반대로 mitotic 에이전트 Docetaxel에 전립선 암 세포 모델의 생성

Cancer Research
 

Summary

암 치료에 저항을 질병의 진행 및 죽음에 기여 한다. 저항의 기계 론 적인 토대를 결정 하는 것입니다 치료 응답을 개선 하기 위한 중요 한. 이 원고 전립선 암 경로 해 부 하기 (PC)의 taxane 저항 셀 모델을 생성 하는 프로토콜 PC 환자에서 Docetaxel 저항 진행에 관련 된 세부 사항.

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Mohr, L., Carceles-Cordon, M., Woo, J., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J., Rodriguez-Bravo, V. Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel. J. Vis. Exp. (127), e56327, doi:10.3791/56327 (2017).

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Abstract

Microtubule 대상 에이전트 (Mta)는 다양 한 종양의 치료에 주류. 그러나, 화학요법 약물에 저항을 획득된 질병 진행의 공통 메커니즘 및 악성 종양의 전조 결정 기능 이다. 전립선 암 (PC), taxane Docetaxel 같은 Mta에 저항 치료 실패 뿐만 아니라 빈약한 예 지 및 높은 사망 율에 의해 정의 된 질병의 치명적인 단계 향해 진행을 지시 한다. 수십 년 동안 공부, 인수 저항에 기여 하는 메커니즘의 배열 완전히 이해 되지 않는다 고 따라서 이러한 고급 단계에 있는 환자를 유익할 수 있던 새로운 치료 전략의 개발에 상당한 제한이 포즈 질병입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 단계의 전립선 암의 치명적인 기능을 모방 하는 메커니즘을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 Docetaxel 내성 전립선 암 세포 라인의 세대는 인수 chemoresistance에 의해 발생. 잠재적인 제한 시간이 지남에, 저항 속성의 손실 등 셀 기반 모델에 내장에 불구 하 고이 메서드에 의해 생성 Docetaxel 저항 셀 라인 성공적으로 최근 연구에서 사용 된 및 발전 기회를 제공 우리의 치명적인 전립선 암에 인수 chemoresistance의 분자 이해.

Introduction

세포 주기 통제의 손실에 의해 발생 하는 확산의 증가 속도 암1의 특징입니다. 이 기능 속성 렌더링 암 세포 고유 셀 사이클의 주요 프로세스의 충실도에 따라 동안 S-및 M-단계는 다양 한 세포 주기 perturbing DNA 손상 또는 mitotic 결함을 유발 하는 약물의 개발을 주도하 고 있다. 비록 mitotic kinases 또는 모터 단백질의 억제제 같은 수많은 안티 mitotic 에이전트는 현재 개발 되 고 임상 시험된에서 레거시 microtubule 대상 에이전트 (Mta) 계속를 위한 유일한 임상 승인 된 접근 암2,,34유사 분열을 대상으로. Mta 중 불안정 (Vinblastine Vincristine, Vinorelbine) 또는 (taxane 파생 에이전트 Paclitaxel, Docetaxel 또는 Cabazitaxel) microtubules 안정화 및 그로 인하여 작동 mitotic 스핀 들5,6의 형성을 방지. 이 트리거는 스핀 들 어셈블리 검사점7,8, 장기간된 mitotic 체포와 배양된 세포9,10 에 최후 세포 죽음 및 종양11에에서 mitotic 결함에 결과 ,12 고 따라서 전립선 암13큰 다양 한 그들의 사이에서 암 치료에 유용.

전립선 암은 가장 자주 진단 암과 암의 주요 원인이 남자14죽음 관련. Antimitotic 에이전트 Docetaxel 등 전립선 암 환자의 생존 향상 되며이 질병15,,1617의 처리에서 주류. 불행히도, 초기 종양 수축 량에도 불구 하 고 종양 세포 치료 중 약물 저항 자주 개발. 몇 가지 세포 메커니즘 chemoresistance, apoptotic와 염증 경로, 규제 완화 등 활성화/overexpression ATP 묶는 카세트 운송업 자 같은 마약 경과 펌프의 개발 원인에 연루 되어 P-당단백질 (P-gp/ABCB1), 후자는 결과 셀18,19에서 화학요법 에이전트의 수출. Taxanes 저항 또한 tubulin isotypes 또는 tubulin 돌연변이, 약물 및 그 대상 20,21사이의 상호 작용을 방지 하는 식의 변화와 같은 다른 원인으로 연결 되었습니다. 또한, 저항 게놈 불안정성 축적 및 종양이22,23관련 되어 있다. 그러나, taxane 저항에 기여 하는 메커니즘은 완전히 이해 되지,는 분명 모양을 방지 하는 치료 전략의 부재. 따라서, 이러한 메커니즘의 해 부에 지원 실험 모델을 생성 하 고 이러한 약물 저항의 개발을 방지 하는 새로운 치료 접근을 식별 하는 긴급 한 필요가 있다.

이 문서에서 우리는 전립선 암 세포 Docetaxel 저항 (DR)의 생성을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 추가 저항 상태 식민지 대형 분석 실험 및 양적 RT-PCR를 사용 하 여 이러한 셀의 유효성을 검사 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드에 의해 생성 세포 분자 기능을 통해 다양 한 실험적인 분석 실험을 수행 하는 융통성을 제공 하는 추가 혜택으로 공개적으로 사용 가능한 인간 종양 샘플 데이터베이스에서 발견의 많은 업과의 이점을 종양 샘플에서 허용 하는 것 보다 시간의 긴 기간 치료 저항의 이러한 암 모델 수 많은 주 조직 문화, 그리고 다른 접근 들에 대 한 확장, 유전자 조작, 현미경 검사 법 방법으로 시각 고 유전자 발현에 대 한 분석. 또한, 추가로 종양 형성 및 성장 vivo에서 효과 분석 하는 쥐에 xenotrasplanted 수 있습니다. 현재, 전립선 암의 맥락에서 약물 내성 연구를 주요 대체 방법 종양 샘플의 직접 분석 이다. 이러한 샘플 유전자 발현 및 주어진된 종양의 mutational 상태에 대 한 정보를 수집 하는 매우 강력한 시스템을 제시 하는 동안 그들에 게 액세스 매우 제한 될 수 있습니다 그리고 그들은 더 조작 및 실험 분석에 대 한 유지 하기 어려운이 이 프로토콜24,25생성 된 셀 라인으로 쉽게 할 수 있습니다. 중요 한 것은, 미래에 대안 같은 환자에서 인간의 파생된 organoids의 생성 될 것 이라고 매우 강력한 도구 현재 메서드26,27대안 접근 한다. 이후 그들은 어떤 종양은 그것의 원래 환경에서 3D 컨텍스트에서 정리 것 이다, organoids 세포와 인간 종양 사이의 완벽 한 모델 될 것입니다. 그러나,이 프로토콜에서 설명 하는 실험 셀 모델은 여전히 더 많은 유지 저렴 하 고 빠른 분석에 적합. 이러한 세포 선을 공부 하 여 얻은 결과를 추정 하 고 인간의 샘플 및 3 차원 문화에서 확인 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 우리의 프로토콜은 다른 약물과 암 종류의 연구에 적용할 수 있습니다 이후 어떤 셀 라인 chemoresistance 메커니즘 연구를 셀 모델을 추구 하는 연구원에 대 한 관심의 수 있습니다. 여기에 설명 된 메서드는 어떤 실험실, 저렴 한 가격에 적용 하 고 약물 내성의 분자 및 세포 메커니즘의 예비 연구를 허용 쉽습니다.

Protocol

1. 식민지 형성 능력 (IC50)에서 50%를 일으키는 Docetaxel 농도 감소

참고:이 프로토콜에서 Docetaxel IC50 농도 평가 식민지 형성을 사용 하 여 능력입니다. 조사에 따라 세포 생존 능력 (즉, MTS 분석 실험)를 평가 하는 데 사용 하는 대체 메서드를 사용할 수 있습니다 ' 환경 설정.

  1. 성장 DU145 또는 22Rv1 75 cm 2 플라스 크에 세포와 10mm Docetaxel 미래 실험에 사용 되는 DMSO에 희석의 충분 한 재고를 준비.
  2. IC50 Docetaxel의 결정에 대 한 셀을 접시, 플라스 크에서 미디어를 제거, 신중 하 게 씻어 5 mL PBS, 셀 및 2 mL 0.05% 품 어 세포를 플라스 크 표면에서 분리를 37 ° C에서 3-5 분에 대 한 트립 신-EDTA.
  3. 신선한 미디어의 5 mL을 사용 하 여 플라스 크에서 trypsinized 셀 린스 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 원심 (300 x g, 3 분, 실 온 (RT))에 의해 셀을 펠 렛.
  4. 는 상쾌한 제거 하 고 신선한 미디어의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend는 셀. 2-2.5 x 10 5 셀/mL DU145 및 22Rv1에 대 한 10 5 셀/mL x 4-4.5 세포 현 탁 액을 희석 아래로 pipetting으로 잘 혼합 하 고 두 6 잘 플레이트의 각 음에 서 스 펜 션의 2 개 mL를 씨앗.
  5. 후 24 h, 70-80% 합류에 셀 때 추가 복용량 고조 Docetaxel 농도 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 그리고 각 잘 1000 nM. DMSO와 잘 컨트롤 Docetaxel ( 그림 2A)에 사용 되는 높은 볼륨에서 취급.
  6. 후 72 h 발음 마약 미디어를 포함 하 고 신선한 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다. 약 4-5 일 이내 번호판 얼룩에 대 한 준비가 될 것입니다.
  7. 식민지, 얼룩에 부드럽게 2-3 mL PBS로 세척 하 고 조직 문화 후드 또는 증기 두건 안쪽 20 분 동안 2-3 mL 크리스탈 바이올렛 솔루션 (0.1 w/v %10% 포 르 말린에) 그들을 품 어.
  8. H 2 O 2-3 mL에 대 한 솔루션 및 세척의 접시 얼룩 제거, H 2 O를 제거 하 고 접시 건조.
  9. 어느 Docetaxel 농도 50% (IC50) 세포 생존 능력을 감소 하는 확인 하려면 우물을 시각화 하 여 결과 분석 합니다. 수동으로 ()을 피하기 위해 같은 식민지를 두 번 계산 마커 펜의 도움으로 식민지를 계산 하 고 그래프 ( 그림 2A)에서 세포 생존 능력의 비율을 나타냅니다. 마지막으로, ( 그림 3A에서 같이) 그림 표현에 대 한 번호판의 디지털 이미지를 받아.

2. Docetaxel 내성 전립선 암 세포의 생성

참고: 세포 치료 같은 Docetaxel 솔루션 주식 결심 IC50 약의 사용을 사용 하 여 수행 (사전에 충분 한 재고를 준비 실험 사용 하 여). 항상 뭔가 잘 작동 하지 않는 경우에 이전 단계에서 세포의 작은 술병을 유지. 부모의 셀을 전체 절차를 통해 작은 술병에 병렬로 성장 하 고 Docetaxel 취급 플라스 크에 사용 금액을 흉내 낸 해당 볼륨에서 차량 (DMSO)에 노출 한다.

  1. 미디어의 20 mL를 포함 하는 150 cm 2 플라스 크에 접시 DU145 또는 22Rv1 셀 (3.5 x 10 6 세포 플라스 크 당 DU145 및 6.5 * 10에 대 한 22Rv1에 대 한 플라스 크 당 6 셀). 10 ~ 20 셀의 플라스 크를 사용 하 여 프로토콜의 끝에 충분 한 세포를가지고 것이 좋습니다.
  2. 후 24 h, 세포는 약 70-80%에서 합류 ( 그림 2B, Docetaxel 전에), 프로토콜의 1 단계에서 결정 IC50 농도에서 Docetaxel 추가 (5이이 프로토콜에서 설명 하는 셀에 대 한 nM).
  3. 후 72 h 발음 마약 미디어를 포함 하 고 신선한, Docetaxel 무료 미디어 ( 그림 2B, Docetaxel 후 72 h)를 추가 합니다. 모든 3-4 일 미디어를 변경 합니다. 약 1-2 주 이내 저항 클론 ( 그림 2B, Docetaxel 후 7 ~ 14 일) 현미경 분명 나타납니다.
  4. 미디어 발음, 신중 하 게 씻어 15 mL PBS와 셀 및 4 mL 0.05% 품 어 세포를 플라스 크 표면에서 분리를 37 ° C에서 3-5 분에 대 한 트립 신-EDTA.
  5. Resuspend 8 mL 신선한 매체를 사용 하 여 플라스 크에서 trypsinized 셀. 모든 치료 플라스 크에서 수영장 셀입니다. 원심 (300 x g, 3 분, RT)에 의해 셀을 펠 렛.
  6. 제거는 상쾌한, 셀 펠 릿 20 ml 신선한 매체의 resuspend와 150 cm 2 플라스 크에 세포 격판덮개 (3.5 x 10 6 세포 플라스 크 당 DU145 및 6.5 * 10에 대 한 22Rv1에 대 한 플라스 크 당 6 셀).
  7. 후 24 h, 세포는 약 70-80%에서 합류, 추가 5 nM Docetaxel (초기 IC50 농도) 다시.
  8. 2.3 2.6에 하루 3 단계를 반복 합니다.
  9. 후 24 h, 세포는 약 70-80%에서 합류, 2 X IC50 Docetaxel 농도와 치료 세포 (10 nM이이 프로토콜에서 설명 하는 셀에 대 한).
  10. 반복 2.3을 2.8, Docetaxel 농도의 복용량 단계적 확대를 다음 단계 (25 nM, 50 nM, 100 nM와 250 nM), 최종 높은 농도에서 플라스 크에서 성장 하는 세포의 안정 되어 있는 인구를 생성. 최대 6 개월 1000 nM 농도 ( 그림 1A)를 도달할 때까지 높은 농도 대 한 복용량 에스컬레이션 프로토콜을 구현할 수 있습니다.

3. 기능 특성의 인수 Docetaxel 저항 식민지 대형 분석 결과 의해

참고:이 프로토콜 chemoresistance 평가 식민지 대형 분석 실험을 사용 하 여. 조사에 따라 세포 생존 능력 (즉, MTS 분석 실험)를 평가 하는 데 사용 하는 대체 메서드를 사용할 수 있습니다 ' 환경 설정.

  1. 접시 2000 셀 (DU145 또는 22Rv1, 보호자 및 Docetaxel 방지) 6-잘 접시에 잘, 당 사용 하 여 미디어의 2 mL 잘 당.
  2. 후 24 h 추가 Docetaxel의 증가 농도 (부모의 셀: 0.25, 0.5, 1, 2.5 및 5 nM; 박사 셀: 50, 125, 250, 500 및 1000 nM). DU145 및 22Rv1 셀 라인에 대 한. 동일한 볼륨 높은 Docetaxel 복용량에 대 한 사용에서 컨트롤 한 잘에만 DMSO를 추가.
  3. 72 h 후 미디어를 포함 하는 약물을 발음 하 고 신선한 Docetaxel 무료 미디어 추가.
  4. 식민지 현미경 아래에서 표시 됩니다 때까지 1-2 주에 대 한 번호판을 품 어.
  5. 식민지, 얼룩에 부드럽게 2-3 mL PBS로 세척 하 고 조직 문화 후드 또는 증기 두건 안쪽 20 분 동안 2-3 mL 크리스탈 바이올렛 솔루션 (0.1 w/v %10% 포 르 말린에) 그들을 품 어.
  6. H 2 O 2-3 mL에 대 한 솔루션 및 세척의 접시 얼룩 제거, H 2 O를 제거 하 고 접시 건조.
  7. 우물을 시각화 하 고 수동으로 마커 펜 ()을 피하기 위해 같은 식민지를 두 번 계산의 도움으로 식민지를 계산 하 여 결과 분석 하 고 그래프에서 세포 생존 능력의 비율을 나타냅니다. 그림 표현 ( 그림 3A)에 대 한 번호판의 디지털 이미지.

4. Phenotypic 특성의 Docetaxel 저항 인수 형 qRT-PCR 분석 통해

참고: Docetaxel (DR) 내성 세포 전시 그들의 부모의 세포 라인에 비해 다른 식 프로필 28 , 29. 따라서 선택의 성공 qRT-PCR에 의해 확인할 수 있습니다 특정 표식에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 (뇌관 시퀀스에 대 한 참조 자료 섹션; 대 한 자세한 내용은, 결과 섹션을 참조 하십시오). 이 세 번째 라운드 후 시작 선택의 각 라운드 후 할 수 있습니다. 또는, 서쪽 blotting에 의해 Docetaxel 저항 표현 형의 평가 또한 가능 하다.

  • RNA 추출 키트를 사용 하 고 제조 업체에 따라 보호자와 Docetaxel 내성 세포에서 RNA 추출
      ' s 지침 (테이블의 재료 및 시 약 대 한 자세한 내용은 참조). 최소를 사용 하 여 1-2 10 6 셀 x 좋습니다. 분 광 광도 계를 사용 하 여
    1. 계량 RNA 260 nm absorbance 최고의 순도, 260 nm/280 nm 흡 광도 비율 2.0에 가까운 이어야 합니다.
    2. Perform 역방향 역방향 전송 키트를 사용 하 고 제조 업체에 따라 보완 DNA (cDNA)를 전사 ' s 지침 (참조 테이블의 자료와 정보에 대 한 시 약), 20 µ L에서 RNA의 1 µ g를 사용 하 여 반응 혼합 (cDNA의 높은 금액 필요한 경우, 그에 따라 반응 혼합 최대 규모).
    3. 관심사의 각 유전자에 대 한 다음과 같은 3 중에서 정량 반응을 준비:
      -2 µ L 10 µ M 앞으로 뇌관의
      -2 µ L 10 µ M 역 뇌관의
      -10 µ L SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스
      -5 µ L H 2 O
      -1 µ L의 4.3 단계에서 새로 준비 된 cDNA.
      주:이 프로토콜에 사용 되는 뇌관의 시퀀스에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.
    4. PCR 프로그램을 다음과 같이 설정:
      -15 분 동안 95 ° C
      -94 ° C 30에 대 한 s |
      -40 56 ° C s | 40 번
      -72 ° C 30에 대 한 s |
    5. 정량 결과 분석 하 고 부모의 사이 유전자 발현에 변화를 확인 하 고 박사 샘플, 관심사의 각 유전자의 사이클 임계값 (Ct) 값 3 중에 결정 됩니다 평균 로드 제어 (말라 triplicate 평균으로 정규화 ) 박사 (박사 Ct) 및 부모의 셀 (부모의 Ct). 부모 셀에 대 한 값을 1로 정규화 됩니다. ΔCt (Ct 박사-부모의 Ct) 최종 mRNA 배 변화를 결정 하 고 그래프에 표시. 증가 > 2 또는의 감소 < 0.5 중요 하 게 고려 하 고는 Docetaxel의 설립의 좋은 유효성 검사 인수 저항 형 ( 그림 3B).
  • Representative Results

    이 의정서는 Docetaxel 저항 (DR) 전립선 암 세포의 생성으로 이어질 것입니다. 완료에 대 한 타임 라인 프로토콜의 단계 그림 1A그림 1B의 도식 표현에 요약 된 대로 7 개월 4에서 범위 수 있습니다. 시간 투자 수 선택의 셀 라인 및 프로토콜에 설명 된 대로 사용 하는 약물 농도의 범위에 따라 달라 집니다. 중요 한 것은, 각 셀 라인 Docetaxel IC50 농도의 결정 선택 (그림 2A)의 셀에 대 한 프로토콜에서 사용 하 여 농도 범위를 확대 하는 약물의 디자인 수 있습니다. 프로토콜이 시작 되 면 모니터링 프로토콜 제대로 작동 하는 경우를 현미경 아래 다른 시간 지점에서 DU145 및 22Rv1 세포에 초기 Docetaxel 효과 관찰할 수 있습니다. 시간 포인트 Docetaxel 처리 과정을 모니터링 하는 제안: 72 h, 7 일 및 14 일에 대 한 Docetaxel 노출 후 Docetaxel 노출 (초기), 전에. 종양 세포의 단지 소수 민족 Docetaxel 노출 생존과 생성 (그림 2B) 현미경 관찰 될 수 있는 클론 note.

    대표적인 식민지 대형 분석 실험 및 보호자의 부 량 그래프와 새로 생성 된 Docetaxel (DR) 내성 세포 그림 3A에서 표시 됩니다. Note 생성된 Docetaxel 내성 세포 약물 농도 부모의 셀 보다 더 높은 최대 1,000-fold 살아남을 수 있습니다.

    마지막으로, Docetaxel 저항 표현 형 qRT-PCR (그림 3B)에 의해 유효성 수 있습니다. Note Docetaxel 내성 세포, 부모 세포에 비해 특성 최대-ABCB1 GATA2의 규정과 다운 레 귤 레이 션 CK19 및 CDH1의 표시. 때문에 우리는 이미 실험적으로 우리의 이전 게시 작업 GATA2 upregulation에 두 박사 셀 모델,2829CDH1 함께 CK19의 downregulation이이 유전자는 유효성 검사에 대 한 선정 됐다. ABCB1 유전자 약물 내성 세포18,19upregulated 일관 되도록 다른 사람에 의해 표시 되었습니다 주식 유전자로도 선정 되었다. 그러나, 그것은 문학에 따르면 고 셀 모델와 연구원에 의해 저항 세포 생성을 위해 선택 하는 약물에 따라 다른 유전자를 선택할 수 있습니다 주의 하는 것이 중요.

    Figure 1
    그림 1: Docetaxel 내성 전립선 암 세포 모델의 생성에 대 한 타임 라인. (A) Docetaxel 저항 셀 모델의 생성에 대 한 프로토콜 타임 라인의 대표 다이어그램. 그림 묘사 Docetaxel 처리, 유효성 검사 단계 및 각 부분에 필요한 시간. 보호자 및 Docetaxel 방지 셀 (빨간색)에서 72 h에 대 한 표시 Docetaxel 농도와 치료의 기능 식민지 대형 분석 실험을 포함 하는 프로토콜의 유효성 검사 단계 (B) 회로도 표현을 대표 식민지 비율과 qRT-PCR phenotypic 유효성 검사에 대 한 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 2
    그림 2: Docetaxel 내성 전립선 암 세포 모델 시스템의 생성. (A) 다이어그램 부모의 전립선 암 세포 선 DU145 및 22Rv1에서에서 Docetaxel IC50의 묘사 (프로토콜의 1 단계). 세포 생존 능력 및 복용량 고조 농도 필요 Docetaxel의 예상된 비율 포함 되어 있습니다. 대표 DU145 및 22Rv1 세포 생존 그래프 5를 나타내는 IC50 Docetaxel 노출의 72 h 포함 후로 nM. 실험은 triplicates 및 데이터 DU145의 평균 ± sd (B). 대표적인 밝은 분야 현미경 이미지 나타내고 22Rv1 세포에서 Docetaxel 저항 (프로토콜의 2 단계)의 생성 하는 동안 시간 표시. 빨간색 화살표 프로토콜 완료 Docetaxel 저항 복제를 나타냅니다. 스케일 바 = 50 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 3
    그림 3: Docetaxel 저항 셀 모델의 기능 및 phenotypic 특성. (A) 보호자 및 Docetaxel 방지 셀 표시 Docetaxel 농도 72 h. 식민지의 비율에 대 한 모든 치료 농도 포함된 그래프에 표시 됩니다에 대 한 치료의 대표적인 식민지 대형 분석. 실험은 triplicates 및 데이터가 나타내는 sd. 스케일 바 평균 ± 5 mm. (B) 박사/부모의 상대 mRNA 배 증가 = ABCB1의 qRT-PCR에 의해 계량 GATA2, CK19 및 CDH1 표시 됩니다. 말라에 모든 정량 원시 데이터 정규화 (자세한 내용은 프로토콜 참조). 실험은 triplicates 및 데이터 대표 평균 ± sd. * p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Discussion

    이 원고에서는 우리 chemoresistance 표현 형의 획득에 기여 하는 메커니즘의 연구에 대 한 수 Docetaxel 내성 전립선 암 세포 모델 시스템을 생성 하는 방법 설명. 이 접근은 매우 안정적이 고 재현, 일부 잠재적인 제한 사항은 고려해 야 합니다. 이후만 셀의 대량 인구의 극히 chemoresistance28을 전시할 것 이다, 것이 좋습니다 세포의 큰 인구와 함께 시작 (우리가 일반적으로 약 1.2 x 10에 대 한 계정을 150 cm2, 20 플라스 크 플레이트8 셀)입니다. 프로토콜의 주요 단계는 절차의 성공을 보장 하기 위해 고려 되어야 한다. 첫째, 그것은 매우 사용 같은 Docetaxel 갓 긴 기간 사용 (10 m m 재고-80 ° C에서에 제대로 저장 될 때 년에 aliquots를 사용할 수 있습니다)에 대 한 재고를 준비 하는 것이 중요. Aliquot Docetaxel에 약간의 변화 IC50, 셀 라인 타이밍의 세대의 결과 식민지 형성 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 그것은 유사 세포의 새로운 배치를 사용 하는 경우 발생할 수 있으므로 각 개별 셀 라인, IC50를 결정 하는 프로토콜을 시작 하는 중요 한. 셋째, 오류 수 있습니다 신속 하 게 감지 하 고 수정 현미경 세포를 자주 확인 하 여 약물 치료는 효과적인 모니터링에 필수적 이다. 마지막으로, 오염 또는 프로토콜 가운데 세포의 생존 능력에 영향을 미칠 수 있는 예기치 않은 문제 중간 단계의 재고를 항상 유지 하 고 좋습니다. 중요 한 것은, 우리의 프로토콜 72 h 뒤에 약의 더 낮은 일정 농도 보다는 긴 회복 기간, 최고의 모방 하려고 Docetaxel의 고용량을 전립선 암 세포를 노출 하 여 약물 내성의 모델을 생성 하는 것을 목표로 임상 시나리오가 taxane 에이전트15,16전립선 암 치료에 대 한 보고.

    또한, 약물 내성 세포 전시 시간이 지남에 인수 저항 속성의 진보적인 손실로 이어질 수 있는 높은 소성을 주목 한다. 따라서 문화에 2-3 개월 이상에 대 한 이러한 세포를 사용 하 여 확장는 권장 하지 않습니다. 영구적인 공급 필요 하다 면 그것은 지속적으로 저항 세포의 새 일괄 처리를 생성 하는 것이 좋습니다. 그러나, 만약 셀의 일괄 처리 오랜된 시간 동안 경작 되는, 식민지 대형 분석 실험 및 정량 그들의 저항을 재평가 하 사용할 수 있습니다. 또 다른 대안은 72 h (500-1000 nM) Docetaxel의 높은 복용량으로 세포를 치료 하 여 말기 저항을 높일 것 이다. 1 ~ 2 주간의 회복 기간 후 phenotype 시험 될 수 있다 다시 정량 및 식민지 형성에 의해 분석 실험. 그것도 가능, 치료 세포의 aliquots (FBS, 10 %DMSO)에서 액체 질소에 저장을 권장 되지는 않지만. 그 후 동결-해 동 주기 chemoresistance 형 항상 다시 평가 해야 상기 방법으로 note 하시기 바랍니다.

    이러한 경고에도 불구 하 고 우리28,2930,31,,3233 키 소설 세포를 식별 하기 위해 이러한 모델 시스템을 성공적으로 수 있었다 고 분자 메커니즘을 선도 높은 종양을 시작, 세포 생존, 용량과 Docetaxel 내성 세포에 공격. 이러한 암 세포 모델 시스템을 사용 하 여, 우리는 세포가 상피 및 전립선 관련 분화 마커의 부재와 대상의 overexpression 발달 특징 undifferentiated 형 전시 발견 (노치 및 고슴도치) 신호 경로, 화학요법 노출28살. 두 번째 연구에서 공개적으로 사용 가능한 환자 유전자 데이터 세트24,25, 함께이 모델을 사용 하 여 우리가 발견 그 초기 전사 요소 GATA2는 높은 overexpressed 전이성에 거세 저항 화학 요법에 저항력이 전립선 암 세포입니다. GATA2 신호 네트워크29IGF2 종속 다운스트림 키를 직접 활성화 하 여 세포의 생존을 증가 시킵니다. 특히, 이러한 연구 고급 전이성 전립선 암 공격34GATA2의 소설 키 역할을 식별 하는 데 도움이.

    그것은 많은 다른 유형의 다양 한 화학요법 약물으로 치료 하는 암 중 널리 퍼진 약물 저항의 개발 Docetaxel과 전립선 암에 국한 되지 않습니다 하는 문제입니다. 실제로, 실험 모델의 가용성에 유사한 제한이 적용, 그리고 그것은 우리의 프로토콜 다른 암 종류 및 그들의 각각 chemoresistance 메커니즘 연구에 적용할 수 있습니다.

    이 프로토콜에서 설명 된 대로 Docetaxel 저항 세포의 생성 chemoresistance의 소설 관련 분자 및 세포 메커니즘을 식별 하는 기능적 도구로 사용할 수 있습니다. 이는 높은 악성 전립선 암에 대 한 새로운 치료법의 개발 수 똑, 우리가이 질병에 대해 무엇을 알고 하 고 우리는 환자를 치료 하는 방법의 경계를 한 번 더 밀고 새로운 목표를 찾아내기에 문을 엽니다.

    Disclosures

    저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

    Acknowledgments

    V.R.-B. 건강의 미국 부 로부터 자금을 받습니다 & 번호 1를 부여 하는 인간 서비스, 국립 보건원, 국립 암 연구소 K22 CA207458-01 '과 법학. 건강의 미국 부 로부터 자금을 받습니다 & 번호 1를 부여 하는 인간 서비스, 국립 보건원, 국립 암 연구소 R01 CA207311-01.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DU145 cells ATCC HTB-81
    22Rv1 cells ATCC CRL-2505
    Docetaxel Selleck Chemicals S1148 in DMSO (10mM)
    Tissue culture flask 150cm2 Falcon 355001
    6-well tissue culture plates Falcon 353046
    RPMI 1640 Medium Gibco 11875093 Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin
    Foundation B Fetal Bovine Serum Gemini 900208
    1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CM
    0.05%Trypsin-EDTA Gibco 25300-062
    Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
    RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
    SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR Invitrogen 18080051
    Power SYBR Green PCR Master Mix Invitrogen 4367659
    Crystal Violet Sigma-Aldrich C0775
    10% Formalin Solution Sigma-Aldrich HT501128
    Primers for qRT-PCR: Life technologies
    CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT
    CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT
    CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC
    CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC
    ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA
    ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG
    GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA
    GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA
    ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC
    ACTIN R: CTCCTTAATGTCACGCACGAT

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