Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Biochemistry

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Summary

Nous présentons un protocole visant à quantifier avec précision les protéines avec étiquetage isobare, vaste fractionnement, outils bioinformatiques et mesures de contrôle de la qualité en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse à haute résolution.

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High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J. H., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

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Abstract

Plusieurs avancées exceptionnelles ont eu lieu en spectrométrie de masse (MS)-base de protéomique, avec le progrès technique particulière en chromatographie liquide (LC) couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) et capacité de multiplexage étiquetage isobare. Ici, nous introduisons un protocole de profilage de profond-protéomique qui combine la balise masse tandem (TMT) de 10-plex étiquetage avec une vaste plate-forme de LC/LC-MS/MS, MS après interférence computational correction pour doser avec précision toute protéomes et. Ce protocole comprend les étapes principales suivantes : extraction de protéine et digestion, TMT étiquetage, 2 Dimensions (2D) LC, spectrométrie de masse à haute résolution et traitement informatique des données. Des mesures de contrôle de la qualité sont inclus pour le dépannage et d’évaluer la variation expérimentale. Plus de 10 000 protéines dans des échantillons de mammifères peuvent être dosés en toute confiance avec ce protocole. Ce protocole peut également être appliqué à la quantification des modifications post traductionnelle avec des modifications mineures. Cette méthode multiplexée, robuste fournit un outil puissant pour l’analyse protéomique dans une variété d’échantillons complexes, y compris la culture de cellules, des tissus animaux et des échantillons cliniques humains.

Introduction

Progrès de la technologie de séquençage de nouvelle génération ont conduit à un nouveau paysage pour l’étude des systèmes biologiques et la maladie humaine. Cela a permis à un grand nombre de mesures du génome, transcriptome, protéome, métabolome et autres systèmes moléculaires pour devenir tangible. Spectrométrie de masse (MS) est une des méthodes plus sensibles en chimie analytique, et son application en protéomique a rapidement élargi après le séquençage du génome humain. Dans le domaine de la protéomique, ces dernières années ont abouti à des avancées techniques majeures dans basées sur des analyses quantitatives, y compris les isobares de marquage et de multiplexage capacité combinée à une vaste chromatographie en phase liquide, en plus de l’instrumentation avances, permettant des mesures plus précises et plus rapides avec moins de matériau échantillon requis. Protéomique quantitative est devenus une approche grand public pour le profilage des dizaines de milliers de protéines et de modifications post-traductionnelles dans des échantillons biologiques extrêmement complexes1,2,3,4 , 5 , 6.

Multiplexé isobares étiquetage méthodes telles que tag isobarique pour quantification relative et absolue (par exemple, iTRAQ) et tag de masse en tandem (TMT) MS ont grandement amélioré le débit de l’échantillon et a augmenté le nombre d’échantillons qui peuvent être analysées dans une seule expérience1,6,7,8. Ainsi que d’autres méthodes de quantification basée sur MS, comme dosage exempte d’étiquette et les isotopes stables d’étiquetage avec des acides aminés en culture cellulaire (c.-à-d., SILAC), le potentiel de ces techniques dans la protéomique champ est considérable9 ,10,11. Par exemple, la méthode TMT autorise 10 échantillons de protéines pour être analysés dans le 1 expérience à l’aide de réactifs 10-plex. Ces balises TMT structurellement identiques ont la même masse globale, mais les isotopes lourds sont répartis différemment sur des atomes de carbone ou d’azote, résultant en un ion unique journaliste pendant la fragmentation MS/MS de chaque étiquette, ce qui permet la quantification relative entre les 10 échantillons. La stratégie TMT est systématiquement appliquée afin d’étudier les processus cellulaires12,13,14voies biologiques et progression de la maladie.

Importantes améliorations techniques ont amélioré les systèmes de chromatographie liquide (LC)-MS/MS, tant au niveau des séparations LC et les paramètres de MS, afin d’optimiser l’identification des protéines sans sacrifier la précision de dosage. Première dimension séparation des peptides par une technique de séparation avec l’orthogonalité élevée à la deuxième dimension est essentielle dans ce type de méthode protéomique fusil pour atteindre un résultat maximum20. Chromatographie liquide en phase inversée pH élevé (RPLC) offre de meilleures performances que ne le fait de chromatographie échangeuse de cations forts classiques20. RPLC pH élevé est associé à une deuxième dimension du RPLC pH faible, tant analytique gamme dynamique et la couverture de protéine sont améliorées, ayant pour résultat la capacité d’identifier la majeure partie des protéines exprimées lors de l’exécution d’ensemble-proteome analyses15 ,16,17,18. D’autres avancées techniques comprennent les petites particules de C18 (1,9 µm) et étendu longue colonne (~ 1 m)19. En outre, autres améliorations notables incluent les nouvelles versions de spectromètres de masse avec taux de balayage rapide, amélioration de la sensibilité et résolution20et les pipelines de bioinformatique sophistiqué pour MS données minières21.

Nous décrivons ici un protocole détaillé qui intègre les plus récentes méthodologies avec modifications afin d’améliorer la sensibilité et le débit, tout en se concentrant sur les mécanismes de contrôle de la qualité tout au long de l’expérience. Le protocole prévoit l’extraction de protéine et digestion, TMT 10-plex étiquetage, pH basique et fractionnement RPLC pH acide, haute résolution détection MS et MS informatique (Figure 1). En outre, nous mettre en œuvre plusieurs mesures de contrôle de la qualité de diagnostic et d’évaluation variation expérimentale. Ce protocole détaillé est destiné à aider les nouveaux chercheurs sur le terrain systématiquement identifier et à quantifier avec précision des milliers de protéines d’un lysat ou tissu.

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Protocol

attention : avant toute utilisation, veuillez consulter toutes les fiches de données sécurité pertinentes, (c.-à-d., FS). Copiez toutes les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution de ce protocole.

Remarque : un ensemble de réactifs TMT 10-plex étiquette isobare est utilisé dans le présent protocole pour la quantification du protéome de 10 échantillons.

1. préparation de cellules/tissus

Remarque : il est essentiel de recueillir des échantillons en un temps minimal à basse température pour garder les protéines dans leur état d’origine biologique.

  1. Laver les cellules adhérentes (par exemple, les cellules HEK 293) sur une plaque de 10 cm deux fois avec 10 mL de glace froide tampon phosphate salin (PBS). Grattez et prélever des cellules (~ 2 x 10 6 cellules) dans 1 mL de PBS. Transférer dans des tubes de 1,5 mL et éliminer les PBS après centrifugation à 600 x g pendant 5 min à 4 boulettes de cellule magasin c ° à-80 ° C jusqu'à la lyse.
    Remarque : Une expérience pilote est souvent réalisée pour examiner le rendement de protéine. Environ 1 mg de protéines peuvent être extraits de 10 x 10 6 cellules de mammifères ou d’une plaque de 15 cm avec 80 % confluent.
  2. Sinon, lyser les cellules adhérentes dans leur assiette en ajoutant le tampon de lyse directement sur la plaque après le lavage. Recueillir des lysats dans des tubes de 1,5 mL et utilisez la description de protocole étape 2.5.
  3. Cellules en suspension
  4. à frais virés en tubes de 15 mL, laver deux fois avec 10 mL de PBS froid glace, transférer dans des tubes de 1,5 mL et centrifuger à 600 g pour enlever les PBS. Retirez les étapes de lavage complètement pour maintenir la concentration voulue des ingrédients de tampon de lyse de PBS. Boulettes de cellule à-80 ° C se conservent jusqu'à la lyse.
  5. Collecte et peser rapidement les tissus. Garder les tissus en azote liquide immédiatement après dissection et magasin à -80 ° C.
    Remarque : Le rendement de protéine des tissus est environ 5 à 10 % du poids des tissus
  6. utiliser des tailles de tissu homogène et régions anatomiques pour les 10 échantillons afin de réduire l’hétérogénéité de l’échantillon. Enlever la contamination sanguine en rinçant des échantillons deux fois avec 1 mL de PBS froid glace afin d’éviter les protéines de sang très abondante qui affectent le dosage de la protéine et l’analyse de données en aval.

2. Extraction de protéine, contrôle de la qualité Western Blotting, Digestion en solution et dessalage du Peptide

Remarque : manipulation de chacune des 10 échantillons pareillement au cours de n’importe quelle étape avant la mise en commun des échantillons marqués au TMT est essentiel pour réduire variation.

  1. Faire tampon de lyse (50 mM HEPES [pH 8,5], 8 M urée et le désoxycholate de sodium 0,5 %) le jour de l’expérience.
    Remarque : Dénaturation de la protéine partielle lors de la lyse échantillon affecte l’efficacité de la protéine digestion.
  2. Ajouter la lyse de la mémoire tampon pour que le rapport entre la mémoire tampon pour le volume de l’échantillon est 10:1 et environ 20 % du volume final de perles de verre (0,5 mm de diamètre) de granulés de cellules ou tissus (p. ex., ratio 10 : 1 volume entre le tampon et échantillons) pour atteindre une concentration de la protéine finale de 5 à 10 mg/mL. Garder les 10 échantillons de la même concentration en tenant compte du nombre de cellules utilisées ou de poids de chaque échantillon tissulaire.
  3. Maintenir concentration en urée 8 m en ajoutant l’urée solide à l’échantillon. N’oubliez pas de tenir compte du volume du culot cellulaire ou tissulaire lors du calcul de la quantité d’urée solide à ajouter à l’échantillon pour atteindre la concentration de 8 M.
    NOTE : Tampon non frais urée peut introduire des modifications chimiques artificielles (c.-à-d., protéine carbamylation) et un effet négatif sur le nombre de peptides identifiés. Urée occupe un volume considérable (100 mg d’urée occupe ~ 73 µL de solution).
  4. Garder les débris insolubles dans le lysat pour permettre la digestion des protéines insolubles 23.
  5. Lyser les échantillons dans un mélangeur à 4 ° C à la vitesse 8 pendant 30 s, repos pendant 5 s et répéter 5 fois ou jusqu'à ce que les échantillons sont homogénéisés. Les échantillons peuvent également être lysées par agitation pendant 30 s à température ambiante (RT) avec un 30 s sur la glace pendant environ 10 cycles de refroidissement. Ajuster les conditions de lyse que nécessaire, selon le type de l’échantillon.
  6. Mélanger le lysat puits sans centrifugation et faire 2 petites parties aliquotes (~ 15 µL de chaque). Utiliser 1 partie aliquote à mesurer la concentration de protéines et 1 aliquote pour effectuer la validation de contrôle positif en effectuant l’analyse par western blot. Garder l’aliquote grand restant pour l’analyse protéomique.
  7. Concentration de protéine de mesure par un test de dosage de protéines standard ou par un teinté bleu de Coomassie court sodium dodécyl sulfate polyacrylamide gel (10 %) 22 avec l’albumine sérique bovine (BSA) comme norme. Utiliser une norme de BSA avec un haut degré de précision de concentration connue. Pour atteindre le plus haut niveau de précision, effectuer l’analyse des acides aminés de la norme de BSA.
    Remarque : Les autres normes précises peuvent être disponibles. Les concentrations de protéine peuvent également être estimées par nombre des cellules ou des tissus poids. Bien que 1 mg de protéine (100 µg/échantillon) est recommandé, l’analyse peut être réalisée avec aussi peu que 100 µg de protéines (10 µg/échantillon).
  8. Ajouter 100 % acétonitrile (ACN) pour obtenir une concentration finale de 10 % des protéases ACN et LysC en un ratio de substrat-enzyme de 1 : 100 (w/w) pour digérer les protéines dans des conditions à la RT pour 2 h 1 hautement dénaturantes. Ajouter le dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 1 mM pour réduire les ponts disulfures en protéines et incuber pendant 1 h. LysC effectuer la digestion à une concentration finale d’urée de 7,2 M.
  9. Diluer les échantillons à 2 M urée avec 50 mM HEPES (pH 8,5) et plus digérer avec de la trypsine à ta pendant 3 h ou jusqu’au lendemain à une trypsine à rapport protéine 01:50 (w/w). Utiliser environ 2 µg de trypsine pour 100 µg de protéines et une concentration de la trypsine d’environ 10 ng/µL.
    Remarque : Les facteurs qui peuvent conduire à la digestion trypsique inefficaces sont issues de pH, trypsine inactive ou l’utilisation d’un ratio inappropriée de l’enzyme pour le substrat.
  10. Ajouter TNT à 1 mM de rendement et de réduire davantage les peptides pendant 2 h à température ambiante.
  11. Ajouter iodoacétamide (IAA), pour atteindre 10 mM. Incuber 30 min dans le noir pour alkylat Cys-contenant des peptides à RT.
  12. Étancher les IAA n’ayant pas réagi en ajoutant TNT pour atteindre 30 mM et incuber 30 min à température ambiante.
  13. Vérifier l’efficacité de la digestion trypsique en examinant une petite aliquote de chaque échantillon. Dessalement en utilisant un embout de pipette de 10 µL avec chromatographie médias intégrés dans l’espace mort, selon le fabricant ' protocole s. Analyser chaque échantillon par LC-MS/MS. LC-MS/MS, les paramètres sont les mêmes qu’à l’étape 5, à l’exception que le gradient est 10 min 23.
  14. Effectuer une recherche de base de données pour les données brutes de MS (voir plus en détail à l’étape 6) comme paramètre de recherche à l’aide de 4 clivages manquées.
    Remarque : Si le nombre de raté clivages est > 10 %, cela peut indiquer la digestion trypsique incomplète. Ceci affecte négativement les résultats en aval. Il s’agit d’une étape critique contrôle qualité (CQ).
  15. Digérer des échantillons à nouveau si le clivage manqué est > 10 % en ajoutant un supplémentaire de 10 µL de la trypsine aux échantillons.
  16. Acidifier les échantillons en ajoutant l’acide trifluoroacétique (TFA) pour atteindre la concentration de 1 %. Mesurer le pH à l’aide d’une bande de pH. Vérifier que le pH est pariWeen 2 et 3. Ajouter plus TFA goutte sage (1 µL que nécessaire jusqu'à obtenue le bon pH).
  17. Centrifuger à 20 000 x g à RT pendant 10 min et de recueillir le liquide surnageant.
  18. Lavage essorage de capacité 0,5 à 60 µg colonnes contenant de la résine de phase inverse C18 avec 0,25 mL de méthanol si vous utilisez 100 µg échantillons. Laver 0,03 à 30 µg capacité essorage colonnes avec 0,25 mL de 60 % TFA ACN/0.1% si vous utilisez 10 µg échantillons. Centrifuger les colonnes à centrifuger à 500 g pendant 30 s.
  19. Équilibrer colonnes avec 0,5 mL de 0,1 % TFA et supprimer par centrifugation à 500 g pendant 30 s.
  20. Charger des échantillons sur des colonnes et lier des échantillons aux colonnes par centrifugation à 100 x g pendant 3 min ou jusqu'à ce que tout l’échantillon a passé par le biais de la colonne.
  21. Ajouter 0,5 mL de 0,1 % TFA à colonnes et centrifuger à 500 x g pendant 30 s.
  22. Ajouter 125 µL de 60 % ACN/0.1% TFA à chaque colonne et éluer par centrifugation à 100 g pendant 3 min. s’assurer que toute la solution a traversé la colonne.
  23. Sécher les éluants dans une pompe à vide. S’assurer que les échantillons sont restes complètement sèches et non liquides dans les tubes. Magasin à-80 ° C jusqu'à ce qu’une analyse plus approfondie.

3. Étiquetage des Peptides de TMT

Remarque : il est essentiel de s’assurer que tous les échantillons sont entièrement étiquetés par des réactifs TMT. Plusieurs facteurs (p. ex., quantité de réactifs TMT utilisé, le pH et précision de dosage de la protéine) peuvent affecter le TMT étiquetage de l’efficacité, qui modifie négativement tous les résultats en aval.

  1. Reconstituer chaque échantillon de peptide de morue dessalée dans 50 µL de tampon HEPES de 50 mM (pH 8,5). Vérifier le pH et faire en sorte qu’il est entre 7 et 8.
    Remarque : L’échantillon peut être acide si ne pas complètement sèches après l’étape de dessalement, qui aura une incidence sur l’efficacité étiquetage.
  2. Garder ~ 1 µg de chaque échantillon sans étiquette pour un TMT étiquetage efficacité essai subséquent, tel que décrit à l’étape 3.3.
  3. Dissoudre réactifs TMT chez ACN anhydre et étiqueter les échantillons de peptide en suivant le fabricant ' instructions de s. Incuber les réactifs à la droite pendant 1 h.
  4. Exécuter un test de l’efficacité étiquetage QC TMT en dessalement ~ 1 µg de chaque échantillon TMT-étiquetés et - non étiqueté à l’aide de pointes de pipette 10 µL avec médias embarqués chromatographie selon le fabricant ' protocole s. Analyser des échantillons TMT marquées et non marquées par LC-MS/MS.
    NOTE : LC-MS/MS paramètres sont les mêmes qu’à l’article 5, à l’exception que le gradient est 10 min.
  5. Examiner les données brutes pour s’assurer que les peptides non étiquetés ne sont pas détectés dans les échantillons étiquetés, assurant l’efficacité étiquetage complete ( Figure 2). Cela pour 6 à 10 peptides distincts vérifier l’efficacité étiquetage.
  6. Étancher la réaction en ajoutant 4 µL d’hydroxylamine 5 % et incuber pendant 15 min.
  7. Mélanger une aliquote de volume égal et petite (2 µL) de chaque échantillon marqués au TMT. Dessalement à l’aide de pointes de pipette 10 µL avec médias embarqués par chromatographie. Analyse des échantillons par LC-MS/MS, comme indiqué au point 3.4. Utiliser le logiciel de saut (un algorithme de recherche de base de données open source qui convertit les fichiers raw de MS en tandem pour une liste des peptides et des protéines) pour déterminer le ratio de concentration relative de tous les 10 échantillons par les TMT tag des intensités de tous identifiés peptides.
    Remarque : Ce test du rapport de prémélange QC est utile pour déterminer le bon ratio de mélange égal avant la mise en commun finale, comme le pipetage erreurs peuvent se produire qui ne changera pas les concentrations et l’étape de quantification des protéines peut ne pas être toujours exacte. C’est aussi la meilleure façon de faire en sorte que le montant de chacune des 10 échantillons utilisées pour le mixage final sont tous à un ratio égal, comme indiqué au point 3.5.
  8. Répéter autant de fois que nécessaire pour atteindre un ratio de 1:1 dans les 10 échantillons.
  9. Également mélanger 10 échantillons selon les résultats de l’essai de rapport de prémélange. Utiliser l’échantillon avec la plus faible concentration comme référence pour régler les volumes des autres 9 échantillons.
  10. Enlever les sous-produits de la réaction de trempe de l’échantillon groupé TMT marqués par dessalage.
  11. Cartouches d’extraction
  12. solid-phase de lavage 1 mL contient 50 mg de sorbant par colonne avec 1 mL/0,25 mL de méthanol, si vous utilisez 100 µg échantillons. Laver colonnes à centrifuger avec 1 mL/0,25 mL de 60 % de capacité 0,5 à 60 µg C18 TFA ACN/0.1% si vous utilisez 10 µg échantillons. Centrifuger les colonnes à 500 g pendant 30 s.
  13. Équilibrer colonnes avec 0,5 mL de 0,1 % TFA et supprimer par centrifugation à 500 g pendant 30 s.
  14. Charger des échantillons sur des colonnes et lier par centrifugation à 100 x g pendant 3 min ou jusqu'à ce que la totalité de l’échantillon a traversé la colonne.
  15. Ajouter 0,5 mL de 0,1 % TFA à colonnes et centrifuger à 500 x g pendant 30 s.
  16. Ajouter 125 µL de 60 % ACN/0.1% TFA à chaque colonne et éluer par centrifugation à 100 g pendant 3 min. s’assurer que toute la solution a traversé la colonne.
  17. Sécher les éluants dans une pompe à vide. S’assurer que les échantillons sont restes complètement sèches et non liquides dans les tubes. Magasin à-80 ° C jusqu'à ce qu’une analyse plus approfondie.

4. PH à haute résolution, base large LC préfractionnement

  1. Set 2 colonnes C18 reliés contenant des particules d’hybride éthylène ponté (4,6 mm x 25 cm, pour un total de 50 cm, taille des particules 3,5 µm) et d’utiliser une pompe à LC microlitre flux haute performance pour fractionnement.
    Remarque : L’utilisation de 2 colonnes augmente la charge de peptide et n’améliore pas nécessairement la chromatographie. Pour les échantillons contenant ≤ 200 µg de peptides, 1 colonne suffit.
  2. Laver la boucle de 100 µL avec des ajouts ultérieurs de 300 µL de méthanol, d’eau et tampons A chaque (formiate d’ammonium 10 mM, pH 8,0).
  3. Laver les colonnes avec 100µl également mixte isopropanol, méthanol, ACN, et l’eau et équilibrer la colonne dans le tampon de 95 % pour 2 h.
  4. Solubiliser l’échantillon de morue dessalée regroupées marqués au TMT peptide dans 65 µL de tampon A. vérifier que le pH de l’échantillon est ~ 8.0. Si toujours acide, utilisez l’hydroxyde d’ammonium pour ajuster le pH à 8.0.
  5. Fractionnement échantillon en utilisant le gradient suivant avec tampon B (une plus de 90 % de la mémoire tampon ACN) : 15 à 20 % pendant 15 min, 20 à 35 % pour 100 min et 35 à 50 % pendant 30 min. mettre le collecteur de fraction pour recueillir des fractions toutes les 2 min y compris les temps de chargement. Régler le débit à 0,4 mL/min. Voir référence 29 et la Figure 1 pour un chromatogramme représentatif.
  6. Recueillir un total de 80 fractions et sécher 40 fractions (toute autre fraction) avec une pompe à vide jusqu'à dessiccation complète.
  7. Utiliser les 40 échantillons séchés pour analyse LC-MS/MS.
  8. Analyser toutes les 80 fractions par LC-MS/MS pour atteindre une couverture ultra profonde proteome.

5. Paramètres et préparation de LC-MS/MS

Remarque : quantification à TMT-basé, peptide ions sont isobares et apparaissent sous la forme 1 masse dans un scan de MS1. Cependant, ils sont dosés selon l’intensité des ions (ions de journaliste unique 10) de la journaliste dans l’analyse MS/MS après que l’ion de peptide a été fragmentée et dissociation de collision plue énergétique (HCD). Les ratios d’ion journaliste TMT peuvent être supprimés de co d’élution des ions TMT marqué 24. Rétrécissement de l’ion d’isolation fenêtre 25, phase gazeuse purification 26, le MultiNotch MS3 méthode 27 ou fractionnement vaste avec LC multidimensionnel et gradients de longs (4-8 h) 28 sont moyens.

  1. Pack 75 µm de diamètre interne (ID) vider les colonnes avec 1,9 µm de résine C18 à 30 à 40 cm de long (volume de lit ~1.3 µL).
  2. Chauffer les colonnes à 65 ° C avec un chauffage de portefeuille papillon pour réduire la contre-pression et évitent de faire pression sur de la très-haute-pression système de chromatographie liquide (UPLC). Enrouler la colonne 2 à 3 fois dans le réchauffeur de papillon pour s’assurer que la longueur du lit colonne entière est chauffée. La colonne à l’intérieur de l’appareil en veillant à ne pas de bande sur le capteur de température à l’intérieur de l’appareil de chauffage de bande.
    NOTE : Le radiateur de portefeuille de papillon est monté et collée sur un morceau sur mesure de plexiglas attaché à l’étape XYZ de l’instrument.
  3. Préparer un (3 % diméthyl sulfoxyde et 0,2 % acide formique) de tampon et tampon B (tampon un 67 % plu ACN) et laver les colonnes avec 95 % de tampon B. Puis, entièrement équilibrer colonnes dans les tampons de 95 % A (volumes d’au moins 3 colonnes). Utiliser un débit de ~0.25 µL/min et la contre-pression de 280 à 320 bar
  4. Examiner la qualité du système LC-MS/MS en exécutant 100 ng de rat cerveau peptides (ou norme de notre choix) deux fois avant d’analyser les échantillons marqués au TMT. Vérifiez les paramètres suivants fréquemment pour assurer la collecte des données de haute qualité : intensité du signal MS (entre e8 et e9 pour l’intensité du pic de base), l’enquête qualité des spectres MS/MS (une bonne représentation des ions y et b), largeur du PIC (12-22 s), temps de rétention globale, Pression du circuit LC (montée en pression > 50 barres indique une colonne sale ou un embout colmaté émetteur) et la variabilité de run-to-run (sommets identiques devraient être < 30 s entre les exécutions).
    Remarque : Pour résoudre les ions journaliste près-isobare des réactifs 10-plex TMT (différence de 6,32 mDa), la résolution de MS/MS doit être réglée au moins 30 000 personnes à 400 m/z. HCD est généralement utilisée pour la fragmentation d’ion de journaliste TMT10-plex, car il n’est pas soumis à la règle du tiers qui s’applique à la dissociation induite par collision (CID) piège à ions instruments.
  5. Nettoyer et calibrer l’instrument MS régulièrement et permet d’améliorer les performances du système frais tampons LC.
  6. Reconstituer les peptides séchés de la séparation de pH basique dans 5 % TFA.
  7. Charger ~0.2 µg sur la colonne tout en coulant 5 % tampon A.
  8. Élution avec 15 % à 45 % du tampon B 150 min. Comme point de départ, utiliser le gradient suivant : temps 0, tampon B 5 % ; temps 2, tampon B 15 % ; 135, tampon B 45 % du temps, le temps 145, tampon B 70 % ; et 150, tampon B 95 % du temps. Ajuster le dégradé légèrement pour les fractions RPLC précoces et tardives de pH basique après avoir examiné les chromatogrammes de base pic.
  9. Exploiter le spectromètre de masse en mode dépendant des données avec un balayage de sondage dans l’analyseur de masse piège ionique (400-1600 m/z ; 60 000 résolution ; 1 x 10 6 automatique de gain (AGC) cible ; 50 ms ion maximale temps ; et mode de centre de gravité). Effectuer des analyses à haute résolution de 20 MS/MS (résolution 60 000, cible AGC 1 x 10, 5, un temps maximal ion ~ 100 ms, 35 énergie de collision de HCD normalisé, 0,4 m/z isolation fenêtre et exclusion dynamique de 20 s).
    NOTE : Dissociation de transfert électronique (ETD) est déconseillée pour TMT10-plex réactifs parce que les sites de clivage ETD diffèrent de HCD, résultant en chevauchement ion journaliste. En outre, ETD n’entrent en vigueur que HCD parce que les peptides tryptiques génèrent habituellement + 2 États chargés et ETD est plus efficace dans les États de charge plus élevées.

6. Analyse de données de MS

Remarque : nous décrivons l’analyse des données avec le logiciel de saut. Cependant, analyse de données peut être réalisée avec d’autres programmes disponibles commercialement ou gratuits.

  1. Traiter les fichiers raw du spectromètre de masse avec l’hybride repose sur des balises de recherche moteur JUMP 21, qui associe une recherche de modèle de base de données et un séquençage repose sur des balises de novo pour améliorer la sensibilité et la spécificité.
  2. Convertir des données brutes de mzXML format et rechercher les spectres MS2 contre la base de données cible-leurre UniProt humaine (ou autre base de données spécifique à l’espèce appropriée) pour calculer le taux de fausse découverte (FDR).
  3. Effectuer des recherches à l’aide d’une tolérance de masse de 10 ppm pour les ions précurseurs et de fragment. Autres paramètres de recherche la valeur restriction entièrement tryptique avec 2 clivages manqués maximales, 3 sites de modification maximale par peptide et l’affectation d’un b et y ions pour marquer les peptides. La valeur statiques modifications aux balises TMT sur les résidus de Lys et des terminus de N (+229.162 Da) et carbamidomethylation des résidus Cys (+57.021 Da). Définir les modifications dynamiques à inclure Met oxydation (+15.994 Da), qui est un artefact de peptide commun résultant de la manipulation des échantillons.
  4. Critères de
  5. Filtrer les données par ce qui suit : longueur de peptide minimale de 7 acides aminés, la précision de m/z (p. ex., 5ppm) et correspondant à des scores (score de J et deltaCn). Groupe de peptides selon longueur peptidique, trypticity et état de charge.
  6. Utiliser un niveau supplémentaire de filtrage en faisant correspondre les scores pour réduire les protéines FDR à moins de 1 %. Les protéines identifiées par un seul chef d’accusation spectrale exigent un score plus élevé correspondant.
  7. Pour les membres de la protéine correspondante de cluster partagées par plusieurs membres d’une famille de protéines, de peptides dans 1 groupe.
    Remarque : Selon le principe de parcimonie, le groupe est représenté par la protéine avec le plus grand nombre de peptides affectées et d’autres protéines correspondant à des peptides unique 1.
  8. Quantifier les protéines en additionnant journaliste ion compte à travers toutes les correspondances de spectre de peptide correspondant (MPS) en utilisant un programme intégré à la suite de logiciels de saut.
  9. Chacun accepté PSM, extraire et corriger les intensités d’ion journaliste TMT selon la distribution isotopique de l’étiquetage réactifs et le biais de chargement, qui est calculé d’après les données globales de quantification des PSM. Filtre à PSMs, avec faible intensité et des niveaux de bruit élevés avec des seuils définis par l’utilisateur lors de la quantification.
  10. Calculer un signal relatif entre chaque ion de journaliste et la moyenne de tous les ions de reporter de 10. La somme des signaux relatifs de MPS pour les protéines identifiées. Convertir ces signaux relatifs aux signaux absolues en multipliant l’intensité d’ion journaliste moyenne des MPS top 3 en protéines correspondantes.
  11. Utiliser une approche computationnelle MS après y pour remédier. En supposant que l’intensité d’ion 1 y est proportionnelle à l’intensité d’ion journaliste, calculer la relation linéaire des analyses propres et dériver le niveau de brouillage de l’intensité d’y1ion contaminés dans scans bruyant 23.
    NOTE : Pour peptides tryptiques TMT-étiqueté, résidus K-TMT et R sont de 2 types d’ions y 1 (Da 376.27574 et Da 175.11895, respectivement) dans les analyses de MS2. Si seulement 1 y 1 ion est détectée et est compatible avec le peptide identifié, la MS2 est réputé propre scan ( Figure 3 a). Si les deux y1ions sont détectés, la MS2 est réputé un scan bruyant.
  12. Les valeurs de dosage des protéines à l’exportation vers un logiciel de feuille de calcul pour une analyse ultérieure. Utiliser les comparaisons ou une analyse de variance pour identifier les protéines qui sont exprimés différentiellement.

7. Validation des données MS

Nota : afin d’évaluer la qualité des données de MS, au moins 1 méthode de validation doit être effectuée avant de procéder à des expériences biologiques chronophages.

  1. Examiner manuellement les spectres MS/MS des protéines d’intérêt pour valider la séquence peptidique et au dosage d’ion journaliste TMT.
  2. Utilisation connue des données de quantification de protéines pour confirmer les résultats MS.
  3. Vérifier les changements de protéine avec des approches axées sur les anticorps (par exemple, westeRN analyse blot et immunohistochimie).
  4. Chimiquement synthétiser les peptides d’intérêt et utilisez-les normes intérieures pour confirmer l’identification de peptides natives.
    NOTE : Leurs modèles MS/MS et les temps de rétention pendant LC-MS/MS doivent être identiques.
  5. Vérifier les modifications des protéines avec une approche ciblée de la MS.

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Representative Results

Nous avons utilisé un mélange décrit précédemment hétérospécifique peptide d’analyser systématiquement l’effet du taux de compression en 3 étapes principales protocole, y compris pre-MS fractionnement, les paramètres de MS et correction de post-MS23. Le fractionnement de pre-MS a été évalué et optimisé en utilisant une combinaison de pH basique RPLC et pH acide RPLC. Post-MS analyse, seulement des peptides spécifiques ont été examinées. Nous avons utilisé ce modèle d’interférence pour examiner un certain nombre de paramètres dans LC/LC-MS/MS, y compris la MS2 fenêtre isolation, en ligne LC résolutions, quantité de chargement du pH acide en ligne RPLC et du RPLC pH élevé en mode hors connexion (voir la Figure 3 en référence ( 29).

Pour modifier la résolution au cours de la LC en mode hors connexion, nous séparés les peptides marqués isobares en 320 fractions et ensuite combinés des fractions sélectionnées ensemble pour régler la puissance de séparation. Résolution de LC en mode hors connexion a été testée en utilisant un certain nombre de sous-ensembles de fraction collectées (1, 5, 10, 20, 40, 80 et 320), tout en surveillant les niveaux de brouillage. Nous avons constaté que les niveaux de brouillage est passée progressivement de 16,4 % à 2,8 %, indiquant que vaste fractionnement pendant la séparation de LC hors connexion un peu atténué le problème de co à élution de peptides mais n’était pas capable d’éliminer complètement la interférence.

Ensuite, nous avons évalué l’effet de la fenêtre d’isolement MS2 sur l’interférence. Nous avons déterminé expérimentalement que l’ingérence est approximativement proportionnel à la taille de la fenêtre de l’isolement, en accord avec précédentes études29,30. Par exemple, une différence de 4 x de taille de la fenêtre (1,6 à 0,4 Da) a entraîné une ~ 4 x différence de niveau d’inférence (14,4 % à 3,7 %). Nous aussi déterminé la quantité de chargement optimal sur la colonne pour l’analyse de MS et utilisé cette information pour nier encore interférence. Nous avons réduit l’interférence de 9,4 % à 3,3 % en chargeant la quantité appropriée de l’échantillon. Trop d’échantillon peut entraîner pic élargissement31 et donc augmenter le niveau de brouillage, aboutissant à la précision de dosage de protéine réduite. Enfin, nous avons optimisé la résolution RPLC en ligne en changeant les longueurs dégradés (1, 2 et 4 h) et en utilisant une colonne longue (~ 45 cm). Nous avons constaté qu’une pente de 4 h presque éliminé l’interférence (jusqu'à 0,4 %) mais a également ajouté temps instrument. Les paramètres optimisés a révélé une fenêtre étroite isolement (0,4 Da), ~ 100 ng d’échantillon chargé sur colonne et fractionnement de niveau intermédiaire (~ 40 x 2 h, 3,3 jours). Nous avons également montré que grâce à une stratégie axée sur l’ordinateur post-MS correction, nous avons amélioré la précision quantitative lors de la détermination des ratios de protéine (Figure 3 b).

Nos résultats indiquent que l’utilisation d’optimisé SM-paramètres et correction de post-MS peut fournir un profil de protéomique approfondie et pratiquement éliminer les interférences qui sont souvent produit par des techniques de marquage isobares pour le dosage de la protéine.

Figure 1
Figure 1 : schéma d’ensemble-proteome analysis profilage par TMT-LC/LC-MS/MS. Dix échantillons biologiques ont été lysées, digérés et marqués avec 10 différentes étiquettes de TMT, également mis en commun et fractionnées en 80 fractions par chromatographie liquide (LC) à phase inversée en mode hors connexion pH basique. Chaque autre fraction a été séparée par RPLC acide et analysée en ligne avec un spectromètre de masse à haute résolution. Les fichiers raw de MS/MS ont été traitées et fouillés sur une base de données Uniprot pour l’identification des peptides et des protéines. Les protéines ont été dosés selon les intensités relatives des balises TMT. Enfin, les protéines identifiées et étalonnées ont été soumis pour analyse de données intégrative. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : TMT examen de l’efficacité de l’étiquetage. Tous les deux marqués au TMT et leurs correspondants non échantillons ont été analysés par LC-MS/MS séparément pour examiner TMT étiquetage de l’efficacité. Pour l’étiquetage de TMT complet, (A), le peptide sans étiquette PIC était complètement absente dans l’échantillon étiqueté, (B) alors que le peptide marqués au TMT était présent uniquement dans l’échantillon étiqueté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : approche computationnelle pour suppression d’interférence après la collecte de données de MS. (A) MS2 tous les balayages ont été divisés en propre (panneau de gauche) et bruyants scans (panneau de droite). Balayages bruyants pièce les deux ions1 y K et R (1 d’un peptide de la cible et les autres de contaminer des peptides). (B) Peptides d’Escherichia coli ont été individuellement étiquetés avec 3 différents réactifs TMT et mis en commun à 1:3 : ratios de 10. Environ 20 fois plus peptides rat ont été ajoutés comme toile de fond. Les intensités relatives additionnées des peptides dans les 3 groupes d’e. coli a révélé que y1 correction à base d’ion est plus précise pour le dosage de base TMT. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les auteurs décrivent un protocole haut débit pour la quantification des protéines avec une stratégie de marquage isobare 10-plex, qui a été appliqué avec succès dans plusieurs publications12,13,14,32 . Dans ce protocole, nous pouvons analyser jusqu'à 10 échantillons de différentes protéines biologiques dans le 1 expérience. Nous pouvons régulièrement identifier et doser les protéines plus 10 000 avec le degré de confiance élevé. Même si l’étiquetage isobare est une technologie efficace pour doser les protéines, il est limité par le taux de compression qui peut conduire à une imprécision quantitative. Notre protocole en utilisant diverses stratégies, comme l’optimisation de la LC/LC et les paramètres de MS/MS en combinaison avec correction de post-MS-à base d’ion y1 , élimine efficacement la plupart des effets de brouillage et donc considérablement améliore la précision des dosage de la protéine.

Pour le dosage de la protéine, la suite du saut de programmes fonctions dans un certain nombre de façons. Nous avons mesuré l’impureté isotopique pour chaque lot de réactifs achetés, qui diffère légèrement des valeurs rapportées dans les certificats fournis par le vendeur. L’impureté isotopique mesurée est utilisée pour corriger les intensités des ions de reporter dans le logiciel de saut. Une protéine est généralement quantifiée par PSMs beaucoup avec diverses intensités absolues qui sont influencées par plusieurs facteurs, tels que l’efficacité de l’ionisation. Parce qu’on ne connaît pas l’influence des facteurs, les spectres de masse ne révèlent que les abondances relatives des ions de journaliste dans un essai TMT. Les abondances relatives des ions de journaliste sont calculés en divisant l’intensité de chaque ion journaliste par l’intensité moyenne de 10 tous les journalistes. Pour fournir le meilleur représentant « signal absolu » de la protéine, nous avons calculé une moyenne des intensités relatives des 3 MPS avec les plus hautes intensités absolues de la protéine et la moyenne de la plus forte intensité absolue pour estimer l’absolu signal de la protéine. Nous avons défini ces étapes comme la mise à l’échelle. La correction de1 y est universellement applicable à n’importe quel essais TMT ; Toutefois, dans certains cas nous ne pourrions pas corriger des peptides avec un spectre MS/MS contenant l’ion de1 y. Cependant, nous avons constaté qu’environ 90 % des spectres ont les ions y1 de lysine et d’arginine. Pour compenser l’interférence causée par conjointement à élution de peptides qui ont les mêmes résidus C-terminal comme le peptide identifié, le niveau de brouillage estimée était essentiellement doublé et de correction. Cette hypothèse était fondée sur des preuves empiriques que nous avons recueillies au cours de nombreuses expériences TMT, où nous avons observé le même niveau d’intensité pour y1 en peptides contenant K et R.

Interférence peut être réduit par de nombreuses méthodes autres que ce que nous avons décrit dans le présent protocole, tels que l’approche multinotch MS3. Toutes ces méthodes sont valides et ont leurs mérites individuels. En fin de compte, la méthode utilisée dépend de plusieurs facteurs, y compris mais non exclusivement quantité d’échantillon, disponibilité de l’instrument (c'est-à-dire, type d’instrument et temps nécessaire pour analyser les échantillons), résultats souhaités (c.-à-d., le nombre de les protéines identifiées) et la précision de dosage nécessaire.

Afin d’assurer les résultats les plus précis, il est important de respecter les mesures de contrôle de la qualité dans tout le protocole. Ceux-ci incluent l’utilisation de normes précises pour le dosage d’échantillon (p. ex., BSA qui a subi une analyse des acides aminés), tester l’efficacité d’étiquetage du réactif TMT, détermination de l’efficacité de la digestion trypsique, effectuer un test du rapport de prémélange pour assurer un mélange égal de tous les 10 échantillons et en utilisant un logiciel pour corriger tout biais de chargement. Dans les cas où une protéine connue ou plusieurs protéines sont censés présenter des changements d’expression entre des échantillons individuels, il est important d’effectuer l’analyse par western blot après la lyse de la cellule initiale pour confirmer que ces changements sont présents et peuvent être détectées. Cela garantit que les échantillons représentent la biologie à tester et permet d’économiser temps, argent et effort avant d’effectuer l’ensemble du protocole TMT. Si un échantillon particulier ne devrait ne pas exprimer certaines protéines, il est également important d’utiliser l’analyse par western blot pour confirmer leur absence après lyse avant de continuer avec le protocole. Le test du rapport de prémélange est utilisé lorsque la plupart des protéines sont supposés ne change ne pas à travers les 10 échantillons biologiques. Nous avons supprimé aussi les protéines contaminantes connues, comme les kératines, donc ils n’affecterait pas négativement notre correction. Notre méthode de quantification corrigé toute erreur qui aurait pu se produire des erreurs de pipetage, etc.. Lorsque cela est possible, nous avons utilisé spécifiquement pipette volumes de plus de 5 µL à réduire les erreurs. Nous avons effectué plusieurs tours de ce test de prémélange pour s’assurer que nous avons obtenu un mélange précis de 1:1. Il est important de noter que nous n’a pas effectué ce type de test du rapport de prémélange, lors de l’utilisation des échantillons d’immunoprécipitation pour le protocole, comme nous avons prévu un pourcentage important des protéines pour changer. Dans ce cas, le test de prémélange pourrait fausser les résultats. Ceci est également vrai de toute expérience dans laquelle au moins 1 des 10 échantillons devrait varier considérablement dans l’expression de la protéine (vecteur vide, l’inhibition du protéasome, etc.) dans ce cas, il est fortement recommandé d’utiliser des répétitions pour faciliter la quantification statistiques. Nous recommandons généralement effectuer 3 réplique pour ces types d’échantillons. En fin de compte, le nombre de répétitions est basé sur la variabilité attendue de chaque échantillon.

Avec quelques ajustements, ce protocole robuste peut être utilisé comme un pipeline protéomiques générales d’enquêter sur les protéines, protéine, progression de la maladie et autres fonctions biologiques. Le protocole présenté ici offre une technique puissante pour obtenir une couverture profonde de protéine et d’atténuer les suppression de rapport au cours de la quantification. Avec des modifications mineures, ce protocole peut être facilement adapté pour quantifier les modifications post-traductionnelles de protéines, tels que la phosphorylation et l’ubiquitination acétylation33,,34. Ces types de projets de protéomique complète peuvent être intégrés à la génomique, transcriptomique et éventuellement la métabolomique pour une approche de biologie systémique comprendre les systèmes biologiques et faciliter les nouvelles découvertes des mécanismes moléculaires, biomarqueurs et cibles thérapeutiques dans la maladie13,28,35,36,37,38.

Nous avons démontré une méthode de quantification précise plus 10 000 protéines de lysats de cellules entières ou des tissus. Nous espérons que cette méthode soit largement applicable à de nombreux systèmes biologiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient tous les autres membres de laboratoire et de la facilité de discussion utile. Ce travail a été partiellement soutenu par des subventions NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 et ALSAC. L’analyse de MS a été réalisée dans recherche protéomique hospitalier le St. Jude Children, partiellement pris en charge par grant NIH Cancer Center Support P30CA021765. Les auteurs remercient Nisha Badders pour aide à l’édition du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

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