Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi presenterer en protokoll for nøyaktig quantitate proteiner med isobar merking, omfattende fraksjoneres, Bioinformatikk verktøy og kvalitet skritt i kombinasjon med flytende kromatografi interfaced til en høy oppløsning masse spectrometer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J. H., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mange eksepsjonelle fremskritt har blitt gjort i massespektrometri (MS)-basert Proteomikk, med bestemte tekniske fremskritt i flytende kromatografi (Langbane) koblet til tandem massespektrometri (LC-MS/MS) og isobar merking multipleksing kapasitet. Her introduserer vi en dyp-Proteomikk profilering protokoll som kombinerer 10-plex tandem masse tag (TMT) merkingsteknikker med en omfattende LC/LC--MS-/ MS plattform og etter MS databehandlingsressurs støy korreksjon til nøyaktig quantitate hele proteomes. Denne protokollen omfatter følgende hovedtrinn: protein utvinning og fordøyelsen, TMT merking, 2-dimensjonal (2D) LC, høyoppløselig massespektrometri og beregningsorientert databehandling. Kvalitetskontroll trinn er inkludert for feilsøking og evaluere eksperimentell variasjoner. Mer enn 10.000 proteiner i pattedyr prøver kan være trygt quantitated med denne protokollen. Denne protokollen kan også brukes på kvantifisering av innlegg translasjonsforskning endringer med mindre endringer. Denne multiplekset, robust metoden gir et kraftig verktøy for proteomic analyse i en rekke komplekse eksempler, inkludert cellekultur, dyr vev og menneskelige kliniske prøver.

Introduction

Fremskritt innen neste generasjons sekvensering teknologi har ført til et nytt landskap for å studere biologiske systemer og menneskelig sykdom. Dette har tillatt en rekke målinger av genomet, transcriptome, proteom, metabolome og andre molekylære systemer bli håndgripelig. Massespektrometri (MS) er en av de mest følsomme metodene i analytisk kjemi, og dens anvendelse i Proteomikk har ekspandert etter sekvensering av det menneskelige genomet. I feltet Proteomikk har de siste årene gitt store tekniske fremskritt i baserte kvantitative analyser, inkludert isobar merking og multipleksing evne kombinert med omfattende flytende Ture, i tillegg til instrumentering fremskritt, slik at for raskere og mer presise målinger med mindre utvalg materialer kreves. Kvantitativ Proteomikk har blitt en mainstream tilnærming for profilering titusenvis av proteiner og posttranslational endringer i svært komplekse biologiske prøver1,2,3,4 , 5 , 6.

Multiplex isobar merking metoder som isobar koden for relative og absolutte kvantifisering (dvs., iTRAQ) og tandem masse tag (TMT) MS har kraftig forbedret utvalg ytelse og økt antall eksempler som kan analyseres i en enkelt eksperiment1,6,7,8. Sammen med andre baserte kvantifisering metoder, for eksempel etikett-fri kvantifisering og stabil isotop merking med aminosyrer i cellekultur (dvs.SILAC), potensialet i disse teknikkene i Proteomikk er feltet betydelig9 ,10,11. For eksempel tillater metoden TMT 10 protein prøver skal analyseres sammen i 1 eksperiment ved hjelp av 10-plex reagenser. Disse strukturelt identiske TMT koder har samme totale massen, men tung isotoper er ulikt fordelt på karbon eller nitrogen-atomer, noe som resulterer i en unik reporter ion under MS-/ MS fragmentering av hver kode, og dermed muliggjør relativ kvantifisering mellom 10 prøvene. TMT strategien brukes rutinemessig studere biologiske banene og sykdomsprogresjon cellulære prosesser12,13,14.

Tekniske forbedringer har forbedret flytende kromatografi (Langbane)-MS-/ MS systemer, både LC separasjoner og MS parametere, for å maksimere protein identifikasjon uten å ofre kvantifisering nøyaktighet. Første dimensjon utskillelse av peptider ved en separasjon teknikk med høy orthogonality til den andre dimensjonen er avgjørende i denne typen hagle Proteomikk metode for å oppnå maksimale resultater20. Høy pH reverseres-fase flytende kromatografi (RPLC) gir bedre ytelse enn konvensjonelle sterk cation exchange kromatografi20. Høy pH RPLC er kombinert med en andre dimensjon av lav-pH RPLC, er både analytisk dynamisk område og protein dekning forbedret, resulterer i evnen til å identifisere mesteparten av uttrykt proteiner under hele-proteom analyser15 ,16,17,18. Andre tekniske fremskritt inkluderer små C18 partikler (1,9 µm) og utvidet lang kolonne (~ 1 m)19. Videre inkluderer andre kjente forbedringer nye versjoner av masse spektrometre med rask skanning priser, fingerfølsomhet og oppløsning20og sofistikert bioinformatikk rørledninger for MS data mining21.

Her beskriver vi en detaljert protokoll som inneholder de nyeste metodikkene med endringer for å forbedre både følsomhet og gjennomstrømning, mens fokus på kvalitet kontrollmekanismer hele eksperimentet. Protokollen inneholder protein utvinning og fordøyelsen, TMT 10-plex merking, grunnleggende pH og syre pH RPLC fraksjoneres, høy oppløsning MS oppdagelsen, og MS behandling (figur 1). Videre implementere vi flere kvalitetskontroll trinn for feilsøking og evaluering av eksperimentell variasjoner. Denne detaljerte protokollen er ment å hjelpe forskere nye feltet rutinemessig identifisere og nøyaktig quantitate tusenvis av proteiner fra en lysate eller vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

forsiktig: ta kontakt med alle relevante Produktdatablad (i.e. MSDS) før bruk. Kan bruke alle nødvendige sikkerhets praksis når denne protokollen.

Merk: et TMT 10-plex isobar etiketten reagens sett brukes i denne protokollen for proteom kvantifisering av 10 prøver.

1. forberedelse av celler/vev

Merk: det er viktig å samle eksempler i minimal tid ved lav temperatur å holde proteiner i den opprinnelige biologiske tilstanden.

  1. Vask tilhenger celler (f.eks, HEK 293 celler) på en 10 cm plate to ganger med 10 mL av is kaldt fosfat-bufret saltvann (PBS). Skrape og samle celler (~ 2 x 10 6 celler) i 1 mL av PBS. Overføre til 1,5 mL rør og fjerne PBS etter sentrifugering 600 x g i 5 min på 4 ° C. Store celle pellets ved-80 ° C til lysis.
    Merk: Et pilotprosjekt utføres ofte for å undersøke protein avkastning. Ca 1 mg av proteiner kan hentes fra 10 x 10 6 pattedyrceller eller en 15 cm plate med 80% samløpet.
  2. Lyse eventuelt tilhenger celler på tallerkenen ved å legge lyseringsbuffer direkte til platen etter vask. Samle inn lysates inn i 1,5 mL rør og bruke protokollen beskrivelsen i trinn 2.5.
  3. Samle suspensjon celler i 15 mL rør, vask to ganger med 10 mL av is kaldt PBS, overføre til 1,5 mL rør og sentrifuge 600 x g fjerne PBS. Fjern PBS fra vask trinnene helt å opprettholde ønsket konsentrasjonen av lysis buffer ingredienser. Lagre celle pellets ved-80 ° C til lysis.
  4. Samle og veie vev raskt. Holde vev i flytende nitrogen umiddelbart etter disseksjon og butikk på-80 ° C.
    Merk: Protein avkastningen av vev er ca 5% til 10% av vev vekt
  5. bruke homogen vev størrelser og anatomisk områder for 10 prøver for å redusere utvalget heterogenitet. Fjerne blod forurensning av skylling prøver to ganger med 1 mL av is kaldt PBS å unngå svært rikt Blodproteiner påvirker protein kvantifisering og nedstrøms dataanalyse.

2. Protein utvinning, kvalitetskontroll Western Blotting, i-løsning fordøyelsen og peptid avsalte

Merk: håndtering av hver av 10 eksempler på samme måte i alle trinn før av TMT-merket prøver er avgjørende for å redusere variant.

  1. Gjør lyseringsbuffer (50 mM HEPES [pH 8.5], 8 M urea og 0,5% natrium deoxycholate) dagen av eksperimentet.
    Merk: Delvis protein rødsprit under eksempel lysis påvirker protein fordøyelse effektivitet.
  2. Legg til lysis buffer slik at forholdet mellom eksempel volum-buffer er 10:1 og ~ 20% av det siste bindet av glassperler (0,5 mm diameter) til celle pellets eller vev (f.eks, 10: 1 Volumforholdet mellom buffer og prøver) å oppnå en siste protein konsentrasjon av 5 til 10 mg/mL. Holde alle 10 prøver den samme konsentrasjonen av vurderer antall celler brukes eller vev vekt hver prøve.
  3. Behold urea konsentrasjonen på 8 M legger til solid urea i utvalget. Husk å vurdere volumet av cellen pellets eller vev når beløpet av solid urea til å prøve å oppnå 8 M konsentrasjonen.
    Merk: Un frisk urea bufferen kan introdusere kunstig kjemisk endring (dvs., protein carbamylation) og negativt påvirke antall peptider identifisert. Urea er en betydelig volum (100 mg av urea opptar ~ 73 µL i løsningen).
  4. Holde uløselig rusk i den lysate å tillate fordøyelsen av uløselig proteiner 23.
  5. Lyse prøvene i en blender på 4 ° C på hastighet 8 for 30 s, resten for 5 s, og gjenta 5 ganger eller til prøvene er homogenisert. Eksemplene kan også være lysed av vortexing for 30 s ved romtemperatur (RT) med 30 s kjøling periode på is for ~ 10 sykluser. Justere lysis betingelsene etter behov, avhengig av hvilken eksempel.
  6. Bland lysate brønnen uten sentrifugering og lage 2 små dele (~ 15 µL hver). Bruk 1 aliquot å måle protein konsentrasjon og 1 aliquot for å utføre positiv kontroll validering ved western blot analyse. Holde de gjenværende store aliquot for Proteomikk analyse.
  7. Mål protein konsentrasjon av en standard protein kvantifisering analysen eller en Coomassie-farget kort natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel (10%) 22 med bovin serum albumin (BSA) som standard. Bruk en BSA standard med en høy grad av kjente konsentrasjon nøyaktighet. For å oppnå den høyeste graden av nøyaktighet, utføre aminosyre analyse av BSA standarden.
    Merk: Andre nøyaktig standarder kan være tilgjengelige. Protein-konsentrasjoner kan også estimeres ved celle tall eller vev vekter. Selv om 1 mg protein (100 µg/sampling) anbefales, analysen kan gjennomføres med så lite som 100 µg protein (10 µg/sampling).
  8. Legg til 100% acetonitrile (ACN) å oppnå en siste konsentrasjon av 10% ACN og LysC protease på et enzym-til-underlaget forholdet mellom 1 (w/w) å fordøye proteiner under svært denaturing forhold ved RT for 2t 1: 100. Legge til dithiothreitol (DTT) i en siste konsentrasjon av 1 mM å redusere disulfide obligasjoner i proteiner og ruge for 1 h. utføre LysC fordøyelsen i en siste konsentrasjon av 7,2 M urea.
  9. Fortynne prøver 2 M urea med 50 mM HEPES (pH 8.5) og ytterligere digest prøver med trypsin på RT 3 h eller overnatting på en trypsin protein forhold 1:50 (w/w). Bruk ca 2 µg av trypsin for 100 µg protein og en trypsin konsentrasjon av ca 10 ng/µL.
    Merk: Faktorer som kan føre til ineffektiv trypsin fordøyelsen er pH problemer, inaktiv trypsin eller bruk av et upassende forhold av enzymet for substrat.
  10. Legge til DTT gi 1 mM og redusere peptider 2 h på RT.
  11. Legg til iodoacetamide (IAA) å oppnå 10 mM. Ruge på RT i 30 min i mørket for å alkylate Cys inneholder peptider.
  12. Slukke Ureagert IAA ved å legge til DTT å oppnå 30 mM og ruge i 30 min på RT.
  13. Kontrollere effektiviteten av trypsin fordøyelsen ved å undersøke en liten aliquot av hvert utvalg. Desalt ved hjelp av en 10 µL pipette tips med kromatografi media innebygd i feltet død, ifølge produsenten ' s-protokollen. Analysere hvert utvalg av LC-MS/MS. LC-MS/MS parametere er det samme som i trinn 5, med unntak at forløpningen er 10 min 23.
  14. Utfører en databasesøk for MS rådata (se flere detaljer i trinn 6) med 4 tapte cleavages som søk parameter.
    Merk: Hvis antallet tapte cleavages er > 10%, kan det tyde på ufullstendig trypsin fordøyelsen. Dette vil negativt påvirke nedstrømsresultater. Dette er et kritisk kvalitetskontroll (QC) skritt.
  15. Fordøye prøver igjen hvis de savnet Kløv er > 10% ved å legge til en ekstra 10 µL av trypsin prøvene.
  16. Syre prøvene ved å legge trifluoroacetic syre (TFA) å oppnå 1% konsentrasjon. Måle pH ved hjelp av en pH stripe. Kontroller at pH er spillmellom 2 og 3. Legge mer TFA dråpe klok (1 µL) etter behov til riktig pH oppnås.
  17. Sentrifuge 20.000 x g på RT for 10 min og samle nedbryting.
  18. Vask 0,5 til 60 µg kapasitet spinn kolonner som inneholder C18 omvendt-fase harpiks med 0,25 mL av metanol hvis bruker 100 µg prøver. Vask 0,03 30 µg kapasitet spinn kolonner med 0,25 mL 60% ACN/0.1% TFA hvis bruker 10 µg prøver. Sentrifuge spinn kolonner på 500 x g for 30 s.
  19. Likevekt kolonner med 0,5 mL 0,1% TFA og fjerne av sentrifugering 500 x g for 30 s.
  20. Laste prøver på kolonner og binde prøver til kolonner ved sentrifugering 100 x g i 3 minutter eller til alle utvalget har gått gjennom kolonnen.
  21. Legge til 0,5 mL 0,1% TFA kolonner og sentrifuger på 500 x g for 30 s.
  22. Legge til 125 µL 60% ACN/0.1% TFA til hver kolonne og elute av sentrifugering 100 x g for 3 min. sikre alle løsningen har gått gjennom kolonnen.
  23. Tørr eluents i et vakuum konsentrator. Kontroller prøvene er helt tørr og ikke flytende fortsatt i rørene. Butikken på-80 ° C til videre analyse.

3. TMT merking av peptider

Merk: det er viktig å sikre at alle prøvene er fullt merket av TMT reagenser. Flere faktorer (f.eks, mengde TMT reagenser brukes, pH-verdi og nøyaktigheten av protein kvantifisering) kan påvirke TMT merking effektivitet, som vil negativt endre alle nedstrømsresultater.

  1. Rekonstituer hver avsalte peptid prøve i 50 µL av 50 mM HEPES buffer (pH 8.5). Sjekk pH og påse at det er mellom 7 og 8.
    Merk: Utvalg kan være Sure hvis ikke tørket helt etter avsalting trinn, som vil påvirke merking effektiviteten.
  2. Holde ~ 1 µg av hver umerkede prøve for en påfølgende TMT merking effektivitet test, som beskrevet i trinn 3.3.
  3. Løses TMT reagenser i vannfri ACN og etiketten peptid prøver etter produsenten ' s instruksjoner. Inkuber reagensene på RT 1 h.
  4. Utfører en QC TMT merking effektivitet test av avsalting ~ 1 µg av hver TMT-merket og -umerkede prøve med 10 µL pipette-spisser med innebygd kromatografi media ifølge produsenten ' s-protokollen. Analysere TMT-merket og umerkede prøver av LC-MS/MS.
    Merk: LC--MS-/ MS parametere er de samme som seksjon 5, med unntak at forløpningen er 10 min.
  5. Undersøke rådata for å sikre at umerkede peptider ikke gjenkjennes i merket utvalgene, å sikre fullstendig merking effektivitet ( figur 2). Gjør dette for 6 til 10 separat peptider å bekrefte merking effektiviteten.
  6. Slukke reaksjonen ved å legge 4 µL av 5% hydroksylamin og Inkuber i 15 min.
  7. Blande en liten og like volum (2 µL) aliquot av hver TMT-merket prøve. Desalt ved hjelp av 10 µL pipette-spisser med innebygd kromatografi media. Analysere prøvene av LC-MS/MS, som beskrevet i trinn 3.4. Bruke hoppe program (en åpen kildekode-database algoritme som konverterer tandem MS raw-filer til en liste over peptider og proteiner) å bestemme relative konsentrasjon forholdet mellom alle 10 prøver av TMT tag intensiteten av alle identifisert peptider.
    Merk: Denne QC premix forholdet testen er nyttig for å bestemme riktig forholdet for lik blanding før den endelige pooling, som pipettering feil kan oppstå som vil endre konsentrasjoner og protein kvantifisering trinnet ikke alltid nøyaktig. Det er også den beste måten å sikre at mengden av 10 prøvene brukes for den endelige blandingen er alle på en tilsvarende forhold, som beskrevet i trinn 3.5.
  8. Gjenta så mange ganger som nødvendig for å oppnå en 1:1 ratio over alle 10 prøver.
  9. Like bland 10 prøvene Ifølge resultatene av premix forholdet testen. Bruke prøven med den laveste konsentrasjonen som grunnlinjen for å justere volum av andre 9 prøvene.
  10. Fjerne biprodukter av slukke reaksjonen av grupperte TMT-merket prøven ved avsalte.
  11. Vask 1 mL solid-fase utvinning patroner som inneholder 50 mg absorberende per kolonne med 1 mL/0,25 mL av metanol hvis bruker 100 µg prøver. Vask 0,5 - til 60-µg kapasitet C18 spinn kolonner med 1 mL/0,25 mL 60% ACN/0.1% TFA hvis bruker 10 µg prøver. Sentrifuge kolonner på 500 x g for 30 s.
  12. Likevekt kolonner med 0,5 mL 0,1% TFA og fjerne av sentrifugering 500 x g for 30 s.
  13. Laste prøver på kolonner og binde ved sentrifugering 100 x g i 3 minutter eller til alle utvalget har gått gjennom kolonnen.
  14. Legge til 0,5 mL 0,1% TFA kolonner og sentrifuger på 500 x g for 30 s.
  15. Legge til 125 µL 60% ACN/0.1% TFA til hver kolonne og elute av sentrifugering 100 x g for 3 min. sikre alle løsningen har gått gjennom kolonnen.
  16. Tørr eluents i et vakuum konsentrator. Kontroller prøvene er helt tørr og ikke flytende fortsatt i rørene. Butikken på-80 ° C til videre analyse.

4. Omfattende med høy oppløsning, grunnleggende pH LC Prefractionation

  1. Sett 2 sammenkoblede C18 kolonner som inneholder forente etylen hybrid partikler (4.6 mm x 25 cm, totalt 50 cm, 3,5 µm partikkelstørrelse) og bruke en mikroliter flyt høyytelses LC pumpe for fraksjoneres.
    Merk: Bruk av 2 kolonner øker peptid belastning og nødvendigvis forbedrer ikke kromatografi. For prøver som inneholder ≤ 200 µg av peptider, 1 kolonne er tilstrekkelig.
  2. Vask 100 µL loopen med påfølgende tillegg av 300 µL hver av metanol og vann buffer A (10 mM ammonium formiat, pH 8.0).
  3. Vask kolonnene med 100 µL av like blandet isopropanol, metanol, ACN, og vann og equilibrate kolonnen i 95% buffer A for 2 h.
  4. Solubilize avsalte gruppert TMT-merket peptid eksemplet i 65 µL bufferen A. Kontroller at prøven pH er ~ 8.0. Hvis fortsatt syreholdig, bruke ammonium hydroksid justere pH til 8.0.
  5. Fractionate prøven ved hjelp av følgende gradient med buffer B (buffer en pluss 90% ACN): 15% til 20% i 15 min og 20% til 35% for 100 min 35% til 50% for 30 min. satt brøkdel collector å samle fraksjoner hver 2 min inkludert lastetiden. Angi flyt til 0,4 mL/min. Se referanse 29 og figur 1 for en representant chromatogram.
  6. Samle totalt 80 fraksjoner og tørr 40 brøker (hver annen brøkdel) med en vakuum konsentrator til fullstendig tørrhet.
  7. Bruker 40 tørket prøvene for LC--MS-/ MS analyse.
  8. Analysere alle 80 fraksjoner av LC-MS/MS å oppnå ultra-dypt proteom dekning.

5. LC--MS-/ MS forberedelse og parametere

Merk: I TMT-baserte kvantifisering, peptid ioner er isobar og vises som 1 masse i en MS1 skanning. Imidlertid er de quantitated ifølge intensiteten av reporteren ioner (10 unike reporter ioner) i MS-/ MS søket etter peptid ion har blitt fragmentert med høyere energi kollisjon dissosiasjon (HCD). TMT reporter ion forholdstallene kan undertrykkes fra co elueringsrør TMT-merket ioner 24. Innsnevring ion isolasjon vinduet 25, gassfase-rensing 26, MultiNotch MS3 metoden 27 eller omfattende fraksjoneres med flerdimensjonale LC og lang graderinger (4-8 h) 28 finnes alternative tilnærminger.

  1. Pack 75 µm indre diameter (ID) tomme kolonner med 1,9 µm C18 harpiks til 30 til 40 cm lengde (~1.3 µL seng volum).
  2. Varme kolonnene på 65 ° C med en sommerfugl portefølje ovn for å redusere backpressure og unngå over å presse ultra-høy-trykk flytende kromatografi (UPLC) system. Coil kolonnen 2 til 3 ganger i sommerfugl ovnen slik at hele kolonnen sengs lengden er oppvarmet. Tape kolonnen på innsiden av ovnen er forsiktig med å tape over temperatursensoren i varmeapparatet.
    Merk: Sommerfugl portefølje ovnen er montert og tapet på et skreddersydd stykke plexiglass knyttet til XYZ scenen av instrumentet.
  3. Forberede buffer en (3% dimethyl sulfoxide og 0,2% maursyre) og buffer B (buffer en pluss 67% ACN) og vaske kolonnene grundig med 95% buffer B. Deretter fullt equilibrate kolonner i 95% buffer A (minst 3 kolonne volumer). Bruke en flow rate på ~0.25 µL/min og backpressure av 280 til 320 Språklinje
  4. Undersøke kvaliteten på LC--MS-/ MS systemet ved å kjøre 100 ng rotte hjernen peptider (eller standard vårt valg) før analysere TMT-merket prøvene. Sjekk følgende parametere jevnlig for å sikre høy kvalitet datainnsamling: undersøkelse MS signal intensitet (mellom e8 og e9 for base peak intensitet), kvaliteten på MS-/ MS spectra (en god representasjon av y og b ioner), peak bredde (12-22 s), hele tiden, LC systemtrykket (TRYKKØKNING > 50 barer angir en skitten kolonne eller tett emitter tips), og løpe bruk (identiske topper skal < 30 s mellom kjøres).
    Merk: For å løse de nær isobar reporter ionene 10-plex TMT reagenser (6.32 mDa forskjell), MS-/ MS oppløsning må være satt til minst 30 000 på 400 m/z. HCD brukes vanligvis for TMT10-plex reporter ion fragmentering, så det ikke er en tredjedel regelen som gjelder kollisjon indusert dissosiasjon (CID) ion felle instrumenter.
  5. Rene og kalibrere MS instrumentet regelmessig og bruker ferske LC buffere til å forbedre systemytelsen.
  6. Gjeninnføre de tørket peptidene fra grunnleggende pH separasjon i 5% TFA.
  7. Last ~0.2 µg på kolonnen mens flytende 5% buffer A.
  8. Elute med 15% til 45% av buffer B i 150 min. Som et utgangspunkt, kan du bruke følgende graderingen: tid 0, buffer B 5%. tid 2, buffer B 15%. tid 135, buffer B 45%, tid 145, buffer B 70%. og 150, buffer B 95%. Justerer den litt for tidlig og sent grunnleggende pH RPLC fraksjoner etter gjennomgang base topp chromatograms.
  9. Opererer masse spectrometer i data-avhengige modus med en undersøkelse scan i ion felle masse analyzer (400-1600 m/z, 60.000 oppløsning; 1 x 10 6 automatisk få kontroll (AGC) mål, 50 ms maksimal ion tid; og centroid modus). Utføre 20 MS-/ MS skanninger med høy oppløsning (60.000 oppløsning, 1 x 10 5 AGC mål, ~ 100 ms maksimal ion tid, 35 HCD normalisert kollisjon energi, 0,4 m/z isolasjon vinduet og 20 s dynamisk eksklusjon).
    Merk: Electron overføring dissosiasjon (ETD) anbefales ikke for TMT10-plex reagenser fordi ETD cleavage steder er forskjellig fra HCD, som resulterer i reporter ion overlapping. ETD er i tillegg ikke effektiv som er HCD fordi tryptic peptider vanligvis genererer 2 ladet stater og ETD er mer effektivt høyere kostnad States.

6. MS dataanalyse

Merk: Vi beskriver dataanalyse med programmet hopp. Men dataanalyse kan utføres med andre kommersielt tilgjengelig eller gratis programmer.

  1. Prosessen råfiler fra det masse spectrometer med hybrid tag-basert søk motor JUMP 21, som kombinerer en mønster-basert databasesøk og et kodebasert de novo sekvensering å forbedre sensitivitet og spesifisitet.
  2. Konvertere rådata til mzXML format og søke MS2 spectra mot målet-lokkefugl UniProt menneskelige databasen (eller andre passende artsspesifikke databasen) til å beregne falske funnrate (FDR).
  3. Utføre søk ved å bruke en 10 ppm masse toleranse for både forløper og fragment ioner. Angi andre søkeparameterne å fullt tryptic begrensning med 2 maksimal tapte cleavages, 3 maksimal endring områder per peptid og tildelingen av en, b og y ioner scorer peptidene. Angi statisk endringer TMT koder på Lys rester og N termini (+229.162 Da) og carbamidomethylation av Cys rester (+57.021 Da). Angi dynamiske endringer med Met oksidasjon (+15.994 Da), som er en vanlig peptid gjenstand fra prøven håndtering.
  4. Filterdata etter følgende kriterier: 7 aminosyre minimum peptid lengde, m/z nøyaktighet (f.eks, 5 ppm) og matchende score (J score og deltaCn). Gruppere peptider ifølge peptid lengde, trypticity, og belaste staten.
  5. Bruk et ekstra nivå av filtrering ved å score protein FDR til under 1%. Proteiner identifisert av en enkelt spectral teller krever en høyere matchende score.
  6. For peptider deles av flere medlemmer av en protein familie, klynge matchet protein medlemmene i 1 gruppe.
    Merk: I henhold til parsimony prinsippet, gruppen er representert av protein med det høyeste antallet tildelte peptider og andre proteiner med unike peptider 1.
  7. Quantitate proteiner ved å summere reporter ion teller over alle samsvarende peptid spektrum kamper (PSMs) i et program som er innebygd i hopp-programvarepakke.
  8. For hver akseptert PSM, ekstra og korrigere TMT reporter ion intensiteten etter isotopanrikning distribusjon av merking reagenser og lasting bias, som beregnes fra global PSM kvantifisering data. Filtrere PSMs med lav intensitet og høyt støynivå med brukerdefinerte terskler under kvantifisering.
  9. Beregner en relativ signalet mellom hver reporter ion og gjennomsnittet av alle 10 reporter ioner. Summere relative signalene fra PSMs for de identifiserte proteinene. Konvertere disse relative signalene til absolutt signaler ved å multiplisere gjennomsnitt reporter ion intensiteten av topp 3 PSMs i tilhørende proteiner.
  10. Bruker en etter MS beregningsorientert tilnærming til å korrigere interferensen. Forutsatt at y 1 ion intensiteten er proporsjonal med reporter ion intensiteten, beregne lineær forholdet fra ren skanner og utlede hvilket forstyrrelser fra forurenset y1ion intensiteten i støyende skanner 23.
    Merk: For TMT-merket tryptic peptider, K-TMT og R rester er 2 typer av y 1 ioner (376.27574 Da og 175.11895 Da, henholdsvis) i MS2 skanner. Hvis bare 1 y 1 ion oppdages og er i samsvar med den identifiserte peptid, som MS2 ren skanning ( figur 3A). Hvis begge y1ions blir funnet, MS2 anses en støyende skanning.
  11. Eksportere protein kvantifisering verdiene til et regnearkprogram for videre analyse. Bruke parvis sammenligninger eller en variansanalyse for å identifisere proteiner som uttrykkes ulikt.

7. MS datavalidering

Merk: for å vurdere kvaliteten på dataene som MS, minst 1 metoden for validering skal utføres før du fortsetter med tidkrevende biologiske eksperimenter.

  1. Manuelt undersøke MS-/ MS spektra av proteiner av interesse å validere peptid sekvens og TMT reporter ion kvantifisering.
  2. Bruk kjent protein kvantifisering data å bekrefte MS resultatene.
  3. Kontroller protein endringer med antistoff-baserte tilnærminger (f.eks, westeRN blot og immunohistochemistry analyse).
  4. Kjemisk syntetisere peptidene rundt og bruke dem som interne standarder for å bekrefte identifisering av innfødte peptider.
    Merk: Deres MS-/ MS mønstre og tiden under LC--MS-/ MS må være identisk.
  5. Kontrollere protein endringer med en målrettet MS tilnærming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brukte en tidligere beskrevet cross-species peptid blanding systematisk analysere effekten av forholdet komprimering i 3 store protokollen, medregnet pre-MS fraksjoneres, MS innstillinger og post-MS korreksjon23. Pre-MS fraksjoneres ble evaluert og optimalisert ved hjelp av en kombinasjon av grunnleggende pH RPLC og surt pH RPLC. For post-MS analyse, ble bare artsspesifikke peptider vurdert. Vi brukte denne forstyrrelser modellen undersøke flere parametere i LC/LC-MS/MS, inkludert MS2 isolasjon vindu, online LC oppløsning, lasting mengden online surt pH RPLC og oppløsningen av den frakoblede høy pH-RPLC (se fig. 3 i referanse 29).

For å endre oppløsning under frakoblet LC, vi isobar merket peptidene adskilt 320 fraksjoner, og da kombinert valgte fraksjoner sammen for å justere separasjon makt. Frakoblet LC oppløsning ble testet ved hjelp av en rekke samlet brøkdel delsett (1, 5, 10, 20, 40, 80 og 320), mens overvåking forstyrrelser nivåene. Vi fant ut at forstyrrelser nivåene redusert gradvis fra 16.4% til 2,8%, indikerer at omfattende fraksjoneres under frakoblet LC separasjon noe lindres problemet med co eluting peptider men var ikke i stand til helt fjerner den forstyrrelser.

Neste, vi vurdert effekten av vinduet MS2 isolasjon på forstyrrelser. Vi bestemt eksperimentelt at forstyrrelser var ca proporsjonal til størrelsen på vinduet isolasjon med tidligere studier29,30. For eksempel en 4-fold forskjell på størrelsen (1.6 til 0,4 Da) resulterte i en ~ 4-fold forskjellen slutning nivå (14.4 3,7%). Vi bestemt hvor optimal lasting på kolonnen for MS analyse og brukte denne informasjonen til å oppheve ytterligere forstyrrelser. Vi redusert forstyrrelser fra 9,4% 3.3% ved å laste riktig mengde utvalg. Lasting mye utvalg kan føre til toppen utvide31 og derfor heve forstyrrelser, som resulterer i redusert protein kvantifisering nøyaktighet. Til slutt, vi optimalisert online RPLC oppløsning ved å endre gradient lengde (1, 2 og 4 h) og bruke en lang kolonne (~ 45 cm). Vi fant at 4-h gradering nesten eliminert forstyrrelser (ned 0,4%), men også lagt instrument tid. Parameterne optimalisert avdekket et smalt isolasjon vindu (0,4 Da), ~ 100 ng av prøve lastet på kolonne- og midlevel fraksjoneres (~ 40 x 2 h, 3,3 dager). Vi viste også at ved å bruke en datamaskin post-MS korreksjon strategi vi forbedret kvantitative presisjon når protein prosenter (figur 3B).

Våre resultater viser at bruk av optimalisert LC-MS parametere og post-MS korreksjon kan gi en grundig proteomic profil og nesten eliminerer forstyrrelser som ofte produsert av isobar merking teknikker for protein kvantifisering.

Figure 1
Figur 1: sammenhengen hele-proteom profilering analyse av TMT-LC/LC-MS/MS. Ti biologiske prøver var lysed, fordøyd og merket med 10 ulike TMT koder, gruppert like og fraksjonert i 80 fraksjoner av frakoblede grunnleggende pH omvendt-fase flytende kromatografi (Langbane). Hver annen brøkdel ble ytterligere atskilt med Sure RPLC og analysert online med en høy oppløsning masse spectrometer. MS-/ MS raw-filer ble behandlet og søkte mot en Uniprot database for peptid og protein identifikasjon. Proteiner ble quantitated ifølge relative intensiteten av TMT koder. Endelig ble identifisert og quantitated proteiner sendt for integrerende dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: TMT merking effektivitet eksamen. Begge TMT-merket og tilhørende umerkede prøver ble analysert av LC-MS/MS separat for å undersøke TMT merking effektivitet. For full TMT merking, (A) det umerkede peptid toppen var helt fraværende i merket prøven, (B) mens TMT-merket peptid finnes bare i merket prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: beregningsorientert tilnærming for forstyrrelser av etter MS datainnsamling. (A) alle MS2 skanner ble delt inn i ren (venstre panel) og støyende skanner (høyre panel). Støyende skanninger viser begge y1 ioner K og R (1 fra et mål peptid og de andre fra forurensende peptider). (B) Escherichia coli peptider individuelt merket med 3 forskjellige TMT reagenser og samlet på 1:3:10 prosenter. Ca 20-fold mer rotte peptider ble lagt som bakgrunn. Summerte relative intensiteten av E. coli peptider i 3 grupper avdekket at y1 ion-baserte korreksjon er mer nøyaktig for TMT-baserte kvantifisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver en høy gjennomstrømming protokoll for kvantifisering av proteiner med en 10-plex isobar merking strategi, som har blitt implementert med hell i flere publikasjoner12,13,14,32 . I denne protokollen, kan vi analysere opptil 10 ulike biologiske protein prøver i 1 eksperiment. Rutinemessig kan vi identifisere og quantitate godt over 10.000 proteiner med høy visshet. Selv om isobar merking er en effektiv teknologi å quantitate proteiner, er det begrenset av forholdet komprimering som kan føre til kvantitative unøyaktighet. Våre ulike strategier, for eksempel MS-/ MS innstillinger i kombinasjon med y1 ion-baserte post-MS korreksjon, og optimalisering av LC/LC-protokoll fjerner effektivt de fleste forstyrrelser effekter og derfor forbedrer vesentlig presisjonen for protein kvantifisering.

For protein kvantifisering, hoppe suite av programmer fungerer på en rekke måter. Vi målt isotopanrikning urenhet for hver gruppe med kjøpt reagenser, som er litt forskjellig fra de rapporterte verdiene i leverandøren sertifikater. Den målte isotopanrikning urenhet brukes for å korrigere intensiteter reporter ioner i hopp programvaren. Et protein er vanligvis quantitated av mange PSMs med ulike absolutt punkthøyde påvirkes av flere faktorer, for eksempel ionisering effektivitet. Fordi påvirkning av faktorene er ukjent, avsløre masse spectra bare den relative abundances av reporteren ioner i en TMT analysen. Den relative abundances av reporteren ioner beregnes ved å dele intensiteten av hver reporter ion av gjennomsnittlig intensiteten av alle 10 journalister. For å gi den beste representanten "absolutt signal" av protein, beregnet vi gjennomsnitt relative intensiteten av 3 PSMs med de høyeste absolutte intensiteter fra protein og gjennomsnittet av sterkeste absolutt intensiteten til å beregne absolutt signalet av protein. Vi definert fremgangsmåten som rescaling. Y1 rettelsen er universelt gjeldende for alle TMT analyser; men i noen tilfeller kan vi ikke korrigere for peptider med MS-/ MS spectra som inneholder y1 ion. Vi fant imidlertid at ~ 90% av spectra har y1 ioner fra både lysin og arginin. For å kompensere for forstyrrelser forårsaket av co eluting peptider som har samme C-terminalen rester som identifiserte peptid, var estimert forstyrrelser nivået egentlig doblet og brukes for rettelsen. Forutsetningen var basert på empiriske bevis som vi har samlet over mange TMT eksperimenter, der vi observerte samme intensitetsnivået for y1 i K - og R-containing peptider.

Forstyrrelser kan reduseres ved mange metoder enn hva vi har beskrevet i denne protokollen, for eksempel MS3 multinotch tilnærming. Alle disse metodene er gyldig og har sine individuelle fortjenester. Til slutt, metodene som er brukt avhenger av flere faktorer, inkludert men begrenset ikke til eksempel beløp, instrument tilgjengelighet (dvs., instrumenttype og tiden som kreves for å analysere prøver), ønskede resultater (dvs., antall proteiner identifisert), og kvantifisering nøyaktighet.

For å sikre de mest nøyaktige resultatene, er det viktig å akt kvalitetskontroll trinnene i protokollen. Disse inkluderer bruker nøyaktig standarder for eksempel kvantifisering (f.eksBSA som har gjennomgått aminosyre analyse), testing merking effektiviteten av TMT reagens, avgjør effektiviteten av trypsin fordøyelsen, utføre en premix forhold test sikre en lik blanding av alle 10 prøver, og bruker en programvare for å rette opp skjevheter lasting. I tilfeller der en kjent protein eller flere proteiner er forventet uttrykk endringer mellom enkelte eksempler er det viktig å utføre western blot analyse etter den første cellen lysis å bekrefte at endringene finnes og kan oppdages. Dette sikrer at eksemplene representerer biologi skal testes og sparer tid, penger og innsats før du utfører hele TMT protokollen. Hvis et bestemt utvalg forventes å ikke uttrykke visse protein(s), er det også viktig å bruke western blot analyse for å bekrefte deres fravær etter lysis før du fortsetter med protokollen. Premix forholdet testen brukes når de fleste proteiner er forventet å ikke endre over 10 biologiske prøver. Vi fjernet også kjente skadelige proteiner, slik som keratins, så de ikke vil negativt påvirke våre korreksjon. Våre kvantifisering metode korrigert for eventuelle feil som har oppstått fra pipettering feil, etc. Når vi spesielt brukt pipette volumer større enn 5 µL for å redusere feil. Vi utførte flere runder av denne premix test for å sikre at vi fikk en nøyaktig 1:1 blanding. Det er viktig å merke seg at vi ikke utføre denne typen premix forhold test ved immunoprecipitation prøver for protokollen, som vi forventet en stor andel av proteiner endre. I slike tilfeller ville premix testen forskyve resultatene. Dette gjelder også av noen eksperiment der minst 1 av 10 prøvene er ventet å variere i protein uttrykk (tom vektor, proteasome hemming, etc.) i slike tilfeller, anbefales det å bruke gjentak for å lette kvantifisering statistikk. Vi anbefaler vanligvis utfører 3 replikerer for disse prøvene. Til slutt, antall gjentak er basert på forventet variasjon av hvert utvalg.

Med noen finjustering, kan denne robuste protokollen brukes som en generell proteomic rørledning for å undersøke proteiner, protein veier, sykdomsprogresjon og andre biologiske funksjoner. Protokollen presenteres her gir en kraftig teknikk for å skaffe dyp protein dekning og lindre forholdet undertrykkelse under kvantifisering. Med mindre modifikasjoner kan denne protokollen lett tilpasses quantitate protein posttranslational modifikasjoner, som fosforylering, ubiquitination og acetylation33,34. Disse typer omfattende Proteomikk prosjekter kan integreres med genomics, transcriptomics og muligens metabolomics en systemer biologi tilnærming til forstå biologiske systemer og lette romanen funn av molekylære mekanismer, biomarkers og terapeutiske mål i sykdom13,28,35,36,37,38.

Vi har vist en metode for nøyaktig quantitating over 10.000 proteiner fra hele celler eller vev lysates. Vi forventer denne metoden å være allment gjeldende mange biologiske systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker alle andre lab og anlegget medlemmer for nyttig diskusjon. Dette arbeidet ble delvis støttet av NI H gir R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 og ALSAC. MS analysen ble utført i St. Jude Children's Research Hospital Proteomikk anlegget, støttes delvis av NIH Cancer Center Support grant P30CA021765. Forfatterne takker Nisha Badders for hjelp med redigering manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14, (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13, (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3, (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84, (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85, (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease. J Proteome Res. 13, (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13, (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28, (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14, (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9, (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13, (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82, (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14, (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13, (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13, (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8, (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89, (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8, (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83, (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8, (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86, (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83, (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15, (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8, (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46, (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15, (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17, (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32, (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11, (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13, (2), 397-406 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics