CD19 कार टी कोशिकाओं के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए एक Syngeneic माउस बी सेल लिंफोमा मॉडल

Cancer Research
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Summary

यहां, हम के उत्पादन और पूर्व नैदानिक परीक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान retroviral transduction द्वारा murine CD19 कार टी कोशिकाओं के रूप में स्थापित syngeneic A20 बी सेल लिंफोमा के खिलाफ एक चिकित्सा के रूप में बालब/सी चूहों के साथ या बिना lymphodepleting प्री कंडीशनिंग.

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Kueberuwa, G., Zheng, W., Kalaitsidou, M., Gilham, D. E., Hawkins, R. E. A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells. J. Vis. Exp. (140), e58492, doi:10.3791/58492 (2018).

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Abstract

CD19 chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) टी सेल थेरेपी के आश्चर्यजनक नैदानिक सफलता तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (सभी) andnon-Hodgkin लिंफोमा (NHL) के लिए दो दूसरी पीढ़ी chimeric प्रतिजन रिसेप्टर्स (कारों) के अनुमोदन के लिए नेतृत्व किया है । क्षेत्र का ध्यान अब अंय रक्त द्रोह में इन सफलताओं की नकल पर है, जहां कम प्रभावशाली पूर्ण प्रतिक्रिया दरों मनाया जाता है । इसके अलावा इंजीनियरिंग की कार टी कोशिकाओं या सह-प्रशासन के अंय उपचार रूपरेखा सफलतापूर्वक अंय कैंसर सेटिंग्स में सफल चिकित्सा के लिए बाधाओं को दूर कर सकते हैं ।

इसलिए हम एक मॉडल है जिसमें दूसरों CD19 कार टी कोशिकाओं के पूर्व नैदानिक परीक्षण आयोजित कर सकते है प्रस्तुत करते हैं । इस अच्छी तरह से परीक्षण बी सेल लिंफोमा मॉडल में परिणाम के लिए जानकारीपूर्ण कार टी सेल चिकित्सा सामांय होने की संभावना है ।

इस प्रोटोकॉल के माध्यम से माउस कार टी कोशिकाओं के reproducible उत्पादन की अनुमति देता है कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक के माध्यम से बेनी-E निर्माता कोशिकाओं के MP71 retroviral का निर्माण और pCL-पारिस्थितिकी पैकेजिंग प्लाज्मिड स्रावित retroviral कणों के संग्रह के बाद और रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा और केंद्रापसारक का उपयोग transduction । retroviral transduction का सत्यापन, और कार टी कोशिकाओं की क्षमता की पुष्टि करने के लिए लक्ष्य लिंफोमा कोशिकाओं को मारने के लिए पूर्व vivo, फ्लो cytometry, luminometry और एंजाइम से जुड़े immunosorbent (एलिसा) के उपयोग के माध्यम से भी वर्णित है ।

lymphoreplete और lymphodepleted syngeneic चूहों में vivo में कार टी कोशिकाओं के परीक्षण के लिए प्रोटोकॉल, स्थापित असर, प्रणालीगत लिंफोमा वर्णित हैं । एंटी कैंसर गतिविधि vivo bioluminescence और रोग प्रगति में द्वारा निगरानी की है । हम स्थापित बी सेल लिंफोमा के उंमूलन के विशिष्ट परिणाम दिखाने के लिए जब 1st या 2 lymphodepleting पूर्व कंडीशनिंग और लंबे समय तक छूट प्राप्त चूहों के एक अल्पसंख्यक के साथ संयोजन मेंएन डी पीढ़ी कारों का उपयोग जब कार टी का उपयोग lymphoreplete चूहों में आईएल-12 एक्सप्रेस कोशिकाओं.

इन प्रोटोकॉल अलग अतिरिक्त संशोधन के साथ CD19 कार टी कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, कार टी कोशिकाओं और अन्य चिकित्सीय एजेंटों के संयोजन या अलग लक्ष्य एंटीजन के खिलाफ कार टी कोशिकाओं के उपयोग के लिए अनुकूलित.

Introduction

Chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) टी-सेल थेरेपी CD19 के उपचार में आश्चर्यजनक नैदानिक सफलता+ tisagenlecleucel के लिए चूक तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकीमिया1 और axicabtagene के लिए अग्रणी दुष्टता दिखाया गया है प्रगतिशील बड़े बी के लिए ciloleucel-सेल गैर-Hodgkin लिंफोमा2 २०१७ में ।

कैंसर और दोनों रोग प्रगति और चिकित्सीय तंत्र में प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच बातचीत के महत्व को तेजी से3,4,5मांयता प्राप्त होता जा रहा है । उदाहरण के लिए, यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि ट्यूमर microenvironment (टीएमई) कारकों है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं6,7,8के प्रभाव कार्यों को दबा सकते है के साथ अटा पड़ा है । वैकल्पिक रूप से अंतर्जात प्रतिरक्षा कोशिकाओं और epitope प्रसार की भड़काना ट्यूमर उंमूलन और ट्यूमर चैलेंज9,10के लिए दीर्घकालिक प्रतिरोध में महत्वपूर्ण हो सकता है । इन दोनों घटनाएं xenogeneic मॉडल है कि एक प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी में मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है । इसी तरह, ट्रांसजेनिक प्रोटीन का उपयोग प्रणालियों सही प्रतिरक्षा सहिष्णुता तोड़ने जो epitope के लिए आवश्यक है11,12प्रसार की चुनौती को प्रतिबिंबित नहीं करते । एक पूरी तरह कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ एक syngeneic मॉडल है, इसलिए, कैंसर रोग प्रगति और प्रतिरक्षा चिकित्सकीय के इन महत्वपूर्ण पहलुओं मॉडलिंग के लिए सर्वोपरि है ।

कार टी के एक महत्वपूर्ण चेतावनी-सेल थेरेपी है कि lymphodepleting पूर्व कंडीशनिंग चिकित्सकीय सफलता13,14के लिए आवश्यक है । यह आमतौर पर कार टी कोशिकाओं15,16के अर्क से पहले कीमोथेरेपी प्रशासन द्वारा रोगियों में प्राप्त की है । एक मानक विधि के रूप में, आदेश में रोगी की स्थापना में इस्तेमाल किया lymphodepletion नकल करने के लिए, हम 5 Gy कुल शरीर विकिरण (TBI) lymphodepletion प्राप्त करने के लिए चिकित्सा कार टी कोशिकाओं के प्रशासन के लिए पहले चूहों असर प्रणालीगत A20 बी-सेल लिंफोमा ।

जबकि lymphodepleting पूर्व कंडीशनिंग रोगियों के बहुमत के लिए एक मुद्दा नहीं है, विषाक्तता कि कीमोथेरेपी एजेंटों के साथ आता है मतलब है कि कम प्रदर्शन स्थिति के रोगियों कार टी सेल चिकित्सा के लिए पात्र नहीं हैं. एक परीक्षण प्रणाली है कि lymphodepletion के लिए अयोग्य रोगियों का प्रतिनिधित्व करता है बनाने के लिए, हम एक lymphoreplete syngeneic माउस मॉडल है जिसमें हम मॉडल कार टी-सेल लिंफोमा के थेरेपी की स्थापना की । इस मॉडल में, हमने दिखाया है कि कार टी कोशिकाओं के भीतर से IL-12 के स्राव ~ 25%17की एक सफलता दर के साथ स्थापित लिंफोमा के उंमूलन के लिए नेतृत्व कर सकता है । इसके अलावा, हमें पता चला कि अंतर्जात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को कैंसर उंमूलन में शामिल थे ।

यहां हम विस्तार में वर्णन माउस कार टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल, syngeneic चूहों में लिंफोमा की स्थापना, और के साथ या लिंफोमा के उपचार कार टी कोशिकाओं के साथ या lymphodepleting पूर्व के उपयोग के बिना कंडीशनिंग । यह अन्य एजेंटों के साथ कार टी कोशिकाओं के संयोजन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, अन्य transgenes के साथ कार टी कोशिकाओं का परीक्षण या लिंफोमा के खिलाफ अन्य दत्तक सेल थेरेपी या immunotherapy रणनीतियों के उपयोग के लिए.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों जानवरों के तत्वावधान में आयोजित किया गया (वैज्ञानिक प्रक्रियाओं) १९८६ अधिनियम और ब्रिटेन समंवय समिति के तहत कैंसर अनुसंधान के लिए दिशानिर्देश । सभी पशु अध्ययन CRUK-मैनचेस्टर संस्थान में आयोजित किए गए और स्थानीय पशु कल्याण और नैतिकता की समीक्षा शरीर (CRUK-MI AWERB) द्वारा अनुमोदित ।

1. तैयारी

  1. Maxiprep pMP71 retroviral का निर्माण प्लाज्मिड और पीसीएल-इको retrovirus पैकेजिंग plasmids18.
    नोट: pMP71 encodes mCherry और एक FMDV2A अनुक्रम से अलग कार । यह अंय retroviral constructs के साथ विनिमेय है । pCL-पारिस्थितिकी सांकेतिक शब्दों में झूठ, पोल और ecotropic लिफाफा प्रोटीन ।
  2. RPMI १६४० मध्यम, 10% FCS, 1% 100x पेनिसिलिन-streptomycin-glutamine (पीएसजी) का उपयोग संवर्धन माउस टी कोशिकाओं के लिए पूरा टी सेल मध्यम (TCM) तैयार करें ।
    नोट: समाधान १०० IU/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin और एल glutamine के 2 मिमी), ५० माइक्रोन β-mercaptoethanol और 25 मिमी 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) शामिल हैं ।
  3. संस्कृति A20 कोशिकाओं में RPMI १६४०, 10% FCS और ०.०५ मिमी β-mercaptoethanol पर ३७ ° c, 5% सह2.
  4. संस्कृति प्लेटिनम-e (बेनी-e) पूर्ण Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में कोशिकाओं (DMEM 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 2 मिमी एल-glutamine, 1 μg/एमएल puromycin और 10 μg/एमएल blasticidin) में ३७ ° c, 5% सह2.
    नोट: बेनी-ई कोशिकाओं 293T कोशिकाओं और एक्सप्रेस झूठ, पोल और ecotropic लिफाफा retroviral प्रोटीन से प्राप्त कर रहे हैं ।
  5. अभिकर्मक मीडिया समाधान 1 और 2 तुरंत अभिकर्मक करने से पहले तैयार करें । समाधान 1 (ph ७.९) DMEM + 10% FCS + 25 mm HEPES, समाधान 2 (ph ७.१) को शामिल करने के लिए तैयार DMEM + 25 मिमी HEPES ।
  6. बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ कमजोर द्वारा 10 μg/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा समाधान तैयार करते हैं और उपयोग तक-20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
  7. उपयोग करने से पहले ०.२ माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सभी मीडिया बाँझ फ़िल्टर (रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा को छोड़कर).

2. टी कोशिकाओं के Retroviral Transduction

  1. दिन 1: अभिकर्मक के लिए तैयारी
    1. बीज ७.५ x 106 प्लेटिनम-e (बेनी-e) कोशिकाओं में 15 सेमी2 ऊतक संस्कृति के व्यंजन में 18 पूर्ण DMEM की मिलीलीटर और गर्मी में रात भर ३७ ° c, 5% CO2.
  2. दिन 2: बेनी-E retroviral पैकेजिंग सेल लाइन के अभिकर्मक
    1. तैयार २०.४ μg के pcl-पारिस्थितिकी पैकेजिंग वेक्टर डीएनए, ३९.६ μg के प्लाज्मिड डीएनए एंकोडिंग retroviral कार के निर्माण और १५० μL के 1 मीटर CaCl2 के अंतिम खंड के लिए 3 मिलीलीटर अभिकर्मक समाधान 2 प्रति 15 सेमी2 पकवान transfected किया जा करने के लिए । 10 एस के लिए भंवर और 5 मिनट के लिए आराम
    2. 15 सेमी2 व्यंजन से DMEM मीडिया निकालें और अभिकर्मक समाधान 1 के 12 मिलीलीटर के साथ बदलें ।
      सावधानी बरतें जब मीडिया बदल रहा है, 15 सेमी2 व्यंजन केंद्र में शुष्क कर सकते हैं । इसके कारण transfected बेनी-ए की कोशिकाओं की काफी मौत हो सकती है । तेजी से काम करते हैं और एक समय में सिर्फ 1-2 प्लेटों से मीडिया को हटा दें ।
    3. प्रत्येक थाली में समान रूप से प्रत्येक 15 सेमी2 डिश ड्रॉप वार करने के लिए 3 मिलीलीटर अभिकर्मक समाधान 2 युक्त डीएनए और CaCl 2 जोड़ें । धीरे ३७ ° c, 5% सह रात भर में 10 एस मशीन के लिए साइड गति के लिए एक पक्ष के साथ प्लेटें रॉक ।
  3. 3 दिन: transduction के लिए वायरस युक्त supernatant की तैयारी
    1. 18 मिलीलीटर पूरा TCM और मशीन को वापस के साथ transfected प्लेट ई कोशिकाओं के मीडिया की जगह ।
      सावधानी बरतें जब मीडिया बदल 15 cm2 व्यंजन केंद्र में शुष्क कर सकते हैं । इसके कारण transfected बेनी-ए की कोशिकाओं की काफी मौत हो सकती है । तेजी से काम करते हैं और एक समय में सिर्फ 1-2 प्लेटों से मीडिया को हटा दें ।
  4. 3 दिन: अलगाव और इन विट्रो में माउस प्लीहा टी कोशिकाओं के सक्रियकरण
    1. पहले पार्किंसंस एट अल द्वारा वर्णित के रूप में 6-8-सप्ताह पुराने बालब/ 19 . एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में उंहें बाँझ, बर्फ ठंडा, पंजाब में विसर्जित कर दिया ।
    2. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और homogenize न्यूनतम बल के साथ एक मूसल का उपयोग करने के लिए एक तिल्ली हस्तांतरण करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें ।
    3. एक १००० μL पिपेट और ~ ८०० μL पंजाबियों का उपयोग करने के लिए एक १०० माइक्रोन ताकना सेल एक ५० मिलीलीटर एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 5 मिलीलीटर पंजाबियों युक्त ट्यूब छलनी करने के लिए चिपका homogenate हस्तांतरण । अतिरिक्त तिल्ली के लिए चरण 2.4.2 दोहराएँ. ट्यूब प्रति 3 तिल्ली से अधिक न हो ।
      सावधानी बरतें Splenocytes के माध्यम से पारित फिल्टर का झुरमुट फार्म कर सकते है अगर छोड़ दिया खड़ा है । मैन्युअल रूप से घूमता ट्यूबों आवर्तक रूप अगर प्रसंस्करण कई तिल्ली कोशिका के झुरमुट से बचने के लिए. सेल छलनी पर शेष टुकड़े आगे एक 5 मिलीलीटर ंयूनतम बल का उपयोग सिरिंज से एक गोताख़ोर का उपयोग कर मैश किया जा सकता है ।
    4. पंजाब के साथ 20 मिलीलीटर तक टॉप । एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में घनत्व ढाल मीडिया (सामग्री की मेज) के 20 मिलीलीटर पर धीरे 20 मिलीलीटर सेल निलंबन परत । लागू नहीं ब्रेक के साथ 20 मिनट के लिए ८०० x g में परिणामी मढ़ा निलंबन केंद्रापसारक ।
    5. एक बाँझ पाश्चर पिपेट और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण का उपयोग इंटरफेस परत पर फसल कोशिकाओं । पंजाब के साथ ५० मिलीलीटर के लिए ऊपर और 10 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक के लिए धो लो । पूरा TCM में supernatant और पुनः निलंबित कोशिकाओं को त्यागें ।
    6. किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की संख्या गिनना ।
    7. संस्कृति कोशिकाओं के घनत्व में 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल के साथ पूर्ण TCM में 30 एनजी/एमएल विरोधी CD3ε एंटीबॉडी (क्लोन 145-2C11), 30 एनजी/एमएल एंटी CD28 एंटीबॉडी (क्लोन ३७.५१), १०० U/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव आईएल-2 और 2 एनजी/एमएल रिकॉमबिनेंट murine आईएल-7 । फसल की कोशिकाओं की मात्रा के लिए एक उचित आकार के ऊतक संस्कृति कुप्पी का प्रयोग करें ।
      नोट: प्रतिजन-पेश कोशिकाओं टी सेल सक्रियण के लिए CD3 और CD28 एंटीबॉडी द्वारा आवश्यक हैं, अगर शुद्ध टी कोशिकाओं के साथ काम कर यह एंटीबॉडी के साथ कोट प्लेटों के लिए आवश्यक है, या चुंबकीय मोती (सामग्री की तालिका) का उपयोग
    8. ३७ ° c, 5% सह2 रात भर में माउस splenocytes की मशीन ।
  5. 3 दिन: transduction के लिए प्लेट्स की तैयारी
    1. कोट गैर ऊतक संस्कृति 6-अच्छी तरह से 10 μg/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा के 2 मिलीलीटर के साथ प्लेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  6. 4 दिन: माउस टी कोशिकाओं के Transduction
    1. ताजा गैर ऊतक-संस्कृति 6-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए लेपित प्लेटों से रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा स्थानांतरण । transduction के दौर 2 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इन प्लेट्स की मशीन ।
    2. TCM के 2 मिलीलीटर मूल रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा लेपित प्लेटों की एक अच्छी तरह जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए छोड़ने के लिए गैर विशिष्ट बाध्यकारी ब्लॉक ।
    3. हार्वेस्ट retrovirus-supernatant से युक्त transfected बेनी-ई कोशिकाओं में 15 सेमी ऊतक संस्कृति के व्यंजन और पूरा TCM के 18 मिलीलीटर के साथ बदलें ।
      सावधानी बरतें बेनी-E कोशिकाओं के सूखने से बचने के लिए तेजी से काम करते हैं ।
      नोट: अभिकर्मक की सफलता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा इस स्तर पर जांच की जा सकती है अगर ऐसे mCherry (चित्रा 1) के रूप में एक फ्लोरोसेंट मार्कर जीन का उपयोग ।
    4. सेल मलबे को हटाने के लिए ०.४५ माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से retrovirus-युक्त supernatant को फ़िल्टर करें । रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा से TCM निकालें-लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटें और फ़िल्टर्ड retrovirus की २.५ मिलीलीटर युक्त supernatant या एक अच्छी तरह से (नकली अभिकर्मक के लिए पूरा TCM का उपयोग करें) जोड़ें । retrovirus या नकली मीडिया के अलावा के रूप में एक अच्छी तरह से लेबल ।
    5. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए १२०० x g पर प्लेटें केंद्रापसारक ।
    6. Whilst प्लेट कताई, सक्रिय टी कोशिकाओं और एक hemocytometer का उपयोग कर गिनती इकट्ठा कर रहे हैं ।
      1. Transduction 5 x 106 सक्रिय splenocytes के साथ किया जाता है में कुल 5 मिलीलीटर/ 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा अलग ट्यूबों में नकली/transduction के लिए splenocytes की अपेक्षित संख्या गोली ।
      2. फिर से 5 x 10 फ़िल्टर्ड retrovirus के २.५ मिलीलीटर के एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कदम 2.6.4 या TCM से युक्त supernatant के प्रति कोशिकाओं के एक घनत्व पर splenocytes सस्पेंड । जोड़ें रिकॉमबिनेंट मानव आईएल-2 (hIL-2) और रिकॉमबिनेंट माउस आईएल-7 (मिल-7) के अंतिम एकाग्रता के लिए २०० IU/एमएल और 4 एनजी/एमएल क्रमशः ।
    7. कदम 2.6.5 के पूरा होने पर केंद्रापसारक से 6 अच्छी तरह से प्लेटें ले लीजिए और जोड़ने के लिए उचित कुओं में २.५ मिलीलीटर/अच्छी तरह से पुनः निलंबित splenocytes 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा बनाने के लिए/अच्छी तरह से और एक अंतिम एकाग्रता १०० U/एमएल hIL-2 और 2 एनजी/
    8. कमरे के तापमान पर ९० मिनट के लिए १२०० x g पर प्लेटें केंद्रापसारक । केंद्रापसारक के बाद, ३७ ° c, 5% सह2 रात में प्लेटें मशीन ।
  7. 5 दिवस: transduction के दौर 2
    1. इस के रूप में फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है प्लेटों से रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा ले लीजिए । दोहराएँ चरण 2.6.2-2.6.5.
    2. Whilst प्लेट कताई कर रहे हैं, transduction के 1सेंट दौर से कोशिकाओं को इकट्ठा एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर । 2 मिलीलीटर पंजाबियों, भंवर के साथ एक अच्छी तरह कुल्ला और प्रत्येक अच्छी तरह से किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा ।
      नोट: तलछटी कोशिकाओं को पुनः निलंबित करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट. प्रत्येक नियंत्रण/transduction समूह अलग ट्यूबों में ले लीजिए ।
    3. ५०० x जी पर 5 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक फिर से २.५ मिलीलीटर में transduction के २०० IU/एमएल आईएल-2 और 4 एनजी/एमएल-7 के साथ कोशिकाओं को निलंबित । दोहराएँ चरण 2.6.7-2.6.8.
    4. से कोशिकाओं को दूर केंद्रापसारक और ३७ ° c, 5% सह2 में मशीन 4 एच के लिए चरणों में के रूप में transduced कोशिकाओं को इकट्ठा 2.7.2-2.7.3 ।
    5. कोशिकाओं गिनती, 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक और फिर से पूर्ण TCM में 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के साथ १०० यू/एमएल hIL-2 और 2ng/एमएल मिल-7 के घनत्व पर निलंबित । एक उपयुक्त करने के लिए स्थानांतरण संस्कृति कुप्पी और ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2पर मशीन आकार ।
    6. 100U/एमएल hIL-2 और 2ng/एमएल मिल-7 हर 2 दिन में ताजा TCM मीडिया जोड़ें, 1 एक्स 106 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व को बनाए रखने/
      नोट: हार्वेस्ट्ड splenocytes में विभिंन प्रकार के कक्ष होते हैं । इन संस्कृति की स्थिति के तहत, गैर टी कोशिकाओं 2-3 दिन के पाठ्यक्रम पर बंद मर जाते हैं । सेल संस्कृति में ~ 4 दिनों के बाद, टी सेल की संख्या आमतौर पर 0 दिन पर काटा splenocytes की कुल संख्या के बराबर है ।

3. Transduction दक्षता का मापन

  1. 4 दिन के बाद transduction, transduced या गैर transduced टी कोशिकाओं (लगभग 3 एक्स 105 कोशिकाओं) का एक नमूना इकट्ठा । 5 मिनट के लिए ५०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक, supernatant त्यागें, एक बार पंजाबियों के साथ छर्रों कोशिकाओं धोने और फिर से केंद्रापसारक ।
  2. supernatant त्यागें और एक उपयुक्त अमीन प्रतिक्रियाशील डाई (जैसे, जीने/मृत दाग, १०० कमजोर पड़ने में 1) के प्रति अच्छी तरह से युक्त पंजाबियों के १०० μL जोड़ें । अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
  3. पंजाबियों के साथ दो बार धो और 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें और FACS बफर के ५० μL के साथ मशीन विरोधी माउस CD16/एफसी रिसेप्टर ब्लॉकिंग के लिए CD32 एंटीबॉडी (1 में १०० कमजोर पड़ने). 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
  4. सीधे एंटीबॉडी धुंधला मास्टर मिश्रण विरोधी माउस CD4-BV786 और सीडी 8-BV711 एंटीबॉडी (1 μL के अंतिम एकाग्रता/अच्छी तरह से FACS बफर में शामिल) के ५० μL जोड़ें । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन । धो चरण ३.३ दोहराएँ । 1% पीएफए बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखना ।
  5. BV711, BV785 और mCherry प्रतिदीप्ति के मार्कर के रूप में समकक्ष उपयुक्त cytometer के साथ कोशिकाओं का विश्लेषण CD4 और सीडी 8 सबसेट और कार अभिव्यक्ति के रूप में क्रमशः गेटिंग के रूप में (चित्रा 2) ।

4. इन विट्रो में कार टी सेल गतिविधि के सत्यापन

  1. बीज syngeneic लक्ष्य CD19+ ट्यूमर कोशिकाओं के साथ या एक घनत्व पर luciferase अभिव्यक्ति के बिना 1 x 104 कोशिकाओं में १०० μL TCM में एक ९६-well U-नीचे ऊतक संस्कृति की थाली ।
  2. 1:1 का अनुपात (E:T) लक्ष्य के लिए एक प्रभाव को प्राप्त करने के लिए १०० μL/अच्छी तरह से एक खंड में 1 x 104 CD19 कार टी कोशिकाओं/अच्छी तरह से जोड़ें ।
    नोट: E:T अनुपात प्रत्येक कार के निर्माण और लक्ष्य सेल लाइन के लिए स्थापित किया जाना चाहिए ।
  3. अकेले और नकारात्मक नियंत्रण और टी कोशिकाओं phorbol द्वारा उत्तेजित के रूप में अकेले ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करें-myristate-एसीटेट (पमा) (५० एनजी/एमएल) और ionomycin (1 μg/एमएल) इंटरफेरॉन गामा (IFNγ) के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में रिलीज । सह-संस्कृति कक्ष ३७ डिग्री सेल्सियस पर, 5% सह2 16-24 एच के लिए ।
  4. सह संस्कृति के बाद, 5 मिनट के लिए ५०० x g पर प्लेटें केंद्रापसारक और आगे IFNγ और IL-12p70 एलिसा विश्लेषण के लिए supernatant इकट्ठा ।
    नोट: यह-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  5. luciferin युक्त पंजाब के १०० μL में सेल छर्रों पुनः निलंबित (१.५ मिलीग्राम/एमएल) के अंतिम एकाग्रता । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए प्लेटें मशीन । फिर एक उपयुक्त luminometer के साथ एक अच्छी तरह से luminescence उपाय ।
    नोट: जोखिम बार सेल लाइनों और घनत्व के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3ए में दिखाए जाते हैं । Ex-vivo cytotoxicity कार टी कोशिकाओं के लिए संशोधित किया जा सकता है एक्सप्रेस luciferin द्वारा सह-संस्कृति के साथ लक्ष्य antigen एक्सप्रेस सेल लाइनों । कार टी कोशिकाओं लक्ष्य कोशिकाओं को मारने के रूप में, luciferin जारी है, इसलिए luminometry संकेत में कमी सेल को मारने के साथ संबंधित है । गैर transduced कोशिकाओं को अक्सर लक्ष्य सेल व्यवहार्यता पर एक प्रभाव हो सकता है, विशेष रूप से लंबी मशीन अवधि पर । निर्माता की एलिसा प्रोटोकॉल के अनुसार supernatant में murine IFNγ और IL-12p70 की एकाग्रता को मापने । प्रतिनिधि परिणाम में दिखाया गया है (चित्रा 3बी और सी). पूर्व vivo सक्रियण कार टी कोशिकाओं के द्वारा सह-संस्कृति के साथ लक्ष्य प्रतिजन व्यक्त सेल लाइनों का विश्लेषण करके परख की जा सकती है एलिसा का उपयोग supernatant सामग्री । कोशिकाओं और सह संस्कृति अवधि की लंबाई को लक्षित करने के लिए कार टी सेल का अनुपात प्रत्येक कार के निर्माण के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, लक्ष्य सेल लाइन और analyte. पमा और ionomycin उपचार एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है टी कोशिकाओं की गुणवत्ता की पुष्टि करने और उनके जवाब देने की क्षमता ।

5. चूहों में विरोधी कैंसर गतिविधि का आकलन

  1. प्रोटोकॉल 1
    1. प्रदर्शन १०० मिलीग्राम/kg नसों (IV) cyclophosphamide के 6 से 8 में डिलिवरी-सप्ताह बालब/ यह महत्वपूर्ण lymphodepletion17 (चित्रा 4) के बिना ट्यूमर engraftment की अनुमति देता है ।
      नोट: A20 लिंफोमा की स्थापना एक इष्टतम ले दर के साथ 2 महीने से अधिक ले सकते हैं । यह लिंफोमा कोशिकाओं के वितरण से पहले cyclophosphamide 1 दिन के उपयोग से सुधार किया जा सकता है । आदेश में lymphoreplete चूहों का अध्ययन करने के लिए, हम cyclophosphamide की एक खुराक की पहचान की है कि lymphodepletion के कारण के बिना लिंफोमा की क्षमता में वृद्धि सकता है ।
    2. अगले दिन, सुई १०० µ एल के 5 x 105 syngeneic A20 B-सेल लिंफोमा कोशिकाओं luciferase और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) नसों (IV) इंजेक्शन द्वारा चूहों में व्यक्त करने के लिए संशोधित ।
    3. चूहों के लिए प्रणालीगत लिंफोमा विकसित करने की अनुमति ~ 17 दिन ।
    4. intraperitoneal द्वारा प्रणालीगत लिंफोमा की उपस्थिति की पुष्टि करें (आई पी) के १०० μL के इंजेक्शन 30 मिलीग्राम/एमएल luciferin और इमेजिंग का उपयोग कर vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली में
      1. सन्निकट चूहों में सिग्नल spillover से बचने के लिए विभाजक का उपयोग करें. ventral ओर ब्याज की एक निरंतर आकार क्षेत्र के साथ 1 मिनट के लिए चूहों बेनकाब ।
      2. संबंधित प्रकाश इकाइयों (RLU) के रूप में प्रदर्शन प्रति सेकंड फोटॉनों (पी/एस) । सेटिंग्स प्रत्येक ट्यूमर मॉडल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए; एक जोखिम है कि ट्यूमर का जल्दी पता लगाने के लिए ले जा सकते हैं का उपयोग करें, लेकिन ट्यूमर अंतिमबिंदु तक पहुँचने के रूप में संतृप्ति के लिए नेतृत्व नहीं.
      3. रिकॉर्ड कुल ब्याज की एक निरंतर आकार क्षेत्र के साथ प्रत्येक माउस के लिए RLU । (चित्र 5 ए और बी) ।
    5. 1 एक्स 106 कार टी कोशिकाओं की एक खुराक lymphoreplete में आईवी इंजेक्शन से सुई की स्थापना की लिंफोमा असर चूहों ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) स्तर खुराक प्रत्येक कार के लिए स्थापित किया जाना चाहिए एक खुराक वृद्धि अनुसूची का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि कार टी कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाले किसी भी संभावित विषाक्तता विशेषता हैं और संबोधित किया जा सकता है. हालांकि विरोधी माउस CD19 कार टी कोशिकाओं विषाक्तता प्रदर्शित नहीं करते हैं, कार टी कोशिकाओं अप्रत्याशित विषाक्तता को जन्म दे सकते हैं. जहां एक से अधिक कार का निर्माण और transduction क्षमता समान नहीं हैं, सेल की तैयारियों में गैर-transduced टी कोशिकाओं के अतिरिक्त द्वारा व्यवस्थापित की गई टी कोशिकाओं की कुल संख्या को बराबर रखा जाना चाहिए ।
    6. निगरानी रोग प्रगति साप्ताहिक के माध्यम से १०० μL के आईपी इंजेक्शन 30 मिलीग्राम/एमएल luciferin और इमेजिंग में एक का उपयोग कर vivo bioluminescence इमेजिंग सिस्टम (figure 5c).
    7. बारीकी से विषाक्तता के लक्षण के लिए चूहों पर नजर रखने और किसी भी दुख पैदा कर सकते हैं पहले हिंद अंग पक्षाघात (HLP) या रोग ट्यूमर बोझ के प्रारंभिक लक्षण दिखाने कि कोई चूहों euthanize ।
      नोट: A20 लिंफोमा से विषाक्तता मेनिन्जेस के ट्यूमर के आक्रमण के माध्यम से हिंद अंग पक्षाघात में शामिल कर सकते हैं । बदल चाल के प्रारंभिक लक्षण के लिए नियमित रूप से जांच करें । इसी तरह, बड़े आईपी ट्यूमर पैदा कर सकता है जो बदल व्यवहार से दिखाया असुविधा के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
    8. मॉनिटर चूहों के अस्तित्व के लिए ६०-१०० दिन (चित्रा 5d) । एक अनुसूची द्वारा इच्छामृत्यु प्रदर्शन-1 प्रयोग के निष्कर्ष पर विधि ।
  2. प्रोटोकॉल 2
    1. प्रति चूहे की १०० μL में पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा 6 से 8 सप्ताह पुरानी बालब/सी चूहों के लिए २०० मिलीग्राम/किलो cyclophosphamide उद्धार ।
    2. अगले दिन पर, 5 x 105 syngeneic A20 बी सेल लिंफोमा कोशिकाओं luciferase और GFP में १०० μL पंजाबियों के माध्यम से पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से व्यक्त की सुई ।
    3. चूहों के लिए प्रणालीगत लिंफोमा विकसित करने के लिए अनुमति दें ~ 7-14 दिन
    4. १०० μL के आईपी इंजेक्शन द्वारा प्रणालीगत लिंफोमा की पुष्टि करें 30 मिलीग्राम/एमएल luciferin और इमेजिंग में एक vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर ।
    5. lymphodepletion के लिए ०.०२ Gy/मिनट पर 5 Gy कुल शरीर विकिरण (TBI) प्रदर्शन करते हैं ।
      नोट: कार टी सेल उपचार के दौर से गुजर रोगियों जो काफी adoptively हस्तांतरित कार टी कोशिकाओं के engraftment बढ़ जाती है, जो कार टी कोशिकाओं के प्रशासन से पहले lymphodepletion प्राप्त करने के लिए परहेजों की एक सीमा से गुज़रना । यह कुल शरीर विकिरण (TBI) (चित्रा 6) के साथ चूहों में दोहराया जा सकता है ।
    6. अगले दिन पर, 1 x 106 कारों में पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से पंजाब के १०० μL में कोशिकाओं सुई चूहों असर स्थापित ट्यूमर ।
    7. 7 दिनों के बाद पूंछ नस खून के माध्यम से रक्त के नमूने ले लीजिए ।
    8. प्रत्येक रक्त के नमूने के लिए लाल सेल lysis बफर जोड़ें, तो धारा 3 में वर्णित के रूप में प्रवाह cytometry के लिए तैयार । प्रवाह cytometry द्वारा संचलन में कार टी सेल हठ विश्लेषण (चित्रा 2) ।
      नोट: cytometry के लिए तुरंत पहले गिनती मोतियों के अलावा खून की milliliter प्रति कार टी कोशिकाओं की संख्या के निर्धारण की अनुमति देता है ।
    9. कदम 5.1.5-5.1.8 (चित्रा 7) में वर्णित के रूप में रोग की प्रगति पर नजर रखें ।

Representative Results

टी कोशिकाओं की उच्च दक्षता transduction के लिए, यह ताजा retroviral कणों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । बेनी-ई सेल लाइन के अभिकर्मक के साथ-साथ पीसीएल-इको प्रोड्यूसर प्लाज्मिड और pMP71 retrovirus प्लाज्मिड कोशिका retroviral में supernatant कणों के स्राव को जन्म देता है. जब ऐसी mCherry के रूप में एक फ्लोरोसेंट मार्कर जीन, retrovirus में इनकोडिंग है, सफल अभिकर्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की जा सकती है (चित्रा 1) । transfected बेनी-E कोशिकाओं से वायरस युक्त supernatant fection अंश-लेपित प्लेटों पर स्पिन-fibronectin के 2 दौर के माध्यम से टी कोशिकाओं transduce करने के लिए प्रयोग किया जाता है । transduction की दक्षता 4 दिनों के बाद transduction फ्लो cytometry के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है । सफलतापूर्वक transduced कोशिकाओं मार्कर जीन retrovirus (चित्रा 2) में इनकोडिंग व्यक्त करते हैं । Transduction क्षमता से सीमा ~ ५०-९०% पहली पीढ़ी रिसेप्टर्स के साथ क्षमता के लिए ~ 10-40% कार के साथ retroviral पैकेजिंग क्षमता के करीब constructs । जबकि मार्कर जीन अभिव्यक्ति सफल retroviral transduction से पता चलता है, यह अपनी सतह पर कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस लक्ष्य प्रतिजन के साथ आकर्षक पर कार टी कोशिकाओं की कार्यक्षमता को दिखाने के लिए सर्वोपरि है । लक्ष्य सेल लाइनों एक्सप्रेस luciferase के लिए संशोधित luciferase परख में इस्तेमाल किया जा सकता सेल की डिग्री का परीक्षण करने के लिए कार टी कोशिकाओं द्वारा सीधे (3 ए आंकड़ा) को मार डालो । , एलिसा द्वारा निर्धारित लक्ष्य कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति पर कार टी कोशिकाओं से प्रभाव साइटोकिंस की रिहाई भी कार टी सेल cytotoxicity के एक अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ( 3बी और सी सी) ।

कार टी इस प्रोटोकॉल में उत्पादित कोशिकाओं lymphoreplete चूहों में एक १०० मिलीग्राम/cyclophosphamide की किलो खुराक के साथ प्रणालीगत A20 लिंफोमा की स्थापना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है (नसों में इंजेक्शन), 1 5 x 105 A20 कोशिकाओं के IV इंजेक्शन से पहले दिन (चित्रा 4) । luciferin और छवि कैप्चर के साथ आईपी इंजेक्शन vivo bioluminescence imager में एक का उपयोग कर ट्यूमर के बोझ पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक निरंतर रॉय और जोखिम समय भर का उपयोग (चित्र 5 ए-सी) । कार टी एक्सप्रेस IL-12 के लिए संशोधित कोशिकाओं lymphodepleting पूर्व के साथ प्रणालीगत लिंफोमा उन्मूलन में सक्षम हैं, चूहों के बारे में 25% में रोग मुक्त अस्तित्व दे कंडीशनिंग (चित्रा 5d) । Lymphodepleting कंडीशनिंग, 5 Gy TBI द्वारा प्राप्त 1 कार टी कोशिकाओं के चतुर्थ प्रशासन से पहले दिन, काफी engraftment (चित्रा 6) में सुधार । इस मॉडल में, पहली पीढ़ी के कार टी कोशिकाओं प्रणालीगत A20 लिंफोमा उन्मूलन में सक्षम हैं, आमतौर पर चूहों के १००% में रोग मुक्त अस्तित्व उत्प्रेरण (चित्रा 7) ।

Figure 1
चित्र 1. बेनी ई कोशिकाओं के सफल अभिकर्मक की पुष्टि । बेनी-ई कोशिकाओं transfected retroviral कार के निर्माण और pMP71 और pcl-पारिस्थितिकी पैकेजिंग वेक्टर प्लाज्मिड डीएनए के साथ । सफल अभिकर्मक mCherry फ्लोरोसेंट मार्कर जीन की अभिव्यक्ति द्वारा दिखाया गया है । A) चमकीले क्षेत्र माइक्रोस्कोपी, बी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और सी) मर्ज की गई छवियां दिखाई जाती हैं । आवर्धन = 50X । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. प्रवाह cytometry द्वारा transduction दक्षता का निर्धारण. फ्लो cytometry दिन 4 पोस्ट transduction पर माउस टी कोशिकाओं के transduction दक्षता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, क्रमशः रहते हैं, कार का निर्माण, BV711 और BV785 कोशिकाओं का पता लगाने के लिए ज़ोंबी यूवी लाइव/मृत, mCherry, CD4 और सीडी 8 का उपयोग कर । एक के प्रतिनिधि परिणाम ) Non-transduced, B) mCherry. αmCD19. mCD3z और C) mCherry. αmCD19. mCD3z. mIL12 1 के गेटिंग के साथ दिखाए जाते हैं) Singlets 2) जीवित कोशिकाओं 3) CD4 और सीडी 8 4) और 5) mCherry सकारात्मक कोशिकाओं का आकलन कार एक्सप्रेस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. कार टी-सेल गतिविधि की मांयता । αmCD19 कार टी कोशिकाओं सह थे A20 लिंफोमा कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए luciferase एक्सप्रेस (1 x 10 4: 1 x 104) के लिए 16 घंटे में एक U-नीचे ९६ अच्छी तरह से थाली के साथ संस्कृति । सह संस्कृति के बाद, कोशिकाओं को गोली, और supernatant एकत्र किया गया था । ए) पंजाब में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया था और luminometry लक्ष्य कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । सह संस्कृति से Supernatant IFNγ (बी) और आईएल-12 (सी) की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया गया था । कोशिकाओं और सह संस्कृति अवधि की लंबाई को लक्षित करने के लिए कार टी सेल का अनुपात प्रत्येक कार के निर्माण और लक्ष्य सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । पमा और ionomycin उपचार एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है टी कोशिकाओं की गुणवत्ता की पुष्टि करने और उनकी क्षमता कोशिकाओं को जवाब देने के लिए । त्रुटि पट्टियां दिखाएं SD. सांख्यिकीय विश्लेषण एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग कर किया गया था । p < ०.००१) । यह आंकड़ा17से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. lymphodepletion बिना A20 लिंफोमा की स्थापना । Cyclophosphamide lymphodepletion पैदा किए बिना लिंफोमा प्रेरण की क्षमता में वृद्धि कर सकते हैं । A) रक्त गणना के 6-8-सप्ताहीय बालब/सी चूहों के चतुर्थ प्रसव के बाद cyclophosphamide के १०० मिलीग्राम/ त्रुटि पट्टियां दिखाएं SD B) 6-8 के लिंफोमा बोझ सप्ताह पुराने बालब/सी चूहों के चतुर्थ प्रसव के बाद १०० मिलीग्राम/किग्रा के दिन पर cyclophosphamide या खारा-1 और चतुर्थ डिलिवरी 5 x 105 A20 कोशिकाओं के दिन 0 पर एक luminometer का उपयोग कर मापा । ) बी में चूहों का अस्तित्व ). त्रुटि पट्टियां दिखाएं SD. सांख्यिकीय विश्लेषण 2-way ANOVA का उपयोग कर किया गया था । * * p < ०.०१, * * * p < ०.००१) । यह आंकड़ा Kueberuwa एट अल से संशोधित किया गया है । 17. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 5
चित्रा 5. लिंफोमा बोझ और अस्तित्व की निगरानी । चूहों असर A20 लिंफोमा व्यक्त luciferase प्राप्त १०० µ एल intraperitoneal (आईपी) 30 मिलीग्राम/एमएल luciferin के इंजेक्शन और vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली में एक का उपयोग कर imaged थे । एक) चूहों ventral ओर 1 मिनट के लिए उजागर कर रहे थे और तुरंत छवि पृष्ठ पर फ़्लिप करने के लिए शरीर के दोनों किनारों पर ट्यूमर जनता लेने (ख)ग) बालब/सी के लिंफोमा बोझ के प्रतिनिधि परिणाम lymphodepletion बिना अलग αmCD19 कार टी कोशिकाओं प्राप्त चूहों । त्रुटि पट्टियां दिखाएं SEM. D) एक ही चूहों की जीवित रहने की दर । यह आंकड़ा Kueberuwa एट अल से संशोधित किया गया है । 17. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 6
चित्रा 6. lymphodepletion के प्रभाव । a) रक्त गणना 6-8-सप्ताहीय बालब/c चूहों की एक खुराक दर पर 5 Gy TBI प्राप्त करने के बाद ०.०२ Gy/मिनट; त्रुटि पट्टियां दो-तरफ़ा ANOVA द्वारा SD. सांख्यिकीय विश्लेषण दिखाती हैं । * p < ०.०५, * * p < 0.01, * * * p < ०.००१ । ख) mCherry मार्कर जीन के लिए प्रवाह cytometry द्वारा चूहों के परिधीय रक्त में CD4+ और सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं की निगरानी 7 दिन बाद प्रशासन. त्रुटि पट्टियां दिखाएं SD । यह आंकड़ा Kueberuwa एट अल से संशोधित किया गया है । 17. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 7
चित्रा 7. lymphodepleting प्री-कंडीशनिंग के साथ कार टी सेल गतिविधि । ठेठ 5 Gy का असर दिखा परिणाम TBI दिन पहले कार टी सेल प्रशासन के लिए । A) इमेजिंग और (B) १०० µ l intraperitoneal (IP) के इंजेक्शन के बाद चूहों की इमेजिंग की चित्रमय प्रदर्शित 30 मिलीग्राम/एमएल luciferin vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली में एक का उपयोग कर । त्रुटि पट्टियां दिखाएं SEM. C) एक ही चूहे की उत्तरजीविता । यह आंकड़ा संशोधित किया गया है fromKueberuwa एट अल । 17. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Discussion

Syngeneic माउस मॉडल रोग प्रगति और चिकित्सा के परीक्षण की अनुमति है जबकि एक बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली को बनाए रखने । यह सर्वोपरि है जब यह चिकित्सा कि प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ और विशेष रूप से immunotherapeutic एजेंटों के लिए बातचीत करने के लिए आता है ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित दो महत्वपूर्ण काम धाराओं है, पहले एक आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस टी सेल के लिए कारों एक्सप्रेस है । इस transduction के सत्यापन के लिए दीक्षा से 7 दिन की आवश्यकता है । कार टी कोशिकाओं के उत्पादन के साथ सहवर्ती चूहों में प्रणालीगत लिंफोमा की स्थापना है । कार टी सेल उत्पादन में विफल होना चाहिए, या गुणवत्ता अपर्याप्त जा रहा है, वहां आम तौर पर पर्याप्त समय के प्रतिस्थापन कोशिकाओं का उत्पादन करने से पहले चूहों लिंफोमा का शिकार नहीं है । इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि शोधकर्ताओं ने इन मॉडलों का उपयोग सही ट्यूमर खुराक और रोग प्रगति अध्ययन करने के क्रम में सफलतापूर्वक चिकित्सकीय प्रशासन के लिए कार टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए समय है ।

कम टी के लिए विशिष्ट कारण-सेल transduction क्षमता उत्पादक कोशिकाओं के गरीब अभिकर्मक दक्षता, आम तौर पर गरीब प्लाज्मिड शुद्धता या अभिकर्मक मीडिया के पीएच के गलत निर्धारण के कारण होता है शामिल हैं । यह पूर्ण प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले निर्माता सेल अभिकर्मक की दक्षता की जांच करने के लिए सिफारिश की है के रूप में गरीब अभिकर्मक टी सेल transduction की क्षमता को सीमित करेगा । रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़े एकत्र किया जा सकता है और पुन: उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, हालांकि, कम transduction क्षमता में कई फ्रीज-गल परिणाम । वसूली के बाद माउस तिल्ली के स्विफ्ट प्रसंस्करण भी व्यवहार्य टी कोशिकाओं की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल A20 luciferase व्यक्त कोशिकाओं का इस्तेमाल करता है । यह bioluminescence इमेजिंग द्वारा प्रणालीगत ट्यूमर बोझ को मापने की क्षमता प्रदान करता है के रूप में पसंद किया जाता है. हालांकि, एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली की उपस्थिति में, luciferase प्रतिक्रियाओं परिणाम विषम सकता है । हम पहले transgenes17मार्कर के लिए चूहों जीवित की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का परीक्षण किया है । यह महत्वपूर्ण है A20 कोशिकाओं transgenes से मुक्त का उपयोग करने के लिए मांय है कि इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा ट्यूमर उंमूलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका नहीं निभाने के प्रयोग को दोहराने की कुंजी है ।

जबकि नैदानिक एजेंटों केवल vivo में प्रतिरक्षा की कमी चूहों में इस्तेमाल किया जा सकता है, माउस कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ माउस कार टी कोशिकाओं का उपयोग हमें चिकित्सीय प्रभावकारिता या रोग प्रगति के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली के योगदान का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल पूर्व के लिए उपयोग किया जा सकता है बी-सेल लिंफोमा या ऐसे आईएल के स्राव के रूप में अतिरिक्त संशोधनों के साथ अंय कारों को लक्षित कारों के नैदानिक मूल्यांकन-12 के रूप में यहां वर्णित है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यद्यपि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच परस्पर क्रिया syngeneic माउस मॉडलों में मूल्यांकन किया जा सकता है, वे सही नहीं हो सकता है vivo मेंमनुष्य में बातचीत दोहराऊंगा । विशेष रूप से ध्यान दें, मानव और माउस कारों संरचना जो बहाव के परिणाम हो सकता है में भिंन होगा; टी कोशिकाओं के विकास के लिए इष्टतम सक्रियण और सेल संस्कृति की स्थिति अलग20हैं, लक्ष्य प्रतिजन अभिव्यक्ति के ऊतक वितरण मनुष्यों और चूहों के बीच भिन्न हो सकते हैं और अनुभवी विषाक्तता मौलिक अलग हो सकता है । यह इसलिए पुष्ट परिणाम के लिए पूर्व vivo और xenogeneic मॉडल का उपयोग करने के लिए आवश्यक है ।

सारांश में, syngeneic lymphodepleted और lymphoreplete मॉडल के साथ लिंफोमा दोहराऊंगा रोगियों और बिना पूर्व chemo/ यह एक मॉडल प्रणाली है जिसमें नैदानिक सेटिंग्स की नकल करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों कि नई प्रतिरक्षा चिकित्सा एजेंटों के आने की लहर के साथ महत्वपूर्ण होगा की एक श्रृंखला के परीक्षण की अनुमति प्रदान करता है ।

पूर्व कंडीशनिंग के उपयोग के साथ, यह ध्यान दिया जाएगा कि सभी चूहों आमतौर पर लिंफोमा स्पष्ट । मनुष्यों में ९०% पूर्ण प्रतिक्रिया दरों के साथ, यह प्रतिनिधि है । हालांकि, CD19 कार टी सेल थेरेपी के लिए चुनौतियां पलटा हुआ है कि अक्सर CD19 है की उच्च आवृत्ति को रोकने पर टिका होगा । पलटा इस मॉडल में नहीं देखा गया है अप करने के लिए, और अक्सर १०० दिनों से परे । क्लीनिक में देखा पलटा नकल करने के लिए संशोधनों CD19 कार टी सेल थेरेपी के भविष्य की चुनौतियों के साथ मदद कर सकता है ।

Disclosures

डेविड Gilham Celyad के लिए काम करता है जो कार टी कोशिकाओं के उत्पादन में शामिल है । बाकी लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस अनुसंधान (अनुदान १३०३१) और इस काम के समर्थन के लिए CRUK मैनचेस्टर जैविक संसाधन इकाई, इमेजिंग और cytometry और आणविक जीवविज्ञान कोर सुविधाओं के वित्तपोषण के लिए Bloodwise शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Appleton Woods FC121
0.45 µm syringe filter Appleton Woods FC122
1.5ml pestle and microtube VWR 431-0098
100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) Gibco 10378016
2-Mercaptoethanol (50 mM) Gibco 31350-010
Blasticidine S hydrochloride Sigma- Aldrich 15205
Bottle Top Filter (0.2 µm) Scientific Laboratory Supplies FIL8192
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100759 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100552 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5
Calcium chloride dihydrate Sigma- Aldrich C7902
Cell counting beads – CountBright absolute counting beads Molecular Probes C36950
Cell Strainer 100μm VWR 734-0004
Cyclophosphamide Monohydrate Merck 239785-1GM
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose Sigma Aldrich D6546
Dynabeads Gibco 11131D
Ficoll Paque Plus GE Healthcare GE17-1440-03 Sold by Sigma- Aldrich
Flow cytometer - LSR Fortessa x20 BD Biosciences 658222R1
Foetal Bovine Serum Gibco 10270
Haemacytometer Appleton Woods HC001
HEPES solution Sigma- Aldrich H0887 
IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit Invitrogen 88-7121-76
IL2, Proleukin Novartis PL 00101/0936
in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system Bruker T149094
Ionomycin Calcium Salt Sigma- Aldrich I0634
Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit BioLegend 423114 1 in 100 staining dilution
Luminometer - Lumistart Omega BMG Labtech 415-301
Murine IFN-γ ELISA kit Diaclone 861.050.010
Paraformaldehyde Sigma- Aldrich 16005
pCL-Eco Novus Biologicals NBP229540
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma- Aldrich P8139
Platinum E cell line Cell Biolabs RV-101 (RRID:CVCL_B488)
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 BD Biosciences 553294 Clone  37.51
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε BD Biosciences 553057 Clone  145-2C11 
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Biosciences 553142 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2
Puromycin Dihydrochloride Sigma- Aldrich P8833
Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent TaKaRa T100B
Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) BioLegend 577806
Red cell lysis buffer eBioscience 004-4333-57
RPMI 1640 Medium Lonza BE12-167F
Trypsin - EDTA solution Sigma- Aldrich T3924 
XenoLight D-Luciferin Perkin Elmer 122799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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