أزرق تولويدين تلطيخ أبواب جزءا لا يتجزأ من الراتنج للتقييم مورفولوجيا الأعصاب الطرفية

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لتصور الهياكل الدقيقة للأعصاب المحيطية بالحصول على وتلوين الأجزاء 1-2 ميكرومتر مع تولويدين الأزرق

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ghnenis, A. B., Czaikowski, R. E., Zhang, Z. J., Bushman, J. S. Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology. J. Vis. Exp. (137), e58031, doi:10.3791/58031 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الأعصاب المحيطية تمتد في جميع أنحاء الجسم، إينيرفاتينج الأنسجة المستهدفة مع محاور عصبية الحركية أو الحسية. نظراً للتوزيع على نطاق واسع، وكثيراً ما تلف الأعصاب الطرفية بسبب الصدمة أو المرض. كما وضعت أساليب واستراتيجيات لتقييم إصابات الأعصاب المحيطية في نماذج حيوانية، الدالة والتجدد، تحليل مورفوميتري للأعصاب الطرفية أصبح قياس نتائج محطة أساسية. تولويدين الأزرق تلطيخ العصب عبر المقاطع التي تم الحصول عليها من فروع العصب راتنج مضمن أسلوب استنساخه لعمليات التقييم النوعي والكمي للأعصاب المحيطية، وتمكين التصور مورفولوجيا عدد محاور عصبية ودرجة مييلينيشن. هذا الأسلوب، كما هو الحال مع العديد من أساليب نسيجية أخرى، يكون من الصعب تعلم وإتقان استخدام البروتوكولات المكتوبة القياسية. والغرض من هذا المنشور ذلك لإبراز البروتوكولات المكتوبة تولويدين الأزرق تلطيخ للأعصاب الطرفية مع بالفيديو للأسلوب، استخدام الأعصاب الوركي حصادها من الفئران. في هذا البروتوكول، يصف لنا في فيفو التثبيت بالاعصاب الطرفية ومجموعة من الأنسجة، وبعد انتهاء التثبيت مع 2% أكسيد الاوزميوم، تضمين للأعصاب في راتنج الإيبوكسي، وتقطيع أولتراميكروتومي للأعصاب بسمك 1-2μm. أقسام الأعصاب ثم نقلها إلى شريحة زجاجية والملون بالأزرق تولويدين، بعدها يتم كمياً ونوعيا قيموا. وترد أمثلة للمشاكل الأكثر شيوعاً، فضلا عن الخطوات اللازمة للتخفيف من هذه المسائل.

Introduction

الأعصاب المحيطية تمتد في جميع أنحاء الجسم، إينيرفاتينج الأنسجة المستهدفة مع محاور عصبية الحركية أو الحسية1. العيوب الأعصاب المحيطية الناجمة عن الاضطرابات الطبية والصدمة تمثل شاغلا رئيسيا لصحة العامة والآثار الاقتصادية الكبيرة2،3. وعلى الرغم من التقدم الذي تحقق في تقييم نتائج إصابات الأعصاب المحيطية وفهم العصب التجدد، الأساليب التقليدية مثل الأنسجة العصبية وتلطيخ تقنيات أداتين أساسيتين كمياً ونوعيا تقييم صحة العصب كقياس نتائج المحطة طرفية في نماذج حيوانية أو قصت الأنسجة البشرية. هذا هو غالباً ما يقترن القياسات الكهربية لوظيفة الأعصاب الطرفية، حيث يمكن أن تكشف عن مورفوميتري لماذا تجدد الأعصاب وظيفية أو لم يحدث.

أزرق تولويدين تلطيخ راتنج المضمنة أقسام شبه رقيقة الأعصاب الطرفية هو أسلوب متخصصة للتصوير myelinated الألياف العصبية، توفير جودة عالية وواضحة صور مفصلة للعصب هياكل4،5،6 . أزرق تولويدين وصمة عار ميتاتشروماتيك acidophilic، اكتشف ويليام هنري بيركن في7من 1856، وقد تم استخدامه في العديد من التطبيقات الطبية8. تولويدين الأعصاب الطرفية ملطخة باللون الأزرق المقاطع التي تم الحصول عليها من شرائح جزءا لا يتجزأ من الراتنج العصب يسمح لتصور واضح لهياكل العصب. ويمكن تعزيز التصور هيكل غمد المايلين باستخدام أكسيد الاوزميوم بعد انتهاء التثبيت4،9. أكسيد الازميوم هو سامة الأكسدة والدهون مثبت عامل يتفاعل مع سندات مزدوجة في الدهون، أسفر عن10من اﻷغماد المايلين الغنية بالدهون محددة بشكل صارخ. بيد أكسيد الاوزميوم السامة، ومكلفة وتتطلب من حضانة أطول من شرائح العصب، ولا يستخدم دائماً.

وقد وضعت أساليب بديلة لمعالجة وتلطيخ للتصور مورفولوجيا الأعصاب المحيطية؛ البارافين وتمزيقها المبردة، وتقطيع العصب جزءا لا يتجزأ من راتنج الإيبوكسي تليها تلطيخ مع أزرق تولويدين أو حل فينيلينيدياميني قد استخدمت لقياس التغيرات المورفولوجية للأعصاب المحيطية التجديد 11،12 . كل هذه الأساليب لديها مزايا والغلة البيانات الأساسية في العدد من محاور عصبية وسمك المايلين وقطر إكسون وقطر إكسون للألياف ميليناتيد القطر (ز-نسبة) 11،،من1314،15 .

الفرق الأساسي من الراتنج التضمين في هذا البروتوكول أنه يسهل الحصول على 1-2 ميكرومتر سمك المقاطع العرضية بسبب صلابة الراتنج مع الحفاظ على الصفات النسيجي للعصب. توفر هذه المقاطع رقيقة، بدلاً من 4-5 ميكرومترات سمك المقاطع التي تم الحصول عليها من البارافين التضمين، أقسام الأعصاب الطرفية مع دقة أعلى، مما يسمح لتحديد كمي myelination إكسون، مثل نسبة ز، التي لا يمكن أن تكون أكثر دقة التي تم الحصول عليها من أثخن الأبواب16. بينما تمزيقها المبردة التي يمكن استخدامها للحصول على الأجزاء 1-2 ميكرومتر، فقد خبرتنا أن من الأصعب الحصول على المقاطع دون تصدعات كبيرة عديدة. يمكن أن يسبب مثل هذه المقاطع متصدع عد غير دقيق لعدد محاور عصبية وجوانب مييلينيشن.

بالإضافة إلى أزرق تولويدين تلطيخ17، يمكن أيضا استخدام فضية تلطيخ الأسلوب18 و Masson's trichrome المصبوغة4 لإظهار العصب محاور عصبية. ومع ذلك، استخدام الراتنج تضمين المقاطع العصب الوسيط الفئران الملون مع أما الهيماتوكسيلين ويوزين أو ماسون في اﻷغماد المايلين خافت أظهرت trichrome وهياكل غير المعترف بها، بينما تلطيخ تولويدين الأزرق وأظهرت صورة واضحة المايلين غمد ويمكن بسهولة تكون الكمية4. وعلى الرغم من بعض القيود، الأعصاب تولويدين الأزرق تلطيخ راتنج المضمنة الطرفية هو تقنية قيمة يمكن استخدامها عندما تكون الصور عالية الدقة للعصب مورفولوجيا مطلوباً.

العيب الرئيسي لتضمين الراتنج هو أنها تستغرق وقتاً طويلاً ولا تسمح إيمونوستينينج النسيج نفسه نظراً لصعوبة استرجاع مستضد بالمقارنة مع البارافين وتقنيات الأقسام المضمنة المجمدة. وهكذا، من غير الممكن عموما الاستفادة من الأنسجة نفسها إيمونوستينينج التي يتم معالجتها عن طريق تضمين الراتنج لتلطيخ تولويدين الأزرق. على الرغم من عدم المستخدمة هنا، إذا كان المطلوب هو إيمونوهيستوتشيميستري في الراتنج يسمح المضمنة أقسام، استخدام ميثاكريلات غليكول التضمين راتنجات immunohistochemistry المراد تنفيذها على أقسام الأنسجة، إلا أنها باهظة الثمن نسبيا19. هذا يمكن التخفيف إلى حد ما بقطع الأعصاب الطرفية إلى أجزاء منفصلة، وبعض لتضمين الراتنج وآخرون ل immunostaining مباشرة بعد التثبيت.

عملية تولويدين الأزرق تلطيخ راتنج مضمن الأعصاب المحيطية، كما مع تحليل آخر نسيجية، يمكن تقسيم إلى خمس مراحل، بما في ذلك التثبيت، الجفاف، والتضمين، وتمزيقها، وتلطيخ20. ونحن نهدف هنا إلى توفير بروتوكول ومبادئ توجيهية عملية لاستخدام الراتنج الملون فروع العصب الوركي الفئران المضمنة مع تولويدين الأزرق للحصول على صور ذات جودة عالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

واستخدمت الفئران "سبراغ داولي" الكبار في هذا المشروع ووافق جميع الإجراءات بجامعة وايومنغ مؤسسات الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة.

1-الجراحة وفي تثبيت العصب فيفو

ملاحظة: يتم سرد معلومات المورد لجميع المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول للمواد.

ملاحظة: يتم استخدام في فيفو التثبيت العصب للمحافظة على الأنسجة والحد من التدهور الهيكلي التي يمكن أن تحدث بين وقت الوفاة وجمع للأعصاب. في فيفو تثبيت الأنسجة ممارسة معيارية لإعداد النسيج العصبي للأنسجة، حيث التروية غالباً ما تكون مقدمة لهذا. موضع وحجم الأعصاب المحيطية المسموح به للتثبيت في الموقع. لا نوصي بجمع وتثبيت الأنسجة بعد القتل الرحيم نظراً لإمكانية تدهور الأنسجة.

  1. إعداد الفئران للتخدير العام بوضعه في دائرة للاستقراء مع إيسوفلوراني 2-3%، ثم وضع الفئران أنيسثيتيزيد في موقف المعرضة على رأس حصيرة تشريح والاحتفاظ بها في 1-2% إيسوفلوراني عن طريق تخدير الآنف مخروط. لضمان العمق الكافي للتخدير، اختبار الحيوانات لسحب الدواسة تحت أقدام هند والتحقق من عدم وجود ردود الفعل بالبيبرال في العيون بلمس كانتوس الآنسي للعين.
    ملاحظة: حقن داخل الكيتامين بديل استخداماً إلى المستنشق isoflurane.
  2. كشف العصب الوركي، حلق شعر hind limb(s) وتنظيف المناطق حلق مع الإيثانول 70%. بدون مشرط أو مقص، جعل شق 2-3 سم في الجلد على طول أطرافهم هند من الركبة حتى تروتشانتير أكبر، حيث الجس من عظم الفخذ باستخدام مشرط معقم لضمان الموقع المناسب للشق. ويقع عظم الفخذ الدانية فقط في متناول معظم الجزء من العصب الوركي. على الرغم من أن هذا عملية جراحية غير البقاء على قيد الحياة، المحافظة على تقنيات عقيمة.
  3. بعد إجراء شق الجلد، تحديد موقع الطائرة بين العضلات الفخذية ذات الرأسين وعضلة عضلة مكسيموس، واستخدام مقص ميكروديسيكشن فصل اللفافة الكامنة وفضح 2-3 سم على العصب الوركي التسطير. لعرض مقطع واضح للعصب الوركي، استخدام ضام إلى توسيع الفجوة بين عضلات هما (الشكل 1A). مع غرامة ملقط ومقص آيريس، بعناية منفصلة العصب من الأنسجة الضامة، أخذ عناية كبيرة ليس ضغط أو قطع العصب المحيطة.
  4. إضافة مثبت كافية ترامب (فورمالدهايد 4 ٪، 1 ٪ glutaraldehyde في 1 x برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) مع 1.16 غرام NaH2PO4· H2O كل 100 مل) في تجويف يحتوي على الأعصاب المكشوفة لتغطية العصب والسماح للجلوس لمدة 10 دقائق. إذا كان ضروريا، شاش مكان تحت هند الساق لتحسين الزاوية بحيث يمكن إضافة مزيد من مثبت في التجويف. إزالة مثبت بعد 10 دقيقة، وكرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
  5. استخدام مجهر تشريح، قطع العصب من كلا الجانبين باستخدام مقص تشريح غرامة، مع التأكد من عدم تمدد أو قرصه العصب الوركي، وفورا بوضع المقاطع العصب في أنابيب 15 مل تحتوي على مثبت ترامب في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد، تغيير مثبت كل 48 ساعة.
  6. لا تترك الحيوانات غير المراقب خلال أي جزء من العملية الجراحية. بعد إزالة العصب، euthanize الحيوانات بخلع عنق الرحم تحت التخدير.

2-أكسيد الاوزميوم المعاملة وتضمينها الراتنج

  1. بعد التثبيت، بعناية إزالة أي الدهون المتبقية والأنسجة الضامة من العصبية واستخدم مشرط حاد لقطع العصب إلى شرائح حوالي 5 مم في الطول (العصب يمكن فصل أجزاء والمسمى في أنابيب مختلفة). إعداد الطازجة أكسيد أوزميوم 2% المخفف في حل مثبت ترامب وتبقى في أنبوب زجاج. تزج شرائح العصب في أكسيد الاوزميوم 2% ح 2، التي يمكن أن تكون في أنابيب بلاستيكية لهذه الفترة القصيرة من الزمن.
    ملاحظة: بعض أنابيب البلاستيك يتفاعل مع أكسيد الاوزميوم، مما تسبب سواد من الحل، ولذلك لا ينصح بتخزين طويلة من أكسيد الاوزميوم في أنابيب بلاستيكية.
  2. استخدام الإيبوكسي تضمين مجموعة متوسطة، إعداد الصيغة النهائية التضمين:
    1. المزيج الإيبوكسي التضمين المتوسطة مع الحل دسا (دوديسينيلسوكسينيك الخل؛ خليط A) والمزيج الإيبوكسي التضمين المتوسطة مع دكتور الحل (ميثيلناديك الخل؛ خليط ب). واسمحوا كلا المخاليط مزيج أ وب 20 دقيقة على الأقل بالتحريك مع محرض مغناطيسية.
    2. فورا قبل الاستخدام، مزيج الخليط A و B وإضافة المسرع DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) في نسبة 1.5 إلى 2.0 في المائة الحجم الكلي للمخلوط. لاحظ أن الحل DPM-30 ينبغي قياس أدق الحيلولة دون أن يصبح داكن اللون وهش في الكتلة. جميع راتنج الكيماويات السامة؛ اتخاذ المزيد من الحيطة لمنع تماس الجلد أو الاستنشاق.
  3. استخدام أنابيب 1.5 مل، تغسل شرائح العصب مع برنامج تلفزيوني وبدء عملية الجفاف عن طريق وضع شرائح العصب في الممرات المائية المختلفة الأسيتون/المقطر: 30%، 60%، 90%، تركيزات لمدة 10 دقائق، ثم في الأسيتون 100% 3 مرات لكل 10 دقائق.  ملاحظة يمكن استخدام الإيثانول أن مكان الأسيتون.
  4. لتسلل الراتنج، ضع شرائح العصب في خليط جزء 1 من خليط الدمج النهائي والاسيتون 100% الجزء 1 لمدة 30 دقيقة، ثم في خليط من 2 أجزاء من خليط الدمج النهائي والاسيتون 100% الجزء 1 لمدة 30 دقيقة ، وأخيراً مكان قطع العصب في النهائي التضمين الخليط لمدة 30 دقيقة.
  5. وضع شرائح العصب في تضمين قوالب مطاط السيليكون (استخدمت طول 106 مم × 71 مم عرض × 7 مم عمق؛ كتلة الحجم 11 مم طول × 6 مم عرض × 3 مم). إضافة الراتنج على رأس الأعصاب، مع التأكد من تغطية قطاعات العصب كلها وتجنب الوقوع في فقاعات الهواء بلطف. اترك القالب الذي يحتوي على شرائح العصب مع الراتنج بلمرة عند 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

3-تقطيع قبل أولتراميكروتومي

  1. إعداد سكاكين الزجاج باستخدام صانع سكين زجاج (الشكل 1B) وجعل السكاكين الزجاج مع قوارب (الشكل 1)، التي تستخدم لتجميع المقاطع العصب تطفو على الماء المقطر.
  2. وضع كتل الأعصاب راتنج المضمنة في حامل أولتراميكروتومي مع الجانب المنحرف مواجها لأعلى. باستخدام نطاق أولتراميكروتومي، تقليم أي راتنج الزائدة المحيطة بالانسجة العصبية، وكتلة تواجه شكل شبه منحرف وأقرب سطح طولية للعصب ممكن استخدام شفرة مفرد ذو حدين، مثل شفرة حلاقة. عدم اختراق السطح طولية من الجزء العصبية، ومعترف بها في تلطيخ الظلام بأكسيد الازميوم.
    ملاحظة: سوف يقلل تشذيب راتنج الزائدة مجال الراتنج يكون مقطوع وتحسين أداء بليد وقطع في الخطوات اللاحقة.
  3. باستخدام في أولتراميكروتومي، جعل متعددة المقاطع العرضية يكفي لتعريض سطح مقطع عرضي موحد من الأنسجة العصبية باستخدام سكين زجاج عادي. بمجرد القيام بذلك، قم بالتبديل إلى سكين زجاج الذي قارب مليء بالماء المقطر في درجة حرارة الغرفة وضبط أولتراميكروتومي إلى 1-2 ميكرومتر قطع مقاطع رقيقة.
  4. نقل المقاطع رقيقة عائمة من القارب سكين الزجاج إلى قطره ماء منزوع على شريحة الزجاج باستخدام حلقة معدنية (الشكل 1). الجاف للشرائح التي تحتوي على مقاطع بتمرير عدة مرات على لهب لبضع ثوان، مع التأكد من عدم أسخن المقاطع. وصمة عار الأجزاء المجففة فورا مع تولويدين الأزرق أو تخزين في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام قبل التلوين.
    ملاحظة: الأقسام يمكن أيضا أن تجفف باستخدام لوحة أكثر دفئا عند 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يجعل عملية تجفيف بطيئة المقاطع السلس.

4-تولويدين الأزرق تلطيخ

  1. إعداد الحل 1% من تولويدين الأزرق بتذويب ز 2 من بورات الصوديوم في 100 مل مياه، ثم أضف 1 ز تولويدين الأزرق ويحرك حتى يذوب. تصفية الحل باستخدام ورق الترشيح (المسامية الحجم: 11 ميكرومتر)، ويبقى الحل في زجاجة معتمة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوعين.
  2. استخدام ماصة بلاستيكية أو بيبيتور الصغرى، إضافة قطره حل تولويدين الزرقاء على رأس فروع العصب ويغادر إلى 20-30 ثانية.
  3. شطف جميع الحل تولويدين الأزرق الزائد بلطف غمس الشرائح في جرة المياه. وكرر 3-4 مرات حتى تكون المقاطع واضحة. الجاف للشرائح على الأقل 15 دقيقة في 60 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة وثم تغطي الأجزاء مع ساترة استخدام التركيب العادية المتوسطة. دراسة الشرائح المحملة مباشرة أو تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  4. فحص تحت مجهر خفيفة. ينصح بعدسة غمر نفط X 100 لصور مفصلة المستخدمة لحساب نسب ز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

راتنج مضمن الأعصاب الطرفية المقاطع ملطخة تولويدين الأزرق تسمح لبيانات نسيجية دقيقة كوانتيفيكيشنز. لمحة عامة عن الإجراء الذي يظهر في (الشكل 2). أقسام الأعصاب الوركي جزءا لا يتجزأ من الراتنج المتوسطة وملطخة بالصور أزرق تولويدين أظهرت واضح مع الدقة المثلى (3 أرقام). يمكن أن يسبب تلف الأعصاب العديد من التغييرات في العصب هياكل المورفولوجية، على سبيل المثال، التغييرات في الألياف العصبية وقطر إكسون وثخانة غمد المايلين. هذا الأسلوب يمكن الحفاظ على بنية العصب في شكل طبيعي، مما يسهل قياس العديد من المعلمات مثل نسبة قطر إكسون إلى القطر إجمالي الألياف (ز-النسبة؛ الشكل 4). يمكن أن تؤدي مجموعة متنوعة من العوامل إلى أقسام الأعصاب المحيطية أقل من المستوى الأمثل بما في ذلك وجود شقوق (الشكل 5A) في القسم بسبب سوء معالجة العصب. كما يمكن أن تحدث ثقوب في المقطع (الشكل 5B) بسبب الجفاف غير كافية. هو الطي خطأ ممكن آخر في الإجراء من الفروع (الشكل 5)، التي يمكن علاجها باستخدام الحلقات تطعيم لنقل القسم على شريحة الزجاج.

Figure 1
رقم 1: جراحة وتمزيقها. (أ) الفئران العصب الوركي أثناء التثبيت في فيفو . (ب) الزجاج سكين صانع (ج) الزجاج السكاكين مع القارب. (د) طرح الحلقات المعدنية المستخدمة لنقل المقاطع رقيقة من السكاكين الزجاج إلى قطره من المياه على الشريحة الزجاجية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: التخطيطي للطريقة المستخدمة في هذا البروتوكول- (أ) "الكبار سبراغ داولي" تخديره من الفئران، تليها في فيفو العصب التثبيت (ب) والعصب المجموعة (ج). والخطوة التالية هي بعد انتهاء التثبيت مع أكسيد الاوزميوم 2% (د) وراتنج التضمين (ه). الراتنج العصب المضمنة الأقسام ثم قلص (F) ومقطعة (ز) استخدام أولتراميكروتومي. وأخيراً، العصب ملطخة المقاطع على الشريحة الزجاجية مع تولويدين الأزرق (ح). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: المقطع العرضي للعصب الوركي الفئران ملطخة أزرق تولويدين. تظهر المقاطع تحت تكبير مختلفة (10 X 20 X، 40 س و 60 س) صورة واضحة مع القرار الأمثل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: المقطع العرضي للعصب الوركي الفئران ملطخة أزرق تولويدين. يمكن استخدام هذه الصورة ذات الدقة العالية (100 X) لقياس نسبة قطر إكسون إلى القطر إجمالي الألياف (ز-النسبة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: مقاطع عرضية للعصب الوركي الفئران ملطخة تولويدين الأزرق تحت تكبير مختلفة. سيظهر أريزومي المشاكل التي يمكن مواجهتها أثناء أداء هذا البروتوكول. (أ) و (ب). وجود الشقوق والثقوب داخل المقطع العصبية الناجمة عن سوء التعامل مع قسم والجفاف غير كافية للأنسجة، على التوالي. (ج)-للطي للفروع، الذي قد يحدث أثناء نقل المقاطع من السكاكين الزجاج إلى الشريحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

امتحانات هياكل المورفولوجية لإصابة الأعصاب المحيطية والتجديد مواضيع متكررة من دراسة13. في هذا البروتوكول، يصف لنا الخطوات للحصول على صور ذات جودة عالية للبيانات النسيجي كوانتيفيكيشنز استخدام أنسجة العصب الوركي الفئران جزءا لا يتجزأ من كتل الراتنج والملون باللون الأزرق تولويدين. هذا الأسلوب يوفر صورة مورفولوجيا العصبية التي يمكن قياسها كمياً في التجديد العصب بقياس عدد محاور عصبية، ودرجة مييلينيشن ووجود أنسجة تليفية إينفيلتراتيفي والأعصاب الصحة. بينما تظهر الصور تقطيع وتجهيز للأعصاب يصب كعينات، ونفس الخطوات ومواد قابلة للتطبيق إلى إصابة الأعصاب والأعصاب مجدد مع قنوات أو الأنسجة الطعوم، قدم هذا التثبيت من الأنسجة هو كاف20، 21.

بينما جميع الخطوات للبروتوكول ضرورية، بعض هذه الخطوات من المرجح أن يؤدي إلى سوء نوعية المقاطع أو الصور. جفاف الأنسجة غير كافية قد يؤدي إلى ثقوب في فروع العصب (الشكل 5 (ب)). أحد التفسيرات المحتملة هو إيميسسيبيليتي الراتنج مع المياه، والمياه الزائدة في الأنسجة يمنع الراتنج من التسلل إلى النسيج. ولذلك، مما يتيح الوقت الكافي واستخدام الأسيتون المطلق ضروري لضمان الخطوة الجفاف المناسب. على الرغم من أننا استخدام الأسيتون في هذا البروتوكول، يمكن أيضا استخدام الإيثانول. ومع ذلك، العديد من الراتنجات، ليست المتفاعلة مع الإيثانول، ذلك الأنسجة يجب أن تعامل مع أكسيد البروبيلين بمثابة مرحلة انتقالية بين الجفاف الإيثانول وتضمين راتنج.

بسبب ركاكة المقاطع، ينبغي أن يتم نقل أقسام الأعصاب من السكين الزجاج على الشريحة الزجاجية بعناية كبيرة (الشكل 5). 1-2 ميكرومتر أقسام هشة للغاية، ويمكن أن تسبب سوء نقل القسم القسم لكسر. إذا كان المقطع يتم انتقاؤها في الجزء المركزي من القسم بإبرة، القسم هو عرضه للطي في حد ذاته وغالباً ما يكون من الصعب تتكشف عند تحويلها إلى الشريحة. يمكن أن تستخدم أدوات مختلفة لنقل المقطع إلى الشريحة الزجاج، بما في ذلك الإبر والحلقات، وينبغي اختبار كل لمستخدم معين لتحديد التي سوف تسفر عن نقل أفضل النتائج. لأغراضنا، استخدام حلقة الذي يمكن أن يشمل المقطع بأكمله إلى حد كبير انخفاض طي المقاطع عندما نقلوا من السكين الزجاج إلى الشريحة المجهر (الشكل 1).

وبصفة عامة، المناولة السليمة للأعصاب ضروري ضغط الأعصاب يمكن أن تسبب شقوق تحدث في أقسام الأعصاب (الشكل 5A). يمكن أن يحدث ضغط أنسجة العصب أثناء نقل الأجزاء العصبية في عمليات التعرض في الحيوان والتثبيت، والجفاف، وتضمين الراتنج. لتجنب ضغط أنسجة العصب، العصب قطاعات ينبغي أن تنقل بالملقط غرامة والتقطت في واحدة من نهاية الجزء من الناحية المثالية قبل مجرد طبقة ابينيوريال، حيث لن تؤثر على العصب الكامل. وجود شقوق وخطوط (علامات السكين) في أقسام الأعصاب تحدث أيضا بسبب سكاكين الزجاج مملة أو يبالغ. ضمان تمزيقها الأمثل، نوصي بصنع الزجاج الطازجة السكاكين وتغيير السكين الزجاج يقطع كل 25-30، أقل إذا كان تقطيع عن طريق العصب المغطى داخل قناة.

يمكن أن تكون مكلفة نسبيا الراتنجات، غير كافية عند المقاطع الطولية الأعصاب مطلوبة، ويمكن أن تتطلب أدوات مكلفة مثل أولتراميكروتومي وصانع سكين زجاج. وعلى الرغم من هذه القيود، لا يزال يعتبر تولويدين الأزرق تلطيخ راتنج المضمنة الطرفية العصبية المقاطع المعيار الذهبي لتصور مقاطع العرضية للأعصاب الطرفية مورفوميتري4،5. مقاطع طولية يمكن أيضا الكشف عن السمات الهامة للأعصاب المحيطية، مثل استمرارية محواري ورانفييه للعقد، ولكن مفيدة جداً مع إيمونوهيستوتشيميستري. في مثل هذه الحالات هو أن الممارسة العامة لتجهيز خلطات قسمين للعصب نفسه، واحدة تولويدين الأزرق المقاطع العرضية، والأخرى ل immunohistochemistry الطولية. بسبب زيادة حالات الصدمة العصبية المحيطية والإصابات والاحتياجات لأفضل طريقة لتقييم هياكل المورفولوجية العصب، هذا الأسلوب يمكن الاستمرار في تطبيق كأداة أساسية الحصول على بيانات النسيجي من تلف الأعصاب والتجدد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب أود أن ثانكثي "جنكينز مرفق الفحص المجهري" في جامعة وايومنغ لمساعدتهم، وأعضاء المختبر البوشمان، روبالو كيلي وصحيح هايدن، أوسيمانجيانج وبو وسوباش دونغانا، للمساعدة في رعاية الحيوان. هذا المنشور تسنى "جائزة التنمية المؤسسية" (فكرة) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "معاهد الصحة الوطنية في" إطار منحة # 2P20GM103432.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline Gibco 14200-075
Glutaraldehyde Solution Sigma-Aldrich G6257
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate Acros Organics 205950010
Isoflurane Piramal NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit Sigma-Aldrich 45359
Sodium Hydroxide Solution Sigma-Aldrich 72068 To adjust Trump's fixative pH
Acetone Fisher Chemical 170942
Osmium Tetroxide Solution Sigma-Aldrich 75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus VWR 48311-703
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12545102
Pelco Embedding Cast Fisher Scientific NC9671811
Glass Knife Maker RMC Products GKM-2
Ultramicrotome RMC Products MT-XL
15 mL Conical Tube Falcon ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661
4 mL Glass Vial Sigma-Aldrich 854190
Razor Blades VWR 55411-050 For trimming resin block
Perfect Loop Electron Microscopy Sciences 70944 For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm Electron Microscopy Sciences 71012
100 Watt Oven Millipore  6350115
Whatman Filter Paper Sigma-Aldrich WHA10010155
3 mL plastic pipette Sigma-Aldrich Z331740
Micro-surgical Kit World precision instruments
Olympus fluorescence microscope Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
  2. Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
  3. Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57, (4), 462-471 (2006).
  4. Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
  5. Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
  6. Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. 709-717 (2011).
  7. Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
  8. Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
  9. Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
  10. Dykstra, M. J. A manual of applied techniques for biological electron microscopy. Plenum. New York. 257 (1993).
  11. Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107, (6), 1168-1189 (2007).
  12. Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3, (69), 99-105 (1964).
  13. Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. 65-77 (2008).
  14. Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
  15. Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33, (5), 1363-1375 (2012).
  16. Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31, (1), 7-23 (2012).
  17. Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20, (1), 37-41 (2000).
  18. Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
  19. Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30, (1), 27-33 (2007).
  20. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8, (3), 72-79 (2016).
  21. Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
  22. Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28, (5), 79 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics