Evaluación del impacto de la agregación de proteína sobre el estrés oxidativo celular en levaduras

Biochemistry

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Summary

Agregación de la proteína provoca estrés oxidativo celular. Este protocolo describe un método de control de los Estados intracelulares de proteínas amyloidogenic y el estrés oxidativo asociado con ellos, mediante citometría de flujo. El enfoque se utiliza para estudiar el comportamiento de las variantes soluble y propensa a la agregación del péptido amiloide-β.

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Carija, A., Ventura, S., Navarro, S. Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast. J. Vis. Exp. (136), e57470, doi:10.3791/57470 (2018).

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Abstract

Mal plegamiento de proteínas y acumulación en conformaciones amiloides han sido relacionadas con la aparición y progresión de varias enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, todavía hay poca información sobre cómo insoluble proteína agregados ejercen sus efectos tóxicos in vivo. Organismos modelo simples de procariotas y eucariotas, tales como bacterias y levadura, han contribuido significativamente a nuestra actual comprensión de los mecanismos detrás de la formación amiloide intracelular, la propagación de agregados y la toxicidad. En el presente Protocolo, el uso de levadura se describe como un modelo para analizar la relación entre la formación de agregados proteicos y su impacto sobre el estrés oxidativo celular. El método combina la detección del estado intracelular soluble/agregados de una proteína amyloidogenic con la cuantificación del daño oxidativo celular resultantes de su expresión mediante citometría de flujo (FC). Este enfoque es simple, rápida y cuantitativa. El estudio ilustra la técnica al correlacionar el estrés oxidativo celular causado por un amplio conjunto de variantes de péptido amiloide-β con sus propensiones respectiva agregación intrínseca.

Introduction

Proteostasis es un determinante fundamental de los procesos de acondicionamiento físico y el envejecimiento celular. En las células, se mantiene la homeostasis de proteínas por control de calidad de la proteína sofisticadas redes destinadas a asegurar la correcta refolding de Conformadores de proteínas mal plegadas por acompañantes o su proteólisis específica con varios mecanismos bien conservados1 ,2,3,4,5. Un gran número de estudios proporciona apoyo a la relación entre el inicio y la progresión de una amplia gama de enfermedades humanas y la falta de proteostasis, llevando a mal plegamiento de proteínas y agregación. Por ejemplo, la presencia de depósitos de proteína se considera una característica patológica de muchas enfermedades neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson y Huntington enfermedades6,7,8, enfermedades prionogenic y amiloidosis no degenerativas9. Se ha sugerido que temprana asambleas oligomeric y protofibrillar en la reacción de agregación son los elicitores principal de citotoxicidad, establecer aberrantes interacciones con otras proteínas en el medio celular lleno de gente10. Además, inclusiones de proteína (PI) pueden transmitirse entre las células, propagando su efecto tóxico11,12. Por lo tanto, podría ser que la formación de PI de hecho podría constituir un mecanismo de desintoxicación que restringe la presencia de especies peligrosas agregadas a lugares específicos en la célula, donde pueden ser procesados o acumulados sin efectos secundarios importantes 13 , 14.

Estándar en vitro bioquímicos enfoques han aportado importante información sobre las diferentes especies que pueblan las reacciones de agregación y sus propiedades15,16. Sin embargo, las condiciones utilizadas en estos ensayos son claramente diferentes de los que ocurren dentro de la célula y, por lo tanto, cuestionan su importancia fisiológica. Debido a la notable conservación de vías celulares como control de calidad de la proteína, la autofagia o la regulación de redox celular estado17,18 entre eucariotas19,20,21 ,22,23, la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) ha surgido como un simple modelo celular privilegiado para el estudio de los determinantes moleculares de la agregación de proteínas y sus efectos citotóxicos asociados en entornos biológicamente relevantes24,25,26.

Propensión de agregación de la proteína es una característica intrínsecamente codificada en la secuencia primaria. Así, la formación de amiloide-como las estructuras se puede predecir basado en la identificación y evaluación de la potencia de promover la agregación de polipéptidos27regiones. Sin embargo, a pesar del éxito de bioinformáticas algoritmos para predecir las propiedades de agregación en vitro de secuencias de proteínas, son aún muy lejos de pronosticar cómo estas propensiones traducen en vivo impacto citotóxico. Estudios que aborden la relación entre el estado agregado de una proteína dada y su asociado daño celular de forma sistemática pueden ayudar a eludir esta limitación computacional. Esta conexión se aborda en el presente estudio, tomando ventaja de un amplio conjunto de variantes del péptido amiloide-β Aβ42 difieren sólo en un único residuo, pero mostrando un rango continuo de agregación propensiones en vivo28de. En particular, se describe un enfoque basado en FC para identificar las especies conformacionales responsables del daño oxidativo provocado por propensas a la agregación de proteínas en las células de levadura. La metodología ofrece muchas ventajas tales como simplicidad, capacidad de alto rendimiento y precisión para la medición cuantitativa. Este enfoque permitió confirmar ese juego un papel protector contra el estrés oxidativo de la PI.

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Protocol

1. cultivos de S. cerevisiae y expresión de la proteína

Nota: Variantes Aβ exhibición inclinaciones diferentes agregación relativa debido a una mutación en un solo residuo en la posición 19 (Phe19) del péptido de Aβ42 (figura 1A). Estas variantes de péptidos se han etiquetado con la proteína fluorescente verde (GFP), que actúa como una agregación de reportero (figura 1)29.

  1. Transforman plásmidos codifican para 20 variantes de Aβ42-GFP en células de levadura con un BY4741 fondo parental (MATa su3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)30. Cada plásmido codifica para un mutante de Aβ42 fusionado a GFP por un enlazador GSSGSSG. La plásmidos son pESC(-URA) e incluyen el marcador seleccionable URA329.
    1. Preparar el medio completo sintético sin uracilo (SC-URA) con los siguientes componentes: 1,9 g/L nitrógeno levadura base uracilo, sulfato de amonio 5 g/L y 900 mL de ddH2O combinado con 100 mL de glucosa 20% (p/v).
    2. Poner una colonia de las células de levadura transformadas en 20 mL de medio SC-URA que contiene 2% de glucosa y crecer los cultivos durante la noche a 30 ° C bajo agitación en rpm 210.
  2. Al día siguiente, crecen nuevas culturas de células de levadura por inoculación 100 μl de la cultura durante la noche en 5 mL de medio fresco de SC-URA.
  3. Un OD590 de 0.5, centrifugar los cultivos a 3.000 x g durante 4 min, descartar el sobrenadante y resuspender las células en el mismo volumen de medio fresco de SC-URA que contienen rafinosa 2%.
  4. Incubar a 30 ° C bajo agitación a 210 rpm por 30 min. Luego, centrifugar las células a 3.000 x g durante 4 min y descarte el sobrenadante. Resuspender las células en medio fresco de SC-URA que contiene 2% galactosa para inducir la expresión de proteína recombinante.
  5. Después de 16 h de inducir la expresión de proteínas en medio SC-URA que contiene galactosa 2%, 1 mL de las células inducidas en tubos estériles de microcentrífuga la cosecha por centrifugación a 3.000 x g durante 4 minutos.
    Nota: Las diferencias más relevantes se producen después de un período de inducción de 16 h. inducida levadura las células que expresan variantes de Aβ42-GFP puede visualizarse por microscopía de fluorescencia para determinar la distribución de la proteína recombinante dentro de las células (figura 2B).

2. células de tinción

Nota: Células no-inducida son necesarias como control negativo para establecer un umbral fluorescente durante un análisis FC.

  1. Tomar las células de levadura inducida por h 16 y determinar su densidad óptica a 590 nm (OD590). Les diluido en un tampón de fosfato estéril salino (PBS) a un OD590 de 0,1.
    1. Preparar como sigue 1 x de tampón fosfato salino: Añadir 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, y 0.24 g de KH2PO4 a 800 mL de ddH2O. llenar la solución hasta 1 L de ddH2O después de ajustar el pH a 7.4 con HCl. filtro el búfer a través de un filtro de 0.2 μm.
  2. Las suspensiones de células expresando la transferencia a tubos debidamente etiquetados (12 × 75 mm fondo redondo poliestireno expandido) y proteger de la luz. Asegúrese de que están listos para ser cargados en el citómetro de flujo para el análisis, junto con las células no inducidas y no manchado.
  3. Añadir la punta de prueba de estrés oxidativo (por ejemplo, rojo oscuro CellROX) a cada muestra a una concentración final de 5 μm e incubar las células en 30 ° C por 30 min en la oscuridad.
  4. Después de la incubación, lavar las células 3 veces con 1 x PBS y resuspender en el mismo volumen de tampón antes de su análisis por FC.

3. Análisis de citometría de flujo de

Nota: Usar una configuración FC con láseres apropiados y filtros para detectar GFP y señal de fluorescencia de punta de prueba de estrés oxidativo. Puede utilizarse un citómetro de flujo equipado con un láser de nm azul 488 para la detección de GFP y un 635 nm rojo para la detección de la fluorescencia de punta de prueba de estrés oxidativo. Adquisición de la fluorescencia de emisión de GFP y probe el estrés oxidativo se realiza con un 530/30 nm BP filtro y un 660/20 BP, respectivamente (tabla 1).

  1. Haga clic en Abra el Panel de hoja de cálculo nueva y crear los siguientes diagramas de punto de adquisición.
    1. Seleccione la Herramienta de diagrama Scatter de la barra de herramientas y crear un diagrama con las variables área de dispersión lateral (SSC-A) en el eje y frente a zona de dispersión hacia adelante (FSC-A) en una escala lineal en el eje x.
    2. Haga clic en la Herramienta de diagrama Scatter de la barra de herramientas y crear un diagrama con las variables área de FL1 (FITC) en el eje x vs. FL3-área (APC) en una escala logarítmica en el eje y.
  2. Haga clic en el icono Configuración de instrumentos . Haga clic en la ficha de compensación y ajuste todos los niveles de compensación. Haga clic en la ficha de adquisición y seleccione un número total de 20.000 eventos a registrar.
  3. Haga clic en el icono de Flujo para cambiar la velocidad de flujo a baja.
  4. Haga clic en la ficha de adquisición para comenzar a correr las células no inducidas, sin manchas y ajustar la tensión en los Parámetros fijados del instrumento del adelante y dispersión lateral hasta que la población se distribuye en el cuadrante de centro-izquierda.
    1. Haga clic en el icono de polígono para definir una región R1 alrededor de la población de la célula excepto restos de células y esta población cerrada P1 = R1 para todas las parcelas de punto fluorescente y representaciones de histograma (figura 3).
  5. Para ajustar la tensión de la PMT de la señal de fluorescencia, ejecute las células sin manchas en la trama de punto FL1-FL3, ajuste la ganancia en la ficha Configuración del instrumento , hasta que las células se distribuyen en el cuadrante izquierdo más bajo.
  6. Cambiar la muestra a las células inducidas para medir la fluorescencia de GFP. En la ficha Configuración del instrumento , establecer la ganancia de la FSC-A vs FL1 (FITC) cuando la población se distribuye en el cuadrante de abajo a la derecha. Definir la población de células positivas con una puerta (puerta P2).
  7. Cambio la muestra a la inducida mancharon la fluorescencia en una trama de puntos FSC-A vs FL3 (APC) para mostrar el estrés oxidativo de las células. Afine la ganancia hasta que la población celular se distribuye en el cuadrante superior izquierdo. Puerta de la población de células positivas en P3.
  8. Hacer dos parcelas histograma con el icono de histograma para representar a la fluorescencia de la célula. Para representar la intensidad de fluorescencia, asegúrese que es FL1 (FITC) que representa a la fluorescencia de GFP en el eje x, y FL3 (APC) que representa la fluorescencia en el eje y, aplicando las poblaciones P2 y P3 en una escala logarítmica, respectivamente.
    Nota: Superposiciones de histograma son una buena manera de ilustrar las diferencias entre los perfiles de fluorescencia de las células que expresan diversas variantes Aβ.

4. inmunodetección de proteínas recombinantes

  1. Para determinar los niveles de expresión de la proteína, las culturas de levadura inducidas durante 16 horas por centrifugación a 4.000 x g durante 6 minutos la cosecha y almacenar los pellets de células a-80 ° C.
    1. Resuspender las células colectadas expresan la proteína recombinante por 16 h en PBS. Preparación de suspensiones celulares de 200 μL de cada mutante de Aβ42-GFP a una OD590 de 20.
  2. Para el análisis de la fracción de proteína total, cosechar 100 μl de cada mutante por centrifugación a 14.000 x g por 20 min y resuspender el pellet celular en el mismo volumen de tampón de lisis de la levadura Y-por (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1% DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA que contiene 10 mg/mL SB3-14 (myr istyl sulfobetaína) complementado con fluoruro (PMSF) del phenylmethylsulfonyl de 1 mM).
    1. Incubar las muestras durante 20 min a temperatura ambiente en agitación suave.
  3. Determinar la concentración de extracto de proteína mediante el ensayo de Bradford. Carga hasta 5 μg de extracto de proteína de cada muestra en un gel de electroforesis de SDS-PAGE de acrilamida 15% y el blot en una membrana de difluoruro (PVDF) de polivinilideno a 100 V por 60 min.
    1. Preparar a un Bradford reactivo con 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 disuelto en 50 mL de etanol al 95% y agregar 100 mL de ácido fosfórico al 85% (w/v). Entonces, cuando el colorante se haya disuelto completamente, diluir la mezcla con ddH2O a 1 L y filtrar con papel de filtro de celulosa antes de uso.
      Nota: El reactivo de Bradford debe ser marrón claro.
    2. Preparar un estándar de albúmina de suero bovino (BSA) que van desde 5 a 100 μg de proteína en 1000 μl del reactivo de Bradford.
    3. Añadir 1-10 μl de proteína extraer 1 ml del reactivo de Bradford e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    4. Medir la absorbancia de los estándares y las muestras de extracto de proteína a OD595.
    5. Para el análisis, hacer un diagrama con los valores de absorbancia obtenidos para los estándares vs. μg de proteína. Basado en la curva estándar, determinar las concentraciones de las muestras originales de la cantidad de proteína, teniendo en cuenta el volumen y la dilución, si cualquier.
  4. Lavar la membrana con 1 x solución salina tamponada con Tris (TBS), 0,1% Tween 20 (TTBS) y bloquear usando leche descremada en polvo 5% (w/v) con 1 x TTBS.
    1. Para preparar 1 L de 10 x TBS, disolver 24 g de Tris base y 88 g de NaCl en 900 mL de H2Odd y ajustar el pH a 7,6. Añadir ddH2O a un volumen final de 1 L. Para una solución de 1 x, mezcle 1 parte de stock de x 10 con 9 partes de ddH2O.
  5. Incubar la membrana durante 1 h con un anticuerpo primario de β-amiloide 6E10 diluido 1:1,000 y por 1 h a temperatura ambiente con una cabra de anticuerpo secundario conjugado de anti-mouse IgG-HRP diluido 1:10, 000.
  6. Desarrollar membranas usando 1 mL de reactivo fluorescente Luminata y cuantificar bandas por análisis densitométrico como se describe en el paso 5.2.

5. Análisis de datos

  1. Para analizar los datos obtenidos por FC, crear una tabla mostrando la intensidad fluorescente media (IFM) y mediana de la fluorescencia con su correspondiente error estándar o el coeficiente de variación (CV) para la fluorescencia de GFP y niveles de estrés oxidativo.
    1. Haga clic en la ficha Inspector y el icono de estadísticas para personalizar los datos estadísticos que se requieren para cada canal.
      Nota: Cuando se comparan las variantes de la proteína, convertir datos de valores de fluorescencia a una doblar-sobre fondo o resolución métrico (RD):
      Equation 1
      En esta métrica, la muestra media es la media fluorescencia de las muestras problema, el control media es la media fluorescencia de células utilizadas como control, y la SD es la desviación estándar de la media de la fluorescencia. Factor de RD es un índice más preciso que el valor de la IMF como no solo calcula la diferencia entre las muestras, sino también representa la difusión de los datos. Este cálculo es específicamente relevante al comparar datos de diferentes experimentos realizados en el tiempo. Una vez que se han calculado los RDs, el uso de una prueba estadística es recomendable confirmar la significación de las diferencias observadas entre las variantes de la proteína.
  2. De inmunodetección de proteínas, cuantificar los niveles de proteína recombinante por Western blot utilizando el software ImageJ.
    1. Antes del análisis de densitometría, convertir las imágenes raws originales de la membrana desarrollada en modo del archivo JPEG formato y escala de grises.
    2. Ajustar la sección Establecer mediciones del menú analizar valor de gris medio.
    3. Haga clic en la herramienta rectángulo de ImageJ y definir una región de interés (ROI) con un tamaño consistente para el análisis de densitometría de la banda. Centro de cada banda en la imagen de la membrana dentro del marco rectangular creado y registre la medida uno por uno usando Ctrl + M (el comando de medición).
    4. Medir el fondo local adyacente a cada banda, aplicación de la misma área de retorno de la inversión. Después de la medida, restar el fondo local correspondiente de cada banda individual.

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Representative Results

Este protocolo describe cómo utilizar una colección de 20 variantes del péptido de Aβ42 donde Phe19 ha sido mutado a todos natural proteinogenic aminoácidos28. Las propensiones de teórico de la agregación de estas proteínas pueden ser analizadas utilizando dos algoritmos bioinformáticos diferentes (AGGRESCAN y TANGO31,32). En ambos casos, este análisis representa una progresiva gradación de tendencias de agregación, atribuir, como regla general, los valores más altos de residuos hidrofóbicos y la más baja a los cargados y polares (figura 1B, 1C).

Para localizar experimentalmente el estado de la agregación intracelular de diversas variantes de Aβ42, el experimento descrito requiere una transformación de un plásmido, codificación de Aβ42 y fusionada a GFP (figura 1A) bajo el control de la GAL1 inducible por galactosa, en S. cerevisiae. Las células de levadura expresan variantes de Aβ42 después de un período de inducción de 16 h pueden visualizarse bajo el microscopio de fluorescencia. Esta visualización permite confirmar la formación de PI en 10 de las 20 variantes de la colección analizada. El número y tamaño de los agregados fluorescentes difieren de la variante de la variante (figura 2). Figura 2A muestra la cuantificación de la PI de un total de 500 células en cada una de las dos culturas independientes. Aquí, podemos observar un excelente acuerdo entre predecir y en vivo la agregación propiedades.

Para tratar la formación de agregados de proteínas puede desencadenar estrés oxidativo en este modelo celular, este protocolo utiliza FC para controlar la fluorescencia de GFP celular junto con la fluorescencia de la sonda fluorógenos como un indicador de oxígeno reactivo producción de especies (ROS). Figura 3 ilustra el procedimiento y resultados obtenidos para mutantes Gln y Ile, que corresponden a las variantes de Aβ42 homogéneamente distribuidas y la formación de PI, respectivamente.

En primer lugar, la población celular analizada es cerrada (P1) en el punto de FSC-A vs SSC-A parcela eliminar detritus celulares del análisis (Figura 3A). La señal de la fluorescencia de GFP vs estrés oxidativo punta de prueba de la población P1 está representada en gráficos de trama de puntos donde las células fluorescentes verdes están cerradas en P3 (figura 3B). Figura 3 y 3D muestran los histogramas para obtener datos estadísticos para cada variante expresa, incluyendo el CV (tabla 2), con el fin de cuantificar la media y la mediana fluorescencia de cada marcador fluorescente.

Se espera que todos mutantes se expresó en los mismos niveles ya que difieren en un solo aminoácido (0.02% de la secuencia de Aβ42-GFP). Sin embargo, la maquinaria proteostasis puede responder de manera diferencial a sus propensiones de agregación particular. Por lo tanto, los niveles de expresión de proteínas en los extractos celulares se cuantifican usando un anticuerpo específico de Aβ (figura 4). Vemos que, como tendencia general, PI-formación Aβ42 variantes están presentes en niveles más bajos que aquellos que permanecen homogéneamente distribuidos en el citosol.

Se observan importantes diferencias entre variantes de Aβ42 cuando su fluorescencia de punta de prueba de estrés oxidativo, los niveles de proteínas y propiedades de fluorescencia de GFP se representan en relación con su capacidad para formar PI y sus propensiones de agregación intrínseca ( Figura 5). El más agregación propensos a PI formando variantes provocan mucho estrés oxidativo más baja que sus contrapartes más solubles (figura 5A, 5B). Con estos resultados, no existe correlación evidente entre el tamaño y el número de agregados por individuales de la célula (figura 2) y niveles de estrés oxidativo. PI-formando variantes, especialmente mutantes con Trp y Phe en posición 19, están presentes en la célula a niveles inferiores a aquellos distribuidos homogéneamente en el citosol (figura 5, 5 D). La excepción a esto es el mutante de Thr, que menos del 10% de las células forma PI (figura 1B, 1C). Esto corresponde con el hecho de que las variantes más propensa a la agregación se eliminan selectivamente por el control de calidad de levadura degradación maquinaria28. La fluorescencia de GFP y niveles de la proteína correlacionan bien para las formas más solubles de Aβ42, pero no para que forman PI (figura 5E, 5F). Esto es probablemente porque en estas poblaciones celulares, la fluorescencia proviene de dos compartimentos diferentes, el citosol y las inclusiones, y sus contribuciones relativas a la fluorescencia total difieren entre los mutantes34.

Figure 1
Figura 1 . Análisis de tendencia de agregación para la colección de construcciones de la fusión de GFP de Aβ42 derivado de la mutación del residuo en la posición 19 en el péptido de Aβ42 por naturales todos los aminoácidos. A. esta imagen muestra un modelo 3D de wt Aβ42 fusionada a GFP por un enlazador (Aβ42, gris; GFP, verde), basado en el 1EMA PDB para proteína fluorescente verde de Aequorea victoria y la 2OTK para el péptido Aβ Alzheimer en el que la cadena lateral del Phe19 del wt Aβ42 se muestra en rojo. El modelo es creado utilizando software Pymol. 19 residuos en la secuencia de Aβ42 ocupan una posición central en el cúmulo central hidrofóbica. Los gráficos de barras se crean con dos predictores de Bioinformática diferentes: B. AGGRESCAN, C. TANGO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Variantes de Aβ42-GFP PI-formación en de S. cerevisiae culturas inducidas por 16 h de la expresión. A. el gráfico de barras indica el porcentaje de células que contienen un número diferente de PI calculada a partir de un total de 500 células fluorescentes para cada variante en dos réplicas biológicas. B. estas imágenes son representativas microscopia fluorescente de las variantes de la GFP de Aβ42 (Phe, Ile, Thr, Trp). Fueron adquiridos bajo luz UV utilizando un filtro de excitación de GFP (450-500 nm) y un rango de emisión (515-560 nm). La barra de escala representa 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Esquema de flujo cytometry (FC) análisis of S. cerevisiae las células que expresan las variantes de la GFP de Aβ42. A. la tabla muestra las células de levadura cerrada (P1) en parcelas de punto (FSC-A vs SSC-A) donde se elimina detritus celulares de la población de células. Las imágenes microscópicas de Gln (homogéneamente distribuido) y variantes de Ile (PI-formando) aparecen junto a que parcelas el punto FC. La barra de escala representa 10 μm. B. Estas imágenes de trama de punto de dispersión representan GFP-A frente a estrés oxidativo punta de prueba en la que la población cerrada (P3) incluye células sólo fluorescentes, excepto la señal de fondo. Los histogramas de frecuencia de la célula son de C. la señal de la GFP (amplitud FITC) cerrada de P1 y D. CellROX (amplitud APC) cerrada de P3. Se realizó la adquisición de células con un citómetro de flujo. Cada diagrama representa 20.000 eventos. Q y corresponden a mutantes Gln y Ile Aβ42, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Cuantificación de los niveles de proteína celular. Esta figura muestra manchas blancas /negras occidentales de las fracciones de proteína total de mutantes de GFP de Aβ42 después de 16 h de la expresión en S. cerevisiae. Las variantes de formación de PI están coloreadas en verde y los distribuidos difusamente en el citosol se colorean en rojo claro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Estrés oxidativo celular, fluorescencia de GFP intracelular y los niveles de la proteína celular de mutantes de GFP de Aβ42 determinados después de 16 h de la expresión en S. cerevisiae. Las variantes representadas en el eje x se ha ordenado según sus propensiones de agregación previsto AGGRESCAN (panel de la izquierda) o TANGO (panel derecho). Las variantes de formación de PI están coloreadas en verde y las variantes de formación de PI no se colorean en rojo claro. A. B. estos gráficos de barras muestran los valores de fluorescencia de sonda estrés oxidativo obtenidos por un análisis FC de los mutantes de GFP de Aβ42. C. D. estos gráficos de barras representan los niveles de proteína como cuantificada por un análisis de densitometría de Western blot usando el software ImageJ. E. F. estos gráficos de barras muestran los valores de fluorescencia de GFP después de un análisis FC. Probe las barras de error para el estrés oxidativo y los valores de fluorescencia de GFP representan el coeficiente de variación (CV) de las células FC-bloqueado. Las barras de error para los niveles de expresión de proteínas representan ± SE (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Canal Fluoróforo Longitud de onda de excitación (nm) Filtro de paso de banda
FITC GFP 488 530/30
APC CellRox 635 660/20
PerCP IP 488 585/42

Tabla 1. Fuente de laser, filtros band-pass y fluoróforos en citómetro de flujo.

Fluorescencia de GFP CV CellROX fluorescencia CV
A 9316 96.4 de 1964 127,5
C 9709 91.9 1275 172.2
D 11213 101.7 3443 155.8
E 12256 101.1 3220 152.2
F 3010 96.1 1245 146.4
G 11541 97.2 2947 158
H 7895 98.2 3582 120.8
Me 7365 97.2 1416 141.3
K 10839 100.4 3102 122.1
L 7605 96.9 1401 161.8
M 8149 96 1308 170.4
N 12741 97.5 3403 134.9
P 9768 102.8 2629 143,6
Q 13066 91.3 3354 169.9
R 8537 101.3 2839 127,5
S 12053 99.1 3313 174.3
T 10615 97.7 2213 107.7
V 9169 96.1 1878 121.7
W 1715 94.7 1531 100
Y 7574 94.5 1234 138

Tabla 2. Lista de los valores de fluorescencia de GFP y estrés oxidativo sonda fluorescencia obtenida por análisis FC de las células de levadura que expresaban a Aβ42-GFP mutantes de 16 h. Esta tabla muestra la intensidad de fluorescencia media (IFM) y el CV para cada mutante.

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Discussion

Una amplia gama de enfermedades está ligada a la acumulación de proteínas mal plegadas en depósitos celulares6,7,8,33. Se han hecho muchos esfuerzos para desentrañar los mecanismos moleculares que desencadenan la aparición de estas enfermedades usando el enfoque computacional, que no tienen en las concentraciones de proteína de cuenta, o en la vitro se acerca, en la que la concentración de proteína permanece constante durante la reacción. Sin embargo, dentro de la célula, proteínas constantemente sintetizadas y degradadas en un ambiente lleno de gente y no homogénea. Esto explica las frecuentes discrepancias entre las propiedades de agregación in silico, in vitro e in vivo de proteínas amyloidogenic.

Hay múltiples motivos por qué modelos celulares simples, tales como levadura, son una opción razonable para el estudio de la agregación y asociados a la toxicidad de las proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas en un contexto más biológico. Por ejemplo, nos dan la posibilidad de analizar el impacto de la agregación de causa de proteínas en una población celular intacta con análisis rápidos como la implementada aquí. Sin embargo, debemos considerar que nivel oxidativo puede diferenciar entre cepas de levadura. Así, para comparar entre cepas, o incluso entre diferentes proteínas, oxidantes y reductores, como la TDT y diamina, puede usarse para establecer una escala de oxidación/reducción.

En el ejemplo ilustrado en este artículo, el análisis Bioinformático, cuantificación de la proteína celular, la proyección de imagen de localización proteína y análisis simultáneo del FC de GFP actividad y niveles de estrés oxidativo se han integrado para identificar el molecular especies responsables del daño oxidativo provocado por las reacciones de agregación de la proteína. Los resultados demuestran que las variantes más solubles de Aβ42, en lugar de la más agregación-propensos, promover el mayor estrés oxidativo. Esto señala a las especies difusibles el más peligroso de especies de Aβ42 en vivo. La menor toxicidad de agregar variantes parece responder al hecho de que estas conformaciones son secuestradas en PI y a su degradación preferencial por la maquinaria de calidad de proteína, resultando en menores niveles de proteína que la de su solubilidad contrapartes.

El método descrito no se limita al análisis del estrés oxidativo producido por especies de agregados solubles de Aβ42 y puede aplicarse también para estudiar una variedad de trastornos de la agregación de proteínas. Además, la técnica podría ser útil para monitorizar el efecto de inhibidores de la agregación sobre el estrés oxidativo celular, permitiendo descartar para más aplicaciones clínicas aquellas moléculas que promueven la acumulación de especies oxidativo proteína activa. Por último, como una sonda fluorógenos está disponible, el enfoque ofrece notables oportunidades para identificar las especies moleculares responsables de otros efectos tóxicos relacionados con la agregación de la proteína de una forma rápida una manera fácil, proporcionando datos cuantitativos.

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Acknowledgments

   

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast cells BY4741  ATCC 201388 Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
pESC(-Ura) plasmid  Agilent Genomics 217454 Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements Sigma Y1501 Powder
Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids Sigma Y0626 Powder
Raffinose Sigma R7630 Powder
Glucose Sigma G7021 Powder
Galactose Sigma G0750 Powder
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3991  Solution 10X
CellROX Deep Red Reagent  Life Technologies C10422 Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. 
Y-PER protein extraction reagent  Thermo Scientific 78990 Liquid cell lysis buffer
Acrylamide/Bis-acrylamide Sigma A6050 Solution
Bradford dye reagent Bio-Rad  5000205 Dye reagent for one-step determination of protein concentration
β-amyloid antibody 6E10  BioLegend 803001 Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).
Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate  Bio-Rad 1721011
Membrane Immobilon-P, PVDF Millipore IPVH00010
Luminata forte Merk WBLUF0100 Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) Sigma 93482 Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol
FACSCanto flow cytometer  BD Biosciences 657338 Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter
Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell Bio-Rad 1703930 Protein transference system
Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems Bio-Rad 1658000FC Electrophoresis system

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References

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