Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Oligodendrocytes myélinisantes favorisent la propagation du potentiel d’action rapide et la survie des neurones. Décrit ici est un protocole pour l’expression des protéines fluorescentes dans organotypique oligodendrocyte spécifique des tranches de cerveau avec l’imagerie Time-lapse ultérieur. En outre, une procédure simple pour la visualisation de la myéline non-colorées est présentée.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kennedy, L. H., Rinholm, J. E. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56237, doi:10.3791/56237 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Les neurones dépendent de l’isolation électrique et le soutien trophique des oligodendrocytes myélinisantes. Malgré l’importance des oligodendrocytes, les outils avancés actuellement utilisés pour étudier les neurones, en partie seulement ont été prises par des chercheurs de l’oligodendrocyte. Cellule spécifique au type de coloration par transduction virale est une approche utile pour étudier la dynamique de l’organite direct. Cet article décrit un protocole pour la visualisation des mitochondries des oligodendrocytes dans des tranches de cerveau organotypique de transduction avec adeno-associated virus (AAV) transportant des gènes mitochondries protéines fluorescentes ciblés sous le contrôle transcriptionnel de le promoteur de la protéine basique de la myéline. Il inclut le protocole pour faire des coupes de cerveau de souris coronale organotypique. Une procédure de Time-lapse imagerie des mitochondries puis suit. Ces méthodes peuvent être transférées vers les autres organites et peuvent être particulièrement utiles pour l’étude des organites dans la gaine de myéline. Enfin, nous décrivons une technique facilement accessible pour la visualisation de la myéline non colorée dans des tranches de vie par microscopie confocale réflectance (CoRe). Noyau a besoin d’aucun équipement supplémentaire et peut être utile pour identifier la gaine de myéline pendant la formation image live.

Introduction

La substance blanche du cerveau se compose des axones des cellules nerveuses enveloppés dans la myéline, une plasmalemme étendu spécialisé formé par les oligodendrocytes. La myéline est nécessaire pour la propagation du potentiel d’action rapide et fiable et une survie à long terme des axones myélinisés, et une perte de la myéline peut provoquer des dysfonctionnements neurologiques. Malgré leur importance, les propriétés des oligodendrocytes sont moins connues comparées avec les neurones et les astrocytes. Par conséquent, moins d’outils ont été développés pour l’étude des oligodendrocytes.

Vivre l’imagerie des organites cellulaires tels que les mitochondries, le réticulum endoplasmatic (ER) ou différentes structures vésiculaires peuvent être utiles d’étudier les changements dynamiques dans les organites au fil du temps. Traditionnellement, l’imagerie des oligodendrocytes vivant a été réalisée en monocultures1,2. Cependant, oligodendrocytes en monoculture n’affichent pas de myéline compacte et organotypique ou tranches de cerveau aiguë peuvent, par conséquent, être une meilleure option lorsque l'on étudie le mouvement des organites et localisation. Localisation de petits organites et de protéines de la gaine de myéline peut être difficile en raison de la courte distance entre les axones myélinisés et la gaine de myéline environnante. Ainsi, lumière immunostaining microscopiques procédures seul n’ont pas la résolution spatiale d’établir une distinction entre les organites dans la gaine de myéline et ceux dans les axones myélinisés. Cela peut être résolu par transduction virale avec des gènes codant pour des protéines fluorescentes organelle ciblées grâce aux promoteurs spécifiques à un type de cellule. Les avantages sont une expression spécifique des cellules et éparse, qui permet une évaluation précise de la localisation de l’organite et dynamique. Animaux transgéniques permet également d’atteindre telle une ciblées organite spécifique des cellules expression3. Cependant, la production et l’entretien des animaux transgéniques est coûteux et habituellement n’offre pas l’expression rare qui peut être obtenue par des méthodes virales.

La méthode décrite ici utilise la transduction virale des oligodendrocytes avec mitochondrial ciblée des protéines fluorescentes (dsred ou vert fluorescent protéine GFP) conduit par le promoteur de la protéine basique de la myéline (MBP-mito-dsred ou MBP-mito-GFP) pour visualiser mitochondries dans des tranches de cerveau organotypique oligodendrocyte. En outre, l’expression d’une protéine fluorescente dans le cytoplasme (GFP utilisé conjointement avec mito-dsred ou tdtomato utilisé avec mito-GFP) est utilisée pour permettre la visualisation de la morphologie cellulaire, y compris les compartiments cytoplasmiques de la gaine de myéline. Le protocole prévoit la procédure pour faire des coupes de cerveau d’organotypique (une version modifiée du protocole décrit par De Simoni et Yu, 20064,,5). Nous décrivons ensuite la procédure d’imagerie Time-lapse pour étudier le mouvement mitochondriale. Cette procédure utilise un microscope confocal vertical avec un échange continu d’imagerie moyen, une installation qui permet une application facile de drogues ou d’autres modifications moyennes pendant la formation image. La procédure d’imagerie Time-lapse peut être effectuée sur n’importe quel microscope confocal, avec certains équipements supplémentaires pour le maintien des tranches de vie tel que décrit ci-dessous. Le protocole contient également plusieurs conseils pour optimiser l’imagerie et de réduire de phototoxicité.

Enfin, un moyen simple et rapide de visualiser la myéline non-colorées par microscopie confocale réflectance (CoRe) est décrite. Cela peut être utile pour identifier la gaine de myéline pendant la formation image live. Ces dernières années, plusieurs techniques ont été développées à la myéline image sans aucune coloration requise, mais la plupart d'entre eux nécessite des équipements et l’expertise6,7,8. La procédure décrite ici utilise les propriétés réfléchissantes de la gaine de myéline et est une version simplifiée unique-excitation d’onde de la microscopie confocale facteur de réflexion spectrale (SCoRe, dans lequel plusieurs laser des longueurs d’onde est combinés afin de visualiser la myéline) 9. coRe peut être fait sur n’importe quel microscope confocal disposant d’un laser à 488 nm et un filtre d’émission de 470-500 nm passe-bande ou un filtre accordable d’émission.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

les procédures décrites ici ont été approuvés par l’autorité norvégienne de recherche des animaux. Fournisseurs et les numéros de catalogue pour les consommables et autres requis matériel n’existe pas dans la liste du matériel à la fin du document.

1. préparation de tranches organotypique

Remarque : cette recette utilise deux souriceaux à jour après la naissance, 7-9 (7-9), qui donne 24 tranches organotypique divisés sur deux Pétri de six puits. Sauf indication contraire, toutes les procédures doivent être faites dans une hotte stérile et Gants nitril ou latex doivent être utilisés. Devraient servir uniquement cell culture des ingrédients de qualité.

  1. Bouteilles autoclave, outils de dissection (1 gros ciseaux, 1 petit ciseaux, 1 grande spatule plate, 1 petite spatule arrondie et aiguisée et 1 pince, voir matériaux liste pour plus de détails), verre pipettes, pointes de pipette et lingettes de tissu utilisés pour la préparation de tranches.
  2. Est la moitié des pipettes en verre doivent être utilisée avec la grande ouverture, se détachent l’extrémité étroite.
    1. Score avec une pointe à tracer diamant plume (si disponible) autour de la pipette juste au-dessous du point où le verre commence à rétrécir. Placez ensuite l’extrémité pointue de la pipette dans un gant de nitrile ou similaire. Soigneusement se détachent la pointe en pliant la pipette tout en le poussant contre un banc de travail.
    2. Puis émousser l’extrémité cassée en frottant sur un morceau de papier sablé ou fondre légèrement sur un bec Bunsen. Les pipettes brisés sont utilisés pour transférer des tranches de cerveau coupé avec le bout cassé transformé en la poire en caoutchouc et le grand ouvert fin toucher les solution/tranches.
      NOTE : Ceci n’est pas faire sous une hotte stérile et peut être fait plusieurs jours à l’avance.
  3. Préparer Pétri.
    Remarque : Ceci peut être fait le jour avant de le trancher ou au moins 2 heures avant de le trancher.
    1. Membranes de stériliser le polytétrafluoroéthylène (PTFE) (" confettis "). Utiliser deux pinces stériles pour supprimer confetti unique de pièces plastiques bleus environnantes et stériliser en plongeant deux fois dans une boîte de Pétri contenant 96 % d’éthanol (EtOH). Puis poser confetti plat dans une grande boîte de Petri stérile sécher.
      Remarque : Les confettis sont des membranes PTFE hydrophiles similaires aux membranes dans les inserts de culture. L’utilisation de confettis facilite l’imagerie live car seul tranches peuvent être facilement transférées de l’insert à la configuration de microscope en soulevant les confettis avec une pince (voir 4.8. pour plus de détails). Par ailleurs, les tranches de cerveau peuvent être cultivées sans les confettis (dans lequel les tranches seront fixe directement sur la membrane de l’insert de culture). Dans ce cas, l’insertion de la membrane doit être coupée avec un scalpel pour transférer la tranche au bain microscope.
    2. Ajouter 1 mL de milieu de culture (recette en réactifs ' table) dans chaque puits de la six puits Pétri.
    3. Lieu une culture insérer dans chaque puits à l’aide d’une pince stérile. Éviter les bulles d’air entre le foyer et le milieu de culture.
      Remarque : Pour économiser de l’argent et l’environnement, il est possible de réutiliser les inserts de culture. Cela peut être fait par un rinçage complet à le distillée H 2 O (dH 2 O) suivie d’une incubation dans 70 % EtOH pendant au moins 24h avant réutilisation. Lors de la préparation pour la nouvelle culture, sécher les inserts dans une plaque de culture cellulaire sous ultraviolets (UV) pour 15-30 min.
    4. Placer deux confettis (stérilisé et sec) sur chacun des inserts de culture. Placer les confettis vers les bords des inserts pour obtenir un chevauchement minimal.
    5. Mettre les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO 2.
  4. Moyen de dissection froide de bulle (recette en réactifs ' table) avec bioxide gaz (95 % O 2 /5%CO 2). Pour conserver la solution stérile, raccorder le tube de la bouteille de gaz pour un filtre de seringue stérile (0,22 µm taille de pore). Filtre
    1. couple l’autre extrémité de la seringue dans un tube stérile relié à une pipette de verre stériles. Placez la pipette de verre dans la solution, couvrir avec du parafilm et allumez le gaz. Garder le milieu de la dissection sur glace
  5. Préparer la zone de dissection/tranchage.
    NOTE : Idéalement, cette procédure devrait se faire sous une hotte stérile. Si ce n’est pas possible, le vibratome peut rester sur un banc de travail. Dans ce cas, il est recommandé d’utiliser un masque capillaire de net et le visage.
    1. à l’aide d’un grattoir à lame unique, découper un morceau rectangulaire (environ 2 cm x 0,5 cm) du gel d’agarose (recette en réactifs ' table) puis collez ceci sur la scène de vibratome tel que le côté le plus long fait face à la lame vibratome.
    2. Nettoyer toutes les surfaces et les pièces vibratome avec 70 % EtOH et essuyer avec des lingettes tissu autoclavés.
      Remarque : Il est important que toutes les pièces qui seront en contact avec le tissu cérébral soient complètement secs depuis EtOH peut endommager les cellules.
    3. Fixer une lame de rasoir stérile sur le vibratome et contrôler la vibration si le vibratome possède cette fonction.
    4. Place des outils de dissection stérilisés à l’autoclave dans la hotte avec tissu autoclavé lingettes, quatre petites boîtes de Pétri, un scalpel arrondi, 2 pipettes en verre avec poires en caoutchouc, deux pipettes de verre plate (voir PT. 1.1) et super colle (pulvérisée avec EtOH).
    5. Verser moyen de dissection propagés dans le bateau vibratome et dans les quatre petites boîtes de Pétri.
      Remarque : Cette étape ne devrait être faite immédiatement avant la dissection comme moyen à partir de ce moment n’est pas propagé ou gardé sur glace
  6. Cerveaux disséquer et Mont.
    Remarque : Pour obtenir des tranches en bonne santé, cette étape doit être faite rapidement et précisément. Certaine pratique est nécessaire.
    1. Euthanasier l’animal #1 par la dislocation de la neckor conformément aux directives locales et décapiter ensuite avec les gros ciseaux.
    2. Using small, sharp ciseaux, rapidement enlever la peau en faisant une incision sagittale du cou pour le nez et la tirer de côté pour révéler le crâne.
      1. Couper le long de la suture sagittale, suivie d’incisions latérales sur la partie intérieure des os frontaux et la suture lamboid (la frontière entre le cerveau et le cervelet).
      2. Utiliser pince à plier ouvert le crâne de chaque côté. Les nerfs crâniens sont coupés par le cerveau en insérant une spatule arrondie, forte sous la face ventrale du cerveau et doucement passer la spatule latéralement.
    3. Utiliser un grattoir à lame unique pour faire un coronale de coupure rostral au cervelet.
      Remarque : Cette coupe déterminera l’angle auquel les tranches sont coupées. Il convient, donc, de prévoir à un angle de droites.
    4. Retourner le cerveau, le crâne et dans une petite boîte de Pétri contenant le support de dissection.
    5. Répéter les étapes 1.6.1.-1.6.4. pour animal #2 et place ce cerveau dans un deuxième Petri dish.
      NOTE : Les animaux ne sont pas stériles. Réaliser la dissection d’un côté de la hotte et passer ensuite à l’autre, côté propre après avoir enlevé le cerveau du crâne.
    6. Changer de gants.
    7. Attach cerveau vibratome étape : ajouter une fine couche de colle super à l’étape juste devant le gel d’agarose monté. Maintenez le cerveau #1 avec une spatule plate grande avec le fraîchement coupées (caudale) côté touchant la spatule et la face ventrale (et d’être aussi proche que possible de) le gel d’agarose.
      1. Puis placer délicatement le cerveau sur la colle en le poussant hors de la spatule avec un jeu de pinces. Veillez à laisser suffisamment d’espace pour cerveau #2.
        Remarque : Il est important que les cerveaux sont bien attachés à la scène, mais sans colle excessive, car cela peut gêner la coupe.
    8. Immédiatement après le montage du cerveau #1, utilisez la spatule large pour ajouter quelques gouttes de médium de dissection sur le dessus du cerveau. Cela va garder le cerveau humide, durcir la colle et empêchez-le de se coller aux parois des cerveaux.
    9. Répéter les étapes 1.6.7 et 1.6.8. cerveau #2.
    10. Fixer la scène sur le bateau vibratome.
  7. Coupe 230 µm coronale tranches épaisses avec une amplitude de 1 à 1,5 mm, une fréquence de 85 Hz et une vitesse de 0,2 mm/s. tranches frais virés entre environ 1,4 mm rostrale et 2,1 mm de caudale à Bregma.
    1. Tranches frais virés après que chaque tranche a été coupé à l’aide de pipettes de verre plate (PT. 1.1). Transfert en tranches à une boîte de Pétri contenant le milieu de la dissection. Utiliser un scalpel arrondi pour couper les tranches en deux morceaux, divisant les deux hémisphères.
  8. Lorsque toutes les tranches sont coupées, déposer les tranches dans le Pétri.
    1. Sortir de la boîte de Petri (un à la fois) de l’incubateur.
    2. Utiliser les pipettes de verre plate, transvaser avec soin une tranche à chacun du confetti.
      NOTE : Les tranches doivent reposer à plat au milieu des confettis. Cela nécessite des compétences. Toutefois, si certaines tranches ne sont pas parfaits, il est préférable de les laisser qu’afin de passer de temps à essayer de les déplacer, car il est important d’entrer toutes les tranches dans l’incubateur aussi vite que possible.
    3. Utiliser une pipette de verre (bout pointu) pour retirer délicatement les excès du milieu sans toucher la tranche de.
      NOTE : Tranches ne doivent pas être plongés dans un liquide pendant l’incubation. Ainsi, les excès du milieu doit être aspiré telle que les tranches sont exposés à l’air (une fine pellicule de moyen couvre encore les tranches). Tranches de restent immergés dans un liquide seront habituellement malsain ou mourir (4 et nos observations).
    4. Déplacer le plat dans l’incubateur, une fois que tous les confettis ont une tranche.
    5. Répéter les étapes 1.7.8.-1.8.4. plat #2.
  9. Changer le milieu de culture.
    Remarque : Cela devrait être fait le lendemain de tranchage (jour 1 in vitro, DIV1) et ensuite tous les 2-3 jours.
    1. Préchauffer le milieu de culture dans un bain d’eau ou de l’incubateur.
    2. Sous une hotte stérile, utilisez aspiration sous vide ou une pipette ordinaire d’un embout stérile pour aspirer le milieu de culture de chaque puits. Cela se fait doucement basculer le plat (d’environ 30 degrés) et en plaçant l’embout de la pipette au bord de l’insert de culture.
    3. Supprimer environ 800 µL de chaque puits (en laissant juste assez moyen pour garder le fond de l’insert couvert en moyenne). Puis, à l’aide d’une pipette propre, ajoutez 800 µL de milieu préchauffé dans chaque puits. Puis replacez la vaisselle dans l’incubateur de culture cellulaire.

2. Transduction virale

AAVs
  1. achat ou faites avec un plasmide d’intérêt, comme décrit plus haut 10 , 11.
    Remarque : Ce protocole décrit l’utilisation de sérotype AAV 2/8 (AAV 2/8) transportant mitochondrial ciblé dsred ou GFP comme un gène rapporteur sous le contrôle transcriptionnel de la myéline protéine basique promoteur 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred ou AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) pour visualiser les mitochondries de l’oligodendrocyte. AAV 2/8 transportant des GFP ou tdtomato comme gène rapporteur pilotée par le promoteur général de CAG (AAV 2/8 CAG_GFP ou AAV 2/8 CAG_tdtomato) est utilisé pour visualiser le cytoplasme de l’oligodendrocyte. Ainsi, la combinaison d’AAV2/8 MBP_mito_dsred avec CAG_GFP AAV 2/8 donne mitochondries rouges et vert cytoplasme dans les oligodendrocytes, tandis que la combinaison AAV2/8 MBP_mito_GFP et AAV 2/8 CAG_tdtomato donne des mitochondries verts et rouge cytoplasme. Les constructions sont décrites en plus en détail ailleurs 13.
  2. Jour 7 in vitro (DIV7), transduce oligodendrocytes avec les AAVs.
    ATTENTION : Suivre les consignes de sécurité pour travailler avec AAVs. Assurez vous d’avoir la formation adéquate et l’approbation de niveau de sécurité requis. Tous les points suivants devraient être réalisées dans une enceinte de biosécurité de classe II à l’aide de gants et blouse de laboratoire. Ici, application de VAA à la zone du cortex des tranches est décrite, comme il s’agit de la zone qui affiche la meilleure récupération. Milieu de culture
    1. diluer l’AAV dans préchauffé (37 ° C). Les dilutions autour de 2 × 10 9 génome copies/mL (GC/mL) sont recommandées pour obtenir une transduction clairsemée des oligodendrocytes qui permet l’imagerie de cellules individuelles au sein de la tranche. Toutefois, un pilote à l’aide de différents titres devrait faire pour assurer une densité des oligodendrocytes transduits qui est appropriée pour les expériences spécifiques. Si deux AAVs différents sont utilisés, ils doivent être mélangés dans la même solution et ajoutés à la tranche en même temps.
    2. Ajouter environ 1,3 µL dilué AAV pour chaque tranche : Assurez-vous que l’extérieur de l’embout de la pipette est sec. Pipetter : 1,3 l dilué AAV et tenir la pipette au-dessus du cortex, aussi près que possible sans toucher la tranche avec l’embout de la pipette (environ 1 mm).
    3. Pousser ensuite lentement la solution hors de la pipette. Lorsque la solution touche la tranche, placez l’embout de la pipette sur le cortex pour étaler la solution sur la zone du cortex entier.
      Remarque : Cette procédure doit être fait aussi vite que possible pour éviter de les conserver les tranches sur le capot pour plus longtemps que nécessaire. Cela dans un plat en temps et remettre le premier plat dans l’incubateur avant de commencer sur plat #2. Pour obtenir une répartition satisfaisante des AAV sans endommager les tissus nécessite peu de pratique et d’une main ferme.
  3. Si un microscope à fluorescence debout est disponible dans le laboratoire de la cellule, expression de la protéine peut être vérifiée durant le temps dans la culture en plaçant le plat sous le microscope.
    Remarque : Le plat ne doit pas être conservé hors de l’incubateur pendant plus de 2-5 minutes.

3. Time-lapse imagerie

Remarque : l’imagerie peut être effectuée chaque fois que les niveaux d’expression des marqueurs fluorescents sont suffisantes et les tranches apparence saines (généralement DIV11-14).

  1. Veiller à ce que le microscope, la perfusion et le chauffage sont correctement configurés pour que la solution d’imagerie propagée est chauffée et peut entrer et sortir de la baignoire.
    NOTE : Différentes solutions existent pour les chambres de bain. Une version simple est présentée ici.
    1. Fais en - et points de vente de la baignoire par des aiguilles de seringue atténuée (bent à ~ 45°) qui sont attachés aux côtés de la baignoire par blu-amure/fun tack.
    2. Veiller à ce que les tubes va partir d’un flacon de solution d’imagerie continuellement propagé, par l’intermédiaire de la pompe péristaltique, à travers le tube de chauffage de la chaudière, puis à l’aiguille de seringue d’entrée dans le bain.
    3. Connecter un autre tube à la sortie de l’aiguille de seringue. Ce tube passe ensuite par l’intermédiaire de la pompe péristaltique et retour à la bouteille de solution d’imagerie (ou une bouteille pour eaux usées).
  2. Solution d’imagerie de la bulle (recette en réactifs ' table) avec gaz bioxide.
    Remarque : Cela devrait être started au moins 15 minutes avant l’imagerie et continuer tout au long de l’expérience.
  3. Tourner sur la pompe péristaltique et chauffage et exécution de solution dans le bain pour obtenir la température du bain optimale (37 ° c ± 0,5 ° C). Veiller à ce que le capteur thermomètre relié à l’unité de température est immergé dans la solution bain.
  4. Allumez le microscope, la lampe à fluorescence et le laser approprié.
  5. Chemin de
  6. ensemble vers le haut une lumière appropriée pour l’échantillon.
    Remarque : Cela variera selon la sonde et la configuration de microscope. Connaissances générales de l’utilisation du microscope confocal est nécessaire et ne seront pas abordés ici.
  7. Utiliser un objectif à immersion d’eau avec le grossissement approprié et l’ouverture numérique (n.a.). Nous utilisons un objectif plan-apochromat à immersion d’eau 40 x (n.a. 1.0).
  8. Open sténopé pour réaliser une coupe optique d’environ 2 à 2,5 µm pour la vidéo Time-lapse. Cela réduit la présence de mitochondries se déplaçant hors de discussion pendant le Time-lapse.
  9. Transfert organotypique tranche à la baignoire :
    1. Ajouter une goutte de solution d’imagerie ou de milieu de culture à un petit plastique Pétri.
    2. Dans une hotte stérile, utiliser une pince stérile pour transférer une tranche organotypique de la membrane insérer à la baisse. La pince doit toucher seulement les confettis et pas la tranche de.
    3. Mettez le couvercle sur la boîte de Pétri.
    4. Tout de suite mis la boîte de Petri contenant le reste des tranches dans l’incubateur.
    5. Apporter boîte de Pétri contenant tranche le microscope.
    6. Désactiver la pompe péristaltique tout en transférant la tranche à bain de microscope. Tout d’abord, utilisez pince pour soulever des confettis avec la tranche de la boîte de Pétri à au-dessus de la baignoire (les confettis flottera). Puis placez les deux pointes de la pince de chaque côté de la confetti afin qu’ils touchent les confettis sans toucher la tranche et pousser les confettis par le biais de la solution au fond de la baignoire. Centrer les confettis dans le milieu de la salle de bain.
    7. Pinces à usage de placer l’ancre de fixation (harpe) sur le dessus les confettis sans toucher la tranche de
    8. .
      Remarque : Une harpe est une ancre platine en forme de fer à cheval qui est utilisé pour prévenir la tranche du flottant ou à la dérive dans le bain. Pour pointes aiguës, cordes fines courent d’un côté de la harpe à l’autre (ressemblant à une harpe de musique). Pour obtenir des tranches organotypique, la harpe devrait être sans fil et ajuster à la taille de la confettis de telle sorte qu’elle peut pondre sur le dessus les confettis sans toucher la tranche.
    9. Ré-allumer la pompe péristaltique.
  10. Abaisser l’objectif vers le bas pour l’échantillon.
  11. Sélectionnez la cellule et la région à image.
    NOTE : Éviter une exposition excessive des cellules à lumière laser car cela risquerait de toxicité cellulaire (voir les conseils dans les points ci-dessous).
    1. Utiliser les oculaires et la lampe fluorescente pour trouver un oligodendrocyte saine avec l’expression correcte. En règle générale, les oligodendrocytes qui ont une forte surexpression de la protéine fluorescente apparaissent malsaines. Oligodendrocytes malsaines aura des processus avec une apparence de Borel et les mitochondries apparaîtra fragmentés. Dans les oligodendrocytes sains, le soma et les processus apparaissent lisses et les mitochondries ont différentes longueurs (bien que généralement plus court que dans les neurones et les astrocytes 13 , 14 , 15).
    2. Placer la cellule d’intérêt au milieu du champ de vision.
    3. Utilisation du " vivre " fonctionner dans le logiciel (pour microscopes Leica et Zeiss) pour identifier la cellule sur l’écran et choisissez un domaine d’intérêt, par exemple, une partie de la cellule qui contient plusieurs processus primaires ou des gaines de myéline ou un processus unique ou gaine de myéline.
      Remarque : Pour être en mesure de représenter aussi bien des processus/gaines que possible, choisir les zones contenant les processus qui pondent relativement plate sur l’axe x-y.
    4. Zoom sur le champ d’intérêt (en général de produire une image avec une taille de pixel de 0,14 - 0,30 µm).
    5. Aide les " régions " outil, dessinez un rectangle autour de la zone et choisissez l’option numériser uniquement la zone sélectionnée. Balayage de temps et donc l’exposition de laser, est réduite en analysant uniquement la zone sélectionnée.
      NOTE : Les régions rectangulaires horizontale seront analysées plus rapidement que les régions verticales en raison du nombre plus courte des lignes numérisées nécessaires. Si une région de rectangle vertical est analysée, le temps de balayage peut être réduit en faisant tourner le champ de balayage de 90 degrés (à l’aide de l’outil de rotation).
  12. Puissance de laser de réglage et de gain pour obtenir une bonne vue sur les mitochondries.
    Remarque : Utilisez la puissance de laser minimale nécessaire. Si possible, augmentez de gain et non montée en puissance laser. En plus de causer de toxicité cellulaire, laser trop haute puissance va blanchir les objets imagés au fil du temps, ce qui nécessite une nouvelle augmentation de la puissance du laser ou gain lors de la numérisation. La puissance du laser nécessaire et gain dépendra le niveau d’expression et le microscope. Avec un microscope confocal de LSM700, nous utilisons un laser à 555 nm à une puissance de 20-40 µW à image dsred ou tdtomato et un laser à 488 nm sert à 20-30 µW à image GFP (puissance du laser mesuré à l’ouverture arrière de l’objectif). Gain est implanté pour l’imagerie direct, habituellement de l’ordre de 700 à 800 pour GFP et 850-980 pour dsred et tdtomato. Le gain élevé peut causer certains bruit de fond plus, qui est supprimé en augmentant le numérique offset (offset valeurs pondent entre 0 et 15). Dans notre expérience, à l’aide de MBP_mito_GFP donne un meilleur signal-bruit de MBP_mito_dsred.
  13. Vitesse de numérisation de
  14. select.
    NOTE : Minimiser la durée de l’analyse en utilisant une vitesse de numérisation rapide et en traçant une petite région de balayage (voir point 4.10.5 ci-dessous). Il est également possible d’enregistrer les temps de numérisation en effectuant une analyse bidirectionnelle. Cependant, ce n’est pas recommandé à cause de moins bonne qualité d’image.
  15. Jeu de fréquence et durée d’enregistrement Time-lapse, par exemple de capture d’images toutes les 2 secondes pour un total de 20 minutes pour l’imagerie mitochondriale en oligodendrocytes.
    Remarque : La fréquence et la durée doivent être réglés selon la mobilité des objets d’intérêt. Une fréquence plus élevée va exposer l’échantillon à la lumière du laser plus, mais se déplaçant plus rapidement les objets nécessitent également une plus courte durée totale de vidéos time-lapse (p. ex. les mitochondries dans les neurones, qui se déplacent plus fréquemment et à une vitesse beaucoup plus élevée que les mitochondries dans oligodendrocytes, sont généralement imagés par seconde pour un total de 2 minutes 16).
  16. Commencer l’enregistrement Time-lapse.
    Remarque : Les mitochondries peuvent se déplacer hors de discussion et/ou dérive hors de la région de représentation lors de l’enregistrement. Pour minimiser les vibrations et le mouvement, ajuster en - et points de vente de la baignoire et réduire la vitesse de la pompe si nécessaire. Petits changements en bref généralement encore se produire. Ainsi, un monitorage continu de l’écran en imagerie est nécessaire, avec de petits ajustements de la mise au point lors de l’enregistrement.
  17. Capturer une z-pile de la cellule entière pour l’identification future de cellule et imagés processus.
    Remarque : Pour une meilleure résolution, le sténopé devrait être remis à 1 unité aérée pour la pile de z.
  18. Facultatif : visualiser la myéline non-colorées.
    Remarque : Dans les oligodendrocytes transduites avec GFP (cytoplasmique), les gaines de myéline peut habituellement être identifiés comme des lignes droites du cytoplasme (les crêtes cytoplasmiques) reliés à un processus primaire (voir Figure 2 A et B). Toutefois, si l’expression de la GFP est trop faible ou un marqueur cytoplasmique n’est pas utilisé, il est possible de visualiser la gaine de myéline par microscopie confocale réflectance (CoRe) comme expliqué ici.
    1. Mis en place un nouveau chemin de lumière dans le logiciel avec excitation de laser à 488 nm et capture émis la lumière autour de la même longueur d’onde, par exemple 470-500 nm.
    2. Réglage puissance du laser et gagner jusqu'à ce que la myéline est visible (voir exemple dans < forte classe = »xfig "> Figure 3). En utilisant un microscope de LSM 510 Meta, nous utilisons généralement une puissance de laser de 7-12 µW (mesuré à l’ouverture arrière de l’objectif).
  19. En option : préparation de tranches pour immunostaining.
    1. Si la cellule image doit être identifiée après immunomarquage, capturez une image de faible grossissement (10 x) de la cellule et indiquer son emplacement dans l’image en dessinant une flèche ou similaire. Pour faciliter la détection de la cellule, il est recommandé aussi dessiner une carte manuelle de la tranche entière, ce qui indique l’emplacement de la cellule :.
    2. Fix tranche dans 4 % de paraformaldéhyde (PFA) sur agitateur pendant 1 heure à température ambiante.
      ATTENTION : PFA est nocif. Utiliser des vêtements de protection et de n’utiliser que sous une hotte ventilée.
    3. Diluer fixateur 01:10 dans du PBS et laisser à 4 ° C jusqu’au départ d’immunohistochimie dénommés ailleurs 17.
      Remarque : Bien que les tranches peuvent être laissés dans le fixateur dilué pendant plusieurs semaines, fluorescence peut s’estomper. Exécution d’immunohistochimie dans les 10 jours de fixation est recommandé.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Organotypique des tranches de cerveau qui ont été cultivées et transduites tel que décrit ci-dessus montrent une distribution clairsemée des oligodendrocytes corticales exprimant mito_dsred et GFP. Immunohistochimie avec des anticorps contre Olig2 et MBP a confirmé que l’expression spécifique d’oligodendrocytes (Figure 1).

Pour l’imagerie live, oligodendrocytes transduits ont été reconnus par leur morphologie caractéristique de plusieurs gaines de myéline en parallèle (Figure 1 et Figure 2 a). En effectuant l’imagerie Time-lapse sur les oligodendrocytes transduits, il est possible de suivre les mouvements des mitochondries dans les processus primaires et les gaines de myéline (Figure 2 b-D).

Dans les cellules avec faible expression de la GFP, la gaine de myéline pouvaient être identifiée au cours de l’imagerie live par illuminant l’échantillon à 488 nm et capturant émis lumière 470-500 nm (Figure 3 a). Cette technique de microscopie (CoRe) de réflectance confocale a également travaillé sur PFA fixée et immunomarquage tissu, bien que les gaines de myéline apparu gradateur (Figure 3 b-C). Par immunohistochimie avec des anticorps dirigés contre la protéine basique de la myéline (MBP), nous avons constaté que près de 100 % des gaines de myéline pose horizontale au plan d’imagerie (indiqué par les pointes de flèches, Figure 3 b-C) sont visibles avec le noyau, tandis que les gaines de myéline Cette perpendiculaire Lapointe pour le champ de vision (indiquée par des astérisques, Figure 3 b-C) sont moins ou pas du tout visible. Bien que presque tous les entre-noeuds sont visualisées, nombreux entre-noeuds apparaissent discontinus, avec petites pièces de la gaine n’est ne pas visible (Figure 3 a insert). Ces petites « lacunes » dans la myéline peuvent être renseignés par imagerie avec trois longueurs d’onde complémentaires, ce que l'on appelle SCoRe9.

Figure 1
Figure 1 : Immunohistochimique confirme que les MBP-mito-dsred est sélectivement exprimé dans les oligodendrocytes qui infectés par le système immunitaire pour Olig2 et MBP.  Images sont extraites de néocortex des coupes de cerveau de souris cultivées transduite avec (AAV2/8) MBP-mito-dsred (marqueur rouge, mitochondrial) et CAG-GFP (green, cytosol). Les tranches ont été immunomarquées pour le marqueur de la myéline la protéine basique de la myéline (MBP, bleu) et Olig2 (oligodendrocyte lignée cellulaire nucléaire marqueur, magenta). (Figure de référence13) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Imagerie Time-lapse pour suivre le mouvement mitochondriale dans les oligodendrocytes. (A) Projection de z-pile (section optique 10,35 µm) des oligodendrocytes transduites avec MBP_mito_dsred (mitochondries rouges) et CAG_GFP (fluorescence verte). (B) seule image confocale (section optique 1,04 µm) de la même cellule. Carré indique la région sélectionné pour l’imagerie Time-lapse (C) et les lignes tracées pour faire kymographs (kym) en (ré) sont indiqués. (C) Images d’enregistrement Time-lapse de la cellule à A et B prises à différents moments. Déplace les mitochondries sont indiquées (flèches rouges). Kymographs (D) de la trajectoire indiquent au point B. Mitochondries stationnaires sont considérés comme des lignes droites verticales et mitochondries mobiles sont considérées comme des lignes diagonales. Comme peut être vu dans les kymographs et dans les images de temps en (C), seulement des mitochondries dans le processus primaire marqué kymographes 1 (Kym 1) sont déplacent. Les mitochondries dans les trois autres kymographs restent fixes pendant l’enregistrement Time-lapse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Visualisation de la myéline non-colorées par microscopie confocale réflectance (CoRe). (A) Projection de z-pile (section optique 10,35 µm) du néocortex d’une tranche de cerveau organotypique direct. L’expression de la GFP dans les oligodendrocytes ci-contre (corps cellulaire vert) est trop faible pour l’identification des processus primaires et les gaines de myéline. Au lieu de cela, les gaines de myéline ont été visualisées par excitation à 488 nm et capture de lumière émise à 470-500 nm (montré en magenta). Certains de la paranodes riche en cytoplasme de l’oligodendrocyte GFP + peuvent être vus à l’extrémité des entre-nœuds myéline (flèches). Insertion : Partie agrandie de la gaine de myéline montre que la myéline visualisée avec noyau apparaît « inégale » ou discontinu (voir le texte principal pour plus de détails). (B-C) Images confocales du striatum (B) et stratum radiatum de hippocampe CA1 (C) d’une tranche de cerveau de souris aiguë qui a été fixé à 4 % PFA et immunocolorées pour la protéine basique de la myéline (MBP). Gaines de myéline horizontal (pointes de flèche) sont visibles avec le noyau, tandis que les gaines qui sont perpendiculaires au champ de vision (astérisques) ne sont souvent pas visibles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Table des réactifs : S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le protocole permettant la culture organotypique décrite ici est une version modifiée de18 du protocole décrit par De Simoni et Yu (2006)5. Les changements les plus importants ont été décrites ci-dessous. Tampon Tris est ajouté au milieu de culture, ce qui améliore la survie des tranches en dehors de l’incubateur au cours de la transduction virale et la modification du milieu cellulaire. La procédure de stérilisation de confettis est également modifiée. Alors que les autres protocoles stérilisent des confettis à l’autoclave, nous ne recommandons pas cela parce qu’il fera plusieurs d'entre les confettis à friser. Évitez d’utiliser des confettis enroulées comme tranches cultivées sur ces ont tendance à être en moins bonne santé. Notre protocole utilise des souris, les rats pas et est modifié pour le cortex au lieu de l’hippocampe, la culture que nous trouvons fonctionne bien avec des tranches plus minces (230 µm vs 300 µm). Myélinisation des pointes autour de jour après la naissance, 10-20 chez la souris et les rats19, les cultures fabriqués à partir de souris à p7-9 (et puis cultivées pendant 11 à 14 jours) sont optimales pour l’étude des oligodendrocytes myélinisantes. À 11-14 jours in vitro, les cultures contiennent plusieurs oligodendrocytes matures avec des gaines de myéline compact13. Cultures de souris plus jeunes contiendra moins oligodendrocytes matures à la fin de la période de culture, alors que les cultures faites chez des souris âgées ont montré plus difficiles à maintenir en bonne santé20.

La procédure pour faire des tranches organotypique comporte plusieurs étapes cruciales. La dissection et montage du cerveau, ainsi que placer les tranches sur le confetti, doit se faire rapidement et nécessite des compétences. Généralement, les premières tentatives de fabrication organotypiques sont moins réussis, mais 2-3 tours de pratique devraient être suffisant pour acquérir les compétences nécessaires pour faire des cultures en bonne santé. Il est important de maintenir un environnement stérile tout au long de la procédure pour éviter la contamination des cultures. En outre, lorsque vous travaillez avec des cellules vivantes, il est toujours impératif de garantir le bon pH et l’osmolalité des solutions pour maintenir la santé de la cellule. C’est donc un bon conseil pour vérifier l’osmolalité (soit 270-310 mOsm/kg) et le pH de toutes les solutions qui sont utilisés sur les tranches, surtout quand vous faites l’expérience pour la première fois. Les solutions de culture et de la dissection pour la culture organotypique contiennent un indicateur de pH (rouge de phénol), mais le sérum en jaune dans le milieu de culture peut donner l’impression d’une plus faible que le pH réel. Le milieu de culture contient la pénicilline, streptomycine et nystatine afin de minimiser les risques d’infection. Il est donc recommandé d’utiliser ces antibiotiques et antimycotiques lorsque vous configurez la technique de culture organotypique tranche dans le laboratoire, mais plus tard ils peuvent être évités à expertise technique aseptique est appliquée. Le protocole actuel utilise la morphologie cellulaire afin d’évaluer la viabilité des cellules. Pour un examen plus quantitatif, tranches peuvent être chargés avec l’iodure de propidium ou similaires colorants comme décrit ailleurs21. Toutefois, il est important d’être conscient que le spectre d’émission de l’iodure de propidium chevauche dsred, tdtomato et autres indicateurs rouges. Une autre limitation de l’iodure de propidium et réactifs similaires, c’est qu’ils n’entrent pas facilement dans les couches profondes de la tranche, limitant ainsi l’évaluation de la viabilité des cellules de la couche supérieure de cellules5.

Il existe une variété de méthodes pour la livraison de gène. Les principaux avantages de l’utilisation de transduction AAV d’organotypiques de visualiser les organites sont les suivantes : transduction de l’AAV a un meilleur taux de réussite pour les oligodendrocytes mitotiques par rapport aux méthodes de transfection non-virale22. De plus, en culture organotypique tous types de cellules du cerveau sont présents et oligodendrocytes ont une morphologie semblable à celui vu en vivo, y compris la myéline compact13. Cela diffère des oligodendrocytes dans la monoculture, qui n’ont pas la communication avec les axones et donc ne font pas de myéline compacte. Imagerie in vitro est comparativement plus facile avec in vivo et offre une meilleure résolution spatiale, qui est particulièrement intéressant lorsque l’imagerie des petits organites comme les mitochondries. Les recherches futures seront efforcera d’image in vivo, mais face à un grand défi avec les aberrations optiques causées par la gaine de myéline riches en lipides. Par ailleurs, les AAV sérotype tropisme et promoteur spécificité peut varier entre in vivo et in vitro des conditions13,23. Dans le protocole présenté ici, AAV2/8 MBP_mito_dsred et MBP_mito_GFP AAV2/8 sert à visualiser les mitochondries de l’oligodendrocyte. Sérotype AAV 2/1 a également été testé avec MBP_mito_dsred mais infecté un nombre inférieur d’oligodendrocytes dans les tranches organotypique (non illustrés). AAV2/8 CAG_GFP et CAG_tdtomato AAV2/8 a été utilisé pour visualiser le cytoplasme de l’oligodendrocyte. Malgré l’utilisation du promoteur général de CAG pour cela, AAV 2/8 CAG_GFP et CAG_tdtomato infecté sélectivement les oligodendrocytes, avec seulement un petit nombre des astrocytes et les neurones infectés (ceux-ci peuvent être facilement identifiés par leur morphologie caractéristique). Cette sélectivité pour les oligodendrocytes est sans doute en raison du tropisme de l’AAV sérotype 2/824. Toutefois, pour l’expression ciblée organite, la spécificité cellulaire plus élevée atteint avec le MBP - ou autres promoteurs oligodendrocyte spécifique est recommandé. Autres sérotypes testés avec CAG_GFP par nos soins ont été AAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, plus dont infectés principalement les neurones et les astrocytes (non illustrés).

Selon la construction et les conditions expérimentales, modification de la transduction cellulaire sera nécessaire. Si les cellules transduits apparaissent trop faible, essayez un plus long temps in vitro après transduction pour augmenter l’expression. Si les cellules apparaissent brillante mais malsain, réduire le temps après transduction. Si très peu de cellules est transduites, la concentration d’AAV peut être augmentée. Toutefois, il est également possible que le temps in vitro après transduction est trop long et que les cellules transduits sont morts. Pour les constructions utilisées ici, les niveaux d’expression étaient optimales 4-6 jours après la transduction. 7-8 jours après la transduction, cellules semblent moins sains, avec des processus Borel et 10 jours après la transduction, seules quelques cellules transduits étaient visibles (non illustré).

Ce protocole utilise un microscope vertical pour l’imagerie live d’organotypique tranches. Ceci est différent de plus mono- et co des cultures qui utilisent généralement un microscope inversé. Il n’est pas optimale d’utiliser un microscope inversé ici car les tranches doivent alors être tournés avec les confettis vers le haut, ce qui provoque probablement les tranches à être en moins bonne santé. Un des avantages du microscope vertical est la possibilité d’ajouter d’électrophysiologie de l’installation. En outre, l’utilisation d’une pompe à changer de support signifie que drogues en solutions peuvent facilement être ajoutés et supprimés pendant le Time-lapse imagerie. Un inconvénient avec la pompe est maintenant mise au point causée par les vibrations et les courants dans le bain des problèmes. Au microscope, les cellules deviendront progressivement moinsen bonne santé. Nous gardons donc les tranches au microscope pour un maximum de 1 heure. Tranches de représentation sont jetés (déchets spéciaux). Afin d’assurer que les conditions d’imagerie sont optimales, l’imagerie de cellules contrôle, dans lequel mouvement mitochondriale est déjà bien caractérisée, doit être exécuté en parallèle. Pour exemple, le mouvement mitochondriale dans les axones ou dendrites peut être photographiée par transduction tranches avec VAA Syn_mito_dsred 2/1 (dans laquelle dsred expression est pilotée par le promoteur synapsin neurone-spécifique) ou VAA CAG_mito_dsred 2/1 (suivi par immunomarquage à confirmer les cellule identité). Analyse du mouvement mitochondrial peut être fait avec l’outil de kymographes multiples du ImageJ comme décrit ailleurs25.

Nous décrivons ici la base pour la visualisation de la myéline colorées ou non pendant la formation image live. Par rapport à la note9, qui utilise trois longueurs d’onde excitation, CoRe utilise uniquement un (488 nm) et n’est donc plus simple à mettre en œuvre. Dans la partition, les trois longueurs d’onde chaque révèlent différentes « pièces » de la gaine de myéline et ainsi donnent une image complète de la gaine. En outre, le SCoRe peut servir à détecter la gaine de myéline des structures telles que les poches cytoplasmiques. Avec la longueur d’onde unique utilisé dans le noyau, bénéficie d’une vue moins détaillée et gaines peuvent apparaître granulé ou discontinu (Fig. 3). Néanmoins, CoRe visualisé par près de 100 % des gaines de myéline qui sont horizontales pour le champ de vision. Ainsi, le noyau est utile pour la détection des gaines de myéline, mais pas pour l’analyse des structures de la myéline ou intégrité.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Acknowledgements

Nous remercions Linda Hildegard Bergersen et Magnar Bjørås pour accéder à la cellule de laboratoire et équipement, personnel Janelia biologie moléculaire ressource partagée pour la production de virus et de plasmide et Koen Vervaeke pour assistance avec mesures de puissance de laser. Ce travail a été financé par l’Association norvégienne de la santé, le Conseil norvégien de la recherche et de l’équipement de microscopie a été financée par Norbrain.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose  Sigma  A9539
BD Microlance 19G BD 301500 Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas AGA 105701
Brand pipette bulbs Sigma-Aldrich Z615927 Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner) VWR 89038-530
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments 64-0106  Temperature controller - thermometer part
CaCl2 Fluka 21100
CO2  AGA 100309 CO2 for incubator
Cover glass, square Corning Thermo  Fischer Scientific 13206778 To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Delicate forceps Finescience 11063-07 For dissection
Diamond scriber pen Ted Pella Inc. 54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm VWR 612-1702 Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade Electron Microscopy Sciences #7200 Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco-Invitrogen 24010-043
Filter paper circles Schleicher & Schuell 300,220 Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack Loctite 1270884 Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2 Katrin 344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber, Warner Instruments  64-1418 Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3 Sigma H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2 Heto-Holten 96004000M Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated Gibco-Invitrogen 26050-088
KCl Sigma P9541
LCR Membrane, PTFE,  Millipore FHLC0130 Confetti 
Leica VT1200 Leica 14048142065 Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES Thermo  Fischer Scientific 42360024
MgCl2 R.P. Normapur 25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B Electron Microscopy Sciences 62411-B Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit Millipore SLGPM33RA Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm Millipore PICM03050 Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module GILSON F155001 Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaHCO3 Fluka 71628
Nunclon Delta Surface Thermo  Fischer Scientific 140675 Culture plate
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC  Zeiss 441452-9900-000  Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm VWR 291-1211
Paraformaldehyde, granular Electron Microscopy Sciences #19208
PC-R perfusion chamber SiSkiYou  15280000E Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15070-063
Petri dish 140 mm  Heger 1075 Large Petri dish 
Petri dish 92x16 mm  Sarstedt  82.1473 Medium Petri dish 
Petridish 55x14,2 mm VWR 391-0868 Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417 PBS tablets
R2 Two Channel Head  GILSON F117800 Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Large spatula for dissection
Sand paper VWR MMMA63119 Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm Finescience 14130-17 Large scissors for dissection
Scissors, 8,5  Finescience 14084-08 Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade Electron Microscopy Sciences #71972 Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm Millipore SCGPT05RE Filter to sterilize solutions
Super glue precision Loctite 1577386
Surgical scalpel blade no. 22 Swann Morton Ltd. 209 Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B Warner Instruments 64-0100 Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base Sigma  T1503
Trizma HCl Sigma T3253
Water jacketed incubator series II Forma Scientific 78653-2882 Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11, (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics