गतिशील प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण पर इकट्ठे हुए और बायोमास स्पेक्ट्रोमेट्री और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर परत Interferometry से जारी

Biochemistry
 

Summary

यहां हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान एंथ्रेक्स विष के विधानसभा और विधानसभा की निगरानी के लिए एक परत interferometry (BLI) का उपयोग कर । निंनलिखित विधानसभा/बायोमास सेंसर सतह पर, बड़े प्रोटीन परिसरों के दृश्य और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर परिसर के घटकों की पहचान के लिए सतह से जारी कर रहे हैं, क्रमशः ।

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Machen, A. J., O'Neil, P. T., Pentelute, B. L., Villar, M. T., Artigues, A., Fisher, M. T. Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e57902, doi:10.3791/57902 (2018).

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Abstract

vivo में, प्रोटीन अक्सर बड़े macromolecular कॉम्प्लेक्स का हिस्सा होते हैं, जहां बाइंडिंग विशिष्टता और गतिशीलता अंततः कार्यात्मक outputs हुक्म देती है । इस काम में प्री-endosomal एंथ्रेक्स विष इकट्ठा हो जाता है और endosomal परिसर में संक्रमण हो जाता है. सबसे पहले, एन एक cysteine उत्परिवर्ती घातक कारक के टर्मिनल डोमेन (वामोएन) एक इष्टतम अभिविंयास में डाइसल्फ़ाइड युग्मन के माध्यम से एक interferometry परत (BLI) से जुड़ा हुआ है, सुरक्षात्मक प्रतिजन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के लिए बाइंड करने की अनुमति (Kd 1 एनएम) । इष्टतम उंमुख वामोN-PAताकना जटिल तो घुलनशील केशिका morphogenic जीन-2 (CMG2) सेल सतह रिसेप्टर (कश्मीरडी १७० बजे), एक प्रतिनिधि एंथ्रेक्स पूर्व endosomal परिसर, पीएच ७.५ पर स्थिर में जिसके परिणामस्वरूप के लिए बांधता है । इस इकट्ठे परिसर तो अंलीकरण के अधीन है (पीएच ५.०) देर endosome पर्यावरण के प्रतिनिधि संक्रमण करने के लिए झिल्ली में पीएताकना डाला राज्य में ताकना । CMG2 रिसेप्टर और वामोN-paताकना और संक्रमण ताकना से CMG2 की एक पर्याप्त पृथक्करण के बीच एक कमजोर बंधन में यह पीएताकना राज्य परिणाम । इस thio-से वामो केएन की आसक्ति को dithiothreitol से आसानी से उलटा कर दिया जाता है. BLI पर कम सेंसर सतह विज्ञप्ति वामोn-paताकना-CMG2 त्रिगुट परिसर या एसिड microliter मात्रा में वामोn-paताकना परिसर में संक्रमण । जारी परिसरों तो visualized रहे है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर की पहचान की । ये प्रयोग प्रदर्शित करता है कि कैसे की निगरानी के लिए काइनेटिक विधानसभा/लेबल मुक्त BLI के तरीके का उपयोग कर विशिष्ट प्रोटीन परिसरों के विधानसभा/और संरचना और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और जनसंचार द्वारा इन BLI इकट्ठे परिसरों की पहचान का मूल्यांकन स्पेक्ट्रोमेट्री, क्रमशः, आसानी से दोहराने अनुक्रमिक प्रक्रियाओं का उपयोग कर ।

Introduction

की पहचान करने और vivo में प्रोटीन कॉंप्लेक्स विधानसभा शासी जैव रासायनिक शोधकर्ताओं के लिए अत्यधिक ब्याज की है समझ । बड़े विषम प्रोटीन सभाओं के आदर्श के बजाय अपवाद हैं । इस धारणा vivo विधानसभा में स्पेक्ट्रोस्कोपी निगरानी द्वारा समर्थित है, gentler सेल व्यवधान तकनीकों का उपयोग कर परिसरों को अलग, समानता से उत्पादों का मूल्यांकन-शुद्धि तरीकों आधारित है, और उंहें उच्च संकल्प का उपयोग visualizing क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) । सेल के भीतर विधानसभा विशिष्टता के नियंत्रण को समझने के लिए, शोधकर्ताओं को नियमित रूप से अलग करना चाहिए, की पहचान, और अंततः इन गतिशील कोडांतरण/ सबसे भारी इस्तेमाल किया आणविक उपकरण इन सभाओं के घटकों की पहचान करने के लिए अक्सर एंटीबॉडी आधारित immunoprecipitation, जो सेल व्यवधान के दौरान जटिल स्थिरता बनाए रखने पर निर्भर करता है की आवश्यकता है । विभिन्न युग्मित विश्लेषणात्मक तकनीक हाल ही में microfluidic आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर सेल नमूनों से परिसरों पर कब्जा करने के लिए विकसित किए गए थे, जैसे सतह plasmon अनुनाद (SPR). SPR सतहों से हटाने के बाद, इन नमूनों मैट्रिक्स द्वारा विश्लेषण किया गया था असिस्टेड लेजर desorption/ionization उड़ान के समय (मालदी-तोफ)1,2. आसान प्रोटोकॉल का उपयोग कर इस पद्धति को आगे बढ़ाने के शोधकर्ताओं कल्पना करने के लिए और सत्यापित परिसरों कि सेलुलर वातावरण में होने की भविष्यवाणी की अनुमति देगा । चूंकि SPR एक microfluidics आधारित प्रणाली है, समस्याओं को अक्सर कुल गठन से उठता है । इस समस्या को दरकिनार नमूना कमजोर पड़ने की आवश्यकता है, जो बारी में, एकाग्रता उत्तरदायी जैविक परिसरों की अखंडता को कम कर सकते हैं.

लेबल मुक्त प्रौद्योगिकियों में एक अपेक्षाकृत हाल ही में प्रगति के विकास के लिए है interferometry (BLI) प्रणाली3। इन विशेष प्रकाश आधारित चिंतनशील प्रणाली दोहराने, या सबसे अच्छा अनुकरण, SPR बाध्यकारी और काइनेटिक परिणाम3लागत,4 के एक अंश पर विशेष रूप से अगर एक चैनल इकाइयों का उपयोग किया जाता है । BLI एक संदर्भ परत (नियंत्रण) और (प्रयोगात्मक) सतह के बीच प्रतिबिंबित प्रकाश हस्तक्षेप पैटर्न में परिवर्तन के उपाय । चरण में परिणामस्वरूप परिवर्तन एक काइनेटिक और मात्रात्मक readout5के रूप में वास्तविक समय में मापा जाता है । , विशिष्ट स्थिरीकरण chemistries युक्त, शारीरिक रूप से समाधान के बीच स्थानांतरित कर रहा है, के रूप में SPR में microfluidic दृष्टिकोण से बफर परिवर्तन का विरोध किया है, तरंग दैर्ध्य चरण विक्षेप के माध्यम से माप के लिए । जन स्थानांतरण प्रभाव आंदोलन को हल करने से रोका जाता है । SPR के विपरीत, इन प्रणालियों क्रूड जैविक नमूनों से परिसरों का मूल्यांकन करने में काफी उपयोगी होते हैं । शारीरिक BLI प्रयोगों के दौरान मापा पैरामीटर मुख्य रूप से बायोमास या मोटाई में एक परिवर्तन पर निर्भर करता है जो प्रोटीन जटिल विधानसभा या विधानसभा से परिणाम ।

इन फाइबर ऑप्टिक के लिए उपयोग करने के लिए आसान है और अपेक्षाकृत सस्ती सेंसर । एक BLI के उभरते उपयोगी पहलुओं की सतह से नए इकट्ठे प्रोटीन परिसरों के सतही हटाने है । इस पद्धति का एक हाल ही में आवेदन हमारी प्रयोगशाला के लिए बड़े पैमाने पर कैनेटीक्स के वास्तविक समय का निरीक्षण करने की अनुमति दी पीएच एंथ्रेक्स विष सुरक्षात्मक प्रतिजन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के घटक के रूप में संक्रमण कीसंरचना पुनर्व्यवस्था पोरे (पीएपोरे) रूप. इस पर संक्रमण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM)6का उपयोग कर सत्यापित किया गया था । microfluidics प्रणालियों का उपयोग करते समय चिप सतहों से परिसरों को रिहा जब बड़ी मात्रा कमजोर पड़ने प्रभाव अक्सर का सामना करना पड़ा जब से जटिल सेंसर सतहों से बचा जाता है ।

मौजूदा काम में एंथ्रेक्स विष परिसरों को इकट्ठा और विभक्त कर रहे हैं और फिर से microliter मात्रा में जारी है । जिसके परिणामस्वरूप जटिल घटकों का उपयोग कर मान्य हैं orthogonally EM और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS).

Protocol

1. Interferometry पर परिभाषित Macromolecular परिसरों की एसेंबली (BLI)

  1. एक PDEA-संशोधित अमीन प्रतिक्रियाशील पर एक बार फिर से सक्रिय करना एंथ्रेक्स विष परिसर के विधानसभा
    1. हाइड्रेट एक अमीन प्रतिक्रियाशील दूसरी पीढ़ी (AR2G) BLI २५० µ एल में दस मिनट के लिए पानी की l संवेदक टिप ।
    2. कार्यक्रम कदम बार, 1 तालिकामें सूचीबद्ध, BLI इकाई को नियंत्रित करने के सॉफ्टवेयर पर ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    3. 30 एस के लिए २५० µ l पानी में BLI सेंसर टिप विसर्जित करके भागो शुरू करने के लिए एक प्रारंभिक आधार रेखा की मोटाई और घनत्व की माप ।
    4. 7 मिनट के लिए २५० µ एल ५० mm एन एच एस (एन-hydroxysuccinimide) और २०० mm EDC (1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)) में टिप विसर्जित करके इस विसेंसर को सक्रिय करें ।
    5. ५० mM PDEA (2-(2-pyridinyldithio) ethanamine) ०.१ मीटर बोराटे बफर (पीएच ८.५) में भंग 5 मिनट के लिए एक सक्रिय thiol-प्रतिक्रियाशील सतह उत्पंन करने में विसर्जित कर दिया ।
    6. सक्रिय thiol-प्रतिक्रियाशील २५० µ l में १०० एनएम E126C वामोएन 10 मिमी सोडियम एसीटेट पीएच ५.०, १०० मिमी NaCl, 5 मिनट के लिए बफर युक्त समाधान के एल में विसर्जित कर दिया ।
    7. ५० मिमी एल में वामोएन टिप विसर्जित-cysteine, 1 एम NaCl, ०.१ एम सोडियम एसीटेट, पीएच ५.०, 4 मिनट के लिए, किसी भी शेष प्रतिक्रियाशील मुक्त thiol-प्रतिक्रियाशील समूहों बुझाने के लिए.
    8. ५० mm Tris में बुझती वामोN टिप विसर्जित कर दिया, ५० mm NaCl 2 मिनट के लिए बफर आधार रेखा स्थापित करने के लिए ।
    9. 5 मिनट के लिए ०.५ µ एम सुरक्षात्मक प्रतिजन ताकना (फिलीस्तीनी अथॉरिटी), ५० mM Tris, 50mM NaCl में बुझती वामोn टिप विसर्जित करने के लिए वामोn-फिलीस्तीनी अथॉरिटीताकना जटिल बनाएं ।
    10. एक बार पीएताकना जुड़ा हुआ है, पीएताकना समाधान से टिप को दूर करने और 30 सेकंड के लिए ५० mm Tris, ५० mm NaCl में टिप विसर्जित करने के लिए दूर किसी भी गैर विशेष रूप से बाध्य PAताकनाधोना ।
    11. ०.५ µ एम CMG2 रिसेप्टर (transmembrane डोमेन के बिना), ५० मिमी Tris, ५० मिमी NaCl, 5 मिनट के लिए में वामोएनपीएताकना परिसर विसर्जित कर दिया ।
    12. ५० mm Tris, ५० mm NaCl के लिए 30 सेकंड के लिए दूर करने के लिए किसी भी असीम CMG2 पूर्व endosomal परिसर फार्म धोने में वामोN-PAताकना-CMG2 परिसर विसर्जित कर दिया ।
    13. EM विश्लेषण के लिए, एक पीसीआर ट्यूब के अंदर ५० mm डीटीटी, ५० mm Tris, ५० mm NaCl के 5 µ एल में टिप विसर्जित करके, वामोएन-पीएताकना-CMG2 जटिल से ।
    14. परिसर से पेप्टाइड्स के मिलकर एमएस विश्लेषण के लिए, रिलीज वामोएन-फिलीस्तीनी अथॉरिटीताकना-CMG2 परिसर में एक पीसीआर ट्यूब के अंदर 5 µ एल ५० mm डीटीटी, 6 एम GuHCl (केरातिन-free), 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट पीएच ८.० में विसर्जित कर दिया । . यह EM विश्लेषण के लिए इस्तेमाल एक से एक अलग सी सेंसर पर किया जाता है ।
  2. PDEA पर ताकना एंथ्रेक्स विष परिसर की विधानसभा-संशोधित अमीन प्रतिक्रियाशील
    1. पीएच संक्रमण के बाद परिसर को देखने के लिए, 1.1.1 कदम प्रदर्शन-1.1.12 पिछले अनुभाग में वामोN-PAताकना-CMG2 परिसर उत्पंन करते हैं ।
    2. 5 मिनट के लिए एक 10 मिमी एसीटेट पीएच ५.० में एक से अधिक सेंसर टिप विसर्जित पीएताकना संक्रमण के लिए फिलीस्तीनी अथॉरिटी के संक्रमण आरंभ करने के लिए । इस संक्रमण आयाम बढ़ (लगभग ०.२ एनएम) द्वारा संकेत दिया है एक बड़ा आयाम गिरावट है कि पर्याप्त या पूरा रिसेप्टर पृथक्करण कम बाध्यकारी संबंध के कारण होने की कल्पना है द्वारा पीछा किया ।
    3. ५० mm Tris, ५० mm NaCl, पीएच ८.० में, 30 सेकंड के लिए अम्लीय बफर धोने के लिए में वामोएन-पीएताकना टिप विसर्जित कर दिया ।
    4. EM विश्लेषण नमूना के लिए, डाइसल्फ़ाइड रिलीज़ के बाद समाधान में एकत्रीकरण को रोकने के लिए 5 मिनट के लिए १.२५ mm micelles (२.५ mm MSP1D1, 25 mm Na-cholate, १६२.५ mm POPC) युक्त सॉल्यूशन में एक साथ, एक समाधान में शामिल है ।
    5. EM विश्लेषण के लिए, एक पीसीआर ट्यूब के अंदर ५० mm डीटीटी, ५० mm Tris, ५० mm NaCl के 5 µ एल में टिप विसर्जित करके वामोN-PAताकना-Micelle जटिल से ।
    6. परिसर से पेप्टाइड्स के मिलकर एमएस विश्लेषण के लिए, इस micelle को 5 µ एल ५० एमएम डीटीटी, 6 एम GuHCl (केरातिन-फ्री), 25 एमएम अमोनियम बिकारबोनिट पीएच ८.० में एक पीसीआर के अंदर विसर्जित करके, एक सेंसर टिप से वामोN-PAबेचारी परिसर (कोई नहीं) रिलीज ट्यूब. यह EM विश्लेषण के लिए इस्तेमाल एक से एक अलग सी सेंसर पर किया जाता है ।

2. visualizing और मांय जारी Macromolecular सभाओं BLI से नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा

  1. एक कार्बन लेपित घन ३०० ग्रिड निर्वहन चमक । ठेठ चमक निर्वहन सेटिंग्स ०.३८ mBar स्थिर वातावरण दबाव, नकारात्मक 15 mAmps, 20 सेकंड, तो हवा के साथ वेंट कर रहे हैं ।
  2. साफ चिमटी की एक जोड़ी के बीच सुरक्षित ग्रिड ।
  3. पिपेट ग्रिड पर पीसीआर ट्यूब में जारी जटिल नमूना के 4 µ एल और 60 के दशकों के लिए सोखना अनुमति देते हैं ।
  4. दूर एक फिल्टर कागज कील के साथ तरल शेष बाती ।
  5. pipetting 5 µ एल द्वारा ग्रिड दाग ०.७५% ०.०२ माइक्रोन फ़िल्टर uranyl प्रारूपण और बाती दूर अतिरिक्त दाग 5 सेकंड के बाद । ग्रिड को कमरे के तापमान पर सूखने दें ।
  6. देखें सना हुआ नमूना ग्रिड एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग.

3. पूरा पूर्व endosomal एंथ्रेक्स विष परिसर की पहचान (वामोएन-पीएताकना-CMG2) और संक्रमणीय परिसर (वामोn-paताकना CMG2 बिना) मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर ।

  1. 1 घंटे के लिए 20 µ एल और गर्मी के लिए जारी नमूनों पतला ।
  2. ५५ मिमी iodoacetamide, 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट, पीएच ८.० के 2 µ एल जोड़ें, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन (एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर) ।
  3. 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के १०० µ एल के साथ नमूना पतला, पीएच ८.०, 1 मीटर नीचे guanidine हाइडरोक्लॉराइड एकाग्रता को कम करने के लिए ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर में 20 एनजी/µ एल और गर्मी में अनुक्रमण ग्रेड संशोधित trypsin के 5 µ एल जोड़ें ।
  5. 5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए हिमनदों एसिटिक एसिड जोड़ें < 3 के लिए पीएच को कम करने के लिए, तो वैक्यूम ध्यान में 10 µ एल के लिए मात्रा को कम ।
  6. एनएलसी १२०० uHPLC के पारखी पर नमूना प्लेट के लिए पेप्टाइड समाधान स्थानांतरण.
  7. लोड 5 µ l पेप्टाइड समाधान पर एक uHPLC उलट चरण स्तंभ MS के ionization चरण पर घुड़सवार.
  8. 15 µ एल के साथ ०.१% फार्मिक एसिड की अधिकतम दर पर धो कॉलम 5 µl/न्यूनतम और/या ८०० साई के अधिकतम दबाव ।
  9. Elute पेप्टाइड्स के एक प्रवाह दर पर उलट-चरण C18 स्तंभ से ३५० nL/मिनट एक ९० मिनट की अवधि में एक + बी में विलायक बी के ४०% के लिए 5% की एक लाइन ढाल का उपयोग कर (विलायक एक: ०.१% फार्मिक एसिड; विलायक बी: ०.१% फार्मिक एसिड के साथ ९५% acetonitrile) ।
  10. विश्लेषण लाइन पर eluting पेप्टाइड्स मिलकर एमएस का उपयोग कर ।
    1. ionization स्रोत सेट करने के लिए २५०० वोल्ट और आयन स्थानांतरण तापमान के लिए २५० ° c.
    2. स्वचालित नियंत्रण के तहत जन स्पेक्ट्रोमीटर संचालित करने के लिए लगातार एक एमएस के रूप में एक 3 एस अवधि में संभव के रूप में कई मिलकर MSMS के बाद स्कैन, सीआईडी और ३५ के एक सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा का उपयोग कर ।
  11. मानक तरीकों का उपयोग कर पेप्टाइड और प्रोटीन घटकों की पहचान । इस काम के लिए पेप्टाइड और प्रोटीन विश्लेषण के दो सेट प्रदर्शन किए गए ।

Representative Results

बड़े macromolecular परिसरों की असेंबली को मॉनीटर और मान्य करने की क्षमता बड़ी-आणविक सभाओं की विशिष्टता और कार्यक्षमता को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है । प्रस्तुत तरीकों का परिणाम इस के साथ साथ जो बड़े प्रोटीन परिसरों (> 150 केडीए मास) interferometry, सभी जबकि विधानसभा के कैनेटीक्स और आयाम की निगरानी के लिए एक परत का उपयोग कर इकट्ठा किया जा सकता है आसानी से प्रदर्शित करता है । अद्वितीय कॉंपैक्ट प्रकृति की सतह के विधानसभा विश्लेषण को छोटे microvolumes में इकट्ठे परिसरों जारी द्वारा विस्तारित करने के लिए सक्षम बनाता है । इन microvolumes का उपयोग कर परिसरों की प्रारंभिक शारीरिक संरचना कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एमएस का उपयोग कर जटिल घटकों की पहचान सत्यापित करने के लिए । इस पूरी प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा 1में दिखाया गया है ।

सफल विधानसभा के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व है और macromolecular परिसर के सत्यापन के लिए है, जो प्रारंभिक बीज प्रोटीन की उचित अभिविंयास शामिल है । यह सुनिश्चित करता है कि प्रोटीन प्रोटीन संपर्क साइटों, सुलभ sterically अवरुद्ध नहीं कर रहे हैं, और इष्टतम रूप से बाहर से तैनात है । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, एंथ्रेक्स विष परिसर के समुचित अभिविन्यास एक विशेष रूप से इंजीनियर एन घातक कारक के टर्मिनल टुकड़ा (वामोएन) का उपयोग करके हासिल की है तो वामोएन-पीएताकना बाध्यकारी साइट हमेशा तैनात है इसके विपरीत संवेदी आबंध अनुलग्नक साइट6,7। बाद buildup फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए फिलीस्तीनी अथॉरिटी की बाइंडिंग के साथ परिसर में घुलनशील CMG2 के बाद pa के लिए बाध्यकारी अंततः एक translocation सक्षम एंथ्रेक्स विष परिसर बनाता है ।

BLI sensogram ट्रेस एक वास्तविक समय है आयाम एंथ्रेक्स विष घटकों के विशेष इसके अलावा के कारण परिवर्तन के बाहर पढ़ने के रूप में वे पर जोड़ रहे हैं । चित्रा 3 से पता चलता है एक प्रतिनिधि जटिल प्रक्रिया में उस कदम पर फार्म की भविष्यवाणी की एक मॉडल के साथ युग्मित ट्रेस । पहली वृद्धि वामोN टिप पर लोड हो रहा है । शमन और आधार रेखा के बाद, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, तो वामोएन को बांधने में घुलनशील CMG2 रिसेप्टर के अलावा इकट्ठे पूर्व में जिसके परिणामस्वरूप endosomal वामो के परिसर-फिलीस्तीनीअथॉरिटी-CMG2। देर endosome पर्यावरण की ओर प्रगति के लिए, पूरे परिसर में एक कम पीएच पल्स (पीएच ५.०) है कि रिसेप्टर बाइंडिंग कमजोर, अपनी विस्तारित झिल्ली डाला ताकना अनुरूपता के लिए संक्रमण के लिए अनुमति देने के अधीन है । अंलीकरण चरण के 6 Sensogram अंश चित्रा 4में दिखाए गए हैं । प्रारंभिक वृद्धि या ' स्पाइक ' आयाम में होने की संभावना ताकना विस्तार6 कि CMG2 रिसेप्टर बाइंडिंग में कमी करने से पहले होने चाहिए । बड़ा आयाम गिरावट सबसे अधिक संभावना है या पूरा रिसेप्टर पृथक्करण कम बाध्यकारी संबंध के कारण है । इस प्रयोगशाला में पिछले काम के संकेत CMG2 पूरी तरह से विस्तारित पीएताकना करने के लिए बाध्यकारी CMG2 की तुलना में नगण्य है-pa पूर्व बातचीत6। इसके अलावा, sensogram काइनेटिक ट्रेस, वामोएनके सभी sensograms में मनाया-paताकना-एक पीएच ड्रॉप के साथ वामोn-paताकना को CMG2 संक्रमण, कई रन पर reproducible है ।

से पहले और अंलीकरण के बाद, यह आसानी से नकारात्मक दाग उंहें और एमएस (5 चित्रा) द्वारा पहचान द्वारा दृश्य के लिए जारी किए गए है जटिल सेंसर संलग्न । EM परिणामों से प्रतिनिधि परिसरों चित्रा 6में दिखाए जाते हैं । पूर्व endosomal नमूना ग्रिड, बरकरार त्रिगुट के साथ संगत घनत्व शो वामोएन-पीएताकना-CMG2 से मिलकर । पोस्ट-अंलीकरण परिसर ग्रिड, शो फिलीस्तीनी अथॉरिटी को ताकना और कोई स्पष्ट CMG2 घनत्व के साथ micelle शामिल किए जाने से solubilized संक्रमण ।

प्रीती व पोस्ट अंलीकरण परिसरों की पहचान एमएस द्वारा सत्यापित की गई । एक डाटाबेस जहां फिलीस्तीनी अथॉरिटी, P13423 के अनुक्रम; वामोN, P15917; और CMG2, P58335 एक माउस प्रोटीन NCBInr भंडार से व्युत्पंन डाटाबेस की पृष्ठभूमि में शामिल थे । केवल ब्याज की प्रोटीन त्रिगुट और द्विआधारी परिसरों के लिए निंनलिखित एमिनो एसिड कवरेज के साथ इस पहले डेटाबेस खोज से प्राप्त किए गए थे: ५४% और फिलीस्तीनी अथॉरिटी, ३६% और वामो के लिए 6% और CMG2 के लिए ४३% के लिए 22%, क्रमशः (CMG2 द्विआधारी परिसर में नहीं पाया गया था) । आदेश में प्रोटीन एमिनो एसिड कवरेज को अधिकतम करने के लिए, एक दूसरे पेप्टाइड/प्रोटीन की पहचान केवल ब्याज की तीन प्रोटीन युक्त एक प्रोटीन डाटाबेस का उपयोग किया गया था । पूर्व endosomal एमएस नमूने ६०.४६%, ६७.९७%, और वामोएन, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, और CMG2, क्रमशः (चित्रा 7) के लिए ५४.१५% कवरेज के साथ सभी तीन विष घटकों से पेप्टाइड्स निहित । पोस्ट-endosomal परिणाम, चित्रा 8में दिखाया गया है, केवल वामोएन और फिलीस्तीनी अथॉरिटी से (५७.४१% और ६७.७९% कवरेज, क्रमशः) समाहित । के बाद endosomal नमूनों में CMG2 की कमी मनाया BLI एनएम के गठन के दौरान कमी के साथ संगत कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्र 1. प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण के लिए योजनाबद्ध सिंहावलोकन पर इकट्ठे हुए और उंहें और एमएस का उपयोग कर BLI से पृथक संवेदक इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें कृपया

Figure 2
चित्र 2. BLI के लिए विशिष्ट विधानसभा में पहला कदम-संवेदी सक्रियण: E126C घातक कारक एन टर्मिनल डोमेन, (वामोएन) एक thio के माध्यम से जुड़ा हुआ है ठीक से केंद्रित फिलीस्तीनी अथॉरिटीताकना बाध्यकारी इंटरफेस बनाने के संबंध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. BLI के साथ एंथ्रेक्स विष विधानसभा और विधानसभा की निगरानी: sensogram एंथ्रेक्स विष घटकों के विशिष्ट अतिरिक्त के कारण समय के एक समारोह के रूप में आयाम परिवर्तन से पता चलता है के रूप में वे के साथ शुरू हो रहा है पर जोड़ रहे है सेंसर वामोएन लोड हो रहा है (चरण 4 में तालिका 1) । पीएताकना तो घुलनशील CMG2 रिसेप्टर के अलावा द्वारा पीछा सतह पर लोड है । इकट्ठे पूर्व endosomal परिसर में एक वामो-पीए CMG2 के होतेहैं । देर endosome पर्यावरण की ओर प्रगति के लिए, पूरे कार्यात्मक एंथ्रेक्स विष इकट्ठा एक कम पीएच पल्स (पीएच ५.०) है कि रिसेप्टर बाइंडिंग कमजोर, अपनी विस्तारित झिल्ली डाला ताकना अनुरूपता के लिए संक्रमण के लिए अनुमति देने के अधीन है । झिल्ली फैले ताकना के जोखिम की पुष्टि की है और micelles के अलावा द्वारा solubilized । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. BLI sensogram of CMG2 release: अंलीकरण चरण के अंश दिखाएं एक प्रारंभिक वृद्धि या ' स्पाइक ' आयाम में एक बड़ा आयाम गिरावट है कि होने की संभावना है और रिसेप्टर पृथक्करण, क्रमशः ताकना द्वारा पीछा किया । कार्यक्षेत्र बिंदीदार लाल लाइनों एक नए कदम की शुरुआत निरूपित । Sensograms बोल्ड बिंदीदार लाल रेखा पर गठबंधन कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण पर इकट्ठे हुए और BLI से अलग कर उंहें और एमएस का उपयोग कर सेंसर:-शामिल परिसरों को आसानी से 5 µ एल में जारी कर रहे है दृश्य के लिए डीटीटी युक्त बफर के नकारात्मक दाग em और सुश्री द्वारा पहचान कृपया यहां क्लिक करने के लिए इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखें ।

Figure 6
चित्रा 6. उंहें के साथ प्रोटीन परिसरों के दृश्य: पूर्व endosomal नमूना ग्रिड, बरकरार त्रिगुट के साथ संगत घनत्व शो वामोएन-पीएताकना-CMG2 से मिलकर । पोस्ट-endosomal परिसर ग्रिड, शो फिलीस्तीनी अथॉरिटी को ताकना और solubilized micelle द्वारा कोई स्पष्ट CMG2 घनत्व के साथ संक्रमण । अनुमानित परिसरों के मॉडल (बाएं हाथ की ओर) व्यक्तिगत कणों दिखाया के रूप में एक ही पैमाने पर हैं । कणों की भविष्यवाणी की प्रोटीन के साथ रंग (एम घनत्व के आकार के आधार पर) प्रत्येक कण नीचे दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7. एमएस के साथ प्रोटीन परिसरों का सत्यापन: पूर्व endosomal एमएस नमूने ६०.४६% के साथ सभी तीन विष घटकों से पेप्टाइड्स निहित, ६७.९७%, और वामोएन, फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए ५४.१५% कवरेज, और CMG2, क्रमशः. एक झूठी खोज दर (एफडीआर) के बराबर या अधिक से अधिक 5% पीले, एफडीआर बराबर या अधिक 1% से हरी में दिखाया में दिखाया गया पेप्टाइड्स का पता चला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8. एमएस के साथ प्रोटीन परिसरों का सत्यापन: पोस्ट-endosomal नमूने वामोएन और फिलीस्तीनी अथॉरिटी से (५७.४१% और ६७.७९% कवरेज, क्रमशः) निहित है, लेकिन नहीं CMG2 । एफडीआर बराबर या अधिक से अधिक 5% पीले रंग में दिखाया गया, एफडीआर बराबर या अधिक से अधिक 1% हरे रंग में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चरण समय (ओं) विवरण
1 30 प्रारंभिक आधार रेखा
2 ४२० सक्रियण
3 ३०० सक्रियण
4 ३०० वामोN लोड हो रहा है
5 २४० Cysteine बुझाने
6 १२० आधार रेखा
7 ३०० पीएताकना एसोसिएशन
8 30 आधार रेखा
9 ३०० CMG2 एसोसिएशन
10 30 आधार रेखा
11 ३०० एसिड संक्रमण
12 30 आधार रेखा
13 ३०० Micelle एसोसिएशन

तालिका 1. एकल BLI के लिए कदम बार विधानसभा एंथ्रेक्स विष परिसर को चलाने के लिए । ध्यान दें कि आधार रेखाओं को पिछले चरण से दूर असीमित प्रोटीन धोने के लिए और/या एक नया बफर आधार रेखा स्थापित किया जाता है ।

Discussion

इस प्रदर्शन को दिखाता है कैसे macromolecular जटिल गठन आसानी से कर सकते है पर नजर रखी है, interferometry का उपयोग कर visualized, और एमएस के साथ सत्यापित, एक कम समय अवधि में microvolumes के साथ सभी । संरचनात्मक विधानसभा और मनाया परिसरों जैविक रूप से प्रासंगिक भविष्यवाणियों का पालन करें, आगे इस संयुक्त पद्धति मांय । के रूप में परिणाम अनुभाग में कहा गया है, विधानसभा की सफलता के लिए महत्वपूर्ण तत्व तर्कसंगत इंजीनियर cysteine mutagenesis की आवश्यकता को सुनिश्चित करना है कि जटिल प्रोटीन प्रोटीन इंटरफेस ठीक से दूर उंमुख है सेंसर सतह से ।

पिछले सिस्टम BLI और एमएस तकनीक का इस्तेमाल किया है दो और तीन घटक प्रणालियों के बंधन प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से व्यक्त की प्रोटीन की रिसेप्टर बाइंडिंग की अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए, लेकिन, दोनों उदाहरणों में, तरीकों को विकसित करने के लिए उंहें का लाभ लेने के लिए नहीं थे/ दृष्टिकोण8,9. केवल अंय interferometry प्रणाली है कि संयुक्त एमएस विश्लेषण मदद करने के लिए बातचीत की विशेषता एक दोहरे ध्रुवीकरण interferometry10था । दुर्भाग्यवश, यह सिस्टम अब सामांय उपयोग के लिए उपलब्ध नहीं है । के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, वहां पूरा अध्ययन के एक नंबर रहे हैं, जहां नमूनों SPR पर गठन किया गया-जैसे सेंसर सतहों और एमएस विश्लेषण से हटा दिया । उन उदाहरणों में से कोई भी उंहें का उपयोग कर visualized के परिणामस्वरूप ।

इस क्रमिक विधि की सीमाएं अनेक हो सकती है लेकिन गलाऊ हैं । प्रारंभिक स्थिरीकरण और इसलिए विधानसभा की नींव कदम के लिए, संरचनात्मक संपर्क के ज्ञान की कमी सतहों निश्चित रूप से प्रारंभिक विधानसभा चरणों की निगरानी के साथ जुड़े प्रगति में बाधा होगी । संरचना की जानकारी का अभाव एक इंजीनियर नींव के निर्माण के द्वारा संबोधित किया जा सकता है जहां लगाव chemistries (उदाहरण के लिए sulfhydryl moiety डाइसल्फ़ाइड लिंकेज के लिए/उसकी टैग स्थिति) कोर के भीतर विभिंन क्षेत्रों में ले जाया जा सकता है असेंबली सिस्टम । एंथ्रेक्स विष परिसर के मामले में, यह सौभाग्य था कि फिलीस्तीनी अथॉरिटी की सुविधा के लिए बाध्य वामोएन की संरचना11उपलब्ध है । इंजीनियर cysteine के तर्कसंगत नियुक्ति क्षेत्रों के लिए दूर पीएताकना बाध्यकारी चेहरे से स्थानीयकृत था । cysteine लिंकेज chemistries के साथ, यह बेहतर है कि कोई अंय प्रतिक्रियाशील cysteines प्रोटीन की सतह पर मौजूद हैं ।

वहां विभिंन लगाव chemistries जो एक प्रोटीन सतहों पर विशिष्ट लगाव साइट इंजीनियर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक सबसे लोकप्रिय विशिष्ट संलग्नक के प्रोटीन की सतह12पर एक विशेष रूप से परिभाषित स्थान पर एक बायोटिन moiety स्थिति शामिल है । दुर्भाग्य से, बायोटिन एक streptavidin या avidin लेपित सतहों के लिए बाध्यकारी काफी तंग है । बाध्यकारी बातचीत के उलटा सरल नहीं है । एक इंजीनियर के उपयोग के अपने-N पर टैग या सी-टर्मिनस और एनआई के लिए लगाव के बाद आसानी-ंत् सतहों समानता स्थिरीकरण के एक अधिक सार्वभौमिक आवेदन है । बेशक, अपने-सिस्टम टैग के साथ इंजीनियरिंग विधानसभा लगाव साइटों के लिए चेतावनी के एक आवश्यकता है कि एन और सी कोर असेंबली प्रोटीन के टर्मिनी उजागर और इतना है कि लगाव आसान है अलग रहते हैं । सभी विधानसभा प्रक्रियाओं के साथ के रूप में, कोर असेंबली प्रोटीन के संपर्क इंटरफ़ेस जटिल विधानसभा की प्रगति के रूप में उपलब्ध रहना चाहिए ।

शायद chemistries की सतह का उपयोग करने का सबसे आम चिंता गैर विशिष्ट बाध्यकारी है । Streptavidin युक्तियां अक्सर महत्वपूर्ण गैर विशिष्ट बाध्यकारी प्रभाव का एक स्रोत हैं । डाइसल्फ़ाइड लिंक्ड बायोटिन को कम एस-बायोटिन लिंकेज के पीछे छोड़ने के लिए बहुत विशिष्ट परिसरों को जारी रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कसकर स्थिर मैटीरियल streptavidin13। वहां अंय प्रतिवर्ती chemistries जैसे iminoboronates के रूप में उपलब्ध हो रही है और एक कम हद तक14ketoamide । इस क्षेत्र में वर्तमान में अविकसित है, लेकिन आगे प्रतिवर्ती आबंध प्रोटोकॉल के विकास में उच्च ब्याज से बचने के लिए लक्ष्य दवा विषाक्तता प्रभाव है कि सामांयतः आबंध लक्षित दवा विकास के उपयोग के साथ ।

उंहें जटिल कल्पना का उपयोग करने की एक सीमा व्याख्या है, विशेष रूप से उदाहरणों में, जहां इकट्ठे परिसरों की संरचनाओं शुरू में जाना नहीं है । एक अपरिभाषित इकट्ठे macromolecular परिसर में घटकों के स्थानिक स्थान विशिष्ट काइनेटिक और संरचनात्मक मार्करों के रूप में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) का उपयोग कर पहचाना जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक बार एक जटिल बना है, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जोड़ा जा सकता है कि विशेष घटकों के लिए बाध्य । इस विधि अक्सर EM में बड़ी असेंबली15के भीतर विशिष्ट घटकों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है । एक और सीमा जटिल के आकार से संबंधित है, हालांकि वहां गया है उदाहरण जहां छोटे रूप में ७० केडीए (GroES heptamer) के रूप में परिभाषित सममित विधानसभाओं आसानी से नकारात्मक दाग उंहें का उपयोग कर हल कर रहे हैं । जटिल है कि उंहें द्वारा विश्लेषण कर रहे है इकट्ठे के आकार रेंज में है आमतौर पर व्यास में ~ १०० Å या इसके बाद के संस्करण । हाल ही में हालांकि, प्रोटीन के रूप में छोटे रूप में 20 केडीए हल किया गया है और कम संकल्प संरचनाओं प्राप्त किया गया है जब बेहतर दाग के तरीके16का उपयोग कर.

एमएस विश्लेषण के लिए, वर्तमान एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन की वृद्धि हुई संवेदनशीलता नीचे femtomolar (attomoles) स्तर के लिए कुछ मामलों में BLI का पता लगाने की संवेदनशीलता में वृद्धि कर सकते हैं. यह अत्यधिक कल्पना है कि प्रोटीन संकेत है कि आयाम में एक ंयूनतम लेकिन दोहराने वृद्धि दिखाने के प्रश्न में प्रोटीन की पहचान में परिणाम होगा । इसके अलावा, जांच प्रोटीन प्रोटीन-एक और एक सेलुलर वातावरण में प्रभाव परिणाम में एक शुद्धि और बाद में नए परिसर का गठन आसान का पता लगाने में होगा पर संलग्न भागीदारों में से एक के साथ संपर्क । एक सीमा है कि वर्तमान अति संवेदनशील एमएस सिस्टम के साथ मनाया जा सकता है कि ब्याज की प्रोटीन डेटाबेस में नहीं हो सकता है, लेकिन इस अवलोकन दुर्लभ है (जैसे, दुर्लभ प्रजातियों से proteomes) । यदि ब्याज के प्रोटीन के अनुक्रम जाना जाता है, यह समस्या आसानी से एक पृष्ठभूमि प्रोटीन डेटाबेस में प्रोटीन (एस) एमिनो एसिड अनुक्रम सहित द्वारा हल कर रहे है (के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में इस काम में वर्णित) । एक प्रोटीन के प्रतिरोध से कार्यप्रणाली परिणाम की एक और संभावित सीमा trypsinolysis । Trypsin पाचन आमतौर पर प्रोटीन पहचान ऊपर नीचे के लिए डिफ़ॉल्ट विधि है । हालांकि, प्रोटीन trypsin के लिए प्रतिरोधी हो सकता है अगर वे Arg और Lys अवशेषों या इन अवशेषों तक पहुंच की कमी जोड़ संरचना द्वारा प्रतिबंधित कर रहे हैं । इन सीमाओं को हल कर रहे हैं, क्रमशः, विकल्प का उपयोग करके या एक संयोजन या एक खुलासा (यूरिया या guanidine एचसीएल सहित, 1.1.14 और 1.2.6 में संकेत के रूप में) पाचन एंजाइमी से पहले ।

इस पद्धति के संभावित विस्तार के लिए उपयोगकर्ता का पालन करें और क्रूड सेलुलर lysates से सेलुलर विधानसभा परिसरों की पहचान की अनुमति शामिल है । यह बाहर केंद्रित सेलुलर निष्कर्षों में विधानसभा घटकों के लिए परीक्षण बदल जाता है के लिए उपयोग करने के लिए आसान है interferometry प्रक्रिया । अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया microfluidic आधारित के तरीके जो कॉलेस्ट्रॉल और एकत्रीकरण के प्रति संवेदनशील के लिए प्रवण हैं, BLI दृष्टिकोण के लिए सीधे कच्चे तेल के अर्क में परत संवेदक युक्तियां विसर्जित करने के लिए संभावित विशिष्ट परिसरों सीधे इकट्ठा किया जा सकता है इन केंद्रित अशुद्ध नमूनों से । एक बार इकट्ठे, यह पूरी तरह से एक BLI प्रणाली को आगे की पहचान करने और यहां तक कि सेलुलर निष्कर्षों कि microvolume एमएस विधि का उपयोग कर पहचान की गई में संदिग्ध घटकों quantitate के रूप में विशिष्ट एंटीबॉडी जांच का उपयोग करने के लिए व्यवहार्य है । फिर, यहां कुंजी को परिभाषित उपयोग करते हैं, ठीक से विशिष्ट संबध जांच के रूप में कोर प्रोटीन उंमुख है ।

BLI के साथ संक्रमण प्रक्रिया को ताकना करने के लिए को ध्यान में रखते हुए क्षमता को देखने के लिए उच्च क्षमता की पहचान करने में उपयोगी हो जाएगा "विरोधी विष" प्रोटीन संक्रमण के छोटे अणु अवरोधों कि विशेष रूप से देर endosomal के तहत कार्य, कम पीएच ५.० () शर्तों. इस pH प्रेरित ताकना संक्रमण को ताकना करने के लिए इस तरह के ग्लिसरॉल या सुक्रोज के रूप में स्थिरता (osmolytes) तह की उपस्थिति में बाधा है, और इस तरह विशिष्ट लक्षित तह स्थिरता कि फिलीस्तीनी अथॉरिटीताकना गठन को रोकने के विकास के लिए मजबूत समर्थन बख्शी । इस विशिष्ट दृष्टिकोण से बचा जाता है और कच्चे तेल एकत्रीकरण आधारित परख की जगह जहां पीएच बूंदें प्रोटीन वर्षण के लिए सीसा । यह बाद की विधि, हालांकि प्राथमिक के लिए अच्छे तरीके के लिए अच्छा है, अक्सर झूठी सकारात्मक परिणाम जहां विशिष्ट यौगिकों के बजाय वास्तविक आणविक संक्रमण एकत्रीकरण को बाधित करने की ओर जाता है ।

संरचना और छोटे microvolume नमूनों के भीतर व्यक्तिगत इकट्ठे घटकों की पहचान के बहाव प्रेक्षण भी संभावित नेतृत्व यौगिकों मान्य करने में उपयोगी हो सकता है. इस उदाहरण में लागू किया जा सकता है जहां या तो विशिष्ट विधानसभा स्थिरीकरण या स्थिरीकरण लक्ष्य परिणाम है । यह काइनेटिक/संरचना/समानांतर दृष्टिकोण विधानसभा के संदिग्ध नेतृत्व यौगिक प्रभाव की वैधता की पुष्टि करने के लिए उपयोगी है और एक उचित माध्यमिक स्क्रीनिंग कदम या मध्यम प्रवाह दृष्टिकोण के रूप में कार्य करता है ।

क्रायो-EM विधानसभा के विभिन्न राज्यों में macromolecule परिसरों के परमाणु विवरण का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है । पहले क्रायो-em नमूनों की तैयारी करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए पहली बार एक तैयारी सत्यापित नकारात्मक दाग के साथ यथोचित शुद्ध समरूप परिसरों शामिल हैं. इस के साथ साथ प्रस्तुत काम BLI पर प्रोटीन परिसरों के विधानसभा प्रदर्शित करता है-संवेदक सतहों, EM दृश्य के लिए इन परिसरों की रिहाई, और एमएस का उपयोग कर इन घटकों की पहचान. नियंत्रित विधानसभा और रिहाई के इस विशेष पद्धति बहुत विशिष्ट प्रोटोकॉल है कि नकारात्मक दाग उंहें, एक आवश्यक कदम है कि आगे बढ़ाने से पहले प्रदर्शन किया जाना चाहिए के लिए समरूप अनुक्रमिक नमूना तैयारी बढ़ाने में उपयोगी हो सकता है क्रायो-EM । कम संकल्प 3 डी संरचना प्राप्त करने के लिए, जटिल के केवल 30-50 कणों एक शंकु झुकाव श्रृंखला प्रदर्शन करने की जरूरत होगी (७० अलग कण प्रति 2d छवि विचारों) प्रदान की वहां अभिविंयास विविधता है (एकाधिक अलग विचार) ।

एमएस तरीकों को बढ़ाने के संबंध में, संवेदनशीलता में अग्रिम और नमूना मात्रा में कमी को बेहतर बनाने के लिए जारी है । नैनो प्रवाह और अल्ट्रा उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी एक तेजी से कर्तव्य चक्र के साथ जन स्पेक्ट्रोमीटर के विकास के साथ, संवेदनशीलता में वृद्धि हुई है और शक्ति को हल । orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर का हाल ही में परिचय, विशेष रूप से नवीनतम संस्करण (orbitrap संलयन Lumos, और इसकी उंमीद उत्तराधिकारी orbitrap संलयन 1m Lumos) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से खोज एल्गोरिदम बहुत इस प्रक्रिया की सुविधा ।

वर्तमान पद्धति पर नज़र रखता है काइनेटिक विधानसभा और एंथ्रेक्स विष घटकों के विधानसभा लेबल का उपयोग मुक्त BLI के तरीके और संरचना और इन घटकों का उपयोग कर उंहें और एमएस, क्रमशः की पहचान का मूल्यांकन करता है । एक सरल एकल चैनल BLI दिनचर्या नकारात्मक धुंधला EM विश्लेषण और प्राथमिक एमएस तकनीक के साथ युग्मित प्रणाली के उपयोग के लिए एक विधानसभा की प्रक्रिया को चिह्नित करने के लिए पर्याप्त से अधिक कर रहे हैं ।

Disclosures

इस समय कोई प्रकटीकरण नहीं ।

Acknowledgments

यह काम मैडिसन और लीला सेल्फ ग्रेजुएट फेलोशिप (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC बायोमेडिकल रिसर्च ट्रेनिंग प्रोग्राम (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), केयू ब्रिजिंग फंड और जैव अणु इंटरेक्शन टेक्नोलॉजीज सेंटर (BITC) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ( सीटी और MTF) । लेखक के लिए KUMC इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोर पर बारबरा Fegley उनि छवि अधिग्रहण के साथ सहायता के लिए धंयवाद देना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC) Thermo Scientific 22980
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA) GE Lifesciences BR100058
0.5 mL black microtubes Sigma-Aldrich Z688304-500EA
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti 850457C-25mg
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å ThermoFisher Scientific 164561
Acetic acid glacial Fisher A38SL-212
Acetonitrile Fisher A955-4
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips Forte Bio 18-5092
Ammonium bicarbonate Fisher A643-500
Anotop 10 syringe filter, 0.02um GE Lifesciences 6809-1002
BLItz System Pall Forte Bio 45-5000
Boric acid Fisher Scientific 10043-35-3
Capillary Morphogenic Gene-2 Protein produced and purified in-house
Carbon coated Cu 300 grid Electron Microscopy Sciences CF300-CU-50
Dithiothreitol (DTT) GoldBio DTT25
Formic acids JT Baker 0129-01
Guanidine hydrochloride (GuHCl) Sigma-Aldrich G4505-100G
Iodoacetamide MP-BioMedicals,LLC 100-351
JEM-1400 Transmission Electron Microscope JEOL
L-cystiene hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich C121800-5G
Lethal Factor N-terminal domain Protein produced and purified in-house
MS software version 2.2 ThermoFisher Scientific
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 090M14531V
Orbitrap Fusion Lumos ThermoFisher
PCR tubes ThermoFisher Scientific AB-0620
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system Ted Pella, Inc 91000
Protective Antigen prepore Protein produced and purified in-house
Qualitative filter paper circles Fisher Scientific 09-795C 5
Sequencing grade modified trypsin Promega V5111
Sequest HT search engine ThermoFisher Scientific
Sodium acetate trihydrate Fisher Scientific BP334-500
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Sodium cholate Sigma-Aldrich C1254-100G
Tris base Fisher Scientific BP152-10
Uranyl formate (UF) Electron Microscopy Sciences 22450
Xcalibur ThermoFisher Scientific OPTON-30487

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References

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