Formalin की इष्टतम तैयारी के लिए निर्धारित नमूनों पेप्टाइड आधारित मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर Desorption/Ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग वर्कफ़्लोज़

Biochemistry

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Summary

यह प्रोटोकॉल इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए किस्मत में formalin निश्चित ऊतक की उत्सादन आधारित तैयारी के लिए एक प्रतिलिपि और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है ।

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O'Rourke, M. B., Padula, M. P., Smith, C., Youssef, P., Cordwell, S., Witting, P., Sutherland, G., Crossett, B. Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows. J. Vis. Exp. (131), e56778, doi:10.3791/56778 (2018).

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Abstract

मैट्रिक्स के उपयोग की सहायता लेजर desorption/ionization, मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (मालदी MSI) तेजी से विस्तार किया है, के बाद से इस तकनीक का विश्लेषण दवाओं और लिपिड से अणुओं की एक मेजबान N-glycans । हालांकि विभिंन नमूना तैयारी तकनीक मौजूद है, formaldehyde संरक्षित ऊतकों से पेप्टाइड्स का पता लगाने के बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण के इस प्रकार के लिए सबसे कठिन चुनौतियों में से एक रहता है । इस कारण से, हम बनाया है और एक मजबूत पद्धति है कि स्थानिक नमूने के भीतर निहित जानकारी को बरकरार रखता है अनुकूलित है, जबकि के लिए सबसे बड़ी संख्या में है । हम भी एक लागत प्रभावी और सरल तरीके से इस लक्ष्य को प्राप्त करने के उद्देश्य से है, जिससे संभावित पूर्वाग्रह या तैयारी त्रुटि को नष्ट करने, जो हो सकता है जब स्वचालित उपकरण का उपयोग कर । अंतिम परिणाम एक प्रतिलिपि और सस्ती प्रोटोकॉल है ।

Introduction

मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption/ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (मालदी MSI) दो दशकों के लिए एक छवि आधारित तकनीक के रूप में कार्यरत किया गया है1,2, सहित अणुओं की एक श्रृंखला का विश्लेषण: लिपिड3, पेप्टाइड्स2 ,4, प्रोटीन2,5, चयापचयों6,7, एन-glycans8, और सिंथेटिक अणुओं जैसे चिकित्सीय ड्रग्स9,10। इस तकनीक की उपयोगिता के प्रदर्शन प्रकाशनों की संख्या में काफी पिछले दशक6,11,12,13से अधिक हो गए हैं । ऐसे लिपिड के रूप में कुछ अणुओं, अपेक्षाकृत आसान मालदी MSI के माध्यम से विश्लेषण करने के लिए कर रहे हैं, के रूप में वे आसानी से अपने रासायनिक प्रकृति के कारण और इस प्रकार थोड़ा पहले तैयारी3की आवश्यकता है । हालांकि, ऐसे पेप्टाइड्स के रूप में और अधिक कठिन लक्ष्य के लिए, प्रभावी रूप से इन अणुओं को रखने के लिए आवश्यक कदम व्यापक और आम तौर पर जटिल है14. वर्तमान में बहुत कुछ प्रकाशनों का उद्देश्य है कि पता करने के लिए या इस अनूठे दृश्य तकनीक के लिए ऊतक तैयार करने के लिए नियोजित कर रहे हैं कि तरीके में reproducibility का प्रदर्शन15. इस कारण से, हम एक एकल, लागू करने के लिए आसान, पद्धति है कि कोई संशोधन करने के लिए थोड़ा की आवश्यकता चाहिए, एक formaldehyde पार से लिंक किए गए ऊतक स्रोत14से पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए में अवलोकन और कार्यान्वित अनुकूलन संकलित किया है.

इस पांडुलिपि में, हम formalin-फिक्स्ड जमे हुए (FFF) और formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक वर्गों से उत्पंन पेप्टाइड्स का पता लगाने और स्थानिक मानचित्रण के लिए एक सत्यापित, कम लागत प्रतिलिपि पद्धति का वर्णन किया है । इस पद्धति की आवश्यकता नहीं है या किसी विशेष उपकरण3पर भरोसा करते हैं । विशेष रूप से, हम पेप्टाइड्स का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक विशेष नमूना तैयारी के कई पहलुओं का पता; antigen पुनर्प्राप्ति16 और मैट्रिक्स कोटिंग जैसे चरण । हमारे प्रोटोकॉल भी सस्ती उपकरण और रिएजेंट का इस्तेमाल करता है, जिससे इस पद्धति एक व्यापक समुदाय है जो अंयथा वैकल्पिक रोबोट उपकरण17बर्दाश्त करने में असमर्थ हो जाएगा करने के लिए सुलभ बना ।

एक मैनुअल नमूना तैयारी विधि विकसित करने के पीछे तर्क दो गुना था: सबसे पहले, एक sublimator का उपयोग मैट्रिक्स क्रिस्टल के एक सुसंगत और समरूप कोटिंग बनाता है कि ~ 1 लंबाई में µm है18, और अधिक आम छिड़काव के साथ कुछ प्राप्त नहीं तकनीक. दूसरे, अपेक्षाकृत छोटे सेट लागत: कस्टम तंत्र की कुल लागत था < $1500 AUD । हम ध्यान दें, लागत प्रभावशीलता के संदर्भ में, नमूना प्रति मूल्य अभी तक सस्ता है जब वहां कोई रोबोट मशीनरी शामिल है । उत्सादन का उपयोग पहले सूचित किया गया है, तथापि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, कदम दर कदम तरीके कि इस प्रक्रिया का वर्णन और नमूना तैयारी रिपोर्ट नहीं किया गया है और न ही साहित्य में वर्णित है ।

इस प्रोटोकॉल के लिए शोधकर्ताओं कि एक मालदी जन स्पेक्ट्रोमीटर के लिए उपयोग किया है और जो एक जैव के संबंध में स्थानिक जानकारी पैदा करने पर आमादा है सहायता करना है19ब्याज की अणु । संक्षेप में, मालदी MSI ऊतकीय स्क्रीनिंग का एक रूप है कि एंटीबॉडी या दाग2पर भरोसा नहीं करता है ।

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Protocol

चेतावनी: सभी लागू सुरक्षा सावधानियों का पालन किया जाना चाहिए जब इस प्रक्रिया के प्रदर्शन, उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (पीपीई) (जैसे, प्रयोगशाला कोट, नाइट्राइल दस्ताने, सुरक्षा चश्मा, आदि के उपयोग सहित, .)

1. रिएजेंट और उपकरण तैयार करना

  1. समाधान की तैयारी
    1. Carnoy के द्रव की ५०० मिलीलीटर तैयार करने के लिए, एक साफ गिलास एसिटिक बोतल में १००% इथेनॉल (ेतोः), क्लोरोफॉर्म, और एक 6:3:1 वी/वी अनुपात में हिमनदों Schott एसिड मिश्रण ।
    2. तरल nitrocellulose (नेकां) बनाने के लिए, नेकां झिल्ली भंग (सामांयतः पश्चिमी सोख्ता में इस्तेमाल किया) साफ एसीटोन में, कोमल आंदोलन द्वारा, ४० मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए ।
  2. नेकां लेपित स्लाइडों की तैयारी
    1. एक ऊतकीय परीक्षा के लिए रक्त धब्बों की तैयारी के लिए इस्तेमाल एक तकनीक के समान का प्रयोग करें20 नेकां लेपित स्लाइड तैयार करने के लिए ।
    2. पिपेट ४० तरल नेकां के µ एल एक प्रवाहकीय इंडियम टिन ऑक्साइड (इतो) माइक्रोस्कोप स्लाइड के एक किनारे पर । एक भी पतली फिल्म कोटिंग बनाने के लिए एक नियमित रूप से कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग कर, स्लाइड भर में सतह तनाव के तहत नेकां खींचें ।
    3. नेकां 20 एस के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति दें और फिर कमरे के तापमान पर जब तक की जरूरत की दुकान । इन शर्तों के तहत नमूनों का भंडारण अनिश्चितकालीन किया जा सकता है बशर्ते ऊतकों को बनाए रखा जाता है और धूल से मुक्त रहते हैं ।
      नोट: तैयारी का यह तरीका बेहतर "पतली फिल्म" के रूप में जाना जाता है और एक समान कोटिंग है कि नेकां की चिपचिपाहट पर निर्भर करता है और साथ ही सतह तनाव की अपनी कमी की स्लाइड पर स्तर का उत्पादन होगा । स्लाइड तैयार करते समय जो भी सावधानी रखी जानी चाहिए वह उतनी जल्दी नहीं चलती है, जो पूरी कवरेज के बजाय नेकां की लकीरें पैदा करेगी ।
      चेतावनी: के रूप में तरल नेकां बहुत जल्दी सूख जाता है, यह जल्दी से काम करने से पहले यह ठीक से फैल गया है समाधान सुखाने से बचने के लिए आवश्यक है । देखभाल भी जब अपने तरल राज्य में नेकां हैंडलिंग लिया जाना चाहिए, क्योंकि यह एक उच्च ऊर्जावान यौगिक है और आग विस्फोट को रोकने के लिए प्रज्वलन के एक स्रोत से संपर्क नहीं करना चाहिए । नेकां भी endothermic संक्रमण से गुजरती है जब सुखाने और ठंड जलता हो सकता है अगर त्वचा या दस्ताने हाथों के साथ लंबे समय तक संपर्क में आने की अनुमति दी । सभी संबद्ध जोखिमों को छोटा करने के लिए, प्रत्येक समय पर केवल छोटी मात्राएं तैयार की जानी चाहिए (< 1 mL अनुशंसित है) । एक बार सूखी यह कमरे के तापमान पर स्थिर है । हालांकि, नेकां बड़ी मात्रा में मौजूद होने पर विस्फोटक रह सकती है ।
  3. कस्टम वाष्प मंडलों का निर्माण
    1. कैंची की एक जोड़ी के साथ मोटी सोख्ता कागज का एक टुकड़ा काट काफी बड़ा एक मानक प्लास्टिक पेट्री पकवान के नीचे आधा फिट (व्यास में ९४ मिमी और 3 मिमी मोटी) ।
    2. कागज कट, केंद्र में एक आयताकार पट्टी, एक खुर्दबीन स्लाइड के रूप में एक ही आकार छोड़ने, पर्याप्त अतिरिक्त इतना है कि कागज पेट्री डिश में अपनी स्थिति बनाए रखने जाएगा (अनुपूरक चित्रा 1) ।

2. ऊतक वर्गों की तैयारी

  1. FFPE टिशू21.
    1. वांछित ऊतक ब्लॉक का चयन करें और एक मानक पीठ में 12 µm मोटाई पर खंड microtome घुड़सवार और नेकां पूर्व लेपित इतो स्लाइड पर फ्लोट माउंट ।
    2. 2 मिनट के लिए अवशिष्ट आयल को हटाने के लिए ताज़ा xylene में स्लाइडों को जलमग्न करें, और दूसरी बार कार्रवाई दोहराएं ।
      नोट: यदि आयल ब्लॉक विशेष रूप से व्यापक है या ऊतक के तेल ब्लॉक की तुलना में अपेक्षाकृत छोटा है, नमूनों ६० डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया जा सकता है दूर xylene में धोने के लिए पहले बहुमत पिघला ।
    3. एक वर्गीकृत विलायक श्रृंखला में स्लाइडों को विलय करके विकृत नमूनों को धो लें: ७०% v/v ेतोः/जल, १००% ेतोः, Carnoy का द्रव, १००% ेतोः, अति शुद्ध जल और १००% ेतोः । प्रत्येक डुबकी की अवधि 30 s होनी चाहिए, Carnoy के द्रव को छोड़कर, जो कि 2 मिनट तक होना चाहिए ।
      चेतावनी: Carnoy द्रव और xylene संग्रहीत किया जाना चाहिए और एक धुएं डाकू में इस्तेमाल किया, के रूप में वे अत्यधिक विषाक्त अगर सांस रहे हैं ।
  2. Formalin-फिक्स्ड जमे हुए (FFF) ऊतक
    नोट: नमूने पहले से ही जम जाना चाहिए, उचित रूप से नमूना प्रकार के अनुसार.
    1. Equilibrate 20 मिनट के लिए microtome के ऑपरेटिंग तापमान पर ऊतक ब्लॉक22
      नोट: Equilibration तापमान ऊतक के प्रकार पर निर्भर है ।
    2. धारा 12 µm और गल पर एक microtome का उपयोग कर एक पूर्व-तैयार नेकां लेपित इतो स्लाइड पर वर्गों माउंट ऊतक ।
    3. स्लाइड्स को अंधेरे में बेंच पर एक वैक्यूम desiccator में स्टोर कर लीजिये ।
      नोट: नमूने इन शर्तों के तहत कई हफ्तों के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
    4. FFPE ऊतक (2.1.3) के लिए कहा गया के रूप में एक वर्गीकृत विलायक श्रृंखला में नमूनों को धो लें ।
      नोट: नमूना एम्बेडेड नहीं है के रूप में एक xylene deparaffinisation चरण के लिए कोई आवश्यकता नहीं है ।

3. Methylene Crosslink Hydrolysis

  1. नमूना स्लाइड लोड (या तो FFF या FFPE) एक प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स जो 20 mmol tris-एचसीएल (पीएच ८.८) के साथ शीर्ष करने के लिए भर जाता है । सील बॉक्स और यह एक पानी के स्नान में जगह है, पानी की ५०० मिलीलीटर युक्त, बॉक्स के नीचे छूने की अनुमति । फिर यह 15 मिनट के लिए एक दबाव कुकर जो ७० केपीए के एक ऑपरेटिंग दबाव को प्राप्त कर सकते में १२० डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
  2. स्लाइड निकालें, उंहें शांत करने के लिए अनुमति देते हैं, और उंहें 15 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर सूखी ।

4. ऊतक पाचन

  1. एक बार hydrolyzed, कोट trypsin समाधान के 10 µ एल के साथ नमूनों (1 मिलीग्राम/एमएल) अल्ट्रा-शुद्ध पानी में, pipetting द्वारा 10 µ एल समाधान के ऊतक अनुभाग के किनारे पर फिर, एक ही पिपेट टिप का उपयोग कर, सतह के तहत ऊतक की पूरी सतह भर में छोटी बूंद खींचें तनाव.
    नोट: पिपेट टिप और ऊतक किनारों की सीमाओं से परे एंजाइम प्रसार पर के साथ ऊतक की सतह scratching से बचें ।
  2. परिवेश के तापमान पर सूखे के लिए नमूनों की अनुमति दें ।
  3. एक बार सूखी, पहले निर्माण वाष्प चैंबर के शीर्ष के अंदर नमूने माउंट (नीचे का सामना करना पड़ ऊतक) स्लाइड (अनुपूरक चित्रा 2) के या तो किनारे पर आटोक्लेव टेप के साथ ।
  4. पिपेट ६०० µ एक समाधान के एल 1:1 v/v १००% acetonitrile और ५० mM अमोनियम का मिश्रण सोख्ता डिश के नीचे भाग में पेट्री कागज उंगली पर ध्यान से जब तक उंगली को समान रूप से गीला प्रतीत होता है ।
  5. नीचे आधे पर भाप चैंबर के शीर्ष आधा प्लेस, कागज उंगली और नमूना स्लाइड सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से संरेखित करें, और तेल फिल्म के साथ अपनी भूमध्य रेखा के चारों ओर चैंबर सील ।
  6. पूर्ण पाचन की अनुमति देने के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में नमूना रातोंरात छोड़ दें ।

5. मैट्रिक्स कोटिंग via उत्सादन

  1. एक बार पचता है, एक 5 अंकों microanalytical संतुलन पर नमूना स्लाइड तौलना ।
  2. उत्सादन तंत्र के ठंडा उंगली पर स्लाइड माउंट और तांबे टेप के साथ सुरक्षित, उसी तरह के रूप में भाप चैंबर (अनुपूरक चित्रा 3) के लिए वर्णित है ।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्लाइड कूलिंग उंगली से समान रूप से संपर्क किया गया है, तांबे के टेप की एक परत को सतह के स्तर को ठंडा करने वाली उंगली के नीचे रखा जाता है । यह सुनिश्चित करता है कि स्लाइड समान रूप से ठंडा है जो मैट्रिक्स के भी जमाव की ओर जाता है ।
  3. प्लेस ३०० α के मिलीग्राम-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (CHCA) मैट्रिक्स चैंबर के तल पर एक गिलास पेट्री डिश में और समान रूप से फैला मैट्रिक्स क्रिस्टल की एक पतली परत बनाने के लिए ।
  4. sublimator इकट्ठा और घोड़े की नाल दबाना के साथ दो हिस्सों को सुरक्षित । एक रेत स्नान के ऊपर इकट्ठे इकाई 15-20 सेमी निलंबित, २२० डिग्री सेल्सियस से अधिक गरम किया, यह एक धातु एक प्रतिक्रिया स्टैंड से जुड़े अंगूठी में रखकर ।
  5. वैक्यूम स्रोत के लिए चैंबर कनेक्ट, वैक्यूम संलग्न है, और यह 5 मिनट के लिए ~ 25 mTorr के लिए नीचे स्थिर करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  6. बर्फ के साथ शीर्ष करने के लिए ठंडा उंगली पैक और पानी की ५० मिलीलीटर जोड़ें । आगे बढ़ने से पहले एक और 5 मिनट के लिए तंत्र व्यवस्थित करने की अनुमति दें ।
  7. रेत की सतह पर चैंबर कम, पूरी तरह से संपर्क चैंबर के नीचे रेत सुनिश्चित करने, और यह ४५ मिनट के लिए छोड़ के लिए एक आदर्श कोटिंग बनाने के लिए ०.२२ मिलीग्राम/cm2
    चेतावनी: ध्यान रखना चाहिए जब उच्च वैक्यूम में कांच के बने बरतन हैंडलिंग, उपकरण के लिए किसी भी क्षति के रूप में, जबकि खाली, ग्लास चैंबर की भयावह विफलता में परिणाम कर सकते हैं ।
  8. ४५ मिनट के बाद, धातु की अंगूठी जुटाने और चैंबर वेंट द्वारा रेत स्नान से चैंबर निकालें ।
    नोट: एक बार चैंबर वेंट किया गया है, स्लाइड बहुत जल्दी से हवा में पानी के रूप में हटाया जाना चाहिए ठंड उंगली और नमूना स्लाइड पर गाढ़ा करने के लिए शुरू हो जाएगा ।
  9. स्लाइड निकालें और यह सुनिश्चित करने के लिए वजन वांछित कोटिंग प्राप्त किया गया है ।
    नोट: यदि अपर्याप्त कोटिंग प्राप्त किया गया है, बस स्लाइड के लिए उत्सादन प्रक्रिया को दोहराने जब तक वांछित कोटिंग मोटाई हासिल किया गया है ।

6. पुनर्क्रिस्टलीकरण

  1. एक बार sublimated, पहले से निर्मित वाष्प कक्ष के शीर्ष के अंदर नमूना स्लाइड माउंट, के रूप में पहले वर्णित (नीचे ऊतक का सामना करना पड़) ।
  2. पिपेट ६०० µ एल एक समाधान के एक 1:1 (वी/वी) मिश्रण १००% acetonitrile और ०.१% v/वी trifluoroacetic एसिड के पानी में सोख्ता डिश के नीचे भाग में पेट्री कागज पर ध्यान से एक भी कोटिंग सुनिश्चित करते हैं ।
  3. चैंबर इकट्ठा, कागज टैब और माइक्रोस्कोप स्लाइड सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से संरेखित करें, और 1 एच के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में छोड़ दें ।
    चेतावनी: चैंबर सील नहीं है ।
    नोट: एक बार फिर से सघन, मैट्रिक्स के सामांय रूप से पीले रंग सफेद को बदलने के लिए, कम चमकदार दिखना चाहिए, और बहुत भी दिखाई देते हैं । यह इंगित करता है कि reक्रिस्टलीकरण सही ढंग से किया गया है ।
  4. नमूना अब विश्लेषण के लिए तैयार है ।

7. इंस्ट्रूमेंटेशन

  1. कोई डिजिटल छवि बनाने के लिए flatbed स्कैनर में स्लाइड स्कैन करें ।
  2. मास स्पेक्ट्रोमीटर में नमूना लोड और फिर उचित सॉफ्टवेयर मंच का उपयोग कर विश्लेषण ।
  3. एक जगह संकल्प है कि वांछित परिणाम के लिए लागू है के साथ 750-3500 डीए की एक व्यापक रेंज के साथ सकारात्मक आयन reflectron मोड में नमूनों का विश्लेषण । ज्यादातर मामलों में, 20-50 µm रैस्टर चौड़ाई पर्याप्त है, लेकिन के रूप में कम के रूप में 10 µm इस्तेमाल किया जा सकता है15
    चेतावनी: मालदी यूवी पराबैंगनीकिरण विकिरण के एक स्रोत है और सीधे नहीं देखा जाना चाहिए । सुनिश्चित करें कि लेजर उपकरण परिरक्षण आपरेशन करने से पहले के भीतर निहित है ।

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Representative Results

अगर सही ढंग से पीछा किया, इस प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से किसी भी खरोंच या अंय विकृति (चित्रा 1) के बिना ऊतक के सकल आकृति विज्ञान का प्रतिनिधित्व छवियों का उत्पादन करता है । एक सही ढंग से प्रदर्शन नमूना तैयारी के लिए आदर्श सत्यापन, (चित्रा 2) देखा जा रहा है अणु बदलकर विभिन्न शारीरिक संरचनाओं के बीच अंतर करने की क्षमता है.

नमूने गलत तरीके से तैयार किया गया है निर्धारित करने के लिए एक अच्छा गाइड स्थानीयकरण या मैट्रिक्स एकत्रीकरण की उपस्थिति के लिए जाँच करने के लिए है; पेप्टाइड हस्ताक्षर है कि शारीरिक ऊतक की सीमाओं से परे का विस्तार सही संकेतक है कि अणुओं नमूना तैयारी के दौरान स्थानांतरित कर रहे हैं । यह ट्विटर और पाड़ला (२०१७)15में विस्तार से समझाया गया है ।

उत्पादित पेप्टाइड स्पेक्ट्रम असतत अणुओं की एक उच्च बहुतायत है कि अच्छी तरह से चुने हुए जन श्रेणी1,23 में वितरित कर रहे है शामिल होना चाहिए (यह काफी हद तक निर्भर नमूना है, तथापि, यह असामांय नहीं है ५० से अधिक में देखने के लिए FFPE ऊतक से असतत पेप्टाइड हस्ताक्षर) (चित्रा 3)18

Figure 1
चित्र 1 : FFF मानव मस्तिष्क ऊतक के एक सही ढंग से तैयार नमूना । यह संसाधित ऊतक नमूना ५० µm पर imaged किया गया है और अच्छा स्थूल संरचना और सफेद बात (डब्ल्यू एम) और ग्रे मैटर (जीएम) के बीच एक स्पष्ट अंतर से पता चलता है । सफलतापूर्वक तैयार नमूनों अलग ऊतक स्थानों के स्पष्ट भेदभाव दिखाएगा । यहां, ऊपर का एक स्पष्ट क्षेत्र है-पेप्टाइड के विनियमन (मास-चार्ज अनुपात, M/Z) १०८५ पैनल a. भेदभाव के डब्ल्यू एम क्षेत्र में और पैनल सी में अपनी वापसी के बाद पैनल बी में परिभाषित आकार के अभाव द्वारा प्रदर्शित किया जाता है । एक ही ऊतक खंड पर तीन अलग अणुओं के वितरण परख और दिखा रहा है कि कुछ समान रूप से वितरित कर रहे हैं, जबकि अंय असतत शारीरिक स्थानों तक ही सीमित हैं, हम देख सकते है कि नमूना तैयारी सही ढंग से किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : FFF मानव मस्तिष्क ऊतक के एक गलत तरीके से तैयार अनुभाग । यह नमूना ५० µm पर imaged गया है, लेकिन स्थानीयकरण के एक बड़े पैमाने पर स्तर से पता चलता है । पैनलों 1, 2 और 3 भर में मौजूद अणुओं के पैटर्न स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करता है कि, 1 चित्राके विपरीत, वहां जैविक क्षेत्रों या प्रदर्शन अणुओं की बहुतायत में मतभेदों के बीच कोई स्पष्ट परिभाषा है । चूंकि छवियां एक ही हैं, प्रदर्शन के लिए चयनित अणुओं की परवाह किए बिना, हम निष्कर्ष निकाल सकते है कि यह गलत तरीके से तैयार किया जा रहा है की वजह से किया गया है । चूंकि यह मस्तिष्क ऊतक है, इस परिणाम तार्किक, जैविक भावना नहीं बनाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : छवि के वैश्विक जन स्पेक्ट्रम में प्रदर्शित चित्र 1। स्पेक्ट्रम जन रेंज के निचले छोर भर में पेप्टाइड हस्ताक्षर की एक बहुतायत शामिल है, कई उच्च जन पेप्टाइड चोटियों के रूप में अच्छी तरह से वर्तमान के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक आंकड़ा 1 : सोख्ता कागज वाष्प चैंबर में इस्तेमाल काटने के लिए योजनाबद्ध। मोटी सोख्ता कागज ९४ मिमी के व्यास के साथ एक परिपत्र आकार में कटौती की है । एक आयताकार टैब भी एक मानक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड के आकार के साथ अनुरूप करने के लिए बाहर काट रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 2
अनुपूरक आंकड़ा 2 : विधानसभा वाष्प चैंबर के योजनाबद्ध। इस योजनाबद्ध कैसे भाप चैंबर कैसे नमूना स्लाइड, सोख्ता कागज और चिपकने वाला टेप सभी एक दूसरे के साथ संगत के विशिष्ट नोट के साथ इकट्ठा किया जाना चाहिए दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 3
अनुपूरक आंकड़ा 3 : उत्सादन चैंबर विधानसभा की योजनाबद्ध: यह आंकड़ा कैसे नमूना स्लाइड, sublimator, और हीटिंग तंत्र प्रतिलिपि उत्सादन की अनुमति के लिए व्यवस्था कर रहे है दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल analytes के स्थानीयकरण को नष्ट करते हुए, विस्तृत आणविक प्रजातियों की पीढ़ी को अधिकतम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था । मुख्य कारक एक ही अवहेलना सिद्धांत का उपयोग कर जब मैट्रिक्स लागू करने, नमूना पचा, या24उत्सादन के बाद क्रिस्टलीकरण शामिल; अर्थात्, कि वाष्प, मैट्रिक्स या अंयथा के एक भी जमाव, और बनाए रखने की जरूरत है । Pipetting विलायक धोने और पाचन के लिए बहाकर, समान रूप से नमूना के नीचे, किसी भी व्यक्ति कहीं और से अधिक विलायक वाष्प प्राप्त क्षेत्र रोकता है । यह दृश्यमान संघनित्र के गठन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है और समग्र सतह अणुओं के स्थानीयकरण को रोकता है और साथ ही सुनिश्चित करना है कि नमूना समान रूप से पचा और सघन है । यह मैट्रिक्स के एक भी जमाव को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, के रूप में भी कम एक अपेक्षाकृत कम तीव्रता और प्रजातियों की विविधता दिखाएगा, और बहुत ज्यादा नमूने से आयनों को दबा देगा, भी तीव्रता और प्रजातियों की विविधता को कम करने25। मैट्रिक्स के एक भी जमाव को प्राप्त करने के लिए, सुनिश्चित करें कि एक भी, एक समरूप आकार के मैट्रिक्स क्रिस्टल की पतली परत, निलंबित माइक्रोस्कोप स्लाइड के पदचिह्न के नीचे सीधे रखा जाता है । यदि परत असमान या बहुत पतली है, तो मैट्रिक्स के उत्सादन भी धीरे से आगे बढ़ना होगा या असमान26होगा । विलायक और एंजाइम के मैनुअल आवेदन के साथ संभावित मुद्दों उपयोगकर्ता के व्यक्तिगत अनुभव के लिए नीचे आता है । "अभ्यास" के कुछ स्तर के लिए एक दोहराने परिणाम सुनिश्चित करने के लिए की जरूरत है, और वहां कुछ प्रारंभिक आकस्मिक गलत तैयारी हो सकती है । हालांकि, अगर देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि अंतिम छवि "अच्छा नमूना" हम प्रदान की है के गुणों के साथ अनुसार है लिया जाता है, तो किसी भी अनुचित तरीके से तैयार नमूनों झूठी जैविक निष्कर्ष करने के लिए नेतृत्व नहीं होगा ।

आदेश में प्रभावी ढंग से एक ऊतक formaldehyde (FFPE या FFF) में संरक्षित नमूना पचाने के लिए, यह संभव के रूप में methylene crosslinks के रूप में कई trypsin साठा16से पहले निकालने के लिए आवश्यक है । यह आसानी से एक दबाव कुकर में नमूना हीटिंग द्वारा हासिल की है > 100 ° c, एक छोटी अवधि के लिए, वास्तव में बुलबुले कि यांत्रिक नमूना अलग कर सकते हैं पैदा करने के बिना. ऊतक आसानी से खो दिया जा सकता है जब इस तरह से इलाज किया, ताकि इस का मुकाबला करने के लिए, नेकां स्लाइड कार्यरत हैं । जबकि महत्वपूर्ण नहीं, यह नमूना के भौतिक अखंडता जब गर्मी, दबाव, और कार्बनिक विलायक के अधीन सुनिश्चित करता है । नमूने के पाचन तो एक राज्य है कि इसके सक्रियण रोकता है और फिर यह शुष्क करने के लिए, अर्थात् अल्ट्रा शुद्ध पानी में निलंबित करने की अनुमति में एंजाइम लागू करने के द्वारा हासिल की है । भाप चैंबर फिर क्रिस्टलीकरण के रूप में एक ही सिद्धांत के बाद, एक आर्द्र वातावरण के पर्याप्त प्रदान करने के लिए एंजाइम के स्थानीयकृत आंदोलन मुठभेड़ और प्रोटीन रीढ़ सट, लेकिन पर्याप्त नहीं "नमी" के लिए परिणामी पेप्टाइड्स बहाव की अनुमति देने के लिए गौरतलब है कि उनके प्रारंभिक स्थान से26. Pipetting सीधे स्लाइड पर किसी भी सतह analytes, अवशिष्ट crosslinking के प्रभाव और पानी में बड़े प्रोटीन के सामान्य insolubility के कारण नहीं स्थानीयकृत होगा ।

हालांकि हम पेप्टाइड्स के लिए इस पद्धति के आवेदन पर ध्यान केंद्रित किया है, यह बस के रूप में आसानी से चयापचयों, लिपिड, और बरकरार प्रोटीन के विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह करने के लिए लागू किया जा सकता है । कुछ कदमों को हटाने या संवर्धित करने की आवश्यकता होगी; बरकरार प्रोटीन इमेजिंग किसी भी proteolytic क्लीवेज कदम की आवश्यकता नहीं है, लेकिन नमूना अनुभाग के मौलिक कार्यप्रवाह और मैट्रिक्स उत्सादन, क्रिस्टलीकरण, और विश्लेषण के बाद बढ़ते लगभग किसी भी नमूना प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल के विकास और व्यापक अनुभवजंय जांच के माध्यम से अपनी विश्वसनीयता और मजबूती सुनिश्चित करने के लिए हमारा इरादा, एक तरीका है कि कम या कोई संशोधन की आवश्यकता है, कि सस्ती उपकरण का उपयोग करता है बनाने के लिए गया था, और एक विस्तृत करने के लिए उत्तरदाई है उपकरण और जैव रासायनिक कौशल की डिग्री बदलती के साथ समुदाय । हमें उंमीद है कि यह प्रयोगशालाओं के लिए जांच के नए रास्ते खोलता है कि अंयथा इस तकनीक को खारिज कर दिया जाएगा के रूप में भी जटिल या महंगी । हमें यह भी विश्वास है कि हम पेप्टाइड MSI के लिए पहली निश्चित नमूना तैयारी विधि प्रदान की है । लेखन के समय, सबसे तरीके से किया गया है बड़े पैमाने पर उपकरण आधारित है, रोबोट छिड़काव आधारित तरीके27,28,29के उपयोग की आसानी पर एक विशेष जोर के साथ । वहां भी सही प्रक्रिया और तंत्र के रूप में अनुमान के साथ विश्वसनीय methylene hydrolysis के तरीके के तरीके में कम किया गया है इस्तेमाल किया जाएगा ।

अंत में, हम मानते है कि FFPE और FFF ऊतकों के लिए उपरोक्त पद्धति के आवेदन, के लिए MSI की प्रभावकारिता में अधिक से अधिक विश्वास का परिणाम होगा पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए.

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव या व्यावसायिक हित का खुलासा नहीं

Acknowledgements

लेखक के लिए सिडनी मेडिकल स्कूल फाउंडेशन और उदास और उनके अल्जाइमर रोग अनुसंधान के लिए पीएचडी छात्रवृत्ति कार्यक्रम के माध्यम से इस काम के वित्तपोषण भाग के लिए फाउंडेशन और एक चाप डिस्कवरी अनुदान (DP160102063) PKW को संमानित स्वीकार करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryo Microtome Leica CM3050 For preparation and section of tissue.
Indium Tin Oxide Microscope slides Bruker 8237001 For preparation and section of tissue.
Coplin Jars Sigma Aldrich S5516 For preparation and section of tissue.
Pressure Cooker Kambrook KPR620BSS For preparation and section of tissue.
Sublimator Chem Glass NA For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made 
Sand bath NA NA For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company
Glass Petri Dish Sigma Aldrich CLS70165100 For sublimation procedure.
Vacuum Pump NA NA For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer 
Cold trap Chem Glass CG-4510-02 For sublimation procedure.
Hot Plate John Morris EW-15956-32.  For sublimation procedure.
Plastic petri dish Sigma Aldrich Z717223 For sublimation procedure.
37 °C incubator NA NA For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old 
Blotting paper Sigma Aldrich P7796 For sublimation procedure.
Nitrocellulose  Sigma Aldrich N8395 For washing of slides.
Acetone Sigma Aldrich 650501 For washing of slides.
Xylene Sigma Aldrich 214736 For washing of slides.
100% EtOH Sigma Aldrich 1.02428 For washing of slides.
70% EtOH Sigma Aldrich NA For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol 
Chloroform Sigma Aldrich C2432 For washing of slides.
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich ARK2183 For washing of slides.
Tris HCL pH 8.8 Sigma Aldrich TRIS-RO For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water Sigma Aldrich NA For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system
Ammonium Bircarbonate Sigma Aldrich A6141 For proteolytic cleavage. 
Trypsin Sigma Aldrich T0303 For proteolytic cleavage. 
CHCA Matrix Sigma Aldrich C2020 For recrystallisation.
Acetonitrile Sigma Aldrich 1.00029 For recrystallisation.
Trifluoroacetic Acid (TFA)  Sigma Aldrich 302031 For recrystallisation.

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References

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