Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Biochemistry

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Summary

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

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High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J. H., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

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Abstract

Se han logrado muchos avances excepcionales en espectrometría de masas (MS)-basado en proteómica, con progreso técnico especial en cromatografía líquida (LC) acoplada a la espectrometría total en tándem (LC-MS/MS) y la capacidad de multiplexación etiquetado isobárico. Aquí, presentamos un protocolo perfilado profundo-proteómica que combina 10-plex etiqueta masa tándem (TMT) etiquetado con una amplia plataforma LC/LC-MS/MS y corrección de interferencias computacional MS post para cuantificar con precisión todo proteomas. Este protocolo incluye los siguientes pasos principales: extracción de proteínas y la digestión, etiquetado TMT, 2 dimensiones (2D) LC, espectrometría de masas de alta resolución y procesamiento computacional de datos. Medidas de control de calidad se incluyen para solucionar problemas y evaluar la variación experimental. Más de 10.000 proteínas en muestras de mamíferas pueden cuantificarse con confianza con este protocolo. Este protocolo se puede aplicar también a la cuantificación de modificación post traduccional con cambios menores. Este método multiplexado, robusto proporciona una poderosa herramienta para análisis proteómico en una variedad de muestras complejas, incluyendo cultivo de células, tejidos animales y especímenes clínicos humanos.

Introduction

Avances en la tecnología de secuenciación de última generación han llevado a un nuevo panorama para el estudio de sistemas biológicos y enfermedad humana. Esto ha permitido un gran número de mediciones de genoma, transcriptoma, proteoma, metaboloma y otros sistemas moleculares a ser tangible. Espectrometría de masas (MS) es uno de los más sensibles métodos de química analítica y su aplicación en proteómica ha ampliado rápidamente después de la secuenciación del genoma humano. En el campo de la proteómica, los últimos años han producido importantes avances en los análisis cuantitativos basados en MS, incluyendo etiquetado isobárico y la multiplexación capacidad combinada con cromatografía líquida extensa, además de instrumentación avanza, lo que permite mediciones más rápidas, más precisas con menos material de muestra requerido. Proteómica cuantitativa se ha convertido en un enfoque convencional para perfiles de decenas de miles de proteínas y modificaciones postraduccionales en muestras biológicas altamente complejas1,2,3,4 , 5 , 6.

Multiplexados métodos Etiquetadoras isobáricos isobáricos etiqueta para cuantificación absoluta y relativa (es decir, iTRAQ) y etiqueta de masa tándem (TMT) MS grandemente mejorado rendimiento de muestra y aumentó el número de muestras que pueden analizarse en un solo experimento1,6,7,8. Junto con otros métodos de cuantificación basado en MS, cuantificación de etiqueta-libre como el isótopo estable que etiqueta con aminoácidos en cultura de célula (es decir, SILAC), el potencial de estas técnicas en la proteómica campo es considerable9 ,10,11. Por ejemplo, el método TMT permite 10 muestras de proteínas a analizar juntos en 1 experimento utilizando reactivos 10-plex. Estas etiquetas TMT estructuralmente idénticas tienen la misma masa global, pero los isótopos pesados se distribuyen diferencialmente en átomos de carbono o nitrógeno, resultando en un ión único reportero durante fragmentación de MS/MS de cada etiqueta, permitiendo la cuantificación relativa entre las 10 muestras. La estrategia TMT se aplica rutinariamente para estudiar vías biológicas, progresión de la enfermedad y los procesos celulares12,13,14.

Sustanciales mejoras técnicas han mejorado los sistemas de cromatografía líquida (LC)-MS/MS, tanto en términos de parámetros de MS, para maximizar la identificación de proteínas sin sacrificar la precisión de la cuantificación y separaciones LC. Primera dimensión separación de péptidos mediante una técnica de separación con alta ortogonalidad a la segunda dimensión es fundamental en este tipo de método de Proteómica de escopeta para lograr máximos resultados20. Cromatografía líquida de fase inversa de alto pH (RPLC) proporciona un mejor rendimiento que hace de la cromatografía de intercambio catiónico fuerte convencional20. Cuando RPLC de alto pH se combina con una segunda dimensión de TAGATOSA bajo pH, rango dinámico análisis y cobertura de proteína se mejoran, dando por resultado la capacidad para identificar la mayor parte de las proteínas expresadas al realizar análisis de proteoma conjunto15 ,16,17,18. Otros avances incluyen pequeñas partículas de C18 (1,9 μm) y extendido largo columna (~ 1 m)19. Además, otras mejoras notables incluyen nuevas versiones de espectrómetros de masas con las tasas de exploración rápida, mejoras en la sensibilidad y resolución20y sofisticada bioinformática tuberías para MS datos minería21.

Aquí, describimos un protocolo detallado que incorpora las más recientes metodologías con modificaciones para mejorar la sensibilidad y rendimiento, mientras se centra en los mecanismos de control de calidad durante todo el experimento. El protocolo incluye la extracción de proteínas y la digestión, TMT 10-plex etiquetado, pH básico y pH ácido RPLC fraccionamiento, detección MS alta resolución y procesamiento de datos de MS (figura 1). Además, implementamos varios pasos de control de calidad para solucionar problemas y evaluar la variación experimental. Este protocolo detallado está destinada a nuevos investigadores en el campo habitualmente identificar y cuantificar con precisión miles de proteínas a partir de un lisado o tejido.

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Protocol

PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de seguridad (es decir, MSDS) antes de uso. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realiza este protocolo de.

Nota: se utiliza un conjunto de reactivos TMT 10-plex etiqueta isobárico en este protocolo para la cuantificación de proteoma de 10 muestras.

1. preparación de células/tejidos

Nota: es fundamental recoger las muestras en un tiempo mínimo a baja temperatura para mantener las proteínas en su estado biológico original.

  1. Células adherentes de lavado (por ejemplo, las células de HEK 293) en una placa de 10 cm dos veces con 10 mL de hielo frío con tampón fosfato salino (PBS). Raspar y recoger las células (~ 2 x 10 6 células) en 1 mL de PBS. Transferir a tubos de 1,5 mL y PBS después de centrifugación a 600 x g durante 5 min a 4 pellets de celular ° C. tienda a-80 ° C hasta lisis.
    Nota: A menudo se realiza un experimento piloto para examinar el rendimiento de proteína. Aproximadamente 1 mg de proteínas se puede extraer de 10 x 10 6 células de mamífero o de una placa de 15 cm con 80% de confluencia.
  2. Alternativamente, lyse las células adherentes en su placa mediante la adición de tampón de lisis directamente a la placa después del lavado. Recoger los lisados en tubos de 1,5 mL y utilizar la descripción del protocolo en el paso 2.5.
  3. Células de suspensión
  4. recoger en tubos de 15 mL, Lave dos veces con 10 mL de PBS frío hielo, transferir a tubos de 1,5 mL y centrifugar a 600 x g para eliminar PBS. Saque los pasos de lavado totalmente para mantener la concentración deseada de ingredientes de buffer de lisis a PBS. Almacenar pellets de células a-80 ° C hasta lisis.
  5. Recoger y pesar los tejidos rápidamente. Mantener los tejidos en nitrógeno líquido inmediatamente después de la disección y tienda a -80 ° C.
    Nota: El rendimiento de proteína de los tejidos es aproximadamente del 5 al 10% del peso del tejido
  6. utilizar tamaños de tejido homogéneo y regiones anatómicas para las 10 muestras para reducir la heterogeneidad de la muestra. Eliminar la contaminación de sangre aclarando las muestras dos veces con 1 mL de PBS frío hielo para evitar que las proteínas de la sangre muy abundante que afecta a la cuantificación de la proteína y análisis de datos downstream.

2. Extracción de proteínas, Control de calidad Western Blotting, digestión en solución y el péptido de la desalación

Nota: manejo de cada una de las 10 muestras del mismo modo durante cualquier etapa antes de la puesta en común de las muestras etiquetadas TMT es esencial para reducir variación.

Tampón de lisis
  1. hacer (50 mM HEPES [pH 8.5], urea de 8 M y desoxicolato de sodio 0.5%) el día del experimento.
    Nota: Desnaturalización de la proteína parcial durante la lisis de la muestra afecta la eficiencia de digestión de proteína.
  2. Lisis de añadir tampón por lo que la relación de buffer el volumen de la muestra es 10:1 y ~ 20% del volumen final de granos de cristal (0,5 mm de diámetro) pellets de células o tejidos (p. ej., volumen 10: 1 relación tampón de muestras) para lograr una concentración final de proteína de 5 a 10 mg/mL. Mantener la misma concentración de todas las muestras de 10 teniendo en cuenta el número de células o tejido peso de cada muestra.
  3. Mantener concentración urea 8 M mediante la adición de urea sólida a la muestra. No olvide tener en cuenta el volumen del precipitado de células o tejido en el cálculo de la cantidad de urea sólida a añadir a la muestra para lograr la concentración de 8 M.
    Nota: Almacenador intermediario fresco sin urea puede introducir modificación química artificial (es decir, la proteína carbamylation) y afectan negativamente el número de péptidos identificados. Urea ocupa un volumen considerable (100 mg de urea ocupa ~ 73 μl de solución).
  4. Mantener la suciedad insoluble en el lisado para permitir la digestión de las proteínas insolubles 23.
  5. Lyse las muestras en una licuadora a 4 ° C en velocidad 8 para 30 s, el resto de 5 s y repetir 5 veces o hasta que las muestras se homogeneizaron. Las muestras también pueden lisis con un vórtex durante 30 s a temperatura ambiente (RT) con un 30 s período en hielo para ~ 10 ciclos de refrigeración. Ajustar las condiciones de lisis en caso necesario, dependiendo del tipo de muestra.
  6. El pozo lisado sin centrifugación de la mezcla y hacer 2 pequeñas alícuotas (~ 15 μl cada una). Use 1 parte alícuota para medir la concentración de proteína y 1 alícuota para realizar la validación del control positivo por análisis de western blot. Mantener la alícuota grandes restantes para el análisis de proteómica.
  7. La concentración de proteína medida por un análisis de cuantificación de proteína estándar o por una tinción de Coomassie corto sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel (10%) 22 con albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. Utilizar un estándar de BSA con un alto grado de exactitud de concentración conocida. Para lograr el más alto nivel de precisión, realizar un análisis del aminoácido del estándar de BSA.
    Nota: Otras normas precisas pueden estar disponibles. Las concentraciones de proteína también pueden estimarse por el número de células o tejido pesos. Aunque se recomienda 1 mg de proteína (100 μg/muestra), el análisis puede realizarse con tan poco como 100 μg de proteína (10 μg/muestra).
  8. Agregar 100% acetonitrilo (ACN) para lograr una concentración final de 10% ACN y LysC proteasa en una proporción de enzima-sustrato de 1: 100 (w/w) para digerir proteínas en altamente desnaturalizar condiciones a temperatura ambiente por 2 h 1. Añadir dithiothreitol (DTT) a una concentración final de 1 mM para reducir enlaces de disulfuro en proteínas e incubar durante 1 h. LysC realizar digestión a una concentración final de urea de 7,2 M.
  9. Diluir muestras a 2 M de urea con 50 mM HEPES (pH 8,5) y más digerir con tripsina a temperatura ambiente durante 3 horas o toda la noche en una tripsina a relación de 1:50 (w/w). Use aproximadamente 2 μg de tripsina para 100 μg de proteína y una concentración de tripsina de aproximadamente 10 ng/μl.
    Nota: Factores que pueden conducir a la digestión de tripsina ineficientes son problemas de pH, tripsina inactiva o el uso de un ratio inadecuado de enzima sustrato.
  10. Añadir DTT para rendir 1 mM y reducir aún más péptidos por 2 h a TA.
  11. Agregar Yodoacetamida (IAA) para conseguir 10 mM. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad para alkylate péptidos que contienen Cys.
  12. Quench IAA no reaccionado mediante la adición de TDT para alcanzar 30 mM e incubar 30 min a TA.
  13. Comprobar la eficiencia de la digestión de tripsina examinando una pequeña alícuota de cada muestra. Desalinización mediante el uso de una pipeta de 10 μl con cromatografía medios incrustados en el espacio muerto, según el fabricante ' protocolo de s. Analizar cada muestra por LC-MS/MS. LC-MS/MS parámetros son los mismos que en el paso 5, con la excepción de que el gradiente es 10 min 23.
  14. Llevar a cabo una búsqueda de base de datos de MS datos en bruto (véase más detalle en el paso 6) con 4 divisiones perdidas como un parámetro de búsqueda.
    Nota: Si el número de divisiones de perdido es > 10%, puede indicar la digestión incompleta de la tripsina. Esto afectará negativamente a los resultados posteriores. Este es un paso crítico control de calidad (CC).
  15. Digerir muestras otra vez si es el frustrada escote > 10% agregando un adicional 10 μl de la tripsina a las muestras de.
  16. Acidificar las muestras mediante la adición de ácido trifluoroacético (TFA) para lograr la concentración del 1%. Miden el pH con una tira de pH. Verificar que el pH es apostarentre 2 y 3. Añadir más TFA gota sabia (1 μl según sea necesario hasta conseguir el pH correcto es).
  17. Centrifugar a 20.000 x g a temperatura ambiente durante 10 min y recoger el sobrenadante.
  18. Centrifugado de capacidad de 0,5 a 60 μg columnas que contienen resina de fase inversa C18 con 0.25 mL de metanol si usa 100 μg muestras. Lavar 0.03 a 30 μg capacidad centrifugado columnas con 0,25 mL de 60% ACN/0.1% TFA si utilizando 10 μg. Centrifugar columnas de centrifugado a 500 x g por 30 s.
  19. Equilibrar columnas con 0,5 mL de 0,1% TFA y eliminar por centrifugación a 500 x g durante 30 s.
  20. Cargar muestras en columnas y muestras se unen a las columnas mediante centrifugación a 100 x g durante 3 min o hasta que la muestra ha pasado a través de la columna.
  21. Añadir 0,5 mL de 0.1% TFA a columnas y centrifugar a 500 x g durante 30 s.
  22. Añadir 125 μl de 60% ACN/0.1% TFA a cada columna y eluir por centrifugación a 100 x g durante 3 minutos Asegúrese de que la solución ha pasado por la columna de.
  23. Seco los eluyentes en un concentrador de vacío. Asegúrese de que las muestras son restos completamente secos y no líquidos en los tubos. Tienda a-80 ° C hasta análisis.

3. Etiquetado de péptidos de TMT

Nota: es importante garantizar que todas las muestras están totalmente marcadas por reactivos TMT. Varios factores (por ejemplo, cantidad de reactivos TMT, valor de pH y exactitud de la cuantificación de la proteína) pueden afectar TMT etiquetado eficiencia, lo que alterará negativamente todos los resultados de abajo.

  1. Reconstituir cada muestra de péptido desalado en 50 μl de 50 mM de tampón HEPES (pH 8.5). Verificar el pH y asegurarse de que es entre 7 y 8.
    Nota: La muestra puede ser ácida si no seca totalmente después del paso de la desalación, que afectará a la eficacia etiquetadora.
  2. Mantener ~ 1 μg de cada muestra sin etiqueta para una posterior prueba de eficacia etiquetadora TMT, tal como se describe en el paso 3.3.
  3. Reactivos TMT en ACN anhidro se disuelven y etiquetar muestras de péptido siguiendo el fabricante ' instrucciones. Incubar los reactivos a temperatura ambiente por 1 h.
  4. Realizar una prueba de eficiencia etiquetadora QC TMT desalación ~ 1 μg de cada marca TMT - sin etiqueta muestra y mediante el uso de puntas de pipeta de 10 μl con medios integrados cromatografía según el fabricante ' protocolo de s. Analizar muestras de TMT-etiquetados y sin etiqueta por LC-MS/MS.
    Nota: Los parámetros LC-MS/MS son igual que en la sección 5, con la excepción de que el gradiente es 10 minutos
  5. Examinar los datos en bruto para que péptidos sin etiqueta no se detectan en las muestras etiquetadas, asegurando eficiencia etiquetado completa ( figura 2). Hacer esto para péptidos separados de 6 a 10 verificar la eficacia del etiquetado.
  6. Calmar la reacción al añadir 4 μL de hidroxilamina 5% e incúbelos durante 15 min.
  7. Mezclar una alícuota de volumen pequeños e iguales (2 μL) de cada muestra etiquetado como TMT. Desalinización mediante el uso de puntas de pipeta de 10 μl con medios integrados cromatografía. Analizar las muestras por LC-MS/MS, como se describe en el paso 3.4. Utilice el programa software de salto (un algoritmo de búsqueda base de datos de código abierto que convierte los archivos raws de tandem MS a una lista de péptidos y proteínas) determinar el cociente de la concentración relativa de todas las 10 muestras por las intensidades de la etiqueta TMT de todo identificado péptidos.
    Nota: Esta prueba de proporción de mezcla preparada de antemano del control de calidad es útil para determinar la proporción correcta de mezcla igual antes de la puesta en común final, puede provocar errores de pipeteo que cambiará las concentraciones y el paso de cuantificación de proteína puede no ser siempre preciso. También es la mejor manera para asegurar que la cantidad de cada una de las 10 muestras que utiliza para la mezcla final a una relación de igual, como se describe en el paso 3.5.
  8. Repetir tantas veces como sea necesario para lograr una proporción 1:1 a través de todas las 10 muestras.
  9. Igualmente mezclar las 10 muestras según los resultados de la prueba de proporción de mezcla preparada de antemano. Utilizar la muestra con la concentración más baja como base para ajustar los volúmenes de las otras 9 muestras.
  10. Eliminar los subproductos de la reacción de enfriamiento de la muestra combinada marca TMT por desalación.
  11. Cartuchos de extracción
  12. lavado 1 mL de fase sólida que contiene 50 mg de adsorbente por columna con 1 mL/0,25 mL de metanol si usa 100 μg muestras. Lavar capacidad 0.5 a 60 μg C18 spin columnas con 1 mL/0,25 mL 60% ACN/0.1% TFA si utilizando 10 μg. Centrifugar a 500 x g por 30 columnas de s.
  13. Equilibrar columnas con 0,5 mL de 0,1% TFA y eliminar por centrifugación a 500 x g durante 30 s.
  14. Cargar muestras en columnas y se unen por centrifugación a 100 x g durante 3 minutos o hasta que toda la muestra haya pasado a través de la columna de.
  15. Añadir 0,5 mL de 0.1% TFA a columnas y centrifugar a 500 x g durante 30 s.
  16. Añadir 125 μl de 60% ACN/0.1% TFA a cada columna y eluir por centrifugación a 100 x g durante 3 min Asegúrese de que toda la solución ha pasado por la columna.
  17. Seco los eluyentes en un concentrador de vacío. Asegúrese de que las muestras son restos completamente secos y no líquidos en los tubos. Tienda a-80 ° C hasta análisis.

4. Amplia resolución básica pH LC Prefractionation

  1. Set up 2 columnas C18 conectados que contienen partículas de híbrido puente etileno (4,6 mm x 25 cm, por un total de 50 cm; 3,5 μm tamaño de partícula) y utilice un microlitro flujo alto rendimiento LC bomba para fraccionamiento.
    Nota: El uso de 2 columnas aumenta la carga de péptidos y no necesariamente mejora la cromatografía. Para las muestras que contienen ≤ 200 μg de péptidos, 1 columna es suficiente.
  2. Lavar el loop de 100 μl con adiciones posteriores de 300 μL de tampón A, metanol y agua (formiato de amonio de 10 mM, pH 8.0).
  3. Lavar las columnas con 100 μl de igual mezcla isopropanol, metanol, ACN y agua y equilibrar la columna de búfer de 95% A para 2 h.
  4. Solubilizar la muestra desalado péptido combinado marca TMT en 65 μl de tampón A. Verifique que el pH de la muestra es ~ 8.0. Si todavía ácidos, use Hidróxido de amonio para ajustar el pH a 8.0.
  5. Muestra
  6. Fractionate utilizando el siguiente gradiente con buffer B (un 90% más de búfer ACN): 15% a 20% durante 15 min, 20% a 35% para 100 min y 35% a 50% durante 30 minutos ajustar el colector de fracciones para recoger fracciones cada 2 minutos incluyendo el tiempo de carga. Fijar el caudal a 0,4 mL/min. Ver referencia 29 y la figura 1 para un cromatograma representativo.
  7. Recoge un total de 80 fracciones y seco 40 fracciones (fracción otros) con un concentrador de vacío para el secado sea completo.
  8. Utilizar las 40 muestras secadas por LC-MS/MS análisis.
  9. Analizar todas aquellas 80 fracciones por LC-MS/MS para lograr cobertura del proteoma ultraprofundas.

5. Preparación de LC-MS/MS y parámetros

Nota: cuantificación basada en TMT, iones de péptidos son isobáricos y aparecen como 1 masa en una exploración de MS1. Sin embargo, ellos son cuantificados según la intensidad de los iones de reportero (10 único reportero iones) en el análisis de MS/MS después de que el ion del péptido se ha fragmentado con la disociación de colisiones de mayor energía (HCD). Las proporciones de iones reportero TMT pueden suprimirse de la elución de iones marca TMT 24. Estrechamiento del ion aislamiento ventana 25, fase gaseosa purificación 26, MultiNotch MS3 método 27 o amplia fraccionamiento con LC multidimensional y los gradientes largos (4-8 h) 28 son alternativas.

  1. Pack 75 μm de diámetro interno (ID) vaciar columnas con 1,9 μm de resina C18 para 30 a 40 cm de longitud (volumen de cama μL ~1.3).
  2. Las columnas a 65 ° C de calor con un calentador de cartera mariposa para reducir la contrapresión y evitar el exceso de presión sobre de la ultra alta presión sistema de cromatografía líquida (UPLC). La columna de 2 a 3 veces en el calentador de mariposa para asegurar que el vestido de cama entera se calienta la bobina. Cinta de la columna en el interior de la estufa teniendo cuidado de no de cinta sobre el sensor de temperatura interior del calentador.
    Nota: El calentador de cartera mariposa es montado y grabado en una pieza por encargo de plexiglás unida a la etapa XYZ del instrumento.
  3. Preparar un (3% dimetil sulfóxido y 0,2% ácido fórmico) de tampón y tampón B (un 67% más de búfer ACN) y lavar las columnas con 95% buffer B. Luego, completamente equilibrar columnas en 95% buffer A (volúmenes de columna por lo menos 3). Utilizar un caudal de ~0.25 μl/min y contrapresión de 280 a 320 bar
  4. Examinar la calidad del sistema LC-MS/MS ejecutando 100 ng de rata cerebro péptidos (o estándar de nuestra elección) dos veces antes de analizar las muestras etiquetadas de TMT. Comprobar los parámetros siguientes con frecuencia para asegurar la recogida de datos de alta calidad: MS intensidad de la señal (entre e8 y e9 para intensidad máxima base), la encuesta calidad de espectros MS/MS (una buena representación de iones y y b), ancho de pico (s 12-22), tiempo total de retención, Presión del sistema LC (aumento de presión > 50 barras indica una columna sucia o punta de emisor tapado) y variabilidad de la prueba a prueba (picos idénticos deben ser < 30 s entre corridas).
    Nota: Para resolver los iones cerca isobárico reportero de los reactivos TMT 10-plex (6.32 mDa diferencia), la resolución MS/MS se debe ajustar al menos 30.000 en 400 m/z. HCD se utiliza normalmente para fragmentación de iones de TMT10-plex reportero, ya que no es conforme a la regla de un tercio que se aplica a disociación inducida por colisión (CID) en instrumentos de trampa de iones.
  5. Limpiar y calibrar el instrumento MS regularmente y usar tampones frescos de LC para mejorar el rendimiento del sistema.
  6. Reconstituir los péptidos secados de la separación de pH básico en 5% TFA.
  7. Carga ~0.2 μg en la columna mientras que fluye amortiguamiento 5% A.
  8. Elute con el 15% y el 45% de tampón B en 150 min. Como punto de partida, utilice el siguiente gradiente: tiempo 0, 5% de tampón B; tiempo 2, buffer B 15%; 135, buffer B 45% del tiempo, tiempo 145, 70% de tampón B; y 150, buffer B 95% del tiempo. Ajustar el degradado ligeramente para las fracciones de TAGATOSA pH básico precoz y tardía después de examinar los cromatogramas pico base.
  9. Operar el espectrómetro de masas en modo dependiente de datos con un análisis de la encuesta en el analizador de masas de trampa de iones (400-1600 m/z; 60.000 resolución; blanco de 1 x 10 6 automatic gain control (AGC); tiempo de 50 ms máximo ion; y modo de centroide). Realizar exploraciones de alta resolución de 20 MS/MS (resolución 60.000, 1 x 10 5 AGC destino, tiempo máximo ion de ~ 100 ms, 35 HCD normalizaron colisión energía, ventana de aislamiento de 0,4 m/z y exclusión dinámica de 20 s).
    Nota: Disociación de la transferencia de electrón (ETD) no se recomienda para reactivos TMT10-plex porque sitios de clivaje de ETD son diferentes de HCD, dando por resultado la superposición de reportero ion. Además, ETD no es eficaz como es HCD porque péptidos trípticos suelen generan Estados de cargados + 2, y ETD es más eficiente en los Estados de carga más alta.

6. Análisis de datos de MS

Nota: se describe el análisis de datos con el programa de salto. Sin embargo, se pueden realizar análisis de datos con otros programas comercialmente disponibles o gratis.

  1. Motor salto 21, que combina la búsqueda de una base de datos basada en el patrón y una secuencia basada en etiquetas de nuevo para mejorar la sensibilidad y la especificidad de la búsqueda de proceso de archivos raw desde el espectrómetro de masas con el híbrido basado en etiquetas.
  2. Convertir datos sin procesar a mzXML buscar espectros MS2 contra el destino-señuelo UniProt humana la base de datos (u otra base de datos específicos adecuado) para calcular la tarifa falsa del descubrimiento (FDR) y el formato.
  3. Realizar búsquedas utilizando una tolerancia total del 10 ppm para los iones precursores y fragmento. Establecer otros parámetros de búsqueda a la restricción totalmente tríptico con 2 divisiones perdidas máximo, 3 sitios de modificación máxima por péptido y la asignación de un, b y los iones y a los péptidos. Establecer modificaciones estáticas a etiquetas TMT en residuos de Lys y N termini (+229.162 Da) y carbamidomethylation de residuos de Cys (+57.021 Da). Establecer modificaciones dinámicas incluyen oxidación Met (+15.994 Da), que es un artefacto común de péptido resultante de la manipulación de la muestra.
  4. Filtrar datos por los siguientes criterios: 7 longitud mínima de péptido de aminoácidos, exactitud de m/z (p. ej., 5 ppm) y el emparejar las puntuaciones (score J y deltaCn). Grupo de péptidos según longitud del péptido, trypticity y cargar estado.
  5. Utilizar un nivel adicional de filtrado comparando puntuaciones para reducir proteína FDR a menos del 1%. Proteínas identificadas por una sola cuenta espectral requieren una puntuación coincidente.
  6. Para compartido por varios miembros de una familia de proteínas, péptidos se agrupan los miembros de proteínas combinadas en 1 grupo.
    Nota: Según el principio de parsimonia, el grupo está representado por las proteínas con el mayor número de péptidos asignados y otras proteínas por péptidos únicos 1.
  7. Cuantificar proteínas sumando reportero ion cuentas a través de todos los partidos de espectro de péptidos emparejado (PSMs) mediante un programa integrado en la suite de software salto.
  8. Para cada uno aceptado PSM, extraer y corregir las intensidades de ion del reportero TMT según la distribución isotópica de los reactivos de etiquetado y el sesgo de la carga, que se calcula a partir de los datos de cuantificación globales de PSM. Filtro de PSMs con baja intensidad y alto nivel de ruido con los umbrales definidos por el usuario durante la cuantificación.
  9. Calcular una señal relativa entre cada ion de reportero y el promedio de todos los iones del reportero 10. En resumen las señales relativas de los PSMs para las proteínas identificadas. Convertir estas señales relativas a las señales absolutas multiplicando la intensidad de ion reportero hecha un promedio de los PSMs top 3 de las proteínas correspondientes.
  10. Utilizar un enfoque computacional MS post para corregir interferencias. Suponiendo que la intensidad de ion 1 y es proporcional a la intensidad del ion de reportero, calcular la relación lineal de análisis limpiamos y obtener el nivel de interferencia de la intensidad de y1ion contaminados en exploraciones ruidoso 23.
    Nota: Para TMT-labeled péptidos trípticos, residuos de TMT K y R son 2 tipos de iones y 1 (Da 376.27574 y 175.11895 Da, respectivamente) en exploraciones de MS2. Si sólo 1 y 1 ion se detecta y es consistente con el péptido identificado, el MS2 se considera limpiarla exploración ( Figura 3A). Si se detectan dos y1ions, el MS2 se considera una exploración ruidosa.
  11. Exportar los valores de cuantificación de proteínas a un programa de hoja de cálculo para su posterior análisis. Utilizar comparaciones de pares o un análisis de varianza para identificar las proteínas que se expresan diferencialmente.

7. Validación de datos de MS

Nota: para evaluar la calidad de datos de MS, por lo menos 1 método de validación se debe realizar antes de proceder a los experimentos biológicos desperdiciador de tiempo.

  1. Examinar manualmente los espectros MS/MS de proteínas de interés para validar la secuencia del péptido y la TMT reportero ion cuantificación.
  2. Uso conocido datos de cuantificación de la proteína para confirmar los resultados MS.
  3. Verificar cambios de proteína con enfoques basados en anticuerpos (p. ej., westeRN análisis de blot e inmunohistoquímica).
  4. Químicamente sintetizan los péptidos de interés y utilizar los estándares como internos para confirmar la identificación de péptidos nativos.
    Nota: Los patrones de la MS/MS y el tiempo de retención en LC-MS/MS deben ser idénticos.
  5. Verificar cambios de proteína con un enfoque MS orientado.

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Representative Results

Utilizamos una mezcla de péptidos especie descrita para analizar sistemáticamente el efecto de la compresión de la relación en 3 pasos principales del Protocolo, incluyendo fraccionamiento pre-MS, MS ajustes y corrección de post-MS23. El fraccionamiento de pre-MS fue evaluado y optimizado mediante el uso de una combinación de pH básico TAGATOSA y pH ácido RPLC. Para el análisis de post-MS, se consideraron sólo los péptidos específicos. Utilizamos este modelo de interferencia para examinar una serie de parámetros en LC/LC-MS/MS, incluyendo el MS2 ventana de aislamiento, en línea LC resolución, cantidad de carga del línea pH ácido TAGATOSA y resolución de la TAGATOSA offline de alto pH (ver figura 3 en referencia 29).

Para modificar la resolución durante la LC fuera de línea, separados los péptidos marcados isobáricos en 320 fracciones y combina las fracciones para ajustar la potencia de separación. Resolución LC offline fue probado usando un número de subconjuntos de la recogida de la fracción (1, 5, 10, 20, 40, 80 y 320), manteniéndose en los niveles de interferencia. Encontramos que los niveles de interferencia disminuyó gradualmente de 16,4% a 2.8%, indicando que amplia fraccionamiento durante la separación de LC offline algo alivian el problema de co liberador de péptidos pero no fue capaz de eliminar totalmente la interferencia.

A continuación, se evaluó el efecto de la ventana de MS2 aislamiento en interferencia. Se determinó experimentalmente que la interferencia era aproximadamente proporcional al tamaño de la ventana de aislamiento, de acuerdo con anteriores estudios29,30. Por ejemplo, una diferencia de 4 veces del tamaño de la ventana (1.6 a 0.4 Da) resultó en un ~ 4 veces diferencia de nivel de inferencia (14,4% a 3,7%). También determina la cantidad óptima de carga en la columna para el análisis de MS y utiliza esta información para negar más interferencia. Reduce la interferencia de 9,4% a 3.3% cargando la cantidad apropiada de muestra. Carga demasiado muestra puede llevar a la máxima ampliación de31 y por lo tanto, elevar el nivel de interferencia, dando por resultado exactitud de cuantificación de la proteína reducida. Por último, hemos optimizado la resolución online de TAGATOSA cambiando el degradado longitudes (1, 2 y 4 h) y usando una columna larga (~ 45 cm). Se encontró que un gradiente de 4-h casi elimina la interferencia (hasta 0,4%) pero también había añadido tiempo de instrumento. Los parámetros optimizados revelaron una ventana estrecha de aislamiento (de 0,4), ~ 100 ng de la muestra cargada en columna y fraccionamiento de nivel medio (~ 40 x 2 h, 3,3 días). También demostró que usando una estrategia basada en computadoras post-MS corrección mejorado precisión cuantitativa determinar proporciones de proteínas (figura 3B).

Nuestros resultados indican que el uso de optimizado parámetros LC-MS y corrección de post-MS puede proporcionar un perfil proteómico completa y prácticamente eliminar la interferencia que se produce a menudo por técnicas de etiquetado isobáricos para cuantificación de proteína.

Figure 1
Figura 1: esquema de análisis perfiles proteoma conjunto por TMT-LC/LC-MS/MS. Diez muestras biológicas fueron lisis, digeridas y marcadas con 10 diferentes etiquetas TMT, igualmente combinados y fraccionados en 80 fracciones por offline pH básico fase inversa de la cromatografía líquida (LC). Cada otra fracción más fue separado por TAGATOSA ácida y analizado en línea con un espectrómetro de masas de alta resolución. Los archivos crudos de la MS/MS fueron procesados y búsquedos en una base de datos de Uniprot para la identificación de péptidos y proteínas. Las proteínas fueron cuantificadas según las intensidades relativas de las etiquetas TMT. Finalmente, las proteínas identificadas y cuantificadas se sometieron a análisis de datos integral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: TMT etiquetado examen eficacia. Ambos marcados con TMT y sus correspondientes sin etiqueta las muestras se analizaron por LC-MS/MS por separado para examinar TMT etiquetado eficiencia. Para el etiquetado completo de TMT, pico (A) el péptido estaba totalmente ausente en la muestra marcada, (B) mientras que el péptido marcado con TMT estaba presente solamente en la muestra marcada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: enfoque computacional para la eliminación de interferencias después de la recolección de datos de MS. (A) MS2 todas las exploraciones fueron divididas en limpio (panel izquierdo) y las exploraciones del ruidosas (panel derecho). Explora ruidoso exhibe ambos iones de1 y de K y R (1 de un péptido de destino y otros péptidos de contaminación). (B) Péptidos de Escherichia coli fueron etiquetadas con 3 diferentes reactivos TMT individualmente y agrupados en el 1:3:10 razones. Aproximadamente 20-fold más péptidos de la rata fueron agregados como fondo. Las intensidades relativas sumadas de los péptidos de e. coli en los 3 grupos revelaron que y1 base de ion corrección es más precisa para la cuantificación basada en TMT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se describe un protocolo de alto rendimiento para la cuantificación de proteínas con una estrategia etiquetado isobárico 10-plex, que se ha aplicado con éxito en varias publicaciones12,13,14,32 . En este protocolo, podemos analizar hasta 10 muestras diferentes de proteínas biológicas en el 1 experimento. Habitualmente podemos identificar y cuantificar proteínas más 10.000 con alta confianza. Aunque etiquetado isobárica es una tecnología eficaz para cuantificar proteínas, está limitada por la compresión de la relación que puede conducir a la cuantitativa inexactitud. Nuestro protocolo utilizando diversas estrategias, tales como la optimización de los LC/LC y configuración de MS/MS en combinación con la corrección y1 base de ion post-MS, elimina eficazmente la mayoría de efectos de interferencia y por lo tanto, mejora considerablemente la precisión de cuantificación de la proteína.

Para la cuantificación de la proteína, la suite de salto de las funciones de los programas en un número de maneras. Medimos la impureza isotópica para cada lote de reactivos comprados, que difiere ligeramente de los valores reportados en certificados suministradas por el proveedor. La impureza isotópica medida se utiliza para la corrección de las intensidades de los iones de reportero en el programa de salto. Una proteína es típicamente cuantificada por muchos PSMs con varias intensidades absolutas que están influenciados por múltiples factores, tales como la eficiencia de ionización. Debido a la influencia de los factores es desconocida, espectros de masas revelan sólo las abundancias relativas de iones de reportero en un ensayo de TMT. La abundancia relativa de los iones del reportero se calcula dividiendo la intensidad de cada ión reportero por la intensidad media de los 10 periodistas. Para proporcionar al mejor representante "señal absoluta" de la proteína, se calculan un promedio de las intensidades relativas de 3 PSMs con las intensidades absolutas más altas de la proteína y el promedio de la intensidad absoluta más fuerte para estimar el absoluto señal de la proteína. Definimos estos pasos como reescalado. La corrección de1 y es universalmente aplicable a cualquier análisis TMT; sin embargo, en algunos casos podríamos no corregimos para péptidos con espectros MS/MS que contiene el ion de1 y. Sin embargo, encontramos que el ~ 90% de los espectros tienen los iones y1 de lisina y arginina. Para compensar la interferencia causada por Co liberador de péptidos que tienen el mismo residuos C-terminal como el péptido identificado, el nivel de interferencia Estimado esencialmente fue duplicado y utiliza para la corrección. Esta asunción fue basada en la evidencia empírica que hemos recogido en numerosos experimentos TMT, en los que se observó el mismo nivel de intensidad y1 en péptidos que contienen K y R.

Interferencia puede reducirse mediante muchos métodos distintos de lo que hemos descrito en el presente Protocolo, tales como el enfoque multinotch del MS3. Todos estos métodos son válidos y tienen su mérito individual. En última instancia, la metodología utilizada depende de varios factores, incluyendo pero no limitado a la cantidad de muestra, la disponibilidad del instrumento (es decir, tipo de instrumento y tiempo requerido para el análisis de las muestras), resultados deseados (es decir, el número de proteínas identificadas) y precisión de la cuantificación necesaria.

Para asegurar resultados más exactos, es importante prestar atención a los pasos de control de calidad en todo el protocolo. Estos incluyen el uso de estándares precisos de cuantificación de la muestra (por ejemplo, BSA que ha sido objeto de análisis del aminoácido), prueba de la eficacia del etiquetado del reactivo TMT, determinar la eficiencia de la digestión de la tripsina, realizar una prueba de razón de mezcla preparada de antemano para asegurar una mezcla igual de todas las muestras de 10 y utilizando un software para corregir cualquier sesgo de carga. En los casos en que una proteína conocida o múltiples proteínas deben exhibir cambios de expresión entre las muestras individuales, es importante realizar análisis de western blot después de la lisis de la célula inicial para confirmar que estos cambios están presentes y pueden ser detectados. Esto asegura que las muestras representan la biología a probarse y ahorra tiempo, dinero y esfuerzo antes de realizar el protocolo completo de TMT. Si se espera que una muestra particular no expresar ciertas proteínas, también es importante utilizar el análisis de western blot para confirmar su ausencia después de lisis antes de continuar con el protocolo. La prueba de proporción de mezcla se utiliza cuando se espera que la mayoría de las proteínas no cambia a través de las 10 muestras biológicas. También quitamos las proteínas contaminantes conocidas, como las queratinas, por lo que no afectaría negativamente a nuestra corrección. Nuestro método de cuantificación corregido los errores que se han producido errores de pipeteo, etcetera. Cuando sea posible, utilizamos específicamente superior a 5 μl de pipeta volúmenes para reducir errores. Realizamos múltiples rondas de esta prueba de la mezcla preparada de antemano para garantizar la obtención de una mezcla exacta de 1:1. Es importante tener en cuenta que nosotros no realizó este tipo de prueba de razón de mezcla preparada de antemano al utilizar muestras de inmunoprecipitación para el protocolo, como espera que un gran porcentaje de las proteínas para cambiar. En tales casos, la prueba de la mezcla preparada de antemano sería sesgar los resultados. Esto también es cierto de cualquier experimento en el que se espera que al menos 1 de las 10 muestras varían mucho en la expresión de la proteína (vector vacío, inhibición del proteasoma, etc.) en tales casos, se recomienda utilizar repeticiones para facilitar la cuantificación estadísticas. Por lo general recomendamos realizar 3 repeticiones de este tipo de muestras. En definitiva, el número de repeticiones se basa en la variabilidad esperada de cada muestra.

Con algún ajuste, este robusto protocolo puede utilizarse como una tubería general proteómicos para investigar proteínas, proteína vías, progresión de la enfermedad y otras funciones biológicas. El protocolo que presentamos proporciona una técnica poderosa para obtener cobertura de proteína profundo y aliviar la supresión de la relación durante la cuantificación. Con pequeñas modificaciones, este protocolo puede ser fácilmente adaptado para cuantificar modificaciones postraduccionales de la proteína, tales como fosforilación, ubiquitinación y acetilación33,34. Este tipo de proyectos de proteómica completa puede integrarse con genómica, transcriptómica y metabolómica para un enfoque de la biología de sistemas entender los sistemas biológicos y facilitar nuevos descubrimientos de los mecanismos moleculares, posiblemente biomarcadores y dianas terapéuticas en enfermedad13,28,35,36,37,38.

Hemos demostrado un método para la cuantificación precisa más 10.000 proteínas a partir de Lisados celulares o tejidos. Esperamos que este método sea ampliamente aplicable a muchos sistemas biológicos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a todos los demás miembros laboratorio y centro de debate útil. Este trabajo fue parcialmente apoyado por H NI otorga ALSAC, R01GM114260, R01AG047928 y R01AG053987. Se realizó el análisis de MS en de St. Jude Children Research Hospital proteómica, parcialmente financiado por subvenciones de NIH centro apoyo P30CA021765. Los autores agradecen a Nisha Badders ayuda con editar el manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

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References

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