Sand paper VWR MMMA63119 Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm Finescience 14130-17 Large scissors for dissection
Scissors, 8,5  Finescience 14084-08 Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade Electron Microscopy Sciences #71972 Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm Millipore SCGPT05RE Filter to sterilize solutions
Super glue precision Loctite 1577386
Surgical scalpel blade no. 22 Swann Morton Ltd. 209 Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B Warner Instruments 64-0100 Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base Sigma  T1503
Trizma HCl Sigma T3253
Water jacketed incubator series II Forma Scientific 78653-2882 Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11, (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics