Toluidine blå flekker av harpiks-Embedded seksjoner for evaluering av eksterne Nerve morfologi

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å visualisere fine strukturer av eksterne nerver av å skaffe og flekker 1-2 µm seksjoner med toluidine blå

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ghnenis, A. B., Czaikowski, R. E., Zhang, Z. J., Bushman, J. S. Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology. J. Vis. Exp. (137), e58031, doi:10.3791/58031 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Eksterne nerver utvide i hele kroppen, innervating målet vev med motor eller sensoriske axons. På grunn av alminnelig utbredt distribusjon, er perifere nerver ofte skadet på grunn av traumer eller sykdom. Som metoder og strategier har blitt utviklet for å vurdere eksterne nerve skade i dyremodeller, funksjon og gjenfødelse, er analysere morphometry av eksterne nerve blitt en viktig terminal utfallet måling. Toluidine blå flekker av nerve tvers deler fra harpiks innebygd nerve deler er en reproduserbar metode for kvalitativ og kvantitativ vurderinger av eksterne nerver, aktivere visualisering morfologi antall axons og grad av myelination. Denne teknikken, kan som med mange andre histologiske metoder, være vanskelig å lære og mestre bruker skriftlig standardprotokoller. Hensikten med denne publikasjonen er derfor å fremheve skriftlig protokoller for toluidine blå flekker av eksterne nerver med videography av metoden bruker sciatic nerver høstet fra rotter. I denne protokollen, beskriver vi i vivo perifere nerve fiksering og samling av vev og etter fiksering med 2% osmium tetroxide, innebygging av nerver i epoxy harpiks og ultramicrotome snitting av nerver til 1-2μm tykkelse. Nerve deler deretter overført til et glass lysbilde og farget med toluidine blå, etter som de kvalitativt og kvantitativt vurderes. Eksempler på de vanligste problemene vises, og fremgangsmåten for begrensende disse problemene.

Introduction

Eksterne nerver utvide i hele kroppen, innervating målet vev med motor eller sensoriske axons1. Eksterne nerve feil forårsaket av medisinske lidelser og traumer representerer en stor offentlig helse bekymring og har store økonomiske virkninger2,3. Til tross for fremskritt i vurdere resultatene av eksterne nerve skader og forstå nerven fornyelse, er tradisjonelle metoder som nerve histologi og flekker teknikker viktige verktøy å kvalitativt og kvantitativt vurdere nerve helse som en terminal utfallet måling i dyremodeller eller forbrukeravgift menneskelig vev. Dette er ofte kombinert med elektrofysiologiske målinger av eksterne nerve funksjon, hvor morphometry kan avsløre hvorfor funksjonelle nerven fornyelse gjorde ikke eller.

Toluidine blå flekker av harpiks innebygd semi tynn perifere nerve er en spesialisert metode for imaging myelinated nerve fibre, gir høy kvalitet og fjern detaljerte bilder av nerve strukturer4,5,6 . Toluidine blå er en syre metachromatic flekken, oppdaget av William Henry Perkin i 18567, og har blitt brukt i flere medisinske anvendelser8. Toluidine blå-farget perifere nerve deler fra harpiks-embedded nerve segmenter kan tydelig visualisering av nerve strukturer. Visualisering av myelin-skjeden strukturen kan styrkes ved bruk av osmium tetroxide etter fiksering4,9. Osmium tetroxide er en giftig oksiderende og lipid etappe, den stabiliserende agent som samhandler med dobbel bindingene i lipider, noe som resulterer i tydelig definerte lipid-rik myelin sheaths10. Imidlertid osmium tetroxide er giftige, dyr, krever en lengre inkubasjonstiden for nerve segmenter, og brukes ikke alltid.

Alternative metoder for behandling og flekker har blitt utviklet for visualisering av eksterne nerve morfologi; Parafin, kryogene snitting og epoxy harpiks-embedded nerve snitting etterfulgt av flekker med toluidine blå eller phenylenediamine brukes å kvantifisere morfologiske endringer av eksterne nerven fornyelse 11,12 . Disse metodene har sine fordeler og gir viktige data på antall axons, myelin tykkelse, diameter axon og axon diameter myelinated fiber diameter (g-forholdet) 11,13,14,15 .

Primære æren av harpiks-innebygging i denne protokollen er at det muliggjør å få 1-2 μm tykkelse tverrsnitt på grunn av harpiks hårde samtidig opprettholde histologiske kvaliteter av nerve. Disse tynne snitt, i motsetning til de 4-5 μm tykkelse delene fra parafin embedding, gi eksterne nerve seksjoner med høyere oppløsning, noe som åpner for en mer nøyaktig kvantifisering av axon myelination, for eksempel g-forholdet, som ikke kan Hentet fra tykkere deler16. Mens kryogene snitting kan brukes til å få 1-2 µm deler, er det vår erfaring at det er vanskeligere å få avsnitt uten mange store sprekker. Slike sprakk inndelinger kan føre til unøyaktige telling av antall axons og aspekter av myelination.

I tillegg til toluidine blå flekker17, kan sølv flekker metoden18 og Masson's trichrome flekker4 også brukes til å vise nerve axons. Men farget ved hjelp av harpiks innebygging av rotte median nerve deler med enten hematoxylin eosin eller Masson's trichrome viste svak myelin hylser og ukjent strukturer, mens toluidine blå flekker viste klart myelin-skjeden bilde og enkelt kan være kvantifisert4. Til tross for noen begrensninger, toluidine blå flekker av harpiks innebygd ekstern nerver er en verdifull teknikk som kan brukes når bilder med høy oppløsning av nerve morfologi.

Den eneste ulempen for harpiks innebygging er at det er tidkrevende og ikke tillater immunostaining av samme vev på grunn av vanskelighetene med antigen henting i forhold til parafinsnitt og frosne innebygde deler teknikker. Dermed er det ikke vanligvis mulig å benytte samme vev for immunostaining som behandles via harpiks-innebygging av toluidine blå flekker. Selv om ikke brukt her, hvis immunohistochemistry i harpiks innebygde deler, bruk av glykol methacrylate innebygging harpikser tillater immunohistochemistry utføres på vev deler, men det er relativt dyre19. Dette kan reduseres noe ved å kutte perifere nerve i separate segmenter, noen for innebygging av harpiks og andre for immunostaining rett etter fiksering.

Prosessen med toluidine blå flekker av harpiks innebygd ekstern nerver, som med de fleste histopathological analyse, kan bli delt opp i fem stadier, inkludert fiksering, dehydrering, innebygging, skjæring og flekker20. Vi ønsker her å gi en protokoll og praktiske retningslinjer for bruk av harpiks innebygde rotte ischias nerven deler farget med toluidine blå å kjøpe høy kvalitet bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Voksen Sprague Dawley rotter ble brukt i dette prosjektet og alle prosedyrer ble godkjent av University of Wyoming institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen.

1. kirurgi og i Vivo Nerve fiksering

Merk: Leverandørinformasjon for alle materialer og utstyr som brukes i denne protokollen er oppført i Tabellen for materiale.

Merk: I vivo nerve fiksering brukes å bevare vevet og redusere strukturelle fornedrelse som kan oppstå mellom død og samling av nerver. I vivo vev fiksering er vanlig praksis for utarbeidelse av nervesystemet-vev for histology, der perfusjon er ofte en forløper til dette. Plassering og størrelse av eksterne nerver tillatt for i situ fiksering. Vi anbefaler ikke innsamling og fiksering av vev etter euthanasia på grunn av muligheten for vev degradering.

  1. Forberede rotta narkose ved å plassere den i en induksjon kammer med 2-3% isoflurane, og plassere bedøvet rotta i liggende stilling på disseksjon mat og opprettholde på 1-2% av isoflurane via bedøvende nesen kjegle. For å sikre tilstrekkelig dybdeskarphet anestesi, test dyr for pedal uttak på bakben feet og sjekk for fraværet av palpebral reflekser på øynene ved å berøre den mediale canthus av øyet.
    Merk: Intraperitoneal injeksjon av Ketamin er et vanlig alternativ til inhalert isoflurane.
  2. For å avsløre sciatic nerve, barbere håret av hind limb(s) og rengjør barbert områdene med 70% etanol. Med en skalpell eller saks, gjør en 2-3 cm snitt i huden langs hind lem fra kneet til den større trochanter, der palpasjon av femur bruke den sterile skalpell for å sikre riktig plassering av innsnitt. Femur ligger bare proksimale mest tilgjengelige segmentet av ischias nerven. Selv om dette er en ikke-overleve kirurgi, opprettholde sterilt teknikker.
  3. Etter den hud snittet, Finn flyet mellom biceps femoris muskelen og gluteus maximus muskler, og bruker microdissection saks skille underliggende fascia og utsette 2-3 cm understreking sciatic nerve. For å avsløre en klar delen av ischias nerven, bruker du et festepunkt utvide gapet mellom to musklene (figur 1A). Med fine tang og iris saks, forsiktig skille nerve fra rundt bindevev, tar stor forsiktighet for ikke å komprimere eller kuttet av nerve.
  4. Legg nok Trump bindemiddel (4% formaldehyd, 1% glutaraldehyde i 1 x PBS (fosfat bufret saltvann) med 1.16 g NaH2PO4· H2O per 100 mL) inn i hulrommet som inneholder synlige nerve for å dekke nerve og la sitte i 10 min. Hvis nødvendig, sted gasbind under hind ben for å forbedre vinkelen slik at flere bindemiddel kan legges inn i hulrommet. Gjenta dette trinnet to ganger fjerne bindemiddel etter 10 min.
  5. Bruke en dissecting mikroskop, kuttet nerve fra begge sider med fine disseksjon saks, og pass på ikke å strekke eller knipe den sciatic nerven, og umiddelbart sette delene nerve i 15 mL rør som inneholder Trump bindemiddel på 4 ° C i en uke, endre den bindemiddel hver 48 timer.
  6. Ikke la dyr uovervåket under alle deler av den kirurgiske prosedyren. Etter fjerning av nerve, avlive dyrene av cervical forvridning under anestesi.

2. Osmium Tetroxide behandling og harpiks innebygging

  1. Bokfører fiksering, nøye fjerne eventuelle gjenværende fett og bindevev fra nerve og bruker en skarp skalpell for å kutte nerve i segmenter ca 5 mm i lengde (nerve segmenter kan atskilt og merkes i forskjellige rør). Forberede frisk 2% osmium tetroxide fortynnet i Trump etappe, den stabiliserende løsning og holde i røret. Fordype nerve segmenter i 2% osmium tetroxide for 2 h, som kan være i plast rør for denne kort tidsperiode.
    Merk: Noen plast rør reagerer med osmium tetroxide, forårsaker en mørkere løsningen, så langvarig lagring av osmium tetroxide i plast rør ikke anbefales.
  2. Bruker en epoxy innebygging middels kit, Forbered den endelige innebygging formelen:
    1. Bland epoxy innebygging medium med DDSA løsning (dodecenylsuccinic anhydride, blanding A) og bland epoxy innebygging medium med NMA løsning (methylnadic anhydride, blanding B). La begge blandinger A og B blande minst 20 min av omrøring med en magnetisk rørestang.
    2. Umiddelbart før bruk, bland blandingen A og B og tilsett gasspedalen DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) i forhold til 1,5 til 2.0% av det totale volumet av blandingen. Merk at DPM-30 løsningen bør måles nøyaktig for å forhindre at den blir mørk i fargen og sprø. Alle harpiks kjemikalier er giftig; ta ekstra forsiktighet for å unngå hudkontakt eller innånding.
  3. Bruke 1,5 mL rør, vaske nerve segmenter med PBS og starte dehydrering prosessen ved å plassere nerve segmentene i forskjellige aceton/destillert vann passasjer: 30%, 60%, 90%, konsentrasjoner i 10 minutter hver, så 100% aceton 3 ganger for 10 min.  Merk at etanol kan brukes i aceton.
  4. For harpiks infiltrasjon, plassere nerve segmentene i en blanding av 1 del av siste innebygging blandingen og 1 del 100% aceton i 30 min, så i en blanding av 2 deler av siste innebygging blandingen og 1 del 100% aceton i 30 min , og endelig sted nerve segmenter i finalen innebygging blanding i 30 min.
  5. Sette nerve segmentene i silikongummi innebygging muggsopp (vi har brukt 106 mm lengde x 71 mm bredde x 7 mm dybde, blokk størrelse 11 mm lengde x 6 mm bredde x 3 mm dybde). Forsiktig legge harpiks på nervene, sørge for å dekke hele nerve segmentene og unngå å gjøre luftbobler. La mold som inneholder nerve segmenter med skal danner på 60 ° C over natten.

3. skjæring av Ultramicrotome

  1. Forberede glasskniver med et glass knivmaker (figur 1B) og gjør glasskniver med båter (figur 1 c), som brukes til å samle nerve delene flyter på destillert vann.
  2. Sted harpiks innebygd nerve blokker i ultramicrotome holderen med trapesformet siden vendt oppover. Bruker ultramicrotome omfanget, trimme eventuelt overskytende resin rundt nervevev og gjøre blokken møte en trekantet form og som nær langsgående overflaten av nerve som mulig med et enkelt kanter blad, som et barberblad. Ikke trenge gjennom langsgående overflaten av nerve segmentet, som gjenkjennes ved sine mørke flekker av osmium tetroxide.
    Merk: Trimming av overskytende resin vil redusere området skal deles og forbedre blad ytelse og kutte i de etterfølgende trinnene.
  3. Bruke ultramicrotome, lage tverrsnitt tilstrekkelig å avsløre en ensartet tverrsnitt overflaten av nervevev med vanlig glass kniv. Når dette er gjort, Bytt til glass kniv med båt er fylt med destillert vann ved romtemperatur og justere ultramicrotome til 1-2 μm å skjære tynne snitt.
  4. Overføre flytende tynne snitt fra glass kniv båten til en dråpe deionisert vann på glass lysbilde ved hjelp av metall loop (figur 1 d). Tørr lysbilder som inneholder inndelinger ved å sende flere ganger over varme i noen sekunder, og pass på ikke å overopphetes delene. Stain tørket seksjoner umiddelbart med toluidine blå eller lagre i romtemperatur i flere dager før farging.
    Merk: Deler kan også tørkes med en plate varmere ved 60 ° C i 15 min. En langsom tørkeprosessen gjør delene glatt.

4. toluidine blå flekker

  1. Klargjør 1% løsning av toluidine blå ved oppløsning 2 g natriumborat i 100 mL deionisert vann, deretter legge 1 g av toluidine blå og rør til oppløst. Filtrere løsning ved hjelp av filter papir (pore størrelse: 11 µm) og holde løsningen i en ugjennomsiktig flaske ved romtemperatur for to uker.
  2. Bruker en plastikk pipe eller mikro hindre, legge en dråpe toluidine blå løsning på delene nerve og la i 20-30 s.
  3. Skyll av alle toluidine blå løsning overflødig av forsiktig dipping lysbildene i deionisert vann glasset og gjenta 3 - 4 ganger til delene er klart. Tørr lysbilder minst 15 min 60 ° C eller over natten i romtemperatur, og deretter dekke delene med en dekkglassvæske ved hjelp av vanlige montering medium. Undersøke montert lysbildene umiddelbart eller lagrer ved romtemperatur.
  4. Undersøk under lys mikroskop. En 100 X olje nedsenking linsen anbefales for detaljerte bilder brukes til å beregne g-prosenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Harpiks innebygd ekstern nerve deler farget med toluidine blå tillate nøyaktige histologiske data quantifications. En oversikt over fremgangsmåten vises i (figur 2). Sciatic nerver seksjoner innebygd i harpiks medium og farget med toluidine blå viste klare bilder med optimal oppløsning (tall 3). Nerveskader kan forårsake mange endringer i nerve morfologiske strukturer, for eksempel endringer i nerve fiber og axon diameter myelin-skjeden tykkelse. Denne metoden kan bevare nerve strukturen i sin naturlige form, som muliggjør måling av flere parametere som forholdet mellom axon diameter å totalt fiber diameter (g-forholdet; Figur 4). En rekke faktorer kan føre til mindre enn optimal perifere nerve deler inkludert tilstedeværelse av sprekker (figur 5A) i delen på grunn av feil håndtering av nerve. Hull kan også oppstå i delen (figur 5B) på grunn av utilstrekkelig dehydrering. En annen mulig feil i prosedyren er folding av delene (figur 5C), som kan løses ved hjelp av vaksinere løkker for delen overføring på av objektglass.

Figure 1
Figur 1: kirurgi og snitting. (A) rotte sciatic nerve under i vivo fiksering. (B) Glass kniv maker (C) glasskniver med båt. (D) Metall looper brukes til å overføre fløt tynne snitt fra glasskniver til en dråpe deionisert vann på objektglass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk av metoden brukes i denne protokollen. (A) voksen Sprague Dawley rotten er anesthetized, etterfulgt av i vivo nerve fiksering (B) og nerve samling (C). Det neste trinnet er etter fiksering med 2% osmium tetroxide (D) og harpiks innebygging (E). Harpiks innebygde nerve delene er så trimmet (F) og inndelte (G) bruker en ultramicrotome. Til slutt, nerve deler på objektglass er farget med toluidine blå (H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: tverrstilt delen av en rotte sciatic nerve farget med toluidine blå. Viser inndelingene under forskjellige forstørrelse (10 X, 20 X, 40 X og 60 X) klart bilde med optimal oppløsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: tverrstilt delen av en rotte sciatic nerve farget med toluidine blå. Denne oppløsning (100 X) kan brukes til å måle forholdet axon diameter å totalt fiber diameter (g-forholdet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: tverrgående deler av en rotte sciatic nerve farget med toluidine blå under ulike forstørrelser. Vises aresome av problemene som kan oppstå under utførelsen av denne protokollen. (A) og (B). Tilstedeværelsen av sprekker og hull i delen nerve skyldes feil håndtering av delen og utilstrekkelig dehydrering i vevet, henholdsvis. (C). Folding av deler, som kan skje under overføring delene fra glasskniver til lysbildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Undersøkelser av morfologiske strukturer av eksterne nerve skader og gjenfødelse er hyppige fag studie13. I denne protokollen beskriver vi fremgangsmåten for å få høy kvalitet bilder for histologiske dataene quantifications ved hjelp av rotte sciatic nervevev innebygd i harpiks blokker og farget med toluidine blå. Denne teknikken gir et bilde av nerve morfologi der nerven fornyelse kan kvantifiseres ved å måle antall axons, myelination, tilstedeværelse av infiltrasjon fibrotiske vev og helse nerver. Mens bildene viser snitting og behandling av uskadet nerver som eksempler, de samme trinnene og materialer gjelder skadet nerver og nerver regenerert med rør eller vev grafts, gitt at fiksering av vev er tilstrekkelig20, 21.

Mens alle trinn av protokollen er viktig, er noen av disse trinnene mer sannsynlig føre til dårlig kvalitet deler eller bilder. Utilstrekkelig vev dehydrering kan føre til hull i delene nerve (figur 5B). En mulig forklaring er immiscibility av harpiks med vann, og overflødig vann i vev hindrer harpiks fra infiltrasjon vevet. Derfor tillater nok tid og bruk av absolutt aceton er avgjørende for å sikre riktig dehydrering trinn. Selv om vi brukte aceton i denne protokollen, kan etanol også brukes. Mange harpikser, men er ikke reaktive med etanol så vevet må behandles med propylen og å tjene som en overgang mellom etanol dehydrering og harpiks innebygging.

På grunn av thinness av delene, bør overføre nerve deler fra glasskniven til av objektglass gjøres med stor forsiktighet (figur 5C). 1-2 μm delene er veldig skjør, og feilaktig overføring av delen kan forårsake delen å bryte. Hvis delen er plukket opp i den sentrale delen av delen med en nål, delen er utsatt for folding i på seg selv og ofte vil være vanskelig å utfolde når overført til lysbildet. Forskjellige verktøy kan brukes for overføring av delen til av objektglass, inkludert nåler og looper, og hver skal testes for en bestemt bruker til å bestemme som vil gi best overføring resultater. For vårt formål redusert bruk av en loop som kan omfatte hele delen sterkt folding av inndelinger når de ble overført fra glasskniven til mikroskopet lysbildet (figur 1 d).

Vanligvis er forsvarlig håndtering av nerver viktig som kompresjon av nervene kan forårsake sprekker oppstår i nerve deler (figur 5A). Nerve vev komprimering kan skje under overføring av nerve segmenter i prosessene av eksponering i dyr, fiksering, dehydrering, og harpiks innebygging. For å unngå nerve vev komprimering, nerve segmenter skal overføres av fine tang og plukket opp på en ende av segmentet ideelt av rettferdig epineurial lag, så hele nerve ikke påvirkes. Sprekker og linjer (kniv merker) i delene nerve kan også skyldes kjedelig eller mye glasskniver. For å garantere beste snittestillingen, anbefaler vi gjør frisk glasskniver og endre glasskniven hver 25-30 kutt, færre hvis snitting gjennom nerve innkapslet i en kanal.

Harpiks kan være relativt dyrt, er utilstrekkelig når langsgående nerve deler er nødvendig, og kan kreve dyrt verktøy som en ultramicrotome og et glass knivmaker. Til tross for disse begrensningene regnes fortsatt toluidine blå flekker av harpiks innebygd ekstern nerve deler gullstandarden for visualisering av tverrsnitt av eksterne nerve morphometry4,5. Langsgående inndelinger kan også avsløre viktige funksjoner av eksterne nerver, som axonal kontinuitet og noder av Ranvier, men er mest nyttig med immunohistochemistry. I slike tilfeller er det generelle praksis ulikt behandle to deler i samme nerve, blå for toluidine tverrsnitt, og den andre for langsgående immunohistochemistry. Økt forekomst av eksterne nerve trauma og skader og behov på en bedre måte vurdere nerve morfologiske strukturer, kan denne metoden fortsatt brukes som et viktig verktøy for å få histologiske data av nerveskader og gjenfødelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil thankthe Jenkins mikroskopi anlegg på University of Wyoming for deres hjelp og medlemmer av Bushman lab, Kelly Roballo, Hayden sanne, Wupu Osimanjiang og Subash Dhunghana, hjelp med dyr omsorg. Denne publikasjonen ble gjort mulig ved en institusjonell Development Award (idé) fra National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under Grant # 2P20GM103432.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline Gibco 14200-075
Glutaraldehyde Solution Sigma-Aldrich G6257
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate Acros Organics 205950010
Isoflurane Piramal NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit Sigma-Aldrich 45359
Sodium Hydroxide Solution Sigma-Aldrich 72068 To adjust Trump's fixative pH
Acetone Fisher Chemical 170942
Osmium Tetroxide Solution Sigma-Aldrich 75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus VWR 48311-703
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12545102
Pelco Embedding Cast Fisher Scientific NC9671811
Glass Knife Maker RMC Products GKM-2
Ultramicrotome RMC Products MT-XL
15 mL Conical Tube Falcon ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661
4 mL Glass Vial Sigma-Aldrich 854190
Razor Blades VWR 55411-050 For trimming resin block
Perfect Loop Electron Microscopy Sciences 70944 For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm Electron Microscopy Sciences 71012
100 Watt Oven Millipore  6350115
Whatman Filter Paper Sigma-Aldrich WHA10010155
3 mL plastic pipette Sigma-Aldrich Z331740
Micro-surgical Kit World precision instruments
Olympus fluorescence microscope Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
  2. Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
  3. Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57, (4), 462-471 (2006).
  4. Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
  5. Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
  6. Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. 709-717 (2011).
  7. Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
  8. Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
  9. Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
  10. Dykstra, M. J. A manual of applied techniques for biological electron microscopy. Plenum. New York. 257 (1993).
  11. Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107, (6), 1168-1189 (2007).
  12. Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3, (69), 99-105 (1964).
  13. Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. 65-77 (2008).
  14. Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
  15. Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33, (5), 1363-1375 (2012).
  16. Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31, (1), 7-23 (2012).
  17. Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20, (1), 37-41 (2000).
  18. Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
  19. Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30, (1), 27-33 (2007).
  20. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8, (3), 72-79 (2016).
  21. Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
  22. Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28, (5), 79 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics