Visualizzazione e Live Imaging del Oligodendrocyte organelli in fettine di cervello Organotypic utilizzando Virus Adeno-associati e microscopia confocale

Neuroscience

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Summary

I oligodendrocytes myelinating promuovono la propagazione del potenziale d'azione rapida e la sopravvivenza neuronale. È descritto qui un protocollo per l'espressione del oligodendrocyte-specific di proteine fluorescenti in organotipiche fette del cervello con formazione immagine successiva di time-lapse. Inoltre, una procedura semplice per la visualizzazione non macchia mielina è presentata.

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Kennedy, L. H., Rinholm, J. E. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56237, doi:10.3791/56237 (2017).

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Abstract

I neuroni si basano sull'isolamento elettrico e supporto trofico dei oligodendrocytes myelinating. Nonostante l'importanza degli oligodendrociti, gli strumenti avanzati attualmente usati per studiare i neuroni, sono state prese solo parzialmente dai ricercatori del oligodendrocyte. Cella tipo-specifica colorazione di trasduzione virale è un approccio utile per studiare la dinamica dell'organello dal vivo. Questo articolo descrive un protocollo per la visualizzazione di mitocondri del oligodendrocyte nelle fette del cervello organotipiche di trasduzione con virus adeno-associato (AAV) portatori di geni per le proteine fluorescenti mirate mitocondriale sotto il controllo trascrizionale del il promotore di proteina basica della mielina. Esso comprende il protocollo per rendere organotipiche fette di cervello del topo coronale. Una procedura per time-lapse imaging dei mitocondri quindi segue. Questi metodi possono essere trasferiti ad altri organelli e possono essere particolarmente utili per lo studio di organelli nella guaina mielinica. Infine, descriviamo una tecnica prontamente disponibile per la visualizzazione della mielina non macchia in fette di vita da microscopia Confocal di riflessione (CoRe). CoRe non richiede nessun equipaggiamento supplementare e può essere utile per identificare la guaina mielinica durante la formazione immagine dal vivo.

Introduction

Materia bianca del cervello è composto di cellule nervose assoni avvolti nella mielina, una membrana di plasma estesa specializzata formata da oligodendrociti. Mielina è necessaria per la propagazione del potenziale d'azione veloce e affidabile e sopravvivenza a lungo termine degli assoni myelinated e una perdita di mielina può causare disfunzione neurologica. Nonostante la loro importanza, le proprietà degli oligodendrociti sono meno conosciuti rispetto con i neuroni e astrociti. Di conseguenza, meno strumenti sono stati sviluppati per lo studio di oligodendrociti.

Live imaging di organelli cellulari come i mitocondri, reticolo endoplasmatico (ER) o diverse strutture vescicolari possono essere utile per studiare i cambiamenti dinamici negli organelli nel corso del tempo. Tradizionalmente, formazione immagine degli oligodendrociti vivente è stata eseguita in monocolture1,2. Tuttavia, oligodendrociti in monocoltura non visualizzare compatta mielina e organotipiche o fettine di cervello acuto possono, quindi, essere un'opzione migliore quando si studia la localizzazione e il movimento degli organelli. Localizzazione di piccoli organelli e proteine nella guaina mielinica può essere difficile a causa della breve distanza tra l'assone myelinated e la guaina di mielina circostante. Così, le procedure di luce immunostaining microscopica da solo non avere la risoluzione spaziale di discriminare tra quelli nell'assone myelinated e organelli nella guaina mielinica. Questo può essere risolto attraverso la trasduzione virale con geni per le proteine fluorescenti targeting organello guidate dai promotori specifici del tipo di cella. I vantaggi sono un'espressione di cellula-specifico e rada, che consente una valutazione accurata della localizzazione dell'organello e dinamiche. Animali transgenici è utilizzabile anche per realizzare tale un organello targeting cellula-specifico espressione3. Tuttavia, la produzione e la manutenzione di animali transgenici è costosi e di solito non offrono l'espressione sparsa che possa essere raggiunti dai metodi virale.

Il metodo descritto qui utilizza trasduzione virale degli oligodendrociti con proteine fluorescenti targeting mitocondriale (dsred o verde proteina fluorescente, GFP) guidato dal promotore di proteina basica della mielina (MBP-mito-dsred o MBP-mito-GFP) per visualizzare mitocondri del oligodendrocyte nelle fette del cervello organotipiche. Inoltre, espressione di un'altra proteina fluorescente nel citoplasma (GFP utilizzato insieme a mito-dsred o tdtomato utilizzato con mito-GFP) viene utilizzato per abilitare la visualizzazione della morfologia delle cellule, compresi i comparti citoplasmatici della guaina mielinica. Il protocollo comprende la procedura per effettuare organotipiche fette del cervello (una versione modificata del protocollo descritto da De Simoni e Yu, 20064,5). Descriviamo quindi la procedura di imaging time-lapse per studiare il movimento mitocondriale. Questa procedura utilizza un microscopio confocale verticale con uno scambio continuo di imaging medio, un'installazione che consente la facile applicazione di farmaci o altri cambiamenti medi durante la formazione immagine. La procedura di imaging time-lapse può essere eseguita su qualsiasi microscopio confocale, con alcune attrezzature supplementari per il mantenimento della vita fette come descritto di seguito. Il protocollo contiene anche alcuni suggerimenti per ottimizzare la formazione immagine e ridurre la fototossicità.

Infine, è descritto un modo semplice e veloce per visualizzare mielina non macchia da microscopia Confocal di riflessione (CoRe). Questo può essere utile per identificare la guaina mielinica durante la formazione immagine dal vivo. Negli ultimi anni, diverse tecniche sono state sviluppate alla mielina immagine senza alcuna colorazione necessaria, ma la maggior parte di questi richiedono specifiche attrezzature e competenze6,7,8. La procedura qui descritta utilizza le proprietà riflettenti della guaina mielinica ed è una versione semplificata di singolo-eccitazione lunghezza d'onda di microscopia Confocal di riflessione spettrale (Punteggio, in cui diverse lunghezze d'onda del laser è combinato per visualizzare mielina) 9. coRe può essere fatto su qualsiasi microscopio confocale che dispone di un laser a 488 nm e un filtro di emissione di 470-500 nm passa-banda o un filtro di emissione sintonizzabile.

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Protocol

le procedure qui descritte sono state approvate dall'autorità norvegese per la ricerca animale. I fornitori e i numeri di catalogo per i materiali di consumo e altre richieste attrezzature sono disponibili nell'elenco materiali alla fine del documento.

1. preparazione di organotipiche fette

Nota: questa ricetta utilizza due cuccioli di topo postnatale giorno 7-9 (p7-9), che producono 24 fette organotipiche divisi su due piastre di coltura di sei-pozzo. Salvo diversa indicazione, tutte le procedure dovrebbero essere fatto in una cappa sterile e guanti in lattice o nitrile dovrebbero essere usati. Dovrebbero essere usati solo ingredienti di qualità cultura cellulare.

  1. Autoclave bottiglie, strumenti di dissezione (grande 1 forbice, 1 piccola forbice, 1 grande spatola piatta, 1 piccola spatola arrotondata e affilata e 1 forcipe, vedi materiali lista per i dettagli), vetro pipette, puntali per pipette e salviette di tessuto utilizzati per la preparazione di fetta.
  2. Come metà delle pipette di vetro deve essere utilizzata con la grande apertura, rompere l'estremità stretta.
    1. Punteggio con uno scriber diamante (se disponibile) della penna intorno la pipetta appena sotto il punto dove il vetro inizia il restringimento. Quindi posizionare l'estremità a punta della pipetta in un guanto di nitrile o simili. Interrompe con attenzione la punta piegando la pipetta e contemporaneamente spingerlo contro un banco di lavoro.
    2. Poi smussare l'estremità rotta da sfregamento su un pezzo di carta vetrata o fondere leggermente su un becco Bunsen. Le pipette rotte sono usate per trasferire fette tagliate del cervello con l'estremità rotta trasformato nel bulbo di gomma e la grande aperta fine toccare la soluzione/fette.
      Nota: Questo non è fatto in una cappa sterile e può essere fatto diversi giorni di anticipo.
  3. Preparare piastre di coltura.
    Nota: Questo può essere fatto il giorno prima di affettare o almeno 2 ore prima di affettare.
    1. Membrane sterilizzare politetrafluoroetilene (PTFE) (" coriandoli "). Utilizzare due pinze sterili per rimuovere singoli coriandoli da pezzi di plastica blu circostanti e sterilizzare immergendo due volte in una piastra Petri contenente 96% etanolo (EtOH). Poi stendere coriandoli Appartamento in un grande piatto di Petri sterili asciugare.
      Nota: I confetti sono membrane in PTFE idrofiliche simile alle membrane negli inserti di cultura. L'uso dei coriandoli aiuti il live imaging poiché singole fette possono essere facilmente trasferite dall'inserto per il setup di microscopio sollevando i coriandoli con il forcipe (vedere 4.8. per i dettagli). In alternativa, le fette di cervello possono essere coltivate senza i coriandoli (in cui fisserà le fette direttamente alla membrana dell'inserto cultura). In questo caso, l'inserto di membrana deve essere tagliato con un bisturi per trasferire la fetta al bagno microscopio.
    2. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura (ricetta di reagenti ' tabella) in ogni pozzetto dei piatti sei pozzetti cultura.
    3. Una coltura di
    4. posto inserire in ciascun pozzetto usando pinze sterili. Evitare le bolle d'aria tra l'inserto e il terreno di coltura.
      Nota: Per risparmiare soldi e ambiente, è possibile riutilizzare gli inserti di cultura. Questo può essere fatto da un appropriato risciacquo in acqua distillata H 2 O (dH 2 O) seguita da incubazione in 70% EtOH per un minimo di 24h fino al riutilizzo. Quando si prepara per la nuova cultura, asciugare gli inserti in una piastra di coltura cellulare sotto ultravioletto (UV) luce per un minimo di 15-30
    5. Posto due coriandoli (sterilizzati e secco) su ciascuno degli inserti cultura. Posizionare i coriandoli verso i bordi degli inserti per ottenere la minima sovrapposizione.
    6. Mettere le piastre nell'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C con 5% CO 2.
  4. Medio di dissezione freddo di bolla (ricetta di reagenti ' tabella) con gas di biossido (95% O 2 /5%CO 2). Per mantenere la soluzione sterile, collegare il tubo della bombola ad un filtro siringa sterile (dimensione dei pori di 0.22 µm). Filtro
    1. coppia l'altra estremità della siringa in una provetta sterile collegato a una pipetta di vetro sterile. Inserire la pipetta di vetro nella soluzione, coprire con parafilm e accendere il gas. Mantenere il mezzo di dissezione su Ice.
  5. Preparare l'area di dissezione/affettatura.
    Nota: Idealmente, questa procedura deve essere eseguita in una cappa sterile. Se questo non è possibile, del vibratome può essere lasciata su un banco di lavoro. In questo caso, si consiglia di utilizzare una maschera per capelli net e viso.
    1. Usando una lama di rasoio singolo bordo, tagliare un pezzo rettangolare (circa 2 cm x 0,5 cm) di gel di agarosio (ricetta di reagenti ' tabella) e incollare questo sul palco vibratome tale che il lato lungo verso la lama del vibratome.
    2. Pulire tutte le superfici e le parti del vibratome con 70% EtOH e asciugare con salviette di tessuto autoclavato.
      Nota: È importante che tutti i pezzi che saranno in contatto con il tessuto cerebrale siano completamente asciutti poiché EtOH può danneggiare le cellule.
    3. Fissare una lama di rasoio sterile del vibratome ed eseguire controllo di vibrazioni, se questa funzione è il vibratome.
    4. Strumenti di dissezione in autoclave posto nella cappa insieme tessuto autoclavato wipes, quattro piccole capsule di Petri, un bisturi arrotondata, 2 pipette in vetro con lampade in gomma, due pipette di vetro fisse (Vedi PT. 1.1) e super colla (spruzzato con EtOH).
    5. Versare mezzo dissezione propagati in barca vibratome e nei quattro piccoli piatti Petri.
      Nota: Questo passaggio solo dovrebbe essere eseguita immediatamente prima della dissezione poiché medio da questo punto in poi non è gorgogliare o mantenere sul ghiaccio.
  6. Cervelli dissezionare e Monte.
    Nota: Per ottenere fette sani, questo passaggio deve essere fatto rapidamente e con precisione. È necessaria una certa pratica.
    1. Eutanasia animale #1 da dislocazione di neckor secondo le linee guida locali e poi decapitare con le forbici grandi.
    2. Using piccolo, forbici affilate, rapidamente rimuovere la pelle facendo un'incisione sagittale dal collo al naso e tirare da parte per rivelare il cranio.
      1. Tagliare lungo la sutura sagittale, seguita da incisioni laterali sopra la parte interna delle ossa frontali e la sutura di lamboid (al confine tra cervello e cervelletto).
      2. Usare pinze per piegare aperto il cranio su ogni lato. I nervi cranici sono tagliati fuori dal cervello inserendo una spatola arrotondata, sharp sotto il lato ventrale del cervello e delicatamente spostando lateralmente la spatola.
    3. Utilizzare una lama di rasoio singolo spigolo a fare un coronale tagliare rostral al cervelletto.
      Nota: Questo taglio sarà determinare l'angolo a cui vengono tagliate le fette. Si dovrebbe, quindi, essere fatta all'angolo retto.
    4. Flip il cervello fuori del cranio e in un piccolo piatto di Petri contenente mezzo dissezione.
    5. Ripetere i passaggi 1.6.1.-1.6.4. per animale #2 e posto questo cervello in un secondo Petri piatto.
      Nota: Gli animali non sono sterili. Eseguire la dissezione su un lato della cappa e poi passare al lato opposto, pulito, una volta che i cervelli sono stati rimossi dal cranio.
    6. Cambiare i guanti.
    7. Attach cervello vibratome stage: aggiungere un sottile strato di colla super sul palco proprio di fronte il gel dell'agarosi montato. Tenere il lato cervello #1 con una spatola piatta larga con appena tagliata (caudale) toccando la spatola e il rivestimento del lato ventrale (e di essere più vicino possibile a) il gel dell'agarosi.
      1. Poi posizionare delicatamente il cervello sulla colla spingendolo fuori la spatola con un set di pinze. Assicurarsi di lasciare abbastanza spazio per cervello #2.
        Nota: È importante che i cervelli sono fissati bene sul palco, ma senza eccessiva colla, come questo può ostruire il taglio.
    8. Immediatamente dopo il montaggio del cervello #1, usare la spatola grande per aggiungere alcune gocce di mezzo di dissezione in cima il cervello. Ciò manterrà il cervello umido, indurire la colla ed evitare che si attacchi ai lati dei cervelli.
    9. Ripetere i passaggi 1.6.7 e 1.6.8. per cervello #2.
    10. Collegare la fase sulla barca vibratome.
  7. Fette 230 µm spessore coronale con un'ampiezza di 1-1,5 mm, una frequenza di 85 Hz e una velocità di 0,2 mm/s. raccogliere fette approssimativamente fra rostrale 1,4 e 2,1 mm caudale al Bregma.
    1. Raccogliere fette dopo ogni fetta è stato tagliato utilizzando pipette in vetro Open End (PT. 1.1). Trasferimento fette in una piastra Petri contenente mezzo di dissezione. Utilizzare un bisturi arrotondato per tagliare le fette in due pezzi, dividendo i due emisferi.
  8. Quando vengono tagliate tutte le fette, inserire i piatti di cultura fette.
    1. Togliere la piastra di coltura (uno alla volta) l'incubatore.
    2. Utilizzando le pipette di vetro fissa, trasferire con cautela una fetta a ciascuno dei coriandoli.
      Nota: Le fette devono porre piatto nel mezzo i coriandoli. Questo richiede una certa abilità. Tuttavia, se alcune fette non sono perfette, è meglio lasciarli che to trascorrere del tempo cercando di spostarli come è importante ottenere tutte le sezioni in incubatrice velocemente come possibile.
    3. Utilizzare una pipetta di vetro (a punta fine) per rimuovere delicatamente l'eccesso del prodotto senza toccare la fetta.
      Nota: Le fette non devono essere immerso nel liquido durante l'incubazione. Così, eccesso di terreno deve essere aspirato tale che le fette sono esposti all'aria (un film sottile di mezzo ancora coprirà le fette). Fette che rimangano immerse in liquido solitamente saranno malsana o morire (4 e le nostre osservazioni).
    4. Spostare il piatto indietro nell'incubatrice, una volta che tutti i coriandoli hanno una fetta.
    5. Ripetere i passaggi da 1.7.8.-1.8.4. per piatto #2.
  9. Cambiare il terreno di coltura.
    Nota: Questo dovrebbe essere fatto il giorno dopo il taglio (giorno 1 in vitro, DIV1) e poi ogni 2-3 giorni.
    1. Preriscaldare il terreno di coltura in un bagnomaria o l'incubatore.
    2. In una cappa sterile, utilizzare aspirazione di vuoto o di una pipetta regolare con punta sterile per aspirare il terreno di coltura da ciascun pozzetto. Questo viene fatto delicatamente le mance il piatto (di circa 30 gradi) e inserendo la punta della pipetta al bordo dell'inserto cultura.
    3. Rimuovere circa 800 µ l da ogni pozzetto (lasciando solo abbastanza mezzo per tenere la parte inferiore dell'inserto rivestito in mezzo). Quindi, utilizzando una pipetta pulita, aggiungere 800 µ l del mezzo pre-riscaldato in ciascun pozzetto. Poi rimettere i piatti nell'incubatrice della coltura cellulare.

2. Trasduzione virale

  1. acquisto o fare AAVs con un plasmide di interesse, come descritto in precedenza 10 , 11.
    Nota: Questo protocollo descrive l'uso di sierotipo AAV 2/8 (AAV 2/8) trasporto mitocondriale mirata dsred o GFP come un gene reporter sotto il controllo trascrizionale del promotore proteina basica della mielina 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred o AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) per visualizzare i mitocondri oligodendrociti. AAV 2/8 trasporto GFP o tdtomato come gene reporter guidato dal generale promotore CAG (AAV 2/8 CAG_GFP o AAV 2/8 CAG_tdtomato) utilizzato per visualizzare il citoplasma di oligodendrociti. Pertanto, la combinazione di AAV2/8 MBP_mito_dsred con CAG_GFP di AAV 2/8 dà rossi mitocondri e citoplasma verde negli oligodendrociti, mentre combinando AAV2/8 MBP_mito_GFP e AAV 2/8 CAG_tdtomato dà verdi mitocondri e citoplasma rosso. I costrutti sono descritti in maggior dettaglio altrove 13.
  2. Il giorno 7 in vitro (DIV7), trasducono i oligodendrocytes con gli adenoassociati.
    Attenzione: Seguire le norme di sicurezza per l'utilizzo con AAVs. Assicurarsi di avere una formazione adeguata e l'approvazione di livello di biosicurezza richiesto. Tutti i seguenti punti dovrebbero essere effettuati in un armadio di sicurezza biologica classe II utilizzando guanti e camice da laboratorio. Qui, applicazione di AAV per la zona della corteccia delle fette è descritto, in quanto questa è l'area che mostra il miglior recupero. Terreno di coltura
    1. diluire l'AAV in pre-riscaldata (37 ° C). Per ottenere una trasduzione sparse degli oligodendrociti che permette l'imaging delle singole cellule all'interno della slice si consigliano diluizioni circa 2 × 10 9 copie di genoma/mL (GC/mL). Tuttavia, un pilota utilizzando diversi titoli dovrebbe essere fatto per garantire una densità degli oligodendrociti trasdotte che è adatta per gli esperimenti specifici. Se vengono utilizzati due diversi AAVs, devono essere mescolati nella stessa soluzione e aggiunto alla sezione simultaneamente.
    2. Aggiungere circa 1,3 µ l diluito AAV per ogni fetta: assicurarsi che l'esterno della punta della pipetta sia asciutto. 1,3 µ l diluito AAV e tenere la pipetta sopra la corteccia, più vicino possibile senza toccare la fetta con la punta della pipetta (a circa 1 mm).
    3. Poi spingere lentamente la soluzione fuori la pipetta. Quando la soluzione tocca la fetta, spostare la punta della pipetta sopra la corteccia per diffondere la soluzione sopra la zona intera corteccia.
      Nota: Questa procedura deve essere eseguita velocemente quanto possibile di evitare di tenere le fette fuori della cappa più del necessario. Fare questo su un piatto al momento e mettere il primo piatto indietro nell'incubatrice prima di iniziare il piatto #2. Per ottenere una distribuzione soddisfacente di AAV senza danneggiare il tessuto richiede una certa pratica e una mano ferma.
  3. Se un microscopio a fluorescenza in posizione verticale è disponibile in laboratorio delle cellule, l'espressione della proteina può essere controllata durante il tempo nella cultura inserendo il piatto sotto il microscopio.
    Nota: Il piatto non deve essere tenuto fuori dell'incubatrice per più di 2-5 minuti.

3. Time-lapse Imaging

Nota: l'imaging può essere eseguito ogni volta che i livelli di espressione dei marcatori fluorescenti sono sufficienti e le fette un aspetto sane (solitamente DIV11-14).

  1. Assicurarsi che il microscopio, la perfusione e il riscaldamento sono impostati correttamente affinché propagati soluzione di imaging è riscaldata e può entrare ed uscire il bagno.
    Nota: Esistono varie soluzioni per le camere di bagno. Una versione semplice è presentata qui.
    1. Make in - e prese del bagno da aghi di siringhe smussata (piegate a ~ 45°) che sono attaccati ai lati della vasca di blu-tack/divertimento tack.
    2. Assicurarsi che la tubazione vada da un flacone di soluzione di imaging continuamente propagati, tramite la pompa peristaltica, attraverso il tubo di riscaldamento della caldaia e quindi l'ago della siringa di aspirazione nel bagno.
    3. Collegare un altro tubo per la presa dell'ago di siringa. Questo tubo poi va via la pompa peristaltica e torna alla bottiglia di soluzione di imaging (o a una bottiglia di scarico).
  2. Bubble soluzione di imaging (ricetta di reagenti ' tabella) con gas di biossido.
    Nota: Questo dovrebbe essere stariportati almeno 15 minuti prima di formazione immagine e continuare in tutto l'esperimento.
  3. Disabilita il pompa peristaltica e riscaldatore e soluzione di esecuzione attraverso il bagno per ottenere la temperatura ottimale (37 ± 0,5 ° C). Assicurarsi che il sensore del termometro collegato all'unità di temperatura sia immersa nella soluzione vasca.
  4. Accendere il microscopio, Lampada fluorescenza e laser appropriato.
  5. Percorso di
  6. insieme a una luce adatta per l'esempio.
    Nota: Questo può variare a seconda della sonda e l'installazione di microscopio. Conoscenza generale di come utilizzare il microscopio confocale è richiesto e non saranno trattata.
  7. Utilizzare un obiettivo a immersione in acqua con l'appropriato ingrandimento e apertura numerica (n.a.). Usiamo un acqua immersione piano-apochromat 40x (n.a. 1.0).
  8. Open pinhole per raggiungere una sezione ottica di circa 2-2,5 µm per il video time-lapse. Questo riduce l'insorgenza dei mitocondri in movimento fuori fuoco durante il time-lapse.
  9. Fetta organotypic trasferimento al bagno:
    1. aggiungere una goccia di terreno di coltura o soluzione di imaging per una piccola plastica di Petri.
    2. In una cappa sterile, uso pinze sterili per trasferire una fetta organotypic dalla membrana inserire alla goccia. Il forcipe deve solo toccare i coriandoli e non la fetta.
    3. Mettere il coperchio sul piatto Petri.
    4. Immediatamente mettere la piastra di coltura contenente il resto delle fette indietro nell'incubatore.
    5. Portare la capsula di Petri contenente fetta al microscopio.
    6. Spegnere la pompa peristaltica durante il trasferimento fetta al bagno di microscopio. In primo luogo, utilizzare pinze per sollevare coriandoli con fetta da capsula di Petri nella parte superiore della vasca (i coriandoli galleggerà). Poi mettere le due punte della pinza su ciascun lato di coriandoli che toccano i coriandoli senza toccare la fetta e spingere i coriandoli attraverso la soluzione per il fondo della vasca. Centrare i coriandoli nel mezzo della vasca.
    7. Forcipe di uso per posizionare il punto di ancoraggio di Hold-Down (arpa) in cima i coriandoli senza toccare la fetta di
    8. .
      Nota: Un'arpa è un ancoraggio di platino a forma di ferro di cavallo che è usato per prevenire la fetta da galleggianti o alla deriva nel bagno. Per fettine acute, sottili stringhe correre da una parte dell'arpa a altro (simile ad un'arpa di musica). Per fette organotipiche, l'arpa dovrebbe essere Bacelli e adattarsi alle dimensioni dei coriandoli in modo tale che può posare sopra i confetti senza toccare la fetta.
    9. Accendere pompa peristaltica.
  10. Abbassare l'obiettivo verso il basso per esempio.
  11. Selezionare la cella e regione immagine.
    Nota: Evitare l'esposizione eccessiva delle cellule di luce laser come questo può causare tossicità cellulare (vedere suggerimenti nei punti che seguono).
    1. Utilizzare gli oculari e la lampada fluorescente per trovare un aspetto sano del oligodendrocyte con l'espressione corretta. In genere, gli oligodendrociti che hanno una forte sovraespressione della proteina fluorescente appaiono malsani. Oligodendrociti malsani avrà processi con un'apparenza blobby e mitocondri appariranno frammentati. Negli oligodendrociti sani, il soma e processi appaiono uniformi e i mitocondri hanno lunghezze diverse (anche se in genere molto più breve in neuroni e astrociti 13 , 14 , 15).
    2. mettere la cella di interesse al centro del campo visivo.
    3. Uso il " live " funzione del software (per microscopi Leica e Zeiss) per identificare la cella sullo schermo e scegliere un'area di interesse, ad esempio, una parte della cella che contiene diversi processi primari o i foderi di myelin o un singolo processo o fodero di myelin.
      Nota: Per essere in grado di immagine come gran parte delle guaine/processi possibili, scegliere aree contenenti i processi che si trovava relativamente piano in direzione x-y.
    4. Ingrandire il campo di interesse (in genere producendo un'immagine con dimensione dei pixel di 0,14 - 0,30 µm).
    5. Usando il " regioni " strumento, disegnare un rettangolo intorno all'area e scegliere l'opzione di scansione solo l'area selezionata. Scansione di tempo e quindi l'esposizione laser, è ridotto da solo la scansione della regione selezionata.
      Nota: Aree rettangolari orizzontali verranno analizzate più veloce di regioni verticali a causa del numero più corto di linee di scansione necessarie. Se una regione di rettangolo verticale viene analizzata, il tempo di scansione può essere ridotto il campo di scansione rotante di 90 gradi (utilizzando lo strumento di rotazione).
  12. Regolare potenza laser e guadagno per ottenere una buona vista sui mitocondri.
    Nota: Utilizzare la potenza del laser minima necessaria. Se possibile, alzare il guadagno piuttosto che il crescente potere del laser. Oltre a causare tossicità cellulare, troppo ad alta potenza laser sarà candeggina gli oggetti acquisiti nel tempo, richiedendo così un ulteriore aumento della potenza del laser o di guadagno durante la scansione. La potenza del laser richiesto e il guadagno dipenderà il livello di espressione e il microscopio. Con un microscopio confocale LSM700, usiamo un 555 nm laser con una potenza di 20-40 µW a immagine dsred o tdtomato e 488 nm laser viene utilizzato in 20-30 µW per immagine GFP (potenza laser misurata presso l'apertura posteriore dell'obiettivo). Guadagno è impostato alta per l'imaging in vivo, solitamente nella gamma di 700-800 per GFP e 850-980 per dsred e tdtomato. L'alto guadagno potrebbe causare qualche altro rumore di fondo, che viene rimosso aumentando il digitale offset (offset valori laici in genere tra 0 e 15). Nella nostra esperienza, utilizzando MBP_mito_GFP dà un migliore segnale-rumore di MBP_mito_dsred.
  13. Velocità di scansione
  14. select.
    Nota: Ridurre al minimo il tempo di scansione utilizzando una velocità di scansione veloce e disegnando una piccola regione di scansione (vedere punto 4.10.5 qui sotto). È anche possibile salvare il tempo di scansione eseguendo una scansione bidirezionale. Tuttavia, questo non è consigliato a causa di qualità di immagine inferiore.
  15. Set di frequenza e la durata di registrazione time-lapse, ad esempio catturare immagini ogni 2 secondi per un totale di 20 minuti per l'imaging mitocondriale negli oligodendrociti.
    Nota: La frequenza e la durata deve essere impostati secondo la mobilità degli oggetti di interesse. Una maggiore frequenza esporrà l'esemplare più luce di laser, ma oggetti in veloce movimento richiedono anche una durata totale di time-lapse video (ad es. mitocondri nei neuroni, che si muovono più frequentemente e a una velocità molto superiore a mitocondri in oligodendrociti, sono in genere imaged ogni secondo per un totale di 2 minuti 16).
  16. Avviare la registrazione time-lapse.
    Nota: I mitocondri possono spostare fuori fuoco o deriva dalla regione imaged durante la registrazione. Per ridurre al minimo le vibrazioni e il movimento, regolare in - e prese del bagno e ridurre la velocità della pompa se necessario. Piccole modifiche a fuoco solitamente ancora verificarsi. Così, il monitoraggio continuo dello schermo durante la formazione immagine è richiesto, con piccole regolazioni della messa a fuoco durante la registrazione.
  17. Catturare uno z-stack di tutta la cella per la futura identificazione della cella ed imaged processo.
    Nota: Per una migliore risoluzione, il foro stenopeico deve essere reimpostato su 1 unità arioso per lo stack di z.
  18. Optional: visualizzare mielina non macchia.
    Nota: Negli oligodendrociti trasformati con GFP (citoplasmatica), i foderi di myelin può essere identificati solitamente come linee rette del citoplasma (le creste citoplasmatiche) collegati ad un processo primario (Vedi Figura 2 A e B). Tuttavia, se espressione di GFP è troppo debole o un marcatore citoplasmatico non viene utilizzato, è possibile visualizzare la guaina mielinica da microscopia confocal di riflessione (CoRe), come spiegato qui.
    1. Impostare un nuovo percorso di luce nel software con eccitazione laser a 488 nm e cattura emesso luce intorno alla stessa lunghezza d'onda, ad es. 470-500 nm.
    2. Regolazione potenza del laser e guadagnare fino a quando la mielina è visibile (vedere esempio in < forte classe = "Xfig "> figura 3). Utilizzando un microscopio di LSM 510 Meta, generalmente utilizziamo un laser potente di 7-12 µW (misurata l'apertura posteriore dell'obiettivo).
  19. Optional: preparazione delle fette per immunostaining.
    1. Se la cella imaged deve essere identificata dopo che immunostaining, acquisire un'immagine di basso ingrandimento (10x) della cella e indicare la sua posizione nell'immagine disegnando una freccia o simili. Per facilitare il rilevamento della cella, è consigliabile anche disegnare una mappa manuale della fetta intera, che indica la posizione della cella.
    2. Fix affettare in paraformaldeide al 4% (PFA) agitatore per 1 ora a temperatura ambiente.
      Attenzione: PFA è nocivo. Utilizzare indumenti e solo in un cappuccio ventilato.
    3. Diluire il fissativo 01:10 in PBS e lasciare a 4 ° C fino a partire immunohistochemistry come descritto altrove 17.
      Nota: Sebbene fette possono essere lasciati in fissativo diluito per diverse settimane, fluorescenza può sbiadire. Esecuzione di immunohistochemistry entro 10 giorni della fissazione è raccomandato.

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Representative Results

Fettine di cervello organotipiche che sono state coltivate e trasdotte come sopra descritto ha mostrato una distribuzione sparsa di oligodendrociti corticali esprimendo mito_dsred e GFP. Immunostaining con gli anticorpi contro Olig2 e MBP ha confermato che l'espressione era specifico per gli oligodendrociti (Figura 1).

Per l'imaging in vivo, gli oligodendrociti trasdotte sono stati riconosciuti dalla loro morfologia caratteristica di foderi di myelin diversi in esecuzione in parallelo (Figura 1 e Figura 2A). Eseguendo i oligodendrocytes trasdotte time-lapse imaging, è possibile monitorare il movimento dei mitocondri nei processi primari e foderi di myelin (Figura 2B-D).

Nelle cellule con bassa espressione di GFP, la guaina di mielina potrebbe essere identificata durante la formazione immagine diretta illuminando il campione a 488 nm e cattura emesso luce 470-500 nm (Figura 3A). Questa tecnica di microscopia (CoRe) di Confocal di riflessione anche lavorato su PFA fissata e immunostained tessuto, sebbene mielina guaine comparso dimmer (Figura 3B-C). Immunostaining con gli anticorpi contro la proteina basica della mielina (MBP), abbiamo scoperto che quasi il 100% di foderi di myelin posa orizzontale al piano di formazione immagine (indicato da frecce, Figura 3B-C) sono visibili con CoRe, mentre la mielina guaine che laici perpendicolare al campo di vista (indicato da un asterisco, Figura 3B-C) sono meno o per niente visibile. Anche se quasi tutti gli internodi sono visualizzati, internodi molti appaiono discontinue, con piccole parti della guaina non è visibile (InserisciFigura 3A ). Queste piccole "lacune" nella mielina possono essere riempite da formazione immagine con tre lunghezze d'onda complementare, cosiddetto Punteggio9.

Figure 1
Figura 1 : Immunoistochimica conferma che MBP-mito-dsred selettivamente è espressa negli oligodendrociti che sono immune positiva per Olig2 e MBP.  Immagini sono da neocorteccia di fettine di cervello coltivati del topo trasdotte con (AAV2/8) MBP-mito-dsred (indicatore rosso, mitocondriale) e CAG-GFP (verde, cytosol). Le fette immunolabeled per il marcatore di mielina proteina basica della mielina (MBP, blu) e Olig2 (oligodendrocyte lignaggio indicatore delle cellule nucleari, magenta). (Figura per volta da riferimento13) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Time-lapse imaging per monitorare i movimenti mitocondriali negli oligodendrociti. (A) proiezione dello z-stack (sezione ottica 10,35 µm) del oligodendrocyte trasformato con MBP_mito_dsred (mitocondri rossi) e CAG_GFP (fluorescenza verde). (B) singola immagine confocale (sezione ottica 1.04 µm) della cella stessa. Piazza indica la regione che è stata selezionata per l'imaging di time-lapse (C) e sono indicate le linee disegnate per rendere chimografi (kym) a (D). (C) immagini da registrazione time-lapse della cella nella A e B presi in diversi momenti. Muovendo i mitocondri sono indicate (frecce rosse). (D) chimografi dalle traiettorie indicato in (B). I mitocondri stazionari sono visti come linee retta verticale e commoventi mitocondri sono visti come linee diagonali. Come si può vedere nella chimografi e nelle immagini di tempo-corso in (C), si stanno muovendo solo i mitocondri nel processo primario contrassegnato Kymograph 1 (Kym 1). I mitocondri nella chimografi altri tre sono stazionari durante la registrazione time-lapse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Visualizzazione della mielina non macchia da microscopia Confocal di riflessione (CoRe). (A) proiezione dello z-stack (sezione ottica 10,35 µm) da neocorteccia di una fetta di cervello organotipiche dal vivo. L'espressione di GFP in oligodendrociti mostrato qui (corpo cellulare verde) è troppo debole per l'identificazione dei processi primari e i foderi di myelin. Invece, i foderi di myelin sono stati visualizzati da eccitazione a 488 nm e cattura luce emessa a 470-500 nm (mostrato in magenta). Alcune del citoplasma ricco paranodes di GFP + del oligodendrocyte può essere visto alle punte di internodi mielina (frecce). Inserto: Parte ingrandita della guaina mielinica Mostra che la mielina visualizzata con CoRe appare discontinua o "macchia di leopardo" (Vedi il testo principale per i dettagli). (B-C) Immagini confocal dal corpo striato (B) e strato radiato dell'ippocampo CA1 (C) di una fetta di cervello di topo acuta che è stato risolto in 4% PFA e immunostained per proteina basica della mielina (MBP). I foderi di myelin horisontal (frecce) sono visibili con CoRe, mentre guaine che sono perpendicolari al campo di vista (asterischi) più spesso non sono visibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella dei reagenti: Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il protocollo per la fabbricazione di colture organotipiche descritti qui è una versione modificata18 del protocollo descritto da De Simoni e Yu (2006)5. Le modifiche più importanti sono state delineate di seguito. Tampone Tris è aggiunto al terreno di coltura, che migliora la sopravvivenza delle fette quando di fuori dell'incubatore durante la trasduzione virale e dalla sostituzione della medium delle cellule. La procedura di sterilizzazione per confetti è anche cambiata. Mentre altri protocolli coriandoli sterilizzano in autoclave, si sconsiglia questo perché causerà molti dei coriandoli ad arricciarsi. Evitare l'uso di coriandoli arricciati come fette coltivate su questi tendono ad essere meno sani. Il nostro protocollo utilizza topi, ratti non e viene modificato per cultura la corteccia invece l'ippocampo, che troviamo funziona bene con fette sottili (230 µm vs 300 µm). Come mielinizzazione picchi intorno postnatale giorno 10-20 in topi e ratti19, culture effettuata in topi a p7-9 (e quindi colta per 11-14 giorni) sono ottimali per studiare i oligodendrocytes myelinating. Alle 11-14 giorni in vitro, le culture contengono diversi oligodendrociti maturi con i foderi di myelin compatto13. Culture fatta dai più giovani topi conterrà meno oligodendrociti maturi alla fine del periodo di cultura, considerando che culture effettuata in più vecchi topi hanno mostrato più impegnative per mantenere sano20.

La procedura per fare fette organotipiche implica diversi passaggi critici. La dissezione e montaggio dei cervelli, nonché posizionare fette su coriandoli, deve essere fatto velocemente e richiede una certa abilità. In genere, i primi tentativi di fare colture organotipiche fetta sono meno successo, ma 2-3 giri di pratica dovrebbero essere sufficiente per acquisire le competenze necessarie per fare sane culture. È importante mantenere un ambiente sterile durante tutta la procedura per evitare la contaminazione delle culture. Inoltre, quando si lavora con le cellule viventi, è sempre indispensabile per garantire il corretto pH e osmolalità delle soluzioni per mantenere la salute delle cellule. È, quindi, un buon consiglio per controllare osmolalità (dovrebbe essere 270-310 mOsm/kg) e pH di tutte le soluzioni che vengono utilizzati sulle fette, specialmente quando facendo l'esperimento per la prima volta. Le soluzioni di dissezione e cultura per le colture organotipiche contengono un indicatore di pH (rosso fenolo), ma il siero giallo nel terreno di coltura può dare l'impressione di un inferiore rispetto il pH effettivo. Il terreno di coltura contiene penicillina, streptomicina e nistatina per minimizzare le probabilità di infezione. Si raccomanda pertanto di utilizzare questi antibiotici e antimicotici quando si configura la tecnica della coltura organotypic fetta in laboratorio, ma più tardi possono essere evitati applicando una tecnica asettica di esperti. L'attuale protocollo utilizza la morfologia delle cellule per valutare la vitalità cellulare. Per un esame più quantitativo, fette possono essere caricati con ioduro di propidio o coloranti simili come descritto altrove21. Tuttavia, è importante essere consapevoli del fatto che lo spettro di emissione di ioduro di propidio si sovrappone con dsred, tdtomato e altri indicatori rossi. Un'altra limitazione di ioduro di propidio e reagenti simili è che essi non entrano prontamente gli strati più profondi della fetta, limitando così la valutazione di attuabilità delle cellule per lo strato superiore delle cellule5.

Esiste una varietà di metodi per la consegna del gene. I principali vantaggi dell'utilizzo di trasduzione AAV di colture organotipiche fetta per visualizzare gli organelli sono come segue: trasduzione AAV ha un migliore tasso di successo per gli oligodendrociti postmitotic rispetto ai metodi di transfezione non virali22. Ulteriormente, in colture organotipiche sono presenti tutti i tipi di cellule del cervello, e oligodendrociti hanno una morfologia simile a quello visto in vivo, tra cui compatto mielina13. Questo è diverso da oligodendrociti in monocoltura, che mancano la comunicazione con gli assoni e quindi non rendere compatta mielina. Imaging in vitro è più facile rispetto con in vivo e offre una migliore risoluzione spaziale, che è di particolare interesse quando piccoli organelli come mitocondri di imaging. La ricerca futura mirerà a immagine in vivo, ma facce una grande sfida con le aberrazioni ottiche causate dalla guaina di mielina ricca di lipidi. Inoltre, la specificità di tropismo e promotore del sierotipo AAV possono differire tra in vivo e in vitro condizioni13,23. Nel protocollo presentato qui, AAV2/8 MBP_mito_dsred e AAV2/8 MBP_mito_GFP viene utilizzato per visualizzare i mitocondri oligodendrociti. Sierotipo AAV 2/1 è stato testato anche con MBP_mito_dsred ma infettato un numero inferiore di oligodendrociti nelle fette organotipiche (non mostrate). AAV2/8 CAG_GFP e CAG_tdtomato AAV2/8 è stato utilizzato per visualizzare il citoplasma del oligodendrocyte. Nonostante utilizzando il promotore generale di CAG per questo, AAV 2/8 CAG_GFP e CAG_tdtomato selettivamente infettati oligodendrociti, con solo un piccolo numero di astrociti e neuroni sia infettati (questi potrebbe essere facilmente identificati dal loro morfologia caratteristica). Questa selettività per gli oligodendrociti è presumibilmente dovuto il trofismo del AAV sierotipo 2/824. Tuttavia, per l'espressione dell'organello-mirati, la specificità delle cellule più alta raggiunto con il MBP - o altri promotori del oligodendrocyte-specifici è raccomandato. Altri sierotipi da noi testati con CAG_GFP erano AAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, più che infetta principalmente i neuroni e astrociti (non mostrati).

A seconda del costrutto e le condizioni sperimentali, sarà necessari modifica di trasduzione delle cellule. Se le cellule trasdotte appaiono troppo scura, provare un più lungo tempo in vitro dopo trasduzione ad aumentare l'espressione. Se le cellule appaiono luminose ma non sano, ridurre il tempo dopo la trasduzione. Se vengono trasdotti molto poche cellule, si può aumentare la concentrazione di AAV. Tuttavia, è anche possibile che il tempo in vitro dopo trasduzione è troppo lungo e che cellule trasdotte sono morti. Per i costrutti utilizzati qui, i livelli di espressione erano ottimale 4-6 giorni dopo la trasduzione. 7-8 giorni dopo la trasduzione, cellule è apparso meno sane, con processi blobby e 10 giorni dopo la trasduzione, solo poche cellule trasdotte erano visibili (non mostrato).

Questo protocollo utilizza un microscopio dritto per l'imaging dal vivo di organotipiche fette. Questo è diverso dal più mono- e co-culture che utilizzano in genere un microscopio invertito. È suboptimale per usare un microscopio rovesciato qui perché le fette devono essere messo con i coriandoli rivolto verso l'alto, che presumibilmente causa le fette essere meno sano. Uno dei vantaggi del microscopio verticale è la possibilità di aggiungere elettrofisiologia all'installazione. Inoltre, l'uso di una pompa per sostituire il terreno significa che soluzioni di droga possono facilmente essere aggiunti e rimossi durante l'imaging time-lapse. Uno svantaggio con la pompa è problemi di mantenimento fuoco causato dalle vibrazioni e dalle correnti nel bagno. Al microscopio, le cellule diventeranno gradualmente menosano. Manteniamo pertanto fette sotto il microscopio per un massimo di 1 ora. Imaged fette vengono gettati via (rifiuti speciali). Per garantire che le condizioni di formazione immagine sono ottimali, imaging delle cellule di controllo, in cui movimento mitocondriale è già ben caratterizzata, deve essere eseguito in parallelo. Per esempio, movimento mitocondriale in assoni o dendriti possono essere imaged di trasdurre fette con AAV Syn_mito_dsred 2/1 (in cui dsred espressione è guidato dal promotore della sinapsina neurone-specific) o AAV CAG_mito_dsred 2/1 (seguita da immunostaining per conferma identità cellulare). Analisi del movimento mitocondriale può essere effettuata utilizzando lo strumento kymograph Multiple in ImageJ come descritto altrove25.

Qui descriviamo CoRe per la visualizzazione della mielina non macchia durante la formazione immagine dal vivo. Confrontato con il punteggio9, che utilizza tre lunghezze d'onda di eccitazione, CoRe utilizza solo uno (488 nm) ed è quindi più semplice da implementare. Nel punteggio, tre lunghezze d'onda rivelano diversi "pezzi" della guaina mielinica e insieme danno un'immagine completa del fodero. Inoltre, il punteggio utilizzabile per rilevare la guaina mielinica strutture quali tasche citoplasmici. Con la singola lunghezza d'onda usata nel nucleo, è data una visione meno dettagliata e guaine venga granulato o discontinuo (fig. 3). Tuttavia, CoRe Visualizza vicino al 100% delle guaine mieliniche che sono orizzontali per il campo di vista. Così, il nucleo è utile per rilevazione di foderi di myelin, ma non per l'analisi delle strutture di mielina o integrità.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgements

Ringraziamo Linda Hildegard Bergersen e Magnar Bjørås per l'accesso alla cella laboratorio e attrezzature, personale Janelia biologia molecolare ha condiviso la risorsa per la produzione di virus e plasmide e Koen Vervaeke per assistenza con le misure di potenza del laser. Questo lavoro è stato finanziato dall'associazione salute norvegese, Norwegian Research Council e l'apparecchiatura di microscopia è stato finanziato da Norbrain.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose  Sigma  A9539
BD Microlance 19G BD 301500 Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas AGA 105701
Brand pipette bulbs Sigma-Aldrich Z615927 Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner) VWR 89038-530
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments 64-0106  Temperature controller - thermometer part
CaCl2 Fluka 21100
CO2  AGA 100309 CO2 for incubator
Cover glass, square Corning Thermo  Fischer Scientific 13206778 To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Delicate forceps Finescience 11063-07 For dissection
Diamond scriber pen Ted Pella Inc. 54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm VWR 612-1702 Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade Electron Microscopy Sciences #7200 Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco-Invitrogen 24010-043
Filter paper circles Schleicher & Schuell 300,220 Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack Loctite 1270884 Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2 Katrin 344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber, Warner Instruments  64-1418 Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3 Sigma H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2 Heto-Holten 96004000M Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated Gibco-Invitrogen 26050-088
KCl Sigma P9541
LCR Membrane, PTFE,  Millipore FHLC0130 Confetti 
Leica VT1200 Leica 14048142065 Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES Thermo  Fischer Scientific 42360024
MgCl2 R.P. Normapur 25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B Electron Microscopy Sciences 62411-B Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit Millipore SLGPM33RA Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm Millipore PICM03050 Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module GILSON F155001 Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaHCO3 Fluka 71628
Nunclon Delta Surface Thermo  Fischer Scientific 140675 Culture plate
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC  Zeiss 441452-9900-000  Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm VWR 291-1211
Paraformaldehyde, granular Electron Microscopy Sciences #19208
PC-R perfusion chamber SiSkiYou  15280000E Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15070-063
Petri dish 140 mm  Heger 1075 Large Petri dish 
Petri dish 92x16 mm  Sarstedt  82.1473 Medium Petri dish 
Petridish 55x14,2 mm VWR 391-0868 Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417 PBS tablets
R2 Two Channel Head  GILSON F117800 Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Large spatula for dissection
Sand paper VWR MMMA63119 Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm Finescience 14130-17 Large scissors for dissection
Scissors, 8,5  Finescience 14084-08 Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade Electron Microscopy Sciences #71972 Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm Millipore SCGPT05RE Filter to sterilize solutions
Super glue precision Loctite 1577386
Surgical scalpel blade no. 22 Swann Morton Ltd. 209 Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B Warner Instruments 64-0100 Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base Sigma  T1503
Trizma HCl Sigma T3253
Water jacketed incubator series II Forma Scientific 78653-2882 Incubator

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References

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