ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

Biochemistry
 

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Machen, A. J., O'Neil, P. T., Pentelute, B. L., Villar, M. T., Artigues, A., Fisher, M. T. Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e57902, doi:10.3791/57902 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אין ויוו, חלבונים הם לעתים קרובות חלק מתחמים גדולים macromolecular בו מחייב ירידה לפרטים, dynamics בסופו של דבר להכתיב פלטי פונקציונלי. בעבודה זאת, הרעלן גחלת pre-endosomal מורכבים, מעבר מיגדרי לתוך endosomal מורכבים. ראשית, תחום N-מסוף של ציסטאין מוטציה קטלנית פקטור (אםN) מחוברת ביוסנסור אינטרפרומטריה (בלי) biolayer דרך דיסולפידי צימוד בכיוון האופטימלי, המאפשר הגנה אנטיגן (PA) prepore לאגד (Kd 1 ננומטר). מכוונת בצורה אופטימלית אםN-PAprepore מורכבים ואז נקשר לקולטן מסיסים נימי morphogenic ג'ין-2 (CMG2) תא השטח (Kד 170 pM), וכתוצאה מכך מתחם טרום-endosomal נציג גחלת, יציב ב- pH 7.5. זהו מתחם שהורכב ואז נענשים acidification (pH 5.0) נציג של הסביבה אנדוזום מאוחר כדי המעבר של הרשות הפלסטיניתprepore למצב נקבובית ממברנה מוכנס. מצב זה של הרשות הפלסטיניתהנקבוביות תוצאות איגוד חלשה בין הקולטן CMG2, אםN-PA אתהנקבוביות , דיסוציאציה משמעותי של CMG2 של הנקבובית המעבר. Thio-ההחזקה של אםN השטח ביוסנסור זה מתהפך בקלות על-ידי dithiothreitol. הפחתת על פני ביוסנסור רבנות בלי משחרר את אםN-PAprepore-מתחם ternary CMG2 או החומצה מעבר מיגדרי אםN-PAהנקבוביות מתחמי microliter כרכים. מתחמי שפורסמו אז דמיינו, מזוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים וספקטרומטר מסה. ניסויים אלה מדגימים כיצד לפקח על פירוק/ההרכבה קינטי של מתחמי חלבון ספציפי באמצעות מתודולוגיות רבנות בלי ללא תווית ולהעריך את המבנה ואת זהותו של רבנות בלי אלה נאספו מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים והמסה מסות, בהתאמה, באמצעות הליכים רציף קל-כדי-שכפול.

Introduction

זיהוי והבנה יחודיות המסדירים חלבונים מורכבים הרכבה ויוו הוא עניין קיצוני לחוקרים הביוכימי. חלבון הטרוגנית גדולה הרכבות הם הנורמה ולא היוצא מן הכלל. מושג זה נתמך על ידי ניטור ספקטרוסקופיות ויוו האספה, לבודד את מתחמי באמצעות טכניקות הפרעה תא עדינה, הערכת מוצרים מ שיטות לטיהור המבוסס על זיקה והצגה של אותם באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (הקפאה-EM). כדי להבין את הפקד היחודיות הרכבה בתוך התא, החוקרים חייבים לבודד באופן שגרתי לזהות, בסופו של דבר לאפיין את המבנים דינמי הרכבה/פירוק. הכלי מולקולרית שימוש אינטנסיבי ביותר לזהות את מרכיבי מהרכבות אלה לעתים קרובות דורשת נוגדן מבוססי immunoprecipitation, אשר נשענת על שמירה על יציבות מורכבים במהלך לשבירת תאים. טכניקות אנליטיות בשילוב שונות פותחו לאחרונה כדי ללכוד מתחמי מדגימות תא שימוש בגישות microfluidic מבוסס, כגון משטח פלזמון תהודה (SPR). בעקבות הסרת של משטחים SPR, דגימות אלה נותחו על ידי לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון שעת הטיסה (MALDI-TOF)1,2. קידום מתודולוגיה זו משתמשת בפרוטוקול קל יאפשר לחוקרים להמחיש ולאמת מתחמי החזוי המתרחשים חצרו הסלולר. מאז SPR היא מערכת מבוססת מיקרופלואידיקה, בעיות לעיתים קרובות נובעים היווצרות צבירה. עקיפת הבעיה דורשת דילול לדוגמה, אשר בתורו, יכול להפחית את תקינות מכלולי ביולוגי עלול הריכוז.

התקדמות יחסית לאחרונה טכנולוגיות ללא תווית היא הפיתוח של מערכת אינטרפרומטריה (בלי)3biolayer. אלה מסוים השתקפות אור מבוססי מערכות שכפל, או עדיף לחקות, איגוד SPR ותוצאות קינטי בכל חלק של עלות3,4 במיוחד אם ערוץ אחד יחידות משמשות. מתה על מדידת שינויים בדפוסי משתקף הפרעות קלות בין שכבת אסמכתא (בקרה) על פני biolayer (ניסיוני). השינוי שנוצר בשלב נמדד בזמן אמת כמו readout קינטי, תפוקה5. פני השטח ביוסנסור, המכיל ספציפי בטקטיקות בדיקות, הביוכימיה, מועבר פיזית בין פתרונות ולא מאגר שינויים על ידי גישות microfluidic ב SPR, למדידה באמצעות גל שלב deflections. העברה המונית אפקטים תימנע מאת לזעזע את הפתרון. בניגוד SPR, מערכות אלו שימושיות למדי בהערכת קומפלקסים של דגימות ביולוגיות גולמי. הפרמטר הפיזי שנמדד במהלך הניסויים רבנות בלי בעיקר תלוי שינוי מסה או עובי על פני השטח ביוסנסור הנובעת הרכבה מורכב חלבון או פירוק.

אלה ביולוגיים סיב אופטי סיבים הם קל לשימוש וזולה יחסית. אחד ההיבטים שימושי המתעוררים של רבנות בלי הוא הסרת נתיישב חלבון שהורכב מתחמי מפני השטח. יישום האחרונות של שיטה זו אפשרה את המעבדה שלנו כדי לבחון את קינטיקה בזמן אמת של pH בקנה מידה גדול המושרה שחלוף חלבון מבנה של הרכיב מגן אנטיגן (PA) של הרעלן גחלת כמו prepore (הרשות הפלסטיניתprepore) לקביעת שלה טופס נקבובית (הרשות הפלסטיניתהנקבוביות). מעבר זה בקצה ביוסנסור אומתה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM)6. הסרה של קומפלקסים של משטחים ביוסנסור מונע נפח גדול יותר דילול אפקטים לעתים קרובות שאירעה בעת שחרור קומפלקסים של שבב משטחים בעת שימוש מיקרופלואידיקה מערכות.

בשנת העבודה הנוכחית, גחלת הרעלן מתחמי הם מורכבים, לפרק על פני ביוסנסור ושוחררתי microliter כרכים הרכיבים המורכבים וכתוצאה מכך מאומתות באמצעות orthogonally EM וספקטרומטר מסה (MS).

Protocol

1. הרכבה של קומפלקסים Macromolecular מוגדר על משטחים ביוסנסור אינטרפרומטריה Biolayer (בלי)

  1. הרכבה של הרעלן אנתרקס prepore מורכבים על משטח ביוסנסור תגובתי אמין PDEA-השתנה
    1. מימה אמין תגובתי השני דור (AR2G), רבנות בלי ביוסנסור עצה ב 250 µL של מים במשך עשר דקות.
    2. התוכנית שלב זמני, המפורטים טבלה 1, על תוכנת השליטה היחידה רבנות בלי (ראה טבלה של חומרים).
    3. להתחיל את רבנות בלי לרוץ במועט הטיפ ביוסנסור במים µL 250 למשך 30 s כדי למדוד את התוכנית הבסיסית הראשונית של ביוסנסור עובי וצפיפות.
    4. להפעיל את החיישן במועט הטיפ לתוך µL 250 מ מ 50 NHS (N-hydroxysuccinimide) ו-200 מ מ EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) במשך שבע דקות.
    5. לטבול את החיישן שהופעל ב 50 מ מ PDEA (מומס מאגר בוראט 0.1 M (pH 8.5) למשך 5 דקות ליצור משטח תיול-תגובתי שהופעל על 2-(2-pyridinyldithio)ethanamine).
    6. לטבול את החיישן שהופעל תיול-תגובתי לתוך µL 250 של פתרון המכיל 100 ננומטר E126C אםN ב- 10 מ מ סודיום אצטט pH 5.0, 100 מ מ NaCl, מאגר למשך 5 דקות.
    7. לטבול את הטיפ אםN ב- 50 מ מ L-ציסטאין, 1 M NaCl, 0.1 M סודיום אצטט, pH 5.0, 4 דקות, כדי להרוות את כל שאר תגובתי חינם תיול-תגובתי קבוצות.
    8. לטבול את הטיפ אםN quenched ב 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl למשך 2 דקות להקים מאגר בסיסית.
    9. לטבול את הטיפ אםN quenched לתוך prepore אנטיגן מגן 0.5 מיקרומטר (הרשות הפלסטיניתprepore), 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl למשך 5 דקות כדי ליצור את אםN-PAprepore מורכבות.
    10. פעם אחת קשורה הרשות הפלסטיניתprepore , להסיר את הטיפ של הפתרוןprepore הרשות הפלסטינית, לטבול את הטיפ לתוך 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl למשך 30 שניות לשטוף את כל הרשות הפלסטינית מאוגד הלא ספציפיתprepore.
    11. לטבול את אםN-PAprepore מורכבים לתוך 0.5 מיקרומטר קולטן CMG2 (ללא התחום transmembrane), 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl, למשך 5 דקות.
    12. לטבול אםN-PAprepore -CMG2 מורכבים לתוך 50 מ"מ טריס, 50 מ מ NaCl למשך 30 שניות כדי לשטוף את כל CMG2 לא מאוגד לטופס pre-endosomal מתחם.
    13. לניתוח EM, לשחרר את אםN-PAprepore-CMG2 מורכבים מהקצה ביוסנסור במועט הטיפ לתוך µL 5 של 50 מ מ DTT, 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl, בתוך צינור ה-PCR.
    14. לניתוח טנדם MS של פפטידים מהמתחם, לשחרר את אםN-PAprepore-CMG2 מורכבים מהקצה ביוסנסור במועט את החיישן לתוך 5 µL 50 מ מ DTT, 6 מ' צינור GuHCl (ללא קרטין,) 25 מ מ אמוניום ביקרבונט pH 8.0 בתוך ה-PCR . זה מתבצע על ביוסנסור שונה מזו המשמש לניתוח EM.
  2. הרכבה של רעלן גחלת נקבוביות מורכבים על השטח ביוסנסור תגובתי אמין PDEA-השתנה
    1. כדי להציג את המתחם לאחר המעבר המיגדרי pH, לבצע צעדים 1.1.1-1.1.12 בסעיף הקודם כדי ליצור את אםN-PAprepore-מתחם CMG2.
    2. לטבול את הטיפ ביוסנסור לתוך אצטט 10 מ מ pH 5.0 למשך 5 דקות ליזום את המעבר של הרשות הפלסטיניתprepore למעברהנקבוביות הרשות הפלסטינית. מעבר זה מסומן על ידי הגדלת משרעת (כ 0.2 ננומטר) ולאחריו ירידה משרעת גדולה יותר כך המשוערות להיות דיסוציאציה קולטן משמעותי או מלא בשל פחת זיקה מחייבת.
    3. לטבול אםN-PAהנקבוביות עצה ב- 50 מ"מ טריס, 50 מ מ NaCl, pH 8.0, במשך 30 שניות לשטוף את מאגר חומצי.
    4. עבור המדגם ניתוח EM, לטבול את הטיפ ביוסנסור לתוך פתרון המכיל הקזאין 1.25 מ"מ (2.5 מ"מ MSP1D1, 25 מ מ נה-cholate, מ מ 162.5 POPC) למשך 5 דקות למנוע צבירת בפתרון לאחר הפרסום דיסולפידי.
    5. לניתוח EM, שחרור אםN-PAנקבובית -מיצלה מורכבים מהקצה ביוסנסור במועט הטיפ לתוך µL 5 של 50 מ מ DTT, 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl בתוך צינור ה-PCR.
    6. עבור ניתוח MS טנדם פפטידים מן המתחם, לשחרר את אםN-PAהסוס מורכבים (אין מיצלה) מ החיישן עצה במועט את החיישן לתוך 5 µL 50 מ מ DTT, 6 מ' GuHCl (ללא קרטין,) 25 מ מ אמוניום ביקרבונט pH 8.0 בתוך ה-PCR שפופרת. זה מתבצע על ביוסנסור שונה מזו המשמש לניתוח EM.

2. להמחיש ואימות שוחרר הרכבות Macromolecular של רבנות בלי ביולוגיים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי

  1. זוהר פרוק רשת Cu 300 מצופים פחמן. זוהר טיפוסי פריקה הגדרות הן 0.38 mBar אטמוספירה יציבה לחץ שלילי mAmps 15, 20 שניות, ואז אוורור עם אוויר.
  2. רשת מאובטחת בין זוג מלקחיים נקי.
  3. פיפטה µL 4 מדגם מורכבים שפורסמו ב- PCR צינור אל הרשת ומאפשרים ספיחה של שנות השישים.
  4. לפתיל משם שנותרו נוזלי עם טריז נייר סינון.
  5. כתם הרשת על-ידי pipetting 5 µL של 0.75% מיקרון 0.02 נקודות מסונן uranyl formate ו הפתילה הכתם עודף משם לאחר 5 שניות. לאפשר רשת לייבוש בטמפרטורת החדר.
  6. תצוגה צבעונית מדגם רשתות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

3. זיהוי של מלאה טרום-endosomal אנתרקס הרעלן מורכבים (אםN-Paprepore-CMG2), מעבר מיגדרי מורכבים (אםN-Paהנקבוביות ללא CMG2) באמצעות ספקטרומטר מסה.

  1. לדלל דגימות שפורסמו 20 µL, תקופת דגירה של שעה.
  2. הוסף µL 2 iodoacetamide 55 מ מ, 25 מ מ אמוניום ביקרבונט, pH 8.0, ולאחר תקופת דגירה של שעה בטמפרטורת החדר בחושך (מכוסה ברדיד אלומיניום).
  3. לדלל את הדגימה עם 100 µL של 25 מ מ אמוניום ביקרבונט, pH 8.0, כדי להפחית את ריכוז הידרוכלוריד guanidine מתחת 1 מ'.
  4. מוסיפים 5 µL של רצף כיתה ששינה טריפסין-20 ng/µL, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. להוסיף חומצה אצטית בריכוז 5% כדי להפחית את רמת ה-pH ל הסופי < 3, ואז להפחית את נפח כדי µL 10 במיכשור.
  6. העבר את הפתרון פפטיד לשולחן ההנהלה הדגימה על תעשיה של uHPLC 1200 nLC.
  7. לטעון µL 5 הפתרון פפטיד על עמודה שלב הפוכה uHPLC רכוב על הבמה יינון של MS.
  8. רחץ עמודה עם 15 µL 0.1% חומצה פורמית בקצב מרבי של 5 ממוצעL/min ו/או לחץ מרבי של 800 psi.
  9. Elute פפטידים מן העמודה סי18 הפוך-פאזי בספיקה של nL 350/דקה על פני תקופה 90 דקות שימוש הדרגתי לינאל של 5% עד 40% של הממס B ב- A + B (חומצה פורמית 0.1% ת הממס; הממס ב': 95% acetonitrile עם 0.1% חומצה פורמית).
  10. לנתח פפטידים eluting על קו באמצעות טנדם MS.
    1. קבע את מקור יינון וולט 2500, יון טמפרטורה העברת ל 250 מעלות צלזיוס.
    2. לנתח את ספקטרומטר מסה תחת בקרה אוטומטית כדי לבצע סריקה MS באופן רציף אחד ואחריו טנדם רבים MSMS ככל האפשר תוך תקופה s 3, באמצעות CID ואנרגיה התנגשות המנורמל של 35.
  11. לזהות מרכיבים פפטיד, חלבון תוך שימוש בשיטות הרגילות. לעבודה זו, בוצעו שתי ערכות של פפטיד וניתוח חלבון.

Representative Results

היכולת לפקח ולאמת ההרכבה של מתחמים גדולים macromolecular היא צעד מכריע לקראת הבנה של ירידה לפרטים והפונקציונליות של מכלולים גדולים למערכות ביולוגיות. התוצאות מהשיטות שהוצגו במסמך זה להפגין הקלות אשר מתחמי חלבון גדול (> 150 kDa המוני) יכולים להיות מורכבים באמצעות אינטרפרומטריה biolayer, כל זאת תוך מעקב אחר קינטיקה של משרעת של הרכבה. טיבה קומפקטי של פני השטח ביוסנסור מאפשר ניתוח מכלול להתרחב על ידי שחרור מתחמי התאספו לתוך microvolumes קטן. אלה microvolumes יכול לשמש כדי להמחיש את המבנה הפיזי הראשוני של מתחמי באמצעות EM וכדי לאמת את הזהות של הרכיבים המורכבים באמצעות MS. סקירה סכמטי של התהליך הזה מוצג באיור1.

רכיב מפתח עבור הרכבה מוצלח ו אימות של מתחם macromolecular על פני השטח ביוסנסור כרוך הכיוון הנכון של החלבון זרע הראשונית. פעולה זו מבטיחה כי האתרים אינטראקציית חלבון-חלבון הם נגישים, לא sterically חסומים, והוצבו בצורה אופטימלית מהמשטח ביוסנסור. כפי שמוצג באיור2, הכיוון הנכון של הרעלן גחלת מורכבים מושגת באמצעות קטע N-מסוף מהונדסים במיוחד של גורם קטלני (אםN) אז תמיד ממוקם אתר איגודprepore אםN-PA ההפך של6,7באתר המצורף קוולנטיות ביוסנסור. הצטברות עוקבות של המתחם עם קשירה של הרשות הפלסטינית החיישן אםN רבנות בלי ואחריו מסיסים CMG2 מחייב את הרשות הפלסטינית יוצרת בסופו של רעלן גחלת המוסמכת רוברטסונית מורכבים.

המעקב אחר sensogram של רבנות בלי הוא קריאה בזמן אמת מתוך השינויים משרעת בשל תוספת ספציפית של הרכיבים הרעלן גחלת בעת הוספתן על גבי החיישן. איור 3 מראה שעקבות נציג לזווג עם דגם של המתחם חזה לטופס זה שלב בתהליך. העלייה הראשונה היא אםN על הטיפ. לאחר שכבתה בסיסית, הרשות הפלסטיניתprepore ואז נקשר אםN ואחריו התוספת של הקולטן CMG2 מסיסים וכתוצאה מכך המתחם שהורכב pre-endosomal של הרשות הפלסטינית - אםNprepore-CMG2. להתקדם לעבר הסביבה אנדוזום מאוחר, המתחם כולו נענשים דופק pH נמוך (pH 5.0) אשר מחליש את קולטן איגוד, ומאפשר את prepore כדי המעבר שלה קונפורמציה נקבובית מורחבת ממברנה מוכנס. 6 Sensogram עקבות הצעד acidification מוצגים באיור4. הגידול הראשוני או "ספייק" משרעת הוא כנראה סיומת נקבובית6 חייב להתרחש לפני הירידה האיגוד הקולטן CMG2. הירידה משרעת גדולה יותר היא ככל הנראה דיסוציאציה קולטן משמעותי או מלא בשל זיקה מחייבת מופחתת. העבודות הקודמות במעבדה הצביעו CMG2 מחייב מורחב במלואו הרשות הפלסטיניתהנקבוביות הוא זניח לעומת האינטראקציהprepore 6CMG2-PA. בנוסף, הסימן sensogram קינטי, הנהוגות בכל sensograms של הרשות הפלסטינית - אםNprepore-מעברים CMG2 אםN-PAהנקבוביות עם ירידה pH, נגמר לשחזור פועל מרובים.

לפני ואחרי acidification, מתחמי ביוסנסור מצורף משתחררים בקלות עבור ויזואליזציה מאת כתם שלילי EM וזיהוי על ידי MS (איור 5). מתחמי נציג את התוצאות EM מוצגים באיור 6. רשתות דוגמת Pre-endosomal, להראות צפיפויות בקנה אחד עם מתחמי ternary שלם המורכב אםN-PAprepore-CMG2. פוסט-acidification רשתות מורכבות, להראות הרשות לקביעת הנקבוביות, solubilized על-ידי הכללתם מיצלה אין צפיפות CMG2 ברור.

זהותם של קדם ואת מתחמי acidification שלאחר אומתו על ידי MS. מסד נתונים שבו הרצפים של הרשות הפלסטינית, P13423; אםN, P15917; CMG2, P58335 שהיו כלולים ברקע של מסד נתונים חלבונים העכבר נגזר מהמאגר NCBInr. רק את החלבונים של עניין, התקבלו חיפוש במסד הנתונים הראשון זה, עם כיסוי חומצת אמינו הבאים עבור מתחמי ternary ו בינארי: 54%, 22% עבור הרשות הפלסטינית, 36% ו 6% עבור אם ו- 43% עבור CMG2, בהתאמה (CMG2 לא זוהה על המתחם בינארי). על מנת למקסם את הכיסוי חומצת אמינו חלבון, מזהה/אלקטרופיזיולוגיה השני התבצע בעזרת חלבון מסד נתונים המכיל רק את החלבונים שלושה עניין. Pre-endosomal MS דגימות הכיל פפטידים של כל הרכיבים הרעלן שלושה עם 60.46%, 67.97% 54.15% כיסוי עבור אםN, הרשות הפלסטינית CMG2, בהתאמה (איור 7). פוסט-endosomal תוצאות, המוצגת באיור 8, הכיל רק פפטידים אםN ו הרשות הפלסטינית (כיסוי 57.41% ל- 67.79%, בהתאמה). חוסר CMG2 הדגימות פוסט-endosomal עקביים עם הירידה nm רבנות בלי נצפתה במהלך היווצרות הנקבובית.

Figure 1
איור 1. סקירה סכמטית לניתוח של מתחמי חלבון על ו מבודד ביוסנסור רבנות בלי שימוש EM וגב' אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2- ביוסנסור הפעלה: הצעד הראשון הרכבה ספציפיות התמצאות על רבנות בלי ביוסנסור. התחום גורם קטלני E126C N-מסוף, (אםN) מקושר באמצעות יצירת ממשקprepore מחייב כראוי orientated של הרשות הפלסטינית הצמדה thio. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3- פיקוח על גחלת הרעלן הרכבה ופירוק עם רבנות בלי: sensogram מציגה שינויים משרעת כפונקציה של הזמן בשל תוספת ספציפית של האנטרקס הרעלן רכיבים בעת הוספתן על גבי החיישן מתחילה עם טעינת אםN (שלב 4 ב טבלה 1). הרשות הפלסטיניתprepore טעון ואז על גבי המשטח ואחריו התוספת של הקולטן CMG2 מסיסים. המתחם שהורכב pre-endosomal מורכב אם-PAprepore- CMG2. להתקדם לעבר הסביבה אנדוזום מאוחר, להרכיב כל גחלת פונקציונלי הרעלן הוא נתון דופק pH נמוך (pH 5.0) אשר מחליש את קולטן איגוד, ומאפשר את prepore כדי המעבר שלה קונפורמציה נקבובית מורחבת ממברנה מוכנס. חשיפה של קרום פורש נקבובית אישר, solubilized על ידי תוספת של הקזאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4. מתה על sensogram של שחרור CMG2: עקבות הצעד acidification להראות עלייה ראשונית או "ספייק" משרעת ולאחריו ירידה משרעת גדולה יותר שסביר הנקבוביות היווצרות של קולטן דיסוציאציה, בהתאמה. קווים אנכיים אדום מנוקד מציינות התחלה של צעד חדש. Sensograms מיושרים על מודגש המנוקד קו אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. ב ו ניתוח מתחמי חלבון מבודד ביוסנסור רבנות בלי שימוש EM ו- MS: ביוסנסור מתחמי המצורפת משתחררים בקלות אל µL 5 מאגר המכיל DTT ויזואליזציה מאת כתם שלילי EM וזיהוי על ידי גב' אנא לחץ כאן כדי הצג גרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

Figure 6
איור 6- ויזואליזציה של מתחמי חלבון עם EM: רשתות דוגמת Pre-endosomal, להראות צפיפויות בקנה אחד עם מתחמי ternary שלם המורכב אםN-PAprepore-CMG2. רשתות מורכבות פוסט-endosomal, להראות הרשות לקביעת הנקבוביות, solubilized על ידי מיצלה עם אין צפיפות CMG2 ברור. דגמים של מתחמי החזוי (בצד שמאל) נמצאים באותו הסולם כמו חלקיקים בודדים המוצג. חלקיקים שנצבעו החזוי חלבון (בהתבסס על הגודל של צפיפות EM) מוצגים להלן כל חלקיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7. אימות של מתחמי חלבון עם MS: Pre-endosomal MS דגימות הכיל פפטידים של כל הרכיבים הרעלן שלושה עם 60.46%, 67.97% 54.15% כיסוי עבור אםN, הרשות הפלסטינית CMG2, בהתאמה. פפטידים זוהה שיעור גילוי שקר (פד) שווה או גבוה מ-5% שמוצג צהוב, פד ר שווה או גבוהה מ- % 1 מוצגים בירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8. אימות של מתחמי חלבון עם MS: פוסט-endosomal פפטידים דגימות הכיל אםN ו הרשות הפלסטינית (כיסוי 57.41% ל- 67.79%, בהתאמה), אך לא CMG2. רוזוולט שווה או גבוה מ-5% שמוצג צהוב, פד ר שווה או גבוהה מ- % 1 מוצגים בירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שלב הזמן (s) תיאור
1 30 התוכנית הבסיסית הראשונית
2 420 הפעלה
3 300 הפעלה
4 300 אםN טעינה
5 240 ציסטאין כבאות
6 120 תוכנית בסיסית
7 300 הרשות הפלסטיניתprepore האגודה
8 30 תוכנית בסיסית
9 300 עמותת CMG2
10 30 תוכנית בסיסית
11 300 המעבר חומצה
12 30 תוכנית בסיסית
13 300 מיצלה האגודה

טבלה 1- שלב זמני עבור יחיד רבנות בלי נוסעות הרכבה גחלת הרעלן מורכבים. שימו לב כי תוכניות בסיסיות משמשים כדי לשטוף את החלבון לא מאוגד מהשלב הקודם ו/או להקים קו בסיס מאגר חדש.

Discussion

ההדגמה ממחיש כיצד היווצרות מורכבות macromolecular ניתן בקלות לנטר שימוש אינטרפרומטריה biolayer, visualized באמצעות EM, ואומתו עם MS, כולם עם microvolumes בפרק זמן קצר. מתחמי שנצפה בצע את התחזיות רלוונטי מבחינה ביולוגית, אימות נוסף מתודולוגיה זו משולב והאסיפה מבנית. כפי שצוין במקטע תוצאות, רכיב המפתח להצלחה הרכבה דורש ציסטאין מהונדס בצורה רציונלית מוטגנזה מכוונת כדי להבטיח כי הממשקים חלבון מורכב כהלכה אוריינטציה מהמשטח ביוסנסור.

מערכות קודמות יש להשתמש בטכניקות רבנות בלי ו- MS כדי להעריך חלבון מחייב של שניים או שלושה מערכות רכיבים, כמו גם שלמות של קולטן איגוד של ביטוי חלבון, אבל, בשני המקרים, השיטות פותחו לא לנצל טנדם EM/MS הגישה8,9. רק אחרים אינטרפרומטריה מערכת בשילוב ניתוח MS כדי לסייע לאפיין את האינטראקציות היה כפול-קיטוב אינטרפרומטריה10 למרבה הצער, מערכת זו היא כבר לא זמין לשימוש כללי. כאמור במבוא, היו מספר מחקרים שהושלמו איפה הדגימות היו שהוקמה על משטחים כמו SPR ביוסנסור והוסרו מניתוח MS. אף אחת הדוגמאות האלה גרמו מתחמי visualized באמצעות EM.

המגבלות של רציפים בשיטה זו יכולים להיות רבים אבל פתיר. כדי להפוך את הנייח הראשוני ולכן קרן שלב של ההרכבה, חוסר הידע של משטחים אינטראקציה מבניים בהחלט לעכב התקדמות המשויך פיקוח על שלבי ההרכבה הראשונית. חוסר מידע מבנה ניתן לטפל על-ידי עיצוב תעשייתי של קרן לבנות איפה מצורף בדיקות, הביוכימיה (למשל sulfhydryl moiety דיסולפידי קישורים / שלו מתויג מיצוב) ניתן להעביר אזורים שונים בתוך תוכו מערכת הרכבה. במקרה של הרעלן גחלת מורכבים, זה היה מזל כי המבנה של אםN מאוגדים הרשות הפלסטיניתprepore הוא זמין11. מיקום רציונלית ציסטאין מהונדסים מקומי אזורי ', מהפנים איגוד 'prepore ' הרשות הפלסטינית. עם בדיקות, הביוכימיה הצמדה ציסטאין, עדיף כי אין cysteines תגובתי אחרים נמצאים על פני חלבון.

יש בדיקות שונות מצורף, הביוכימיה אשר יכול לשמש כדי להנדס מצורפים מסוים באתר על המשטחים של חלבון. אחד הקבצים המצורפים ספציפי הפופולרי ביותר כרוך מיצוב של ביוטין moiety במיקום מוגדר באופן ספציפי על פני שטח חלבון12. למרבה הצער, ביוטין איגוד streptavidin או אבידין מצופה משטחים די הדוק. היפוך של אינטראקציה הכריכה אינה פשוטה. השימוש מהונדסים שלו-תג-או C-אמיני וקלות עוקבות של קובץ מצורף משטחים Ni-נ הוא יישום אוניברסלי יותר של זיקה הנייח. כמובן, אחד ההליכים לאתרים המצורפים הרכבה הנדסה במערכות שלו מתויג היא הדרישה טרמיני N ו- C של החלבון הרכבה הליבה להישאר חשוף ומופרדים כך הקובץ המצורף הוא קל. כמו עם כל מכלול התהליכים, הממשק האינטראקציה של החלבון הרכבה הליבה חייבת להישאר זמין בהמשך מכלול מורכבים.

אולי החשש הנפוצה ביותר של שימוש ביוסנסור בדיקות משטח, הביוכימיה הוא מחייב שאינם ספציפיים. טיפים Streptavidin לעיתים קרובות מקור של אפקטים משמעותיים שאינם ספציפיים מחייב. דיסולפידי מקושרים ביוטין יכול לשמש כדי לשחרר את מתחמי ספציפית מאוד להשאיר מאחור את הצמדה S-ביוטין מופחתת הלחוצים streptavidin קיבוע ביולוגיים13. ישנם אחרים בדיקות הפיך, הביוכימיה הופכים זמינים כגון iminoboronates ו- ketoamide במידה פחותה14. שדה זה הוא כרגע לא מפותח, אבל יש ריביות גבוהות בפיתוח נוסף הפיך קוולנטיות פרוטוקולים כדי למנוע תופעות רעילות התרופה את המטרה המלוות נפוץ השימוש של פיתוח תרופות יישוב קוולנטיות.

הגבלה של שימוש EM כדי להמחיש מתחמי היא פרשנות, במיוחד במקרים שבו המבנים של מתחמי שהורכב לא בתחילה ידועים. ניתן לזהות את המיקום המרחבי של רכיבים בתוך קומפלקס macromolecular התאספו לא מוגדר באמצעות נוגדנים חד-שבטיים (mAb) כסמני קינטי ומבניים ספציפיים. לדוגמה, ברגע זה נוצר קומפלקס, נוגדנים חד-שבטיים יכולים להתווסף זה לאגד רכיבים ספציפיים. בשיטה זו נעשה שימוש תכוף כדי לזהות רכיבים ספציפיים בתוך מכלולים גדולים15ב EM. מגבלה נוספת קשורה לגודל של המתחם, אמנם היו מקרים שבו מוגדר סימטרי הרכבות קטנה כפי kDa 70 (GroES heptamer) הם בקלות נפתר באמצעות שלילי הכתם EM מתחמים מורכבים הם נותחו על ידי EM בדרך כלל בטווח גודל של ~ 100 Å בקוטר ומעלה. לאחרונה אולם, חלבונים קטן כמו 20 kDa כבר נפתרה, ברזולוציה נמוכה מבנים הושגו בעת שימוש מעולה מכתים מתודולוגיות16.

לניתוח MS, רגישות מוגברת מכשור MS הנוכחי עד לרמת femtomolar (attomoles) יכול במקרים מסוימים להגביר את הרגישות של רבנות בלי זיהוי. . זה מאוד מתקבל על הדעת כי אותות חלבון להראות עלייה amplitudes מינימלית אבל הדיר תגרום זיהוי של החלבון המדובר. בנוסף, חיטוט אינטראקציות חלבון-חלבון עם אחד מבני הזוג המחובר את החיישן והשני וחשש הסלולר בתוקף תגרום טיהור וזיהוי לאחר מכן קל של המתחם שהוקם. מגבלה אחת עלולים להיות שנצפו עם מערכות MS מאוד רגיש הנוכחי הוא החלבון של עניין ייתכן במסד הנתונים, אבל התבוננות זו היא נדירה (למשל, proteomes של מינים נדירים). אם הרצף של החלבונים עניין ידועים, בעיה זו נפתרה בקלות על ידי הכללת את רצף חומצות אמיניות protein(s) רקע חלבון מסד נתונים (כמתואר בעבודה זו במקטע לפרוטוקול). הגבלת פוטנציאל אחר התוצאות מתודולוגיה מן ההתנגדות של חלבון כדי trypsinolysis. טריפסין העיכול היא בדרך כלל שיטת ברירת המחדל עבור התחתון למעלה זיהוי חלבונים. עם זאת, חלבונים יכול להיות עמידים בפני טריפסין אם חסר להם שאריות Arg, ליס או גישה משקעים אלה מוגבלים על ידי המבנה מקופל. מגבלות אלה נפתרות, בהתאמה, באמצעות אלטרנטיבית או שילוב של פרוטאזות או כולל של ריאגנט התגלגלות (אוריאה או guanidine HCl, כפי שמעידה 1.1.14 ו 1.2.6) לפני עיכול אנזימטי.

הרחבות אפשריות של מתודולוגיה זו כוללים המאפשר למשתמש לעקוב ולזהות מכלולי הרכבה הסלולר מ lysates תאית גסה. מתברר בדיקות עבור מכלול הרכיבים השונים תמציות מרוכז הסלולר הוא קל לביצוע באמצעות ההליכים אינטרפרומטריה biolayer. בניגוד מתודולוגיות microfluidic הנפוצות מבוסס אשר נוטה סתימת רגישים צבירה, הגישה רבנות בלי יכול לשמש ישירות לטבול biolayer חיישן טיפים לתוך תמציות גולמי להרכיב באופן פוטנציאלי את מתחמי ספציפיים, ישירות אלה מרוכזים דגימות טהורות. ברגע התכנסה, זה ריאלי לחלוטין לשימוש הגששים נוגדן ספציפי מעקב המערכת רבנות בלי לזהות, אפילו quantitate חשד רכיבי תמציות הסלולר שזוהו באמצעות שיטת microvolume MS. שוב, המפתח כאן היא שימוש מוגדר, אוריינטציה כראוי ליבה חלבונים כמו אחווה מסוימות רגשים.

היכולת להציג את prepore כדי הנקבוביות תהליך המעבר kinetically עם רבנות בלי יהיה מאוד שימושי לזיהוי פוטנציאל "נוגד רעל" מעכבי מולקולה קטנה של המעברים חלבון ספציפי לתפקד תחת מאוחר endosomal, pH נמוך (5.0) תנאים. זה prepore pH המושרה על הנקבוביות המעבר מעוכבת בנוכחות קיפול מייצב (osmolytes) כגון גליצרול או סוכרוז, משאיל ובכך תמיכה חזקה לפיתוח מייצבים מתקפלים יישוב מסוים למנוע הרשות הפלסטינית היווצרותהנקבוביות . גישה ספציפית זו מונע והחלפת מבחני גולמי מבוססות, איפה ה-pH יורדת להוביל חלבון משקעים. השיטה השנייה, למרות טוב עבור שיטות prescreening הראשית, מובילה לעיתים קרובות תוצאות חיוביות שגויות איפה תרכובות מסוימות לעכב את המצבור במקום המעברים מולקולרית בפועל.

התצפיות במורד הזרם של מבנה וזיהוי של רכיבים מורכבים בודדים בתוך דגימות microvolume קטן יכול להיות שימושי גם אימות פוטנציאל להוביל תרכובות. זה יכול להיות מיושם במקרים מייצב הרכבה ספציפיים או הקשורה איפה התוצאה היעד. גישה מקבילה זו קינטי/מבנה/זיהוי שימושית ישירות המאשרת את תוקפו של עופרת חשד effectors תרכובת של הרכבה ומגישה שלב ההקרנה משנית סביר או גישה תפוקה בינונית.

הקפאה-EM היא טכניקה שימושית ללמוד את הפרטים אטומי של מתחמי מקרומולקולה במצבים שונים של הרכבה. לפני הכנת דוגמאות הקפאה-EM, חשוב לוודא קודם שהכנה מכיל מתחמי הומוגנית למדי טהור עם כתם שלילי EM. העבודה שהוצגו במסמך זה מדגים הרכבה של חלבון תסביכים על רבנות בלי ביוסנסור משטחים, שחרור של אלה מתחמי להמחשת EM, וזיהוי מרכיבים אלה באמצעות MS. מתודולוגיה זו מסוים של הרכבה מבוקרת ושחרור יכול להיות שימושי ביצירת פרוטוקולים מאוד ספציפיים המשפרים את הכנת הדוגמא רציפים הומוגנית על כתם שלילי EM, צעד הכרחי כי חייב להיות הפגינו לפני מתקדמים. הקפאה-EM. כדי לקבל מבנה תלת-ממד ברזולוציה נמוכה, רק 30-50 חלקיקים של המתחם יהיה צורך לבצע סדרה הטיה חרוט (70 תצוגות שונות תמונה דו-ממדית לכל חלקיק) בתנאי שיש גיוון התמצאות (מספר תצוגות שונות).

לגבי שיפור שיטות MS, ההתקדמות רגישות, צמצום נפח דגימה להמשיך לשפר. ננו זורם, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה במיוחד וכן פיתוח ספקטרומטרים המוני עם חובה מהר מחזור, רגישות מוגברת ופתרון כוח. היכרות האחרונות ספקטרומטר מסה orbitrap, בפרט הגירסה העדכנית ביותר (orbitrap Fusion Lumos, ו היורשת הצפוי Lumos פיוז'ן Orbitrap 1 מ'), כמו גם אלגוריתמים של חיפוש מאוד להקל על תהליך זה.

המתודולוגיה הנוכחי מנטרת את קינטי הרכבה ופירוק של גחלת הרעלן רכיבים באמצעות מתודולוגיות רבנות בלי ללא תווית, ערך את המבנה ואת זהותו של רכיבים אלה באמצעות EM ו- MS, בהתאמה. השימוש של ערוץ אחד פשוט מתה על המערכת יחד עם שלילי מכתים EM ניתוח שגרתי, טכניקות MS יסודי יותר הולם לאפיין תהליך ההרכבה.

Disclosures

אין גילויים בשלב זה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מדיסון ו ליילה העצמי בוגר אחווה (ליאורה מאור), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC ביו מחקר הכשרה תוכנית (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), KU גישור קרנות, את (מרכז טכנולוגיות אינטראקציה Biomolecule (BITC) גרנט CT ו MTF). המחברים רוצה להודות Fegley ברברה KUMC מיקרוסקופ אלקטרונים הליבה לקבלת סיוע עם רכישת תמונת TEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC) Thermo Scientific 22980
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA) GE Lifesciences BR100058
0.5 mL black microtubes Sigma-Aldrich Z688304-500EA
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti 850457C-25mg
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å ThermoFisher Scientific 164561
Acetic acid glacial Fisher A38SL-212
Acetonitrile Fisher A955-4
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips Forte Bio 18-5092
Ammonium bicarbonate Fisher A643-500
Anotop 10 syringe filter, 0.02um GE Lifesciences 6809-1002
BLItz System Pall Forte Bio 45-5000
Boric acid Fisher Scientific 10043-35-3
Capillary Morphogenic Gene-2 Protein produced and purified in-house
Carbon coated Cu 300 grid Electron Microscopy Sciences CF300-CU-50
Dithiothreitol (DTT) GoldBio DTT25
Formic acids JT Baker 0129-01
Guanidine hydrochloride (GuHCl) Sigma-Aldrich G4505-100G
Iodoacetamide MP-BioMedicals,LLC 100-351
JEM-1400 Transmission Electron Microscope JEOL
L-cystiene hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich C121800-5G
Lethal Factor N-terminal domain Protein produced and purified in-house
MS software version 2.2 ThermoFisher Scientific
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 090M14531V
Orbitrap Fusion Lumos ThermoFisher
PCR tubes ThermoFisher Scientific AB-0620
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system Ted Pella, Inc 91000
Protective Antigen prepore Protein produced and purified in-house
Qualitative filter paper circles Fisher Scientific 09-795C 5
Sequencing grade modified trypsin Promega V5111
Sequest HT search engine ThermoFisher Scientific
Sodium acetate trihydrate Fisher Scientific BP334-500
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Sodium cholate Sigma-Aldrich C1254-100G
Tris base Fisher Scientific BP152-10
Uranyl formate (UF) Electron Microscopy Sciences 22450
Xcalibur ThermoFisher Scientific OPTON-30487

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis. Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).
  2. Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis. The Analyst. 137, 386-392 (2012).
  3. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).
  4. Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Analytical Biochemistry. 172-180 (2009).
  5. Pall. BLI Technology. Available from: http://www.fortebio.com/bli-technology.html (2018).
  6. Naik, S., Brock, S., Akkaladevi, N., Tally, J., McGinn-Straub, W., Zhang, N., Gao, P., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., Fisher, M. T. Monitoring the kinetics of the pH-driven transition of the anthrax toxin prepore to the pore by biolayer interferometry and surface plasmon resonance. Biochemistry. (2013).
  7. Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs. Protein Science. 22, 492-501 (2013).
  8. Jin, H., Cantin, G. T., Maki, S., Chew, L. C., Resnick, S. M., Ngai, J., Retallack, D. M. Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens. Protein Expression and Purification. 78, 69-77 (2011).
  9. Yamniuk, A. P., Edavettal, S. C., Bergqvist, S., Yadav, S. P., Doyle, M. L., Calabrese, K., Parsons, J. F., Eisenstein, E. ABRF-MIRG benchmark study: Molecular interactions in a three-component system. Journal of Biomolecular Techniques. 101-114 (2012).
  10. Moore, J. D., Perez-Pardo, M. A., Popplewell, J. F., Spencer, S. J., Ray, S., Swann, M. J., Shard, A. G., Jones, W., Hills, A., Bracewell, D. G. Chemical and biological characterisation of a sensor surface for bioprocess monitoring. Biosensors & Bioelectronics. 26, 2940-2947 (2011).
  11. Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. G., Williams, E. R., Krantz, B. A. Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers. Nature Structural & Molecular Biology. 17, 1383-1390 (2010).
  12. Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Site-Specific Protein Labeling: Methods and Protocols. 171-184 (2015).
  13. Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry. Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).
  14. Bandyopadhyay, A., Gao, J. Iminoboronate-based peptide cyclization that responds to pH, oxidation, and small molecule modulators. Journal of the American Chemical Society. 138, 2098-2101 (2016).
  15. Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding. The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).
  16. Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research. Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics