Phenotypical और कार्यात्मक अध्ययन के लिए मानव महिला प्रजनन पथ से वृक्ष कोशिकाओं का अलगाव

Immunology and Infection

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Summary

हम यहां एक विधि का वर्णन करने के लिए अलग और अपने phenotypical और कार्यात्मक विशेषताओं के मूल्यांकन के लिए मानव महिला प्रजनन पथ में विभिंन संरचनात्मक डिब्बों से वृक्ष कोशिकाओं को शुद्ध । इस विधि अंय प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या अंय श्लैष्मिक ऊतकों से वृक्ष कोशिकाओं ।

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Rodriguez-Garcia, M., Fortier, J. M., Barr, F. D., Wira, C. R. Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e57100, doi:10.3791/57100 (2018).

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Abstract

श्लैष्मिक ऊतकों में निवासी मानव वृक्ष कोशिकाओं (dc) के लक्षण वर्णन नमूनों को प्राप्त करने में कठिनाई के कारण चुनौतीपूर्ण है, और प्रति ऊतक वर्तमान dc की कम संख्या । फिर भी, के रूप में phenotype और dc के कार्य ऊतक पर्यावरण द्वारा संशोधित किया गया है, यह ऊतक निवासी डीसी आबादी का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है, के बाद से रक्त व्युत्पंन dc पूरी तरह से ऊतकों में dc की जटिलताओं को प्रतिबिंबित । यहाँ हम मानव महिला प्रजनन पथ (FRT) से dc को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद गर्भाशय नमूनों कि दोनों phenotypical और कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है का उपयोग कर. प्रोटोकॉल ऊतक पाचन के होते है एक एकल कोशिका मिश्रित सेल निलंबन, सकारात्मक चुंबकीय मनका चयन के बाद उत्पंन करते हैं । हमारे ऊतक पाचन प्रोटोकॉल सतह मार्करों, जो phenotypical और स्थिर राज्य में dc के कार्यात्मक विश्लेषण रातोंरात मशीन या सेल सक्रियण के बिना अनुमति देता है नहीं सट । इस प्रोटोकॉल अंय प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार या अंय ऊतकों से dc के अलगाव के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

FRT प्रत्यारोपण और1गर्भावस्था की अनुमति जबकि रोगजनकों के खिलाफ की रक्षा के दोहरे समारोह है । यह पूरा करने के लिए, FRT compartmentalized है, प्रत्येक संरचनात्मक क्षेत्र के साथ अद्वितीय ऊतकवैज्ञानिक, प्रतिरक्षा, और कार्यात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित करने के लिए1

श्लैष्मिक पर मौजूद dc फेफड़ों में रोगाणुओं के साथ संपर्क बनाने, आंत, और जननांग पथ, और संभावित रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा निगरानी प्रदान करते हैं2. dc प्रधानमंत्री भोली टी कोशिकाओं के लिए अद्वितीय क्षमता है और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर3. FRT में dc भी ऐसे शुक्राणु में पाया और विकासशील भ्रूण के रूप में विदेशी एंटीजन, बर्दाश्त करने के लिए विशेष कर रहे हैं, सफल गर्भावस्था की अनुमति के लिए4। इसलिए, स्थान के आधार पर, DC phenotype और फ़ंक्शन अलग हो जाएगा । यह ज्ञात है कि इस तरह की है कि उनकी संख्या, phenotype, और कार्यों ऊतक पर्यावरण जिसमें वे3रहते द्वारा संशोधित कर रहे है dc जोरदार ऊतक वातावरण से प्रभावित हैं । इसलिए, FRT dc FRT में संक्रामक रोगों, गर्भावस्था और कैंसर में खेलने की भूमिका को समझने के लिए, निवासी dc का अध्ययन करने की आवश्यकता है, क्योंकि रक्त व्युत्पंन डीसी मॉडल FRT ऊतकों में पाया विनियामक जटिलताओं को संबोधित करने के लिए अपर्याप्त हैं ।

मानव ऊतक निवासी dc के लक्षण वर्णन श्लैष्मिक ऊतकों में मौजूद कोशिकाओं की कम संख्या और मानव ऊतक नमूने प्राप्त करने में कठिनाई के कारण चुनौतीपूर्ण है । dc immunohistochemistry5,6, जो ऊतक के भीतर कोशिका स्थान के बारे में जानकारी का उपयोग कर FRT में अध्ययन किया गया है, लेकिन precludes कार्यात्मक अध्ययन, और सेल मार्करों कि विश्लेषण किया जा सकता की पहचान की संख्या में सीमित है एक बार में । इसके अलावा, फ्लो cytometric विश्लेषण के लिए एकल सेल अलगाव प्रोटोकॉल7,8,9विकसित किया गया है । इन प्रोटोकॉल में से कुछ को माइग्रेट करने वाले उन कक्षों को अलग करने के लिए dc की प्रवासी क्षमता का लाभ उठाते हैं । इन पद्धतियों आमतौर पर रातोंरात गर्मी और सक्रिय dc के चयन की आवश्यकता है, लेकिन स्थिर राज्य में dc के अध्ययन के लिए अनुमति नहीं है ।

यहां, गर्भाशय नमूनों का उपयोग कर, हम FRT में विभिंन संरचनात्मक साइटों से dc अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित, अंतर्गर्भाशयकला (EM), endocervix (CX), और ectocervix (ECX), कि दोनों phenotypical और कार्यात्मक विश्लेषण सक्षम बनाता है । एक गैर proteolytic एंजाइमी पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग कर, हम तुरंत ऊतक पाचन कोशिका अलगाव और प्रवाह कोशिका सक्रियण के बिना cytometric लक्षण वर्णन के बाद आगे बढ़ सकते हैं । बहुरंगा प्रवाह cytometry और कोशिकाओं की कम संख्या के लिए कार्यात्मक अध्ययन अनुकूलन का उपयोग करना, हम की पहचान और FRT के विभिंन साइटों में dc के दुर्लभ सबसेट की विशेषता कर सकते हैं ।

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Protocol

मानव विषयों को शामिल अध्ययन हेलसिंकी की घोषणा में व्यक्त सिद्धांतों के अनुसार आयोजित किया गया । अध्ययन डार्टमाउथ कॉलेज संस्थागत समीक्षा बोर्ड और मानव विषयों (CPHS) के संरक्षण के लिए समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । लिखित सूचित सहमति एचआईवी से सर्जरी से पहले प्राप्त नकारात्मक डार्टमाउथ-हिचकॉक चिकित्सा केंद्र (लेबनान, राष्ट्रीय राजमार्ग) पर hysterectomies के दौर में महिलाओं था । प्रशिक्षित पैथोलॉजिस्ट से ऊतक के नमूनों का चयन किया, CX, और ECX, रोग के घावों से मुक्त और विकृति की साइटों से दूर । डार्टमाउथ हिचकॉक चिकित्सा केंद्र में भर्ती स्वयंसेवी स्वस्थ दानदाताओं से रक्त के नमूने प्राप्त किए गए । रक्त दाताओं गुमनाम थे । हौसले से अलग EM, CX, और ECX ऊतकों को ऑपरेटिंग कमरे से अलगाव और वर्गीकरण के लिए विकृति को हस्तांतरित करने से पहले अलग, बाँझ के ट्यूबों में हमारी प्रयोगशाला में स्थानांतरण किया गया ।

1. एंजाइमी ऊतकों के पाचन

नोट: बाँझ सामग्री का उपयोग करें और एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में काम करते हैं ।

  1. एक संशोधित हांक के संतुलित नमक समाधान तैयार (HBSS) phenol लाल, 100 U/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin, 0.35 g/L NaHCO3, और 20 मिमी HEPES के साथ 1x HBSS का उपयोग कर ।
  2. एंजाइमी कॉकटेल तैयार करें (संशोधित HBSS, 450 U/एमएल collagenase IV, 0.01% [wt/vol] deoxyribonuclease मैं, और 2 मिलीग्राम/एमएल डी-ग्लूकोज) । एक बाँझ 0.22 µm फिल्टर के माध्यम से समाधान पारित. आदर्श रूप में, उपयोग के दिन पर पाचन एंजाइम तैयार है, लेकिन यह भंडारण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है । दोहराया ठंड और गल चक्र से बचें ।
  3. एक 100 x 15 मिमी2 पेट्री डिश में संशोधित HBSS और जगह के साथ ऊतक कुल्ला । पेट्री डिश आकार उपलब्ध ऊतक की मात्रा और एंजाइम कॉकटेल की मात्रा के आधार पर समायोजित (कदम नीचे 1.4.2 देखें) ।
    नोट: ऊतक विकृति से प्राप्त सर्जिकल नमूना के आधार पर आकार में बदलती हैं, 1-10 जी से लेकर.
  4. डिस्पोजेबल स्केलपेल और संदंश के साथ शारीरिक प्रसंस्करण:
    1. ऊतक के लिए पाचन एंजाइम कॉकटेल के लगभग 3 मिलीलीटर जोड़ें जबकि काटने सुखाने को रोकने के लिए ।
    2. का प्रयोग करें संदंश ऊतक और एक स्केलपेल के साथ कीमा को स्थिर करने के लिए पाचन एंजाइम कॉकटेल के संपर्क में ऊतक की सतह क्षेत्र में वृद्धि हुई है । ऊतक को छोटे टुकड़ों में काट लें (< 2 mm एक तरफ) । सभी ऊतक टुकड़े को कवर करने के लिए पर्याप्त पाचन एंजाइम कॉकटेल जोड़ें (5 मिलीलीटर/ पेट्री डिश पर ढक्कन लगाएं ।
    3. 45 मिनट के लिए लगभग 80 rpm पर 5% सह एक रोटेटर पर2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन. सुनिश्चित करें कि रोटेटर गति अच्छी तरह से फैल या बुलबुले उत्पादन के बिना पाचन एंजाइम कॉकटेल घोला जा सकता है ।
    4. 4x और 10x उद्देश्यों के साथ एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ ऊतक तैयारी कल्पना ।
      नोट: पाचन के बाद, छोटे ऊतक टुकड़े और दिखाई उपकला ग्रंथियों सहित एक मिश्रित सेल निलंबन मौजूद होना चाहिए ( चित्र 1aदेखें) ।

2. एकल कोशिकाओं की शारीरिक जुदाई

  1. एक बाँझ वातावरण में, एक 150 x 15 मिमी2 पेट्री डिश में धारक के साथ एक तना हुआ 250 µm मेष जगह है । सुनिश्चित करें कि मेष पेट्री डिश की सतह के ऊपर के बारे में 0.5 सेमी है ।
  2. संशोधित HBSS के 2 मिलीलीटर के साथ मेष गीला और जाल पर पचा ऊतक हस्तांतरण ।
  3. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज गोताख़ोर के सपाट सतह का उपयोग करना, धीरे लेकिन दृढ़ता से, जाल के माध्यम से पचा कीमा बनाया ऊतक पीस ।
    चेतावनी: पीसने भी आक्रामक मेष नुकसान और सेल मृत्यु दर में वृद्धि होगी । इस कदम से संयोजी ऊतक और बलगम से उपकला कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं (प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित) अलग हो जाएगा ।
  4. एक बार ऊतक टुकड़े अच्छी तरह से फैलाया गया है, मेष और धारक पेट्री पकवान ऊपर 2-3 सेमी तरक्की और संशोधित HBSS के 3 मिलीलीटर के साथ कुल्ला अतिरिक्त कोशिकाओं को ठीक ।
  5. सेल सस्पेंशन को लीजिए । एक पेट्री डिश में धारक के साथ 20 µm मेष प्लेस और संशोधित HBSS के 2 मिलीलीटर के साथ गीला । जाल के माध्यम से सेल निलंबन डालो पेट्री डिश ऊपर जाल 2-3 सेमी, और संशोधित HBSS के 6 मिलीलीटर के साथ कुल्ला ।
    नोट: यह कदम एक कोशिकाओं है कि जाल के माध्यम से पारित से, शीर्ष पर बनाए रखा जाता है जो उपकला चादरें, अलग होगा. प्रवाह के माध्यम से एक मिश्रित कोशिका निलंबन है, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं और stromal fibroblasts शामिल है ।
  6. इकट्ठा मिश्रित सेल निलंबन और 10 मिनट के लिए 500 x g पर केंद्रापसारक महाप्राण तरल और घनत्व ढाल केंद्रापसारक के लिए संशोधित HBSS के 4 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  7. polysucrose समाधान के 3 मिलीलीटर पर मिश्रित सेल निलंबन परत और कोई ब्रेक के साथ 30 मिनट के लिए 500 x जी में कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक । polysucrose समाधान के ऊपर से सफेद बैंड इकट्ठा और पंजाबियों के साथ धो लो ।
    नोट: यह अंश समृद्ध मिश्रित सेल निलंबन है, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं में समृद्ध है और कुछ stromal fibroblasts शामिल है ।

3. मृत सेल हटाने

नोट: यदि मृत कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत (> 20%) घनत्व ढाल केंद्रापसारक के बाद समृद्ध मिश्रित सेल निलंबन में मौजूद हैं, चुंबकीय मोतियों के साथ मृत सेल हटाने की सिफारिश की है । मृत कोशिकाओं को हटा दिया जाना चाहिए क्योंकि वे सकारात्मक चुंबकीय मनका चयन प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।

  1. 10x उद्देश्य के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना. समृद्ध मिश्रित सेल निलंबन (500 x g, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) में सभी कोशिकाओं को नीचे स्पिन । पूरी तरह से महाप्राण और supernatant को त्यागें । 1 x 107 कुल कोशिकाओं के प्रति मृत सेल हटाने मोतियों की 100 µ एल जोड़ें (रहते है और मृत), निर्माता के निर्देशों के अनुसार । 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  2. चुंबकीय स्तंभ पर एक 30 µm फिल्टर प्लेस, सेल निलंबन लागू करते हैं और मनका-लेबल कोशिकाओं चुंबकीय कॉलम के माध्यम से गिर करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  3. अनुशंसित (3 मिलीलीटर) के रूप में मृत सेल हटाने बफर के साथ कॉलम कुल्ला । प्रवाह के माध्यम से जीवित कोशिकाओं युक्त इकट्ठा । मृत सेल हटाने के बाद सेल वसूली की सीमा चित्रा 1bमें प्रस्तुत किया है ।
    नोट: इन कोशिकाओं phenotypical अध्ययन के लिए प्रवाह cytometry धुंधला प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (खंड 5) या डीसी अलगाव (धारा 4) के साथ जारी है ।

4. सकारात्मक चुंबकीय मनका चयन द्वारा डीसी शुद्धिकरण

  1. मृत सेल हटाने (कदम 3.2) के बाद, कोशिकाओं को नीचे स्पिन, supernatant को दूर, और 1 x 107 कोशिकाओं (पंजाबियों, 0.5% गर्मी-निष्क्रिय मानव एबी सीरम (एच एस), 2 मिमी EDTA) प्रति 80 µ एल चुंबकीय चयन बफर में सेल गोली reसस्पेंड ।
  2. डीसी आबादी के सकारात्मक चयन के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार CD1a या CD14 चुंबकीय मोती जोड़ें (1 x 107 कोशिकाओं के अनुसार 20 µ एल चुंबकीय मोती) । 4डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
  3. चुंबकीय चयन बफर के साथ कोशिकाओं को धोने, नीचे स्पिन, और बफर पूरी तरह से हटा दें । चुंबकीय चयन बफर के 500 µ एल की एक ंयूनतम में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
  4. स्तंभ को चुंबक से अनुलग्न करें और किसी भी शेष कक्ष के झुरमुट को बनाए रखने के लिए स्तंभ के शीर्ष पर 30 µm फ़िल्टर जोड़ें । अनुशंसित के रूप में चुंबकीय चयन बफर के साथ फिल्टर और कॉलम कुल्ला ।
  5. कक्ष निलंबन को स्तंभ पर लागू करें । कुल्ला 3 चुंबकीय चयन बफर के साथ बार ।
  6. एक 15 एमएल ट्यूब करने के लिए स्तंभ स्थानांतरण, चुंबकीय चयन बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ने, और स्तंभ से चयनित कोशिकाओं को रिहा करने के लिए गोताख़ोर लागू होते हैं ।
  7. शुद्धता बढ़ाने के लिए, नए स्तंभ का उपयोग करके पुनर्प्राप्त कक्षों के साथ 4.4-4.6 के चरण दोहराएँ. चुंबकीय मनका चयन के बाद सेल वसूली की सीमा चित्रा 1Cमें प्रस्तुत किया है ।

5. कोशिका शुद्धता का आकलन: फ्लो Cytometry और माइक्रोस्कोपी

  1. प्रवाह cytometry के लिए एंटीबॉडी धुंधला:
    1. 1 x 106 कोशिकाओं के 100 µ एल में 20% गर्मी से युक्त-निष्क्रिय एच एस को निलंबित एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए, और बर्फ पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
    2. वांछित फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी और मृत कोशिकाओं की पहचान के लिए एजेंट जोड़ें (एक उदाहरण के लिए, धारा 6.5 देखें) । सेट प्रतिदीप्ति ऋण एक (FMO) नियंत्रण द्वार स्थापित करने के लिए, और मुआवजा मोतियों का उपयोग करने के लिए क्षतिपूर्ति के लिए एक दाग नियंत्रण तैयार करते हैं । उपयोग किए गए एंटीबॉडी के उदाहरण तालिका 1में दिए गए हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन, प्रकाश से सुरक्षित ।
    3. चुंबकीय चयन बफर के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
      नोट: EDTA की उपस्थिति प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए सेल के झुरमुट के गठन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । नीचे स्पिन और supernatant त्यागें ।
    4. प्रति ट्यूब 2% paraformaldehyde समाधान के 100 µ एल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें ।
    5. 10,11cytometer प्रवाह द्वारा में नमूनों का विश्लेषण ।
  2. स्तंभ स्पिन (उदा., cytospin) और उपयोग Giemsa धुंधलान आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए:
    1. चुंबकीय चयन बफर के 200 µ एल में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    2. एक स्पिन कॉलम में लोड और 5 मिनट के लिए स्पिन । स्लाइड को पूरी तरह से सूखने दें ।
    3. 2 मिनट के लिए 100% मेथनॉल में विसर्जन के द्वारा स्लाइड को ठीक करें । पानी के साथ स्लाइड कुल्ला और यह शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं ।
    4. एक मानक राइटर्स प्रदर्शन-Giemsa धुंधला । Eosin और 10 मिनट के लिए गर्मी के साथ कोशिकाओं को कवर, पानी के साथ कुल्ला, और इसे सूखा । कवर-Geimsa दाग, 1 मिनट के लिए मशीन, पानी के साथ कुल्ला, और हवा सूखी राइटर्स के साथ कोशिकाओं ।
    5. एक उल्टे माइक्रोस्कोप (चित्र 2a, 40X उद्देश्य) के साथ तैयारियों की जांच करें ।

6. Allogeneic उत्तेजना परख डीसी सेल समारोह का आकलन करने के लिए

  1. जमे हुए परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) गल
    1. 10% एच एस 37 डिग्री सेल्सियस के साथ सेल संस्कृति मीडिया गर्म ।
    2. गल PBMCs को 37 डिग्री सेल्सियस पानी में cryotube रखकर, जमे हुए सेल मीडिया की एक छोटी राशि के cryotube में रहता है । एक बाँझ वातावरण में, 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10% एच एस के साथ पूर्व गर्म सेल संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर cryotube की सामग्री हस्तांतरण ।
    3. 7 मिनट के लिए ~ 500 x जी पर केंद्रापसारक । मीडिया निकालें, गोली फैलाने, 10% एच एस के साथ सेल संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर में PBMCs reसस्पेंड, और कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
    4. धो चरण एक तीसरी बार दोहराएं । कोशिकाओं गिनती ।
  2. भोली टी सेल चयन:
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार भोली टी-कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक नकारात्मक चयन चुंबकीय एंटीबॉडी सेल चयन किट का प्रयोग करें ।
    2. अलगाव के बाद, CD45RA और CCR7 एंटीबॉडी का उपयोग कर शुद्धता की जाँच करें.
      नोट: ठेठ पवित्रता है > 99% टी कोशिकाओं भोली ।
  3. भोली टी सेल प्रसार डाई धुंधला:
    1. सेल प्रसार डाई के 2x समाधान के 600 µ एल तैयार, प्रकाश के लिए जोखिम से डाई की रक्षा.
    2. पंजाबियों के साथ भोली टी कोशिकाओं 2x धो लो । 500 µ l पंजाबियों में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित ।
    3. जबकि धीरे से, के लिए सुरक्षा कैबिनेट में कोशिकाओं भंवर भोले टी कोशिकाओं को प्रसार डाई के 500 µ एल जोड़ें ।
    4. 37डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    5. कक्ष में 10% HS के साथ सेल कल्चर मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़कर सेल लेबलिंग रोकें । 5 मिनट, प्रकाश से संरक्षित के लिए बर्फ पर मशीन ।
    6. 7 मिनट के लिए ~ 500 x जी पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, मीडिया महाप्राण, और 10% एच एस के साथ सेल संस्कृति मीडिया के 4 ° c में कोशिकाओं reसस्पेंड । 3 बहाकर एक कुल के लिए दो बार और दोहराएं । कोशिकाओं की एक aliquot लेने के लिए पिछले केंद्रापसारक से पहले गिनती ।
      नोट: आमतौर पर, अंतिम भोली टी-सेल नंबर 5% और आरंभिक PBMC सेल काउंट के 15% के बीच रेंज होगा ।
    7. कक्ष संस्कृति मीडिया के साथ 10% HS के साथ कोशिकाओं को वांछित सेल एकाग्रता पर reसस्पेंड ।
  4. डीसी-allogeneic भोली टी सेल सह संस्कृति:
    1. प्लेट अलग dc और भोली टी-कोशिकाओं में एक 96-ठीक है, गोल नीचे प्लेट, टी कोशिकाओं के लिए dc के एक 1:15 अनुपात पर. सुनिश्चित करें कि dc श्रेणियों के लिए इष्टतम संख्या 3,000 और 5,000 कक्षों के बीच/
    2. पर थाली केंद्रापसारक 3 मिनट के लिए ~ 500 एक्स जी सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को अच्छी तरह के केंद्र में स्थित हैं । सेल से सेल संपर्क होने के लिए उचित संकेत देने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    3. 6 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन । कोशिकाओं के क्लस्टर की निगरानी, जो कुओं में प्रकट होता है के रूप में प्रसार होता है, माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3ए) के साथ.
  5. प्रवाह cytometry प्रसार का आकलन करने के लिए दाग:
    1. 6 दिनों के बाद, कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा जांच की जा सकती है । प्रवाह cytometry के लिए सह संस्कृति दाग ।
    2. पंजाब में पीली व्यवहार्यता डाई (अधिकतम उत्सर्जन 572 एनएम) का एक 2x समाधान तैयार करें ।
      नोट: सीरम के बिना पंजाबियों का उपयोग महत्वपूर्ण है, के रूप में सीरम प्रोटीन डाई के साथ हस्तक्षेप).
    3. 5 मिनट के लिए ~ 500 x g पर कोशिकाओं के साथ प्लेट केंद्रापसारक ।
    4. supernatant के 100 µ l को हटा दें ।
      नोट: इस बिंदु पर इकट्ठा और घुलनशील कारकों के अलग विश्लेषण के लिए supernatant की दुकान ।
    5. पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें: जोड़ें 150 µ के एल/खैर, पंजाब के 500 x जी में 5 मिनट के लिए, एक पिपेट के साथ supernatant के 150 µ एल निकालें । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुआं में supernatant शेष 50 µ l है ।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 2x व्यवहार्यता डाई के 50 µ एल जोड़ें । 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी, प्रकाश से सुरक्षित ।
    7. मशीन के दौरान, वांछित एंटीबॉडी मार्करों के एक मास्टर मिश्रण तैयार करते हैं । उदाहरण के लिए: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, सीडी 8 FITC, आदि .
    8. एक अच्छी तरह से एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें । 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी, प्रकाश से सुरक्षित ।
    9. , पंजाबियों के साथ 2x कोशिकाओं धो + 2% hs: जोड़ें 150 µ एल/ 5 मिनट के लिए ~ 500 x जी पर केंद्रापसारक एक पिपेट के साथ supernatant के 150 µ एल निकालें ।
    10. 2% पैरा-formaldehyde के 100 µ l/कुआं जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें । यदि आवश्यक: कोशिकाओं और प्रवाह cytometry ट्यूबों के लिए मीडिया स्थानांतरण । ट्यूबों 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है और प्रकाश से सुरक्षित, प्रवाह cytometric विश्लेषण जब तक ।
    11. एक प्रवाह cytometer में ट्यूबों पढ़ें ।

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Representative Results

ऊतक पाचन के बाद, उपकला चादरें और ग्रंथियों की रिहाई देखा जा सकता है, के रूप में चित्र 1aमें दिखाया गया; यह एक सकारात्मक नियंत्रण है जो यह इंगित करता है कि एंजाइमी पाचन सफल था । ऊतक के प्रति ग्राम बरामद कुल व्यवहार्य कोशिकाओं और dc की संख्या भी चित्रा 1b और चित्रा 1C, क्रमशः में दिखाया गया है । प्रतिरक्षा कोशिकाओं stromal कोशिकाओं के 5-30% के बीच का प्रतिनिधित्व करने से पहले घनत्व केंद्रापसारक12,13चित्रा 2 अलग dc के आकृति विज्ञान (चित्रा 2a) और शुद्धता (चित्रा बी3, सी) से पता चलता है. जब चयन के दो दौर प्रोटोकॉल में संकेत के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं, 85-92% के बीच अपेक्षित शुद्धता पर्वतमाला (चित्र 2c) । बरामद कोशिकाओं की संख्या चर है और प्रारंभिक ऊतक आकार और दाता परिवर्तनशीलता पर निर्भर करता है । अलग कोशिकाओं के लक्षण वर्णन13वर्णित किया गया है । चित्रा 3 से पता चलता है एक प्रतिनिधि allogeneic उत्तेजना परख डीसी कार्यशीलता का आकलन करने के लिए । चित्र 3 ए विशेषता है कि टी-सेल के झुरमुट दिखाई देते हैं, जब प्रसार होते हैं, और 3 बी आंकड़ा प्रवाह cytometry द्वारा प्रसार ठहराव से पता चलता है । अंय कार्यात्मक परख, जैसे वायरल कब्जा या cytokine और chemokine उत्पादन भी13प्रदर्शन किया जा सकता है । चित्रा 4 गेटिंग रणनीति समृद्ध मिश्रित सेल निलंबन (चित्रा 4a) के प्रवाह-cytometric विश्लेषण के बाद अलग FRT संरचनात्मक डिब्बों में विभिंन dc आबादी की पहचान करने के लिए दिखाता है । एंटीबॉडी और नकारात्मक नियंत्रण के अनुमापन महत्वपूर्ण हैं, के रूप में dc और मैक्रोफेज उच्च autofluorescence प्रदर्शन । FMO नियंत्रण आरेख 4Bमें दिखाए जाते हैं । चित्र 4c विशिष्ट DC सबसेट, जैसे CD1c +, CD207 +, या CD103 + dc की पहचान करने के लिए कैसे के उदाहरण दिखाता है ।

Figure 1
चित्र 1: ऊतक प्रसंस्करण और सेल की उपलब्धता. (एक) उपकला चादरें और ऊतक पाचन के बाद जारी ग्रंथियों की प्रतिनिधि छवि. () व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या की सीमा ऊतक प्रसंस्करण और प्रत्येक FRT डिब्बे में मृत कोशिका हटाने के बाद बरामद: अंतर्गर्भाशयकला (EM), endocervix (CX), और ectocervix (ECX) । हर डॉट किसी भिंन विषय से कक्षों का प्रतिनिधित्व करता है । (C) चुंबकीय मनका अलगाव के बाद ऊतक के प्रति ग्राम बरामद dc की संख्या । बी और सी13से अनुकूलित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: आकृति विज्ञान और अलग कोशिकाओं की पवित्रता. () पृथक कोशिकाओं के वृक्ष आकृति का सूक्ष्मता निंनलिखित Giemsa धुंधला द्वारा निर्धारित । () phenotypic मार्कर की अभिव्यक्ति से पहले और मनका अलगाव के बाद, के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित की । () CD1a + और CD14 + मनका अलगाव के बाद प्राप्त प्रतिनिधि पवित्रता । 13से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रसार परख । (A) प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियों के प्रसार के दौरान टी सेल क्लस्टर गठन: चरण-कंट्रास्ट (बाएं), प्रसार डाई धुंधला (मध्य), और ओवरले (दाएं) । () अलग एंडोमेट्रियल CD1a + या CD14 + dc और allogeneic भोली टी कोशिकाओं जमे हुए PBMCs. B से प्राप्त की सह संस्कृति के बाद प्रसार की प्रेरण के प्रतिनिधि उदाहरण13से अनुकूलित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: FRT से समृद्ध मिश्रित सेल निलंबन में dc के Phenotypical लक्षण वर्णन. () मिश्रित प्रकोष्ठ में dc की पहचान के लिए गेटिंग कार्यनीति का निलंबन. बहुरंगा भूखंडों में प्रत्येक gated जनसंख्या अगले पैनल में दिखाया गया है । समोच्च भूखंडों CD11c + CD11b + और CD11c + CD11b-गेट्स, क्रमशः दिखाओ । अवांछित कोशिकाओं की पहचान करने वाले मार्कर विश्लेषण से उन्हें बाहर करने के लिए एक ही चैनल का उपयोग दाग हो सकता है; उदाहरण के लिए, मृत कोशिकाओं, CD3 +, और CD19 + कोशिकाओं । (B) उचित द्वार स्थापित करने के लिए FMO नियंत्रित करता है । (C) गेटिंग कार्यनीति का अनुसरण करने वाले DC सबसेट का भेदभाव । समोच्च भूखंडों के बजाय बहुरंगा भूखंडों का चयन किया गया और अधिक सही जनसंख्या वितरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए जब सेल संख्या10कम थे । कम सेल संख्या गेटिंग रणनीति के अंत में उंमीद कर रहे हैं, के रूप में ऊतक dc दुर्लभ आबादी हैं । 13से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

कक्ष मार्कर Fluorochrome क्लोन एकाग्रता प्रति नमूना एंटीबॉडी की राशि
(बफर के 100 µ एल में)
CD45 vioblue450 HI30 1.0 µ g/5 µ l 0.4 µ g
CD11b पे ICRF44 1.0 µ g/5 µ l 0.4 µ g
CD11c PerCp/cy 5.5 Bu15 200 µ g/ml 0.4 µ g
CCR5 पे-Cy7 2D7 0.25 µ g/5 µ l 0.1 µ g
CCR7 पे-Cy7 REA108 99 µ g/ml 0.2 µ g
एचएलए-डॉ बी. वी.-570 L243 100 µ g/ml 0.2 µ g
एचएलए-डॉ FITC AC122 ८२.५ µ g/ml 0.16 µ g
cd3 apc UCHT1 16 µ g/ml 0.03 µ g
cd3 viogreen REA614 137 µ g/ml ०.२७ µ छ
CD163 apc GHI 61/ 80 µ g/ml 0.16 µ g
CD207 apc 1OE2 200 µ g/ml 0.4 µ g
CD1a FITC HI149 0.5 µ g/5 µ l 0.2 µ g
CD1a वायुसेना-700 HI149 0.5 मिलीग्राम/एमएल 1.0 µ g
CD103 पे-Cy7 बी-Ly7 0.25 µ g/5 µ l 0.1 µ g
CD83 पे HB15e 0.25 µ g/5 µ l 0.1 µ g
CD14 APC-आग 63D3 400 µ g/ml 0.8 µ g
CD209 FITC, पे, सुरक्ष १२०५०७ 1.25 µ g/0.25 एमएल 0.01 µ g
ज़ोंबी पीला व्यवहार्यता डाई
7AAD 0.1 मिलीग्राम/एमएल 0.2 यूजी

तालिका 1: FRT में dc का प्रवाह cytometry द्वारा लक्षण वर्णन के लिए एंटीबॉडी का उदाहरण ।

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Discussion

श्लैष्मिक dc एक दुर्लभ कोशिका मजबूत ऊतक वातावरण है, जो उनके phenotype परिवर्तन और समारोह एक बार वे ऊतकों में प्रवेश के द्वारा प्रभावित आबादी रहे है3। जबकि रक्त व्युत्पन्न dc एक बहुत ही उपयोगी मॉडल हैं, वे पूरी तरह से डीसी आबादी की विविधता के ऊतकों में पाया प्रतिनिधित्व नहीं करते । इसलिए, श्लैष्मिक dc की अनूठी विशेषताओं को समझने के लिए, ऊतकों से प्राथमिक कोशिकाओं का अलगाव आवश्यक है । FRT में विभिन्न संरचनात्मक साइटों से dc के अलगाव इन विट्रो में डीसी समारोह का अध्ययन करने और डीसी सबसेट और संरचनात्मक स्थानों के बीच तुलना करने का अवसर प्रदान करता है ।

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि के लिए मानव FRT ऊतकों से dc की शुद्धि की अनुमति देता है प्रदान करते हैं कार्यात्मक विशेषताओं का आकलन में . चूंकि dc कम संख्या में श्लैष्मिक साइटों पर पाए जाते हैं, हम एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए घनत्व ढाल केंद्रापसारक और मृत कोशिका हटाने से ऊतक सेल तैयारी को समृद्ध चुंबकीय मोतियों के साथ सेल अलगाव से पहले । मृत कोशिकाओं के उचित हटाने कुंजी है, के रूप में वे मनका अलगाव के साथ हस्तक्षेप करेंगे । इस तकनीक को सकारात्मक अलग कोशिकाओं की उच्च शुद्धता प्रदान करता है (≈ 90%), समय की एक अपेक्षाकृत कम मात्रा में (4-6 एच), और रात भर के लिए की आवश्यकता के बिना मशीन, इन विट्रो सेल संस्कृति, या माइग्रेशन अलगाव से पहले, जिनमें से प्रत्येक को सक्रिय कर सकते है dc और उनके phenotypic विशेषताओं को बदल । हमारे प्रोटोकॉल सेल सक्रियण ट्रिगर नहीं है, के रूप में ऊपर की कमी से मापा-परिपक्वता मार्करों के विनियमन (CD86, एचएलए-DR, CD83)13। एक अंय लाभ एक गैर proteolytic एंजाइमी पाचन, जो सतह मार्करों से सट नहीं करता है और तत्काल कोशिका अलगाव या phenotypical विश्लेषण ऊतक पाचन निंनलिखित के लिए अनुमति देता है का उपयोग है14

इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण एक एकल कोशिका निलंबन की पीढ़ी है चुंबकीय कॉलम की रुकावट से बचने के लिए । यह सुनिश्चित करने के लिए, मृत कोशिकाओं चुंबकीय सेल चयन करने से पहले हटा दिया जाना चाहिए, फिल्टर चुंबकीय स्तंभों के शीर्ष पर इस्तेमाल किया जा करने की आवश्यकता है, और 3 जी से बड़े ऊतकों दो स्तंभों के बीच विभाजित किया जाना चाहिए । शुद्धि के पहले दौर के बाद एक दूसरे स्तंभ का उपयोग उच्च कोशिका शुद्धता के लिए महत्वपूर्ण है ।

आइसोलेशन विधि की एक सीमा FRT ऊतकों में dc की अंतर्निहित कम संख्या है, जो आमतौर पर 1 ग्राम से छोटे ऊतकों की अच्छी कोशिका वसूली के लिए अनुमति नहीं देता है । इन परिस्थितियों में, तथापि, phenotypical विश्लेषण अभी भी समृद्ध मिश्रित सेल निलंबन का उपयोग किया जा सकता है । यह गैर proteolytic पाचन विधि है, जो सतह मार्करों सट नहीं करता है और ऊतक पाचन के बाद सेल phenotype के तत्काल विश्लेषण के लिए अनुमति देता है के कारण संभव है14। इसके अतिरिक्त, रोगी उंर एक कारक है कि बरामद कोशिकाओं की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, हम पहले दिखा दिया है कि CD1a + अलगाव एक phenotypically अधिक सजातीय जनसंख्या CD14 से + चयन13प्रदान करता है; हालांकि, CD1a + dc CX और ECX से पुनर्प्राप्त करना कठिन है । जबकि CD14 भी मैक्रोफेज पर व्यक्त किया जा सकता है, हमने पाया कि FRT CD14 + अलग जनसंख्या dc में समृद्ध है, सह के आधार पर डीसी मार्करों की अभिव्यक्ति और उनके allogeneic भोली टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने की क्षमता है, जो एक पहचान समारोह है dc13.

चूंकि पुनर्प्राप्त dc की संख्या सामांयत: कम होती है (< 100,000 कुल कक्ष), कम कक्ष संख्याओं के लिए कार्यात्मक अध्ययन ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता होती है । यहां हम एक allogeneic उत्तेजना परख, जो केवल 3,000 के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है के अनुकूलन शो/ हम इन कोशिकाओं के साथ अन्य समारोह अध्ययन किया है, हार्मोनल जवाबदेही, cytokine सहित, और एचआईवी पर रोगाणुरोधी पेप्टाइड उत्पादन-उत्तेजना और एचआईवी FRT dc द्वारा कब्जा13. एक बार जब dc पृथक और मढ़वाया, परख 24 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए, के रूप में सेल व्यवहार्यता उस समय के बाद घट जाती है ।

इस प्रोटोकॉल उचित चुंबकीय मोतियों को युग्मित मार्करों का चयन और अनुक्रमिक सकारात्मक और नकारात्मक मनका चयन अवांछित कोशिका प्रकार को हटाने के लिए संयोजन के द्वारा विभिन्न डीसी सबसेट, या अन्य सेल प्रकार को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । एक सावधानी, हालांकि, यह है कि चयन के हर दौर के साथ कोशिकाओं के कुछ प्रतिशत खो जाएगा, तो FRT dc, जो पहले से ही दुर्लभ है के अलगाव के लिए, और ऊतक आकार आम तौर पर छोटे, विभिंन मार्करों के साथ चयन के कई दौर है (और आवश्यक बहाकर संबद्ध) वांछनीय नहीं हैं । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या अन्य ऊतकों से dc14,15.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

NIH पलाश AI102838 और AI117739 (CRW) द्वारा समर्थित अध्ययन. हम तकनीकी सहायता के लिए रिचर्ड Rossoll धंयवाद । प्रवाह cytometric विश्लेषण DartLab में किया गया था, Dartmouthsupported में साझा संसाधन द्वारा (P30CA023108-37) और (P30GM103415-15) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Hyclone SH30015.03
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
HEPES (1M) Hyclone 15630-080
Collagenase IV Sigma C5138
Deoxyribonuclease I Worthington Biochemical LS002140
D-glucose Sigma Aldritch 50-99-7
0.22 um Stericup 500 mL  filter Millipore SCGPU05RE
100mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875712
150mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875714
150mm x 25mm polystyrene dish Corning 430599 Treated cell culture dish
Isotemp Incubator Fisher Scientific FICO3500TABB 5.0% CO2
American Rotator V American DADE R4140
250 um nylon mesh Sefar 03-250/50
20 um nylon mesh Sefar 03-20/14
Beckman GS-6R Centrifuge Beckman 358702
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L Lonza 04-418Q
Human AB Serum Valley Biomedical HP1022
Histopaque-1077 Sigma Aldritch 10771
Phosphate Buffer Solution (PBS) National Diagnostics CL-253 pH 7.4
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Pre-separation filter (30um) Miltenyi Biotec 130-041-407
LS column Miltenyi Biotec 130-042-410
Quadro MACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS multi-stand Miltenyi Biotec 130-042-303
EDTA USB 15694
CD1a Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-051-001
CD14 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201
eFluor 670 cell proliferation dye eBiosciences 65-0840-85
96 well round bottom plate Falcon 9/8/2866
Zombie yellow viability dye Biolegend 423104
CD3 APC/Cy7, anti-human Tonbo Biosciences 25-0038-T100
CD4 PE, anti-human eBiosciences 12-0048-42
CD8a FITC, anti-human Tonbo Biosciences 35-0086-T100
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter Life Sciences B43618 10 color, VBR
MACSquant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343 8 color, VBR

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References

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