Evaluatie van het effect van eiwit aggregatie op cellulaire oxidatieve Stress in gist

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Eiwit aggregatie lokt cellulaire oxidatieve stress. Dit protocol wordt een methode voor de controle van de intracellulaire toestanden van eiwitten van de amyloidogenic en de oxidatieve stress geassocieerd met hen, met behulp van stroom cytometry beschreven. De aanpak wordt gebruikt voor het bestuderen van het gedrag van oplosbare en aggregatie-naar voren gebogen varianten van de amyloid-β-peptide.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Carija, A., Ventura, S., Navarro, S. Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast. J. Vis. Exp. (136), e57470, doi:10.3791/57470 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Eiwit misfolding en aggregatie in amyloïde conformaties verband met het ontstaan en de progressie van verschillende neurodegeneratieve aandoeningen. Echter, er is nog weinig bekend over hoe onoplosbaar eiwit-aggregaten oefenen hun toxische effecten in vivo. Eenvoudig model van de prokaryote en eukaryote organismen, zoals bacteriën en gist, hebben aanzienlijk bijgedragen aan onze huidige inzicht in de mechanismen achter de intracellulaire amyloïde vorming, aggregaten propagatie en toxiciteit. In dit protocol, wordt het gebruik van gist beschreven als een model om te ontleden de relatie tussen de vorming van eiwit-aggregaten en hun impact op de cellulaire oxidatieve stress. De methode combineert de detectie van de intracellulaire oplosbare/geaggregeerde staat een amyloidogenic eiwit met de kwantificering van de cellulaire oxidatieve schade ten gevolge van de expressie met behulp van stroom cytometry (FC). Deze aanpak is eenvoudig, snel en kwantitatieve. De studie illustreert de techniek door correleren de cellulaire oxidatieve stress veroorzaakt door een groot aantal amyloid-β peptide varianten met hun respectieve intrinsieke aggregatie neigingen.

Introduction

Proteostasis is een fundamentele factor voor cel processen op het gebied van fitness en veroudering. In cellen, wordt eiwit homeostase onderhouden door geavanceerde eiwit kwaliteitscontrole netwerken gericht om ervoor te zorgen dat de juiste uiteinde van misfolded eiwit conformeren van chaperones en/of hun gerichte proteolyse met verschillende goed geconserveerde mechanismen1 ,2,,3,,4,5. Een groot aantal studies verlenen steun aan het verband tussen het ontstaan en de progressie van een breed scala van ziekten bij de mens en het falen van proteostasis, wat leidt tot het eiwit misfolding en aggregatie. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van eiwitten deposito's wordt beschouwd als een pathologische kenmerk van vele neurodegeneratieve ziekten, zoals Alzheimer, Parkinson, en Huntingtons ziekten6,7,8, prionogenic ziekten en niet-degeneratieve amyloidoses9. Er is gesuggereerd dat vroege oligomere en protofibrillar assemblages in de reactie van de globalisatie de belangrijkste elicitors van cytotoxiciteit zijn, tot oprichting van afwijkende interacties met andere eiwitten in de drukke mobiele milieu10. Eiwit insluitsels (PI) kunnen bovendien worden overgebracht tussen cellen, teeltmateriaal hun toxisch effect11,12. Dus zou kunnen het zijn dat de vorming van PI inderdaad een ontgiftende mechanisme dat de aanwezigheid van gevaarlijke geaggregeerde soorten tot specifieke locaties in de cel beperkt, waar ze kunnen worden verwerkt of verzameld zonder belangrijke bijwerkingen kan inhouden 13 , 14.

Standaard in vitro biochemische benaderingen hebben belangrijke inzichten in de verschillende soorten die aggregatie reacties en hun eigenschappen15,16 bevolkenverstrekt. De voorwaarden gebruikt in deze tests zijn echter duidelijk anders dan die welke voorkomen in de cel en, dus, vraag hun fysiologische relevantie. Vanwege de opmerkelijke behoud van cellulaire routes zoals de controle van de kwaliteit van het eiwit, autophagy of de regulering van de cellulaire redox staat17,18 onder eukaryoten19,20,21 ,22,23, de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) heeft ontpopt als een bevoorrechte eenvoudig cellulaire model te bestuderen van de Moleculaire determinanten van aggregatie van eiwitten en het bijbehorende cytotoxisch effect ervan in biologisch relevante omgevingen24,25,26.

Eiwit aggregatie neiging is een functie die inherent gecodeerd in de primaire volgorde. Dus, kan de vorming van amyloid-achtige structuren worden voorspeld op basis van de identificatie en evaluatie van de potentie van aggregatie-bevordering van regio's in polypeptiden27. Echter, ondanks het succes van bioinformatic algoritmen te voorspellen van de eigenschappen van aggregatie in vitro van proteïne sequenties, ze zijn nog lang niet voorspellen hoe deze neigingen vertalen naar in vivo cytotoxisch effect. Studies die betrekking hebben op het verband tussen de geaggregeerde staat van een bepaald eiwit en haar verbonden cellulaire schade op een systematische wijze kunnen bijdragen tot het omzeilen van deze beperking van computationele. Deze verbinding wordt behandeld in de huidige studie, profiteren van een groot aantal varianten van de amyloid-β peptide Aβ42 die alleen verschillen in een enkel residu, maar een doorlopend bereik van aggregatie neigingen in vivo28weergeven. In het bijzonder wordt een FC gebaseerde benadering voor het identificeren van de conformationele soorten administratieve verwerking van de oxidatieve schade door aggregatie-naar voren gebogen eiwitten in gistcellen ontlokte beschreven. De methodologie biedt vele voordelen zoals eenvoud, hoge gegevensdoorvoer vermogen en nauwkeurige kwantitatieve meting. Deze aanpak maakte het mogelijk om te bevestigen dat PI spelen een beschermende rol tegen oxidatieve stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. S. cerevisiae culturen en eiwit expressie

Opmerking: Aβ varianten vertonen verschillende relatieve aggregatie neigingen als gevolg van een mutatie in een enkel residu op positie 19 (Phe19) van de Aβ42 peptide (figuur 1A). Deze peptide varianten zijn gelabeld met groen fluorescente proteïne (GFP), die als een aggregatie verslaggever (Figuur 1)29 optreedt.

  1. Transformeren plasmiden codering voor 20 Aβ42-GFP varianten in gistcellen met een BY4741 ouderlijke achtergrond (MATa zijn3Δ1 leu2Δ0 ontmoette15Δ0 ura3Δ0)30. Elke plasmide codeert voor een Aβ42 mutant gesmolten tot GFP door een linker GSSGSSG. De plasmiden zijn pESC(-URA) en bevatten de selecteerbare markering URA329.
    1. Voorbereiden van de synthetische compleet medium zonder uracil (SC-URA) met de volgende onderdelen: 1.9 g/L gist stikstof basis zonder uracil, 5 g/L ammoniumsulfaat en 900 mL ddH2O gecombineerd met 100 mL glucose van 20% (m/v).
    2. Zet een kolonie van de getransformeerde gistcellen in 20 mL van de SC-URA medium met 2% glucose en groeien de culturen 's nachts bij 30 ° C onder agitatie bij 210 t/min.
  2. De volgende dag, groeien nieuwe gist cellen culturen door inoculating 100 µL van de overnachting cultuur tot 5 mL verse SC-URA voedingsbodem.
  3. Bij een OD590 van 0,5, centrifugeren van de culturen op 3000 x g gedurende 4 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in de dezelfde hoeveelheid verse SC-URA medium met 2% raffinose.
  4. Incubeer bij 30 ° C onder agitatie bij 210 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten. Vervolgens de cellen bij 3000 x g gedurende 4 min centrifugeren en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in verse SC-URA medium met 2% galactose om de recombinant eiwit expressie.
  5. Na 16 h van het inducerende eiwituitdrukking in SC-URA medium met 2% galactose, oogst 1 mL van de geïnduceerde cellen in steriele microcentrifuge buizen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 4 min.
    Opmerking: De meest relevante verschillen optreden nadat een inductieperiode van 16 h. ingegeven gistcellen uiting van Aβ42-GFP varianten kan worden gevisualiseerd door fluorescentie microscopie om te bepalen van de verdeling van de recombinante eiwitten in de cellen (figuur 2B).

2. cel kleuring

Let op: Verse niet-geïnduceerde cellen zijn verplicht als een negatieve controle drempel vast te stellen een fluorescerende tijdens een FC-analyse.

  1. Neem de 16 h-geïnduceerde gistcellen en bepalen hun optische dichtheid bij 590 nm (OD590). Verdun hen in een steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) naar een OD590 0.1.
    1. 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing als volgt voorbereiden: Voeg 8 g NaCl, KCl, 1,44 g nb2HPO4, 0.2 g en 0,24 g van KH2PO4 tot 800 mL ddH2O. Vul de oplossing tot 1 L ddH2O na het aanpassen van de pH op 7.4 met HCl. Filter de buffer door een 0,2 µm filter.
  2. Breng de schorsingen cel waarin adequaat gelabelde buizen (12 × 75 mm ronde onderkant polystyreen) en hen te beschermen tegen licht. Zorg ervoor dat ze zijn klaar om te worden geladen op de cytometer van de stroom voor analyse, samen met niet-geïnduceerde en niet-gekleurde cellen.
  3. De sonde van de oxidatieve stress (bijv CellROX Deep Red) toevoegen aan elk monster op een eindconcentratie van 5 µM en Incubeer de cellen bij 30 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
  4. Na incubatie, wassen van de cellen 3 keer met 1 x PBS en resuspendeer hen in dezelfde hoeveelheid buffer vóór hun analyse door FC.

3. Stroom Cytometry analyse

Opmerking: Gebruik een FC-installatie met passende lasers en filters om GFP en oxidatieve stress sonde fluorescentie signaal te detecteren. Een cytometer van de stroom voorzien van een 488 nm blauwe laser voor het opsporen van GFP en een 635 nm rode laser voor het opsporen van oxidatieve stress sonde fluorescentie kan worden gebruikt. Verwerving van emissie fluorescentie van GFP en oxidatieve stress sonde wordt uitgevoerd met een 530/30 nm BP filter en een 660/20 BP filter, respectievelijk (tabel 1).

  1. Klik op Open nieuwe werkblad paneel en maak de volgende overname dot percelen.
    1. Selecteer het Scatter Plot gereedschap in de werkbalk en maak een perceel met de variabelen kant Scatter-gebied (WS-A) op de y-as vs. vooruit Scatter-gebied (FSC-A) in een lineaire schaal op de x-as.
    2. Klik op de Scatter Plot gereedschap op de werkbalk en het maken van een perceel met de variabelen FL1-gebied (FITC) op de x-as vs. FL3-gebied (APC) in een logaritmische schaal op de y-as.
  2. Klik op het pictogram van Montages van de instrumenten . Klik op het tabblad compensatie en stel alle niveaus van de compensatie. Klik op het tabblad overname en selecteer een totaal aantal van 20.000 gebeurtenissen worden geregistreerd.
  3. Klik op het pictogram van de Stroomsnelheid om over te schakelen van het debiet te laag.
  4. Klik op het tabblad verwerven om te beginnen met het uitvoeren van de niet-geïnduceerde, onbevlekt cellen en aanpassen van de spanning in de Instrumentele instellingen voor het doorsturen en kant scatter totdat de bevolking wordt verdeeld in het midden-links-Kwadrant.
    1. Klik op het pictogram van de veelhoek te stellen een regio R1 rond de celpopulatie exclusief cel puin, en gebruik deze gated bevolking P1 = R1 voor alle fluorescerende dot plots en histogram vertegenwoordigingen (Figuur 3).
  5. Om aan te passen de spanning van de bet van de fluorescentie-signaal, de onbevlekt cellen in de FL1-FL3 dot plot, afstemming van de winst in het tabblad Instrument instelling totdat de cellen zich in het lagere linker Kwadrant bevinden worden uitgevoerd.
  6. Wijzig het monster in de geïnduceerde cellen te meten GFP fluorescentie. Stel de winst in de FSC-A vs. FL1 (FITC) wanneer de bevolking worden gedistribueerd in het kwadrant rechtsonder in het tabblad Instellingen van het Instrument . Definieer de positieve cel bevolking met een hek (Gate P2).
  7. Wijziging van het monster, tot de niet-geïnduceerde gekleurd cellen weer te geven van oxidatieve stress door de fluorescentie op een FSC-A vs. FL3 (APC) stip perceel. Tune de winst totdat de celpopulatie wordt verspreid in de kwadrant links-upper. Poort de positieve celpopulatie in P3.
  8. Maak twee histogram Staanplaatsen met het pictogram van het histogram te vertegenwoordigen de fluorescentie van de cel. Om aan te geven de intensiteit van de fluorescentie, Controleer of FL1 (FITC) vertegenwoordigen de GFP-fluorescentie is in de x-as, en FL3 (APC) vertegenwoordigen de fluorescentie in de y-as, P2 en P3 populaties op een logaritmische schaal, respectievelijk toe te passen.
    Opmerking: Histogram overlays zijn een goede manier om te illustreren de verschillen tussen de profielen van de fluorescentie van cellen uiten van verschillende Aβ varianten.

4. recombinant eiwit Immunodetection

  1. Om te bepalen eiwitniveaus expressie, oogsten van de culturen van de gist voor 16 h geïnduceerd door centrifugeren bij 4000 x g gedurende 6 min, en op te slaan de cel pellets bij-80 ° C.
    1. Resuspendeer de verzamelde cellen uiten van recombinante eiwitten voor 16u in PBS. Bereiden 200 µL cel schorsingen van elk Aβ42-GFP mutant aan een OD-590 van 20.
  2. Voor de analyse van de Fractie van de totale proteïne, oogsten 100 µL van elke mutant door centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 20 min en resuspendeer de cel pellets in dezelfde hoeveelheid gist lysis-buffermengsel Y-PER (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1% DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA met 10 mg/mL SB3-14 (myr istyl sulfobetaine) aangevuld met 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)).
    1. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder milde agitatie.
  3. Bepalen de eiwitconcentratie extract met behulp van de analyse van Bradford. Laden van maximaal 5 µg voor eiwit extract van elk monster op een 15% acrylamide SDS-pagina de Elektroforese van gel en vlek op een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan bij 100 V voor 60 min.
    1. Een Bradford reagens met 100 mg Coomassie briljant blauw G-250 opgelost in 50 mL ethanol 95% en voeg 100 mL 85% (m/v) fosforzuur te bereiden. Vervolgens, wanneer de kleurstof volledig is opgelost, het mengsel met ddH2O tot 1 L verdunnen en filteren door filterpapier cellulose vlak voor gebruik.
      Opmerking: De Bradford-reagens moet worden lichtbruin.
    2. Een norm van bovien serumalbumine (BSA) variërend van 5-100 µg eiwit in 1000 µL van het Bradford reagens te bereiden.
    3. Voeg 1-10 µL van eiwit extract tot 1 mL van het reagens Bradford en Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    4. Meet de extinctie van de normen en de eiwitsteekproeven extract bij OD595.
    5. Bij de analyse, een perceel met de waarden van de extinctie verkregen voor de normen vste maken. µg voor eiwit. Op basis van de standaard curve, bepalen de concentraties van de originele exemplaren van de hoeveelheid eiwit, gezien de omvang en de verdunning, indien van toepassing.
  4. Spoel het membraan met 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), 0,1% Tween-20 (TTBS), en met behulp van 5% (m/v) nonfat droge melk in 1 x TTBS te blokkeren.
    1. Los 24 g van Tris basis en 88 g NaCl in 900 mL H2Odd om te bereiden 1 L van 10 x TBS, en breng de pH op 7.6. DdH2O toevoegen aan een eindvolume van 1 L. Voor een oplossing van 1 x, meng 1 deel van 10 x voorraad met 9 delen van ddH2O.
  5. Het membraan voor 1 h met een primair antilichaam van β-amyloid 6E10 verdund 1:1,000 broeden en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een secundair antilichaam geit anti-muis IgG-HRP-geconjugeerde verdund 1:10, 000.
  6. Ontwikkelen van membranen met 1 mL van Luminata fluorescerende reagens en kwantificeren van bands door densitometric analyse, zoals beschreven in stap 5.2.

5. de gegevensanalyse

  1. Voor het analyseren van de gegevens die zijn verkregen door FC, een tabel weergeven van de gemiddelde TL intensiteit (MFI's) maken en mediaan fluorescentie met de bijbehorende standaardafwijking en/of de coëfficiënt van de AVK (afwijking) voor GFP fluorescentie en oxidatieve stress niveaus.
    1. Klik op het tabblad van de inspecteur en het pictogram van de Statistieken voor het aanpassen van de statistische gegevens die nodig voor elk kanaal zijn.
      Opmerking: Bij het vergelijken van eiwit varianten, fluorescentie waarden gegevens kunnen converteren naar een achtergrond van de fold-over of resolutie metrisch (RD):
      Equation 1
      In deze statistiek, het gemiddelde monster is de gemiddelde fluorescentie van probleem monsters, de gemiddelde controle is de gemiddelde fluorescentie cellen die worden gebruikt als een besturingselement en de SD is de standaarddeviatie van de gemiddelde fluorescentie. RD factor is een nauwkeuriger index dan MFI waarde omdat het niet alleen het verschil tussen monsters maar ook rekeningen berekent voor het verspreiden van de gegevens. Deze berekening is specifiek relevant is als het vergelijken van gegevens afkomstig uit verschillende experimenten uitgevoerd na verloop van tijd. Zodra het RDs zijn berekend, verdient het gebruik van een statistische toets om te bevestigen het belang van de waargenomen verschillen tussen eiwit varianten.
  2. Voor proteïne immunodetection, de recombinante eiwitniveaus door westelijke vlek ImageJ softwarematig te kwantificeren.
    1. Vóór de analyse densitometrie door de oorspronkelijke raw-beelden van het ontwikkelde membraan te converteren in JPEG formaat en greyscale modus file.
    2. Pas de Set metingen sectie van het menu van de analyseren op Grijs-waarde betekenen.
    3. Klik op het gereedschap rechthoek van ImageJ en definieer een regio van belang (ROI) met een consistent formaat voor de band densitometrie analyse. Elke band op het membraan beeld binnen het gemaakte rechthoekig frame te centreren en opnemen van de meting één voor één met behulp van Ctrl + M (de meting opdracht).
    4. Het meten van de lokale achtergrond grenzend aan elke band, hetzelfde ROI gebied toe te passen. Na meting, aftrekken van de overeenkomstige lokale achtergrond van elke individuele band.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol wordt beschreven hoe een collectie van 20 varianten van de Aβ42 peptide waar Phe19 heeft is gemuteerd tot en met alle natuurlijke Proteïnogeen aminozuren28in dienst. De theoretische aggregatie neigingen van deze proteïnen kunnen worden geanalyseerd met behulp van twee verschillende bioinformatic algoritmen (AGGRESCAN en TANGO31,32). In beide gevallen maakt deze analyse een progressieve gradatie van aggregatie tendensen, toeschrijven, als algemene regel, de hoogste waarden aan hydrofobe residuen en de laagste aan geladen en polar degenen (figuur 1B, 1 C).

Als u wilt bijhouden experimenteel de intracellulaire aggregatie-staat voor verschillende varianten van de Aβ42, vereist de beschreven experiment een transformatie van een plasmide, codering voor Aβ42 en gesmolten tot GFP (figuur 1A) onder de controle van de galactose-afleidbare GAL1, in S. cerevisiae. Gistcellen uiting van varianten van de Aβ42 na een inductieperiode van 16 h kunnen worden gevisualiseerd onder een fluorescentie Microscoop. Deze visualisatie maakt het mogelijk om te bevestigen de vorming van PI in 10 van de 20 varianten uit de geanalyseerde collectie. Het aantal en de grootte van de fluorescerende aggregaten verschillen van variant aan variant (Figuur 2). Figuur 2A toont de kwantificering van de PI uit een totaal van 500 cellen in elk van de twee onafhankelijke culturen. Hier kunnen we zien een voortreffelijke overeenstemming tussen voorspelde en in vivo aggregatie eigenschappen.

Om aan te pakken of de vorming van eiwit-aggregaten oxidatieve stress in deze cel modelsysteem veroorzaken kan, dit protocol maakt gebruik van FC te controleren van de cellulaire GFP fluorescentie samen met de fluorescentie van de fluorogenic sonde als een indicator van reactieve zuurstof soorten (ROS) productie. Figuur 3 illustreert de procedure en verkregen resultaten voor Gln en Ile mutanten, die correspondeert met de homogeen verspreid en PI-vormende varianten van de Aβ42, respectievelijk.

Ten eerste, de geanalyseerde celpopulatie is beveiligd (P1) in de WS-A FSC-A vs. stip plot verwijderen cel detritus uit de analyse (figuur 3A). Het signaal van de fluorescentie van GFP vs. oxidatieve stress sonde van de P1-bevolking is vertegenwoordigd in dot perceel grafieken waar groene fluorescerende cellen zijn gated in P3 (figuur 3B). Figuur 3 c en 3D tonen de histogrammen gemaakt om statistische gegevens voor elke uitgedrukt variant, met inbegrip van de CV (tabel 2), teneinde het kwantificeren van het gemiddelde en de mediaan fluorescentie van iedere fluorescerende markeerdraad te verkrijgen.

Alle mutanten wordt verwacht dat op hetzelfde niveau worden uitgedrukt, aangezien zij in een één aminozuur (0,02% van de Aβ42-GFP-reeks verschillen). Echter kan de proteostasis machine inspelen op een gedifferentieerde wijze hun bijzondere aggregatie neigingen. Daarom, de expressie eiwitniveaus in cellulaire extracten worden gekwantificeerd aan de hand van een Aβ-specifieke antilichaam (Figuur 4). We zien dat, als een algemene trend, Aβ42 PI-vormende varianten aanwezig zijn op lagere niveaus dan die resterende homogeen verdeeld in het cytosol.

Belangrijke verschillen tussen de varianten van de Aβ42 kunnen worden waargenomen wanneer hun oxidatieve stress sonde fluorescentie, eiwitniveaus en GFP fluorescentie-eigenschappen worden weergegeven ten opzichte van hun vermogen om te vormen van de PI en hun intrinsieke aggregatie neigingen ( Figuur 5). De aggregatie-gevoeliger PI-vormende varianten ontlokken veel lagere oxidatieve stress dan hun meer oplosbaar tegenhangers (figuur 5A, 5B). Met deze resultaten is er geen duidelijk verband tussen de grootte en het aantal aggregaten per individuele cel (Figuur 2) en oxidatieve stress niveaus. PI-vormende varianten, vooral mutanten Trp en Phe op positie 19, rekening houdend met zijn aanwezig in de cel op lagere niveaus dan die homogeen verspreid in het cytosol (figuur 5C, 5 D). De uitzondering hierop is de Thr mutant, waarvoor minder dan 10% van de cellen PI vormen (figuur 1B, 1 C). Dit komt overeen met het feit dat de meest aggregatie-naar voren gebogen varianten selectief zijn uitgeschakeld door de gist kwaliteitscontrole afbraak machines28. GFP fluorescentie en eiwitniveaus correleren goed voor de meer oplosbare vormen van de Aβ42, maar niet voor de vorming van de PI (figuur 5E, 5F). Dit is waarschijnlijk omdat in deze cellulaire bevolking, de fluorescentie die afkomstig is van twee verschillende compartimenten, het cytosol en de insluitsels, en hun relatieve bijdrage aan de totale fluorescentie tussen mutanten34 verschillen.

Figure 1
Figuur 1 . Aggregatie neiging analyse voor het verzamelen van Aβ42-GFP fusion constructies door alle natuurlijke aminozuren de mutatie van het residu op positie 19 in de Aβ42 peptide afgeleid. A. dit beeld toont een 3D-model van wt Aβ42 gesmolten tot GFP door een linker (Aβ42, grijs; GFP, groen), gebaseerd op de 1EMA van het VOB voor de groen fluorescente proteïne uit Aequorea victoria en de 2OTK voor de Alzheimer Aβ peptide waarin de zijketen van de Phe19 van wt Aβ42 wordt weergegeven in het rood. Het model is gemaakt met behulp van Pymol software. Residu 19 in de volgorde van de Aβ42 neemt een centrale plaats in het centrale hydrofobe cluster. De bar grafieken worden gemaakt met twee verschillende bioinformatic voorspellers: B. AGGRESCAN, C. TANGO. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Aβ42-GFP PI-vormende varianten in S. cerevisiae culturen geïnduceerde voor 16 h van meningsuiting. A. het staafdiagram geeft het percentage cellen met een verschillend aantal PI berekend op basis van een totaal van 500 fluorescerende cellen voor elke variant in twee biologische replicatieonderzoeken. B. deze beelden zijn vertegenwoordiger fluorescent microscopie beelden van geselecteerde Aβ42-GFP-varianten (Phe, Ile, Thr, Trp). Zij werden verworven onder UV-licht met behulp van een excitatie-filter voor GFP (450-500 nm) en een emissie bereik (515-560 nm). De schaal staaf vertegenwoordigt 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Regeling voor stroom cytometry (FC) analyse of S. cerevisiae cellen uiten van geselecteerde Aβ42-GFP varianten. A. de grafiek toont gated gistcellen (P1) op de stip percelen (FSC-A vs. SSC-A) waar detritus van de cel wordt verwijderd uit de celpopulatie. De microscopische beelden van Gln (homogeen verspreid) en Ile (PI-vormende) varianten worden weergegeven naast dat de FC stip percelen. De schaal staaf vertegenwoordigt 10 µm. B. Deze scatter dot perceel beelden vertegenwoordigen GFP-A vs. oxidatieve stress sonde waarin de gated bevolking (P3) alleen fluorescerende cellen bevat, met uitzondering van het signaal van de achtergrond. De cel frequentie histogrammen zijn van C. het GFP-signaal (FITC amplitude) omheinde van P1 en D. CellROX (APC amplitude) omheinde van P3. De cel overname werd uitgevoerd met een stroom-cytometer. Ieder waarnemingspunt vertegenwoordigt 20.000 gebeurtenissen. Q en ik komen overeen met Gln en Ile Aβ42 mutanten, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Kwantificering van cellulaire eiwitniveaus. Dit cijfer toont Western blots van de totale eiwitfracties van Aβ42-GFP mutanten na 16u van meningsuiting in S. cerevisiae. De PI-vormende varianten zijn gekleurd in het groen en die diffuus verspreid in het cytosol in het licht rood worden gekleurd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Cellulaire oxidatieve stress, intracellulaire GFP fluorescentie en cellulaire eiwitniveaus voor Aβ42-GFP mutanten bepaald na 16u van meningsuiting in S. cerevisiae. De varianten vertegenwoordigd op de x-as hebben zijn gerangschikt volgens hun voorspelde aggregatie neigingen of TANGO (rechtervenster) als AGGRESCAN (linkerdeel). De PI-vormende varianten zijn gekleurd in het groen en de niet-PI-vormende varianten zijn gekleurd licht rood. A. B. deze bar grafieken tonen de oxidatieve stress sonde fluorescentie verkregen waarden door een FC-analyse van de Aβ42-GFP mutanten. C. D. deze staafdiagrammen vertegenwoordigen de eiwitniveaus zoals gekwantificeerd door een westelijke vlekkenanalyse voor densitometrie ImageJ softwarematig. E. F. deze bar grafieken tonen de GFP fluorescentie waarden na een analyse van de FC. Sonde van de foutbalken voor de oxidatieve stress en GFP fluorescentie waarden vertegenwoordigen de coëfficiënt van (AVK) van de FC-gated cellen. De foutbalken voor de expressie eiwitniveaus vertegenwoordigen ± SE (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Kanaal Fluorophore Excitatie golflengte (nm) Band Pass Filter
FITC GFP 488 530/30
APC CellRox 635 660/20
PerCP IP 488 585/42

Tabel 1. Laserbron, band pass filters en fluorophores gebruikt in cytometer van de stroom.

GFP fluorescentie CV CellROX fluorescentie CV
A 9316 96,4 1964 127,5
C 9709 91.9 1275 172,2
D 11213 101,7 3443 155,8
E 12256 101.1 3220 152,2
F 3010 96,1 1245 146.4
G 11541 97,2 2947 158
H 7895 98,2 3582 120.8
Ik 7365 97,2 1416 141,3
K 10839 100,4 3102 122.1
L 7605 96,9 1401 161,8
M 8149 96 1308 170,4
N 12741 97,5 3403 134,9
P 9768 102,8 2629 143,6
Q 13066 91,3 3354 169.9
R 8537 101,3 2839 127,5
S 12053 99.1 3313 174.3
T 10615 97,7 2213 107.7
V 9169 96,1 1878 121.7
W 1715 94,7 1531 100
Y 7574 94,5 1234 138

Tabel 2. Lijst met waarden voor GFP fluorescentie en oxidatieve stress sonde fluorescentie verkregen door FC analyse van gistcellen uiting van Aβ42-GFP mutanten voor 16 h. Deze tabel toont de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI's) en de CV voor elke mutant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een breed scala van ziekten is gekoppeld aan de accumulatie van misfolded eiwitten in cellulaire deposito's6,,7,,8,33. Veel inspanningen zijn verricht om te ontrafelen van de moleculaire mechanismen die leiden het begin van deze ziekten met behulp van computationele benaderingen, die niet rekening account eiwit concentraties tot, of in vitro nadert, waarin de eiwitconcentratie blijft constant tijdens de reactie. Binnen de cel zijn eiwitten echter voortdurend gesynthetiseerd en in een overvol en niet-homogene milieu afgebroken. Dit verklaart de frequente verschillen tussen in silico, in vitro en in vivo aggregatie eigenschappen van amyloidogenic eiwitten.

Er zijn meerdere redenen waarom eenvoudige cellulaire modellen, zoals de gist, zijn een redelijke keuze te bestuderen van de samenvoeging en bijbehorende toxiciteit van eiwitten aan neurodegeneratieve ziekten binnen een meer biologische gerelateerde. Bijvoorbeeld, geven ze ons de mogelijkheid om het analyseren van de impact van misfolding aggregatie van eiwitten op een intact cellulaire bevolking met behulp van snelle analyses uitgevoerd, zoals degene die uitgevoerd hier. We moeten echter overwegen dat oxidatieve niveaus giststammen kunnen verschillen. Dus, om te vergelijken tussen de stammen, of zelfs tussen verschillende eiwitten, oxidanten en reductants, zoals DTT en diamine, moeten worden gebruikt om de schaal van een oxidatie/vermindering.

In het voorbeeld geïllustreerd in dit artikel, de bioinformatic analyse, kwantificering van de cellulaire eiwit, zijn eiwit lokalisatie beeldvorming en gelijktijdige FC analyse van GFP activiteit en oxidatieve stress niveaus geïntegreerd ter identificatie van de moleculaire soorten verantwoordelijk voor de oxidatieve schade door eiwit aggregatie reacties ontlokte. De resultaten tonen aan dat de meer oplosbare Aβ42 varianten, in plaats van de aggregatie-gevoeliger, de hoogste oxidatieve stress bevorderen. Dit wijst op de diffusible soorten worden de meer gevaarlijke Aβ42 soorten in vivo. De lagere toxiciteit van het aggregeren van varianten lijkt te reageren zowel op het feit dat deze conformaties zijn afgezonderd in PI en hun preferentiële afbraak door de eiwit kwaliteit machine, wat resulteert in lagere eiwitniveaus dan die van hun oplosbaar tegenhangers.

De beschreven methode is niet beperkt tot de analyse van de oxidatieve stress geproduceerd door Aβ42 samengevoegd/oplosbare soorten en kan ook worden toegepast om te bestuderen van een scala aan eiwit aggregatie aandoeningen. Bovendien, de techniek kan zinvol zijn om te controleren van het effect van aggregatie remmers op cellulaire oxidatieve stress, waardoor te negeren voor verdere klinische toepassingen die moleculen ter bevordering van de accumulatie van oxidatieve actief eiwit soorten. Tot slot, zo lang als een fluorogenic-sonde beschikbaar is, biedt de aanpak opmerkelijke mogelijkheden te identificeren van de moleculaire soorten verantwoordelijk voor andere toxische effecten gekoppeld aan eiwit aggregatie op een snelle een eenvoudige manier, kwantitatieve gegevens te verstrekken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

   

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast cells BY4741  ATCC 201388 Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
pESC(-Ura) plasmid  Agilent Genomics 217454 Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements Sigma Y1501 Powder
Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids Sigma Y0626 Powder
Raffinose Sigma R7630 Powder
Glucose Sigma G7021 Powder
Galactose Sigma G0750 Powder
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3991  Solution 10X
CellROX Deep Red Reagent  Life Technologies C10422 Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. 
Y-PER protein extraction reagent  Thermo Scientific 78990 Liquid cell lysis buffer
Acrylamide/Bis-acrylamide Sigma A6050 Solution
Bradford dye reagent Bio-Rad  5000205 Dye reagent for one-step determination of protein concentration
β-amyloid antibody 6E10  BioLegend 803001 Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).
Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate  Bio-Rad 1721011
Membrane Immobilon-P, PVDF Millipore IPVH00010
Luminata forte Merk WBLUF0100 Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) Sigma 93482 Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol
FACSCanto flow cytometer  BD Biosciences 657338 Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter
Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell Bio-Rad 1703930 Protein transference system
Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems Bio-Rad 1658000FC Electrophoresis system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).
  2. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  3. Wong, E., et al. Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy. Nature Communications. 3, (2012).
  4. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).
  5. Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).
  6. Dobson, C. M. Getting out of shape. Nature. 418, 729-730 (2002).
  7. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  8. Aguzzi, A., O'Connor, T. Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives. Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).
  9. Rapezzi, C., et al. Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview. Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).
  10. Deas, E., et al. Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease. Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).
  11. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).
  12. Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).
  13. Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431, 805-810 (2004).
  14. Ross, C. A., Poirier, M. A. Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).
  15. Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red. Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).
  16. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay. Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).
  17. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast? Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).
  18. Tenreiro, S., Outeiro, T. F. Simple is good: yeast models of neurodegeneration. FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).
  19. Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).
  20. Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).
  21. Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex. eLife. 5, (2016).
  22. Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).
  23. Figley, M. D., Gitler, A. D. Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS. Rare Diseases. 1, e24420 (2013).
  24. Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  25. Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).
  26. Bharathi, V., et al. Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33, 607-620 (2016).
  27. Pallarès, I., Ventura, S. Advances in the prediction of protein aggregation propensity. Current Medicinal Chemistry. (2017).
  28. Villar-Piqué, A., Ventura, S. Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).
  29. Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria. Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).
  30. Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. Linking amyloid protein aggregation and yeast survival. Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).
  31. Conchillo-Solé, O., et al. AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of "hot spots" of aggregation in polypeptides. BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).
  32. Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins. Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).
  33. Renner, M., Melki, R. Protein aggregation and prionopathies. Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).
  34. Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress. Redox Biology. 12, 699-711 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics