Ein Phänomen B-Zell-Lymphom Mausmodell für präklinische Bewertung von CD19-Auto-T-Zellen

Cancer Research
JoVE Journal
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Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Produktion und präklinische Tests der murinen CD19 Auto T-Zellen durch retrovirale Transduktion und Nutzung als Therapie gegen etablierte Phänomen A20 B-Zell-Lymphom bei Mäusen BALB/c mit oder ohne lymphodepleting Vorklimatisierung.

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Kueberuwa, G., Zheng, W., Kalaitsidou, M., Gilham, D. E., Hawkins, R. E. A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells. J. Vis. Exp. (140), e58492, doi:10.3791/58492 (2018).

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Abstract

Die erstaunliche klinische Erfolg CD19 chimeric Antigen-Rezeptor (Auto) T-Zell-Therapie führte zu die Genehmigung von zwei zweiten Generation chimeric Antigen-Rezeptoren (Autos) für akute lymphoblastische Leukämie (ALL)-Andnon-Hodgkin-Lymphom (NHL). Das Feld konzentriert sich jetzt auf emuliert diese Erfolge in anderen hämatologischen Malignomen, wo weniger beeindruckende komplette Responseraten beobachtet werden. Weitere engineering von Auto-T-Zellen oder die gleichzeitige Gabe von anderen Behandlungsmethoden kann erfolgreich Hindernisse für erfolgreiche Therapie bei anderen Krebs-Einstellungen.

Wir präsentieren ein Modell, in dem andere präklinische Tests CD19 Auto T-Zellen führen können. Ergebnisse in diesem gut getestete B-Zell-Lymphom-Modell dürften informative Auto T-Zell-Therapie im Allgemeinen sein.

Dieses Protokoll ermöglicht die reproduzierbare Herstellung von Maus Auto T-Zellen durch Calcium-Phosphat-Transfektion von Plat-E Produzent Zellen mit MP71 retroviralen Konstrukten und pCL-Eco-Verpackung-Plasmid gefolgt von Sammlung von sekretierten retroviralen Partikel und Transduktion mit rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment und Zentrifugieren. Validierung der retrovirale Transduktion und Bestätigung für die Fähigkeit der Auto T-Zellen töten Ziel Lymphom Zellen ex Vivo, durch den Einsatz von Durchflusszytometrie, Luminometry und Enzym-linked Immunosorbentprobe assay (ELISA), wird ebenfalls beschrieben.

Protokolle zum Testen Auto T-Zellen in Vivo in Lymphoreplete und Lymphodepleted Phänomen Mäuse, mit etablierten, systemischen Lymphomen beschrieben. Anti-Krebs-Aktivität wird durch in Vivo Biolumineszenz und Krankheit Fortschreiten überwacht. Wir zeigen typische Ergebnisse der Beseitigung von etablierten B-Zell-Lymphom, bei der Verwendung von 1St oder 2Nd Generation Autos in Kombination mit Lymphodepleting Vorbehandlung und eine Minderheit von Mäusen, die langfristige Remissionen zu erreichen, bei der Verwendung von Auto-T Zellen, IL-12 bei Lymphoreplete Mäusen zum Ausdruck zu bringen.

Diese Protokolle können auszuwertende CD19 Auto T-Zellen mit verschiedenen zusätzlichen Modifikation, Kombinationen von Auto-T-Zellen und andere Therapeutika verwendet werden oder für die Verwendung von Auto-T-Zellen gegen Antigene unterschiedliche Zielgruppen angepasst.

Introduction

Chimeric Antigen-Rezeptor (Auto) T-Zell-Therapie ergab erstaunliche klinische Erfolge bei der Behandlung von CD19+ Malignome führt zur Genehmigung des Tisagenlecleucel für Stammzelltransplantation akute lymphoblastische Leukämie1 und Axicabtagene Ciloleucel für progressive große B-Zell non-Hodgkin-Lymphom2 im Jahr 2017.

Die Bedeutung der Wechselwirkungen zwischen Krebs und das Immunsystem im Krankheitsverlauf und therapeutischen Mechanismen gewinnt zunehmend anerkannte3,4,5. Zum Beispiel ist es gut dokumentiert, dass der Tumor Mikroumgebung (TME) überflutet mit Faktoren, die die Effektor-Funktionen von Immunzellen6,7,8unterdrücken können. Alternativ kann grundieren der körpereigenen Immunzellen und Epitop Verbreitung Schlüssel im Tumor Ausrottung und langfristige Beständigkeit gegen Tumor Challenge9,10sein. Beide dieser Phänomene können in xenogene Modelle ausgewertet werden, die ein immunes System fehlt. Auch spiegeln Systeme mit Hilfe transgener Proteine genau nicht die Herausforderung des Brechens Immuntoleranz für erforderliche Epitop Verbreitung11,12. Ein Phänomen Modell mit einem voll funktionsfähigen Immunsystem ist daher von größter Bedeutung für die Modellierung von diese wichtigen Aspekte der Krankheit fortschreiten und Immune Krebstherapeutika.

Eine wichtige Einschränkung der Auto T-Zell-Therapie ist, dass Lymphodepleting Vorbehandlung für Therapieerfolg13,14erforderlich ist. Dies geschieht in der Regel bei Patienten durch die Verabreichung der Chemotherapie vor der Infusion von CAR T Zellen15,16. Als standard-Methode um Lymphodepletion verwendet, in der Patienten-Einstellung zu imitieren verabreichen wir 5 Gy-Ganzkörper-Bestrahlung (TBI), Lymphodepletion vor der Verabreichung der therapeutischen Auto T-Zellen in Mäusen mit systemischen A20 B-Zell-Lymphom zu erreichen.

Lymphodepleting Vorbehandlung ist, zwar kein Problem für die meisten Patienten heißt Toxizität, die im Lieferumfang von Chemotherapeutika Patienten niedrige Performance-Status Auto T-Zell-Therapie nicht zusteht. Erstellen Sie ein Testsystem, das die Patienten nicht für eine Lymphodepletion darstellt, haben wir ein Lymphoreplete Phänomen Mausmodell, in dem wir Auto T-Zell-Therapie von Lymphomen Modell, etabliert. In diesem Modell zeigten wir, dass die Sekretion von IL-12 aus im Auto T-Zellen zu Beseitigung der etablierten Lymphom mit einer Erfolgsquote von ~ 25 %17. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass körpereigene Immunzellen bei der Beseitigung der Krebs beteiligt waren.

Hier beschreiben wir ausführlich das Protokoll für die Herstellung von Maus Auto T-Zellen, Lymphom in Phänomen Mäuse und Behandlung von Lymphomen mit Auto-T-Zellen mit oder ohne den Einsatz von Lymphodepleting Vorkonditionierung etablieren. Dies kann für Kombination Studien von Auto-T-Zellen mit anderen Agenten, Test Auto T-Zellen mit anderen transgene oder die Verwendung anderer Adoptiveltern Zelle Therapie oder Immuntherapie Strategien gegen Lymphom verwendet werden.

Protocol

Alle Tierversuche wurden unter der Schirmherrschaft der Tiere (wissenschaftliche Verfahren) Act 1986 und UK Coordinating Committee für Krebsforschung Richtlinien durchgeführt. Alle Tierversuche durchgeführt am Institut CRUK-Manchester und genehmigt durch die lokalen Tierschutz und Ethik überprüfen Körper (CRUK-MI-AWERB).

1. Vorbereitungen

  1. Maxiprep pMP71 retrovirale konstruieren Plasmid und pCL-Eco Retrovirus Verpackung Plasmide18.
    Hinweis: pMP71 kodiert, mCherry und das Auto durch eine FMDV2A Sequenz getrennt. Dies ist austauschbar mit anderen retroviralen Konstrukten. pCL-Eco kodiert Gag, Pol und die Ecotropic Umschlag Proteine.
  2. Bereiten Sie komplette T-Zell-Medium (TCM) für die Kultivierung von Maus-T-Zellen mit RPMI 1640 Medium, 10 % FCS, 1 % 100 X Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PSG).
    Hinweis: Die Lösung enthält 100 IE/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 2 mM L-Glutamin), 50 μM β-Mercaptoethanol und 25 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES).
  3. Kulturzellen Sie A20 in RPMI 1640, 10 % FCS und 0,05 mM β-Mercaptoethanol bei 37 ° C, 5 % CO2.
  4. Kultur der Platin-E (Plat-E) Zellen in komplette Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) (DMEM mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 1 μg/mL Puromycin und 10 μg/mL Blasticidin) bei 37 ° C, 5 % CO2.
    Hinweis: Plat-E Zellen stammen aus 293T Zellen und express Gag, Pol und Ecotropic Umschlag retrovirale Proteine.
  5. Bereiten Sie Transfektion Medienlösungen 1 und 2 unmittelbar vor Transfektion. Bereiten Sie Lösung 1 (pH 7,9) enthalten DMEM + 10 % FCS + 25 mM HEPES, Lösung 2 (pH 7,1) enthalten DMEM + 25 mM HEPES vor.
  6. Bereiten Sie 10 μg/mL rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment Lösung durch Verdünnung mit sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und bei-20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
  7. Steril alle Filtermedien durch 0,2 μm-Filter vor der Verwendung (ausgenommen rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment).

(2) retrovirale Transduktion von T-Zellen

  1. Tag 1: Vorbereitung zur Transfektion
    1. Samen 7,5 x 106 Platin-E (Plat-E) Zellen in 15 cm2 Gewebekultur Gerichte in 18 mL komplette DMEM und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.
  2. 2. Tag: Transfektion von Plat-E retrovirale Verpackung Zelllinie
    1. Bereiten Sie 20.4 μg des Pcl-Eco Verpackung Vektor-DNA, 39,6 µg Plasmid-DNA Kodierung retrovirale Auto Konstrukt und 150 μL 1 M CaCl2 zu Endvolumen von 3 mL Transfektion Lösung 2 je 15 cm2 Teller transfiziert werden vor. Wirbel für 10 s und 5 min ruhen lassen
    2. Die 15 cm2 Gerichte DMEM Medien entnehmen und ersetzen mit 12 mL Transfektion Lösung 1.
      Vorsicht Wenn die Medien verändert, können die 15 cm2 Gerichte in der Mitte trocknen. Dadurch können erhebliche Tod von transfizierten Zellen Plat-E. Arbeiten Sie zügig und entfernen Sie Medien von nur 1-2 Platten zu einem Zeitpunkt zu.
    3. Fügen Sie 3 mL Transfektion Lösung 2 mit DNA und CaCl2 um jeweils 15 cm2 Teller tropfenweise, gleichmäßig auf jeder Platte. Schütteln Sie Platten mit einer Seite zur anderen Bewegung für 10 S. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 über Nacht.
  3. Tag 3: Vorbereitung der Virus-haltigen überstand für die Transduktion
    1. Ersetzen Sie die Medien von transfizierten Zellen der Platte-E mit 18 mL komplette TCM zurück zum Inkubator.
      Vorsicht Wenn wechselnde Medien 15 cm2 Gerichte in der Mitte trocknen kann. Dadurch können erhebliche Tod von transfizierten Zellen Plat-E. Arbeiten Sie zügig und entfernen Sie Medien von nur 1-2 Platten zu einem Zeitpunkt zu.
  4. Tag 3: Isolierung und in-vitro- Aktivierung der Milz T Mauszellen.
    1. 6-8-Woche-alten BALB/c Mäuse wie oben beschrieben durch Parkinson Et Al. entfernen Sie Milz 19 und tauche sie in sterile, eiskalt, PBS in einer 50 mL konische Röhre.
    2. Benutzen Sie eine Pinzette Milz auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen und mit einem Stößel mit minimalem Kraftaufwand zu homogenisieren.
    3. Verwenden eine 1000 μl Pipette und ~ 800 μl PBS übertragen Homogenat auf einem 100 μm Pore Zelle Sieb angebracht, um eine 50 mL-Tube mit 5 mL PBS, eine einzelne Zelle Aussetzung zu erreichen. Wiederholen Sie Schritt 2.4.2 für zusätzliche Milz. Überschreiten Sie 3 Milz pro Röhre nicht.
      Vorsicht Splenocyten Filter durchlaufen können Klumpen bilden, bleibt stehen. Manuell schwenken Röhren zeitweise wenn mehrere Milz zur Vermeidung von Zelle Verklumpung zu verarbeiten. Verbleibenden Fragmente auf der Zelle-Sieb kann weiter mit einem Kolben aus einer 5 mL Spritze mit minimalem Kraftaufwand püriert werden.
    4. Top-bis zu 20 mL mit PBS. Schicht der 20 mL Zellsuspension sanft auf 20 mL Dichte Gradienten Medien (Table of Materials) in einem 50 mL-Tube. Zentrifugieren Sie die daraus resultierenden überlagerte Aussetzung bei 800 X g für 20 min mit keine Bremse.
    5. Zellen mit einem sterilen Pasteurpipette und Transfer in ein 50 mL-Tube-Schnittstellenschicht zu ernten. Top-bis zu 50 mL mit PBS und Zentrifuge bei 800 X g für 10 min waschen. Verwerfen Sie den überstand und erneut aussetzen Sie Zellen in der kompletten TCM.
    6. Die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.
    7. Kulturzellen bei einer Dichte von 5 x 106 Zellen/mL in der kompletten TCM mit 30 ng/mL Anti-CD3ε Antikörper (Klon 145-2 C 11), 30 ng/mL Anti-CD28 Antikörper (Klon 37,51), 100 U/mL rekombinanten menschlichen Il-2 und 2 ng/mL rekombinante murine IL-7. Verwenden Sie eine entsprechend dimensionierte Gewebekultur Kolben für das Volumen der Zellen geerntet.
      Hinweis: Antigenpräsentierende Zellen sind erforderlich für den T-Zell-Aktivierung von CD3 und CD28 Antikörper, wenn arbeiten mit gereinigten T Zellen es Mantel Platten mit Antikörpern erforderlich ist, oder verwenden Sie magnetische Beads (Table of Materials)
    8. Inkubieren Sie Maus splenocyten bei 37 ° C, 5 % CO2 über Nacht.
  5. Tag 3: Vorbereitung der Platten für die Transduktion
    1. Mantel-Gewebekultur 6-Well-Platten mit 2 mL 10 μg/mL rekombinanten menschlichen Fibronektin fragmentieren und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
  6. 4. Tag: Transduktion von Maus-T-Zellen
    1. Übertragen Sie rekombinante menschliche Fibronektin Fragment von beschichteten Platten auf frischen Gewebekultur 6-Well-Platten. Inkubieren Sie diese Platten über Nacht bei 4 ° C für Runde 2 der Transduktion.
    2. 2 mL der TCM in jede Vertiefung der ursprünglichen rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment-beschichteten Platten und lassen für 30 min bei Raumtemperatur, unspezifischen Bindung zu blockieren.
    3. Retrovirus-haltigen überstand von transfizierten Zellen der Plat-E in 15 cm Gewebekultur Gerichte und ersetzen mit 18 mL komplette TCM zu ernten.
      Vorsicht Arbeiten Sie schnell, um zu vermeiden, Trocknen von Plat-E Zellen.
      Hinweis: Erfolg der Transfektion kann in diesem Stadium durch Fluoreszenz-Mikroskopie überprüft werden, ob eine fluoreszierende Marker-gen wie mCherry (Abbildung 1) zu nutzen.
    4. Filtern des Retrovirus-haltigen Überstands durch 0,45 μm-Filter, Zelle Ablagerungen zu entfernen. TCM von rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment beschichtet 6-Well Platten zu entfernen und 2,5 mL gefilterte Retrovirus-haltigen überstand oder in jede Vertiefung (Nutzung komplett TCM zur mock Transfektion). Beschriften Sie jedes gut, die Zugabe von Retroviren oder mock Medien.
    5. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1200 X g für 30 min bei Raumtemperatur.
    6. Während Platten drehen, aktivierte T-Zellen zu sammeln und zählen mit einem Hemocytometer.
      1. Transduktion erfolgt mit 5 x 106 aktiviert splenocyten in insgesamt 5 mL/gut. Pellet-die erforderliche Anzahl von splenocyten für Mock/Transduktion in getrennten Rohren durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 Minuten.
      2. Wieder aussetzen Sie splenocyten bei einer Dichte von 5 x 106 Zellen pro 2,5 mL des gefilterten Retrovirus-haltigen überstand aus Schritt 2.6.4 oder TCM als Negativkontrolle. Fügen Sie rekombinanten menschlichen Il-2 (hIL-2) und rekombinanten Maus IL-7 (mIL-7), eine Endkonzentration von 200 IU/mL und 4 ng/mL bzw..
    7. Sammeln Sie 6-Well Platten aus der Zentrifuge nach Abschluss von Schritt 2.6.5 zu und fügen Sie 2,5 mL/Brunnen neu abgehängte splenocyten in entsprechenden Vertiefungen zu machen ein Finales Volumen von 5 mL/gut und eine Endkonzentration von 100 U/mL hIL-2 und 2 ng/mL mIL-7.
    8. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1200 X g für 90 min bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie nach Zentrifugation die Platten bei 37 ° C, 5 % CO2 über Nacht.
  7. 5. Tag: Runde 2 der Transduktion
    1. Das rekombinante menschliche Fibronektin-Fragment von den Platten zu sammeln, wie diese wiederverwendet werden kann. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.2 - 2.6.5.
    2. Während Platten drehen, sammeln Sie Zellen von der 1St Runde Transduktion mit einer Pasteurpipette. Spülen Sie jedes gut mit 2 mL PBS, Wirbeln Sie und sammeln Sie alle verbleibenden Zellen in jede Vertiefung.
      Hinweis: Pipette rauf und runter um sedimentierten Zellen wieder auszusetzen. Sammeln Sie jede Kontrolle/Transduktion Gruppe in getrennten Rohren.
    3. Zentrifuge Rohre bei 500 X g für 5 min. wieder auszusetzen Zellen in 2,5 mL pro Bohrloch der Transduktion mit 200 IU/mL IL-2 und 4 ng/mL IL-7. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.7 - 2.6.8.
    4. Entfernen Sie die Zellen aus der Zentrifuge und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 4 Std. sammeln ausgestrahlt Zellen wie in den Schritten 2.7.2-2.7.3.
    5. Zählen der Zellen, bei 500 X g für 5 min zentrifugieren und wieder auszusetzen in der kompletten TCM bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen/mL mit 100 U/mL hIL-2 und 2ng/mL mIL-7. Übertragen auf eine entsprechend dimensionierte Kultur Kolben und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2.
    6. Hinzufügen von frischen TCM-Medien enthält 100U/mL hIL-2 und 2ng/mL mIL-7 alle 2 Tage, Aufrechterhaltung einer Zelldichte von 1 x 106 Zellen/mL.
      Hinweis: Geerntete splenocyten enthalten eine Vielzahl von Zelltypen. Unter diesen Kulturbedingungen nicht T-Zellen Absterben im Laufe von 2-3 Tagen. Nach ~ 4 Tage in der Zellkultur, die Anzahl der T-Zelle ist in der Regel entspricht die Gesamtzahl der geernteten splenocyten am Tag 0.

3. Messung der Transduktion Effizienz

  1. Am 4. Tag Post Transduktion sammeln Sie eine Probe des ausgestrahlt oder nicht ausgestrahlt T-Zellen (ca. 3 x 105 Zellen). Die Zellsuspension bei 500 X g für 5 min zentrifugieren, überstand verwerfen, gebeizte Zellen einmal mit PBS waschen und wieder Zentrifugieren.
  2. Den überstand verwerfen und 100 μl PBS mit einem geeigneten Amin Reaktivfarbstoffen(z. B.lebenden/Toten Fleck, 1: 100 Verdünnung) pro Bohrloch hinzufügen. 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
  3. Zweimal mit PBS waschen und Zentrifugieren bei 500 X g für 5 min. überstand verwerfen und inkubieren Sie mit 50 μL der FACS-Puffer mit Anti-Maus-CD16/CD32 Antikörper für Fc-Rezeptor blockieren (1: 100 Verdünnung). 10 min bei 4 ° c inkubieren
  4. Direkt hinzugefügt werden 50 μL des Antikörpers Färbung master-Mix mit Anti-Maus CD4-BV786 und CD8-BV711 Antikörper (Endkonzentration von 1 μl/Well in FACS-Puffer). 30 min bei 4 ° C im Dunkeln inkubieren. Wiederholen Sie die Waschschritt 3.3. Zellen in 1 % PFA Puffer wieder auszusetzen und halten die im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Analyse von Durchflusszytometrie.
  5. Analysieren Sie Zellen mit gleichwertigen geeignet Cytometer mit BV711, BV785 und mCherry Fluoreszenz als Marker für CD4 und CD8 Teilmenge und Auto Ausdruck bzw. gating wie in (Abbildung 2).

4. in-vitro- Validierung von Auto T-Zell Aktivität

  1. Samen Phänomen gezielt CD19+ Tumorzellen mit oder ohne Luciferase Ausdruck bei einer Dichte von 1 x 104 Zellen in 100 μl TCM/Brunnen in einer 96-Well U-Boden Gewebekultur Platte.
  2. Fügen Sie 1 x 104 CD19 Auto T Zellen/Brunnen in einem Volumen von 100 μl/Well, ein Effektor Ziel (E:T)-Verhältnis von 1:1 zu erreichen.
    Hinweis: E:T Kennzahlen festgelegt werden für jedes Auto zu konstruieren und gezielt Zelllinie.
  3. Allein Verwendung T-Zellen und Tumorzellen allein als Negativkontrollen und T-Zellen angeregt durch Phorbol-Myristate-Acetat (PMA) (50 ng/mL) und Ionomycin (1 μg/mL) als Positivkontrolle für Interferon Gamma (IFNγ) Version. Kokultur Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 für 16-24 h.
  4. Nach kokultur die Platten 500 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand für weitere IFNγ und IL - 12 p 70 ELISA Analysen zu sammeln.
    Hinweis: Dies kann bei-80 ° c gelagert werden
  5. Wieder auszusetzen Sie Zelle Pellets in 100 μl PBS mit Luciferin (Endkonzentration von 1,5 mg/mL). Inkubieren Sie die Platten für 10 min bei 37 ° c Messen Sie dann die Lumineszenz aus jedem Brunnen mit einem geeigneten Luminometer.
    Hinweis: Belichtungszeiten müssen für Zell-Linien und Dichte optimiert werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3agezeigt. Ex-Vivo Zytotoxizität von Auto-T-Zellen kann auf ausdrücklichen Luciferin von Kokulturen mit Zelllinien mit dem Ziel Antigen Ausdruck geändert werden. Wie Auto-T-Zellen Zielzellen töten, Luciferin freigesetzt wird, daher ist ein Rückgang der Luminometry Signal korreliert mit Zelle zu töten. Non-ausgestrahlt Zellen können oft auf Ziel Zellviabilität, besonders über langen Inkubationszeiten auswirken. Messen Sie die Konzentration von murinen IFNγ und IL - 12p 70 im überstand entsprechend des Herstellers ELISA Protokollen. Repräsentative Ergebnisse erscheinen (Abb. 3 b und 3 c). Ex-Vivo -Aktivierung des Auto-T-Zellen durch kokultur mit Zelllinien mit dem Ausdruck ihrer Ziel-Antigen kann durch die Analyse überstand Inhalte mittels ELISA untersucht werden. Das Verhältnis von Auto-T-Zellen auf Zielzellen und Dauer der kokultur müssen für jedes Auto-Konstrukt, Ziel-Zell-Linie und Analyten optimiert werden. PMA und Ionomycin Behandlung kann als Positivkontrolle verwendet werden, um Qualität der T-Zellen und ihre Fähigkeit zur Reaktion zu bestätigen.

5. Anti-Krebs-Aktivität bei Mäusen zu beurteilen.

  1. Protokoll Nr. 1
    1. Durchführen Sie 100 mg/kg intravenös (IV) Lieferung von Cyclophosphamid in 6 bis 8 Wochen BALB/c Mäuse. Dies ermöglicht Tumor Engraftment ohne signifikante Lymphodepletion17 (Abbildung 4).
      Hinweis: A20 herstellen kann Lymphom mit einer suboptimalen Take Rate mehr als 2 Monate dauern. Dies kann durch den Einsatz von Cyclophosphamid 1 Tag vor der Lieferung der Lymphom-Zellen verbessert werden. Um Lymphoreplete Mäuse zu studieren, haben wir eine Dosis von Cyclophosphamid, die Effizienz des Lymphoms erhöhen könnte, ohne dass Lymphodepletion identifiziert.
    2. Injizieren Sie am nächsten Tag 100 µL 5 x 105 Phänomen A20 B-Zell Lymphom-Zellen geändert, um Luciferase und grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Ausdrücken in Mäusen durch intravenöse (IV) Injektion.
    3. Ermöglichen die Mäuse zu systemischen Lymphomen für ~ 17 Tage.
    4. Bestätigen Sie die Anwesenheit von systemischen Lymphomen durch intraperitoneale (IP) Injektion von 100 μL von 30 mg/mL Luciferin und Bildgebung mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System.
      1. Verwenden Sie Separatoren Signal Spillover in angrenzenden Mäuse zu vermeiden. Setzen Sie Mäuse für 1 min auf der Bauchseite mit einer Konstanten Größe Region von Interesse.
      2. Relative light Units (RLU) als Photonen pro Sekunde (p/s) anzeigen. Einstellungen müssen für jeden Tumor Modell optimiert werden; Verwenden Sie eine Ausstellung, die Früherkennung von Tumoren abholen kann, aber führt nicht zur Sättigung, wie Tumoren Endpunkte erreichen.
      3. Rekord insgesamt RLU für jede Maus mit einer Konstanten Größe Region von Interesse. (Abb. 5a und b).
    5. Eine Einzeldosis von 1 x 106 Auto-T-Zellen durch IV Injektion in Lymphoreplete Mäuse mit etabliert-Lymphom zu injizieren.
      Hinweis: (wichtig) Dosierung von Ebenen muss für jede eingeführt werden, Auto zu konstruieren, mit einer Dosis Eskalation Zeitplan, damit jede möglichen Toxizitäten aus Auto-T-Zellen sind gekennzeichnet und angesprochen werden können. Obwohl Anti-Maus-CD19-Auto-T-Zellen nicht Toxizitäten angezeigt werden, können Auto-T-Zellen zu unerwarteten Toxizitäten führen. Wo mehrere Auto-Konstrukte und Transduktion Effizienz nicht identisch sind, sollte die Gesamtzahl der T-Zellen verabreicht durch die Zugabe von T-Zellen nicht ausgestrahlt in Zelle Vorbereitungen gleich gehalten werden.
    6. Überwachen Sie Krankheitsprogression wöchentlich durch IP-Injektion von 100 μL von 30 mg/mL Luciferin und Bildgebung mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System (Abbildung 5 c).
    7. Aufmerksam verfolgen Sie Mäuse auf Anzeichen von Toxizität und einschläfern Sie keine Mäuse, die frühe Anzeichen der hinteren Extremität Lähmung (HLP) oder pathologischen tumorlast zeigen, bevor alle leiden entstehen kann.
      Hinweis: Toxizitäten von A20 Lymphom zählen Hind Extremität Lähmung durch Tumorinvasion von der Hirnhaut. Überprüfen Sie regelmäßig Frühzeichen veränderten Gangbild. Ebenso können große IP-Tumoren entstehen, die zu Beschwerden durch verändertes Verhalten gezeigt führen kann.
    8. Überleben der Mäuse für 60-100 Tage (Abb. 5D) zu überwachen. Durchführen Sie Euthanasie durch einen Anhang-1-Methode nach Abschluss des Experiments.
  2. Protokoll Nr. 2
    1. Liefern Sie Cyclophosphamid 200 mg/kg 6 bis 8 - Wochen alten BALB/c Mäuse durch Rute Vene Injektion in 100 μl PBS per Mausklick.
    2. Am folgenden Tag injizieren von 5 x 105 Phänomen A20 B-Zell-lymphomzellen Ausdruck Luciferase und GFP 100 μl PBS über Heck Vene injizieren.
    3. Ermöglichen die Mäuse zu systemischen Lymphomen für ~ 7-14 Tage
    4. Systemischen Lymphomen durch IP-Injektion von 100 μL von 30 mg/mL Luciferin und Bildgebung mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System zu bestätigen.
    5. Durchführen Sie 5 Gy-Ganzkörper-Bestrahlung (TBI) bei 0,02 Gy/min für Lymphodepletion.
      Hinweis: Patienten, die Auto T-Zell-Behandlungen unterziehen, eine Reihe von Therapien, um Lymphodepletion zu erreichen, bevor die Verwaltung der Auto-T-Zellen die erhöht das Engraftment des adoptively Auto T-Zellen übertragen. Dies kann bei Mäusen mit Ganzkörper-Bestrahlung (TBI) (Abbildung 6) repliziert werden.
    6. Am nächsten Tag injizieren Sie 1 x 106 Auto-T-Zellen in 100 μl PBS über Heck Vene Injektion in Mäusen mit gegründet Tumoren.
    7. Sammeln Sie Blut Proben über Heck Vene blutet nach 7 Tagen.
    8. Jede Blutprobe fügen Sie rote Zelle Lysis Puffer hinzu, dann Durchflusszytometrie bereiten Sie vor, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Analysieren Sie Auto T Zelle Persistenz in der Zirkulation durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2).
      Hinweis: Zugabe von zählen Perlen unmittelbar vor zytometrie ermöglicht die Bestimmung der Anzahl der Auto-T-Zellen pro Milliliter Blut.
    9. Überwachen Sie Krankheit Fortschritt, wie 5.1.5 - 5.1.8 (Abbildung 7) beschrieben.

Representative Results

Für hohe Effizienz Transduktion von T-Zellen ist es notwendig, frische retroviralen Partikel zu erhalten. Transfektion von Plat-E-Zell-Linie mit pCL-Eco Produzent Plasmid und pMP71 Retrovirus Plasmid ergibt sich die Sekretion von retroviralen Partikel in die Zelle überstand. Wenn eine fluoreszierende Marker-gen, wie z. B. mCherry, in den Retrovirus codiert ist, kann erfolgreich Transfektion durch Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 1) bestätigt werden. Virus-haltigen überstand von transfizierten Zellen Plat-E wird verwendet, um die T-Zellen transduzieren von Spin-Perfektion auf Fibronektin Fragment-beschichteten Platten über 2 Runden. Die Effizienz der Transduktion kann 4 Tage post Transduktion über Durchflusszytometrie bestimmt. Erfolgreich ausgestrahlt Zellen zum Ausdruck bringen des Marker-Gens codiert in den Retrovirus (Abbildung 2). Transduktion Wirkungsgrade reichen von ~ 50-90 % Wirkungsgrad mit Rezeptoren der ersten Generation, ~ 10-40 % mit dem Auto in der Nähe der retroviralen Verpackungsleistung konstruiert. Während Marker-gen-Expression erfolgreich retrovirale Transduktion zeigt, ist es ausschlaggebend für die Funktionalität des CAR-T-Zellen bei der Auseinandersetzung mit Zellen das ausdrückliche Ziel-Antigen auf ihrer Oberfläche zu zeigen. Ziel Zelllinien geändert, um ausdrückliche Luciferase können in Luciferase-Assays verwendet werden, um den Grad der Zelle-Kill durch Auto-T-Zellen direkt (Abbildung 3A) zu testen. Die Freisetzung von Effektor Zytokine aus Auto-T-Zellen auf kokultur mit Zielzellen, bestimmt durch ELISA, kann auch als indirekte Messung der CAR T Zelle Zytotoxizität (Abb. 3 b und 3 C) verwendet werden.

CAR-T-Zellen produziert, die in diesem Protokoll können bei Lymphoreplete Mäusen ausgewertet werden, durch die Schaffung von systemischen A20-Lymphom mit einer Dosis von 100 mg/kg von Cyclophosphamid (eingespritzt intravenös), 1 Tag vor IV Injektion von 5 x 105 A20 Zellen (Abbildung 4). IP-Injektion mit Luciferin und Bilderfassung mit einer in-Vivo -Biolumineszenz-Imager kann verwendet werden, tumorlast mit einer Konstanten ROI und Belichtung Zeit im gesamten (Abbildung 5A-C) zu überwachen. CAR-T-Zellen geändert, um ausdrückliche IL-12 sind in der Lage, die Beseitigung der systemischen Lymphomen mit Lymphodepleting Vorklimatisierung geben krankheitsfreien Überlebens in etwa 25 % der Mäuse (Abbildung 5). Lymphodepleting Vorkonditionierung, verbessert erreicht durch 5 Gy TBI 1 Tag vor die intravenöse Verabreichung von Auto-T-Zellen deutlich Engraftment (Abbildung 6). In diesem Modell sind erste Generation-Auto T-Zellen in der Lage, der Beseitigung der systemischen A20-Lymphom, in der Regel induzierende krankheitsfreien Überlebens in 100 % der Mäuse (Abbildung 7).

Figure 1
Abbildung 1: Bestätigung der erfolgreichen Transfektion von Zellen Plat E. Plat-E Zellen transfiziert mit retroviralen Auto konstruieren und pMP71 und Pcl-Eco Verpackung Vector Plasmid DNA. Erfolgreiche Transfektion wird durch die Expression des Gens mCherry fluoreszierenden Marker angezeigt. (A) Hellfeld-Mikroskopie, (B) Fluoreszenz-Mikroskopie und (C) fusionierten Bilder angezeigt werden. Vergrößerung = 50 X. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Bestimmung der Transduktion Effizienz durch Durchflusszytometrie. Durchflusszytometrie wird verwendet, um festzustellen, die Transduktion Effizienz der T Mauszellen am 4. Tag Post Transduktion, mit Zombie UV lebenden/Toten, mCherry, BV711 und BV785 für den Nachweis von live, Auto bauen, CD4 und CD8-Zellen, beziehungsweise. Repräsentative Ergebnisse der A) nicht ausgestrahlt, (B) mCherry.αmCD19.mCD3z und (C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 sind mit Anspritzung 1 gezeigt) Unterhemden 2) Leben Zellen 3) CD4 und CD8 (4) und (5) Bewertung der mCherry positive Zellen Auto zum Ausdruck zu bringen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Validierung von Auto T-Zell-Aktivität. ΑmCD19-Auto-T-Zellen wurden mit A20-Lymphom-Zellen geändert, um ausdrückliche Luciferase Co kultiviert (1 x 104: 1 x 10-4) für 16 h in ein U-Boden-96-Well-Platte. Nach kokultur Zellen wurden oelletiert und überstand wurde gesammelt. A) Zellen wurden neu in PBS schweben und Luminometry wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zielzellen zu beurteilen. Überstand von kokultur wurde auf das Vorhandensein von IFNγ (B) und IL-12 (C) bewertet. Das Verhältnis von Auto-T-Zellen auf Zielzellen und Dauer der kokultur optimiert werden müssen für jedes Auto zu konstruieren und gezielt Zelllinie. PMA und Ionomycin Behandlung kann als Positivkontrolle verwendet werden, um Qualität der T-Zellen und ihre Fähigkeit zu reagieren zu bestätigen. Fehlerbalken zeigen SD statistische Analyse mit Hilfe einfache ANOVA durchgeführt wurde. p < 0,001). Diese Zahl wurde von17geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Zur Gründung A20 Lymphom ohne Lymphodepletion. Cyclophosphamid kann Effizienzsteigerung von Lymphom Induktion ohne Lymphodepletion zu verursachen. A) Blutbild von 6-8-Woche-alten BALB/c Mäusen nach IV Lieferung von 100 mg/kg von Cyclophosphamid. Fehlerbalken zeigen SD B) Lymphom Belastung von 6-8-Woche-alten BALB/c Mäusen nach IV Lieferung von 100 mg/kg von Cyclophosphamid oder Kochsalzlösung am Tag-1 und IV Lieferung von 5 x 105 A20 Zellen am Tag 0 mit einem Luminometer gemessen. ( C) Überleben der Mäuse in B). Fehlerbalken zeigen SD statistische Analyse mit 2-Way ANOVA durchgeführt wurde. ** p < 0,01 *** p < 0,001). Diese Zahl wurde von Kueberuwa Et Al. modifiziert 17. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5. Überwachung von Lymphom Belastung und überleben. Mäuse mit A20 Lymphom mit dem Ausdruck Luciferase erhalten 100 µL intraperitoneale (IP) Injektionen von 30 mg/mL Luciferin und wurden mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System abgebildet. (A) Mäuse waren ausgesetzt für 1 min auf der Bauchseite und sofort umgedreht auf Bild dorsalen Tumormassen auf beiden Seiten der Organe (B)abholen. C) repräsentative Ergebnisse der Lymphom-Belastung von BALB/c Mäusen erhalten unterschiedliche αmCD19 Auto T-Zellen ohne Lymphodepletion. Fehlerbalken zeigen SEM D) Überlebensrate der gleichen Mäuse. Diese Zahl wurde von Kueberuwa Et Al. modifiziert 17. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. Auswirkungen der Lymphodepletion. (A) Blutbild von 6-8-Woche-alten BALB/c Mäusen nach Erhalt 5 Gy TBI mit einer Dosisrate von 0,02 Gy/min; Fehlerbalken zeigen SD statistische Analyse von zwei-Wege-ANOVA. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. B) Überwachung von CD4+ und CD8+ Auto T-Zellen im peripheren Blut von Mäusen durch Durchflusszytometrie für die mCherry Marker-Gen 7 Tage Post Verwaltung. Fehlerbalken zeigen SD Diese Zahl wurde von Kueberuwa Et Al. modifiziert 17. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7. Auto-T-Zell-Aktivität mit Vorkonditionierung Lymphodepleting. Typische Ergebnisse, die die Wirkung von 5 Gy TBI am Tag vor dem Auto T-Zell-Verwaltung. (A) Bildgebung und (B) grafische Darstellungen der Bildgebung von Mäusen nach 100 µL intraperitoneal (IP) Injektionen von 30 mg/mL Luciferin mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System. Fehlerbalken zeigen SEM. C) Überleben der gleichen Mäuse. Diese Zahl wurde modifizierte FromKueberuwa Et al. 17. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Phänomen Mausmodellen ermöglichen das Testen von Krankheitsverlauf und Therapie unter Beibehaltung ein intaktes Immunsystem. Dies ist entscheidend, wenn es darum geht, Therapien, die mit dem Immunsystem und vor allem für Immuntherapie Agenten interagieren.

Das hier beschriebene Protokoll hat zwei kritische Arbeitsabläufe, ersteres genetisch modifiziert Maus T Zelle, um Autos zu äußern. Dies erfordert 7 Tage nach Beginn der Validierung der Transduktion. Gleichzeitig mit der Produktion von Auto-T-Zellen ist die Einrichtung von systemischen Lymphomen bei Mäusen. CAR-T-Zellen-Produktion ausfallen, oder Qualität wird nicht ausreichen, gibt es in der Regel nicht genug Zeit, um Ersatzzellen vor Mäuse produzieren erliegen Lymphom. Daher ist es wichtig, dass die Forscher anhand dieser Modelle genau Tumor Dosier- und Krankheit Fortschreiten Studien durchführen, um erfolgreich die Produktion von Auto-T-Zellen für therapeutische Verwaltung Zeit.

Typische Gründe für die geringe Effizienz der T-Zell-Signaltransduktion beinhaltet Armen Transfektion Effizienz der Produzent Zellen, in der Regel verursacht durch schlechte Plasmid Reinheit oder ungenaue Bestimmung des pH-Werts der Transfektion Medien. Es wird empfohlen, zu überprüfen, die Effizienz der Produzent Zelle Transfektion bevor Sie fortfahren mit dem vollständigen Protokoll wie schlechte Transfektion wird die Effizienz der T-Zell-Signaltransduktion zu begrenzen. Rekombinante menschliche Fibronektin Fragmente gesammelt werden können und bei-20 ° C zur Wiederverwendung, jedoch mehrere Einfrieren-Taut führen zu reduzierten Transduktion Effizienz gespeichert. Rasche Abwicklung der Maus Milz nach Kollektion auch wichtig für den Erhalt der hohen Erträge von lebensfähigen T-Zellen.

Es sei darauf hingewiesen, dass das hier beschriebene Protokoll nutzt A20 Zellen Luciferase zum Ausdruck zu bringen. Dies wird bevorzugt, da es die Möglichkeit bietet, systemische tumorlast von Biolumineszenz Bildgebung zu messen. In der Gegenwart ein funktionierendes Immunsystem könnte Antworten auf Luciferase jedoch die Ergebnisse verzerren. Wir haben zuvor Immunreaktionen überleben Mäuse auf Marker transgene17getestet. Es ist Schlüssel, wichtige Experimente mit A20 Zellen frei von transgenen validieren zu replizieren, die diese keine bedeutende Rolle bei der Beseitigung der Tumor durch Immunzellen spielen.

Während klinische Agenten nur verwendet in Vivo in immundefiziente Mäuse sein können, ermöglicht die Verwendung von Maus Auto T-Zellen gegen Krebszellen Maus uns, die Beiträge des Immunsystems zur therapeutischen Wirksamkeit oder Krankheit Fortschreiten zu bewerten. Dieses Protokoll könnte für die präklinische Bewertung der Autos, die Ausrichtung auf B-Zell-Lymphom oder anderen Autos mit zusätzlichen Modifikationen wie Sekretion von IL-12, wie hier beschrieben genutzt werden. Beachten ist, dass obwohl das Zusammenspiel von Immunzellen im Phänomen Mausmodellen ausgewertet werden kann, sie nicht präzise Interaktion im Menschen in Vivorekapitulieren können. Bestimmten beachten Sie, dass Mensch und Maus Autos variiert in der Struktur, die nachgelagerte Auswirkungen haben könnte; optimale Aktivierung und Zelle Kulturbedingungen für Wachstum von T-Zellen sind verschiedene20, Gewebeverteilung von Antigen Zielausdruck variieren zwischen Menschen und Mäusen und erfahrenen Toxizitäten radikal unterschiedlich sein können. Daher unbedingt ex Vivo und xenogene Modelle bestätigen Ergebnisse zu nutzen.

Zusammenfassend lässt sich sagen rekapitulieren das Phänomen Lymphodepleted und Lymphoreplete Modell des Lymphoms Patienten mit und ohne vorherige Chemotherapie/Strahlentherapie. Dies bietet ein Modellsystem zum imitieren der klinischen Einstellungen ermöglichen die Prüfung einer Reihe von therapeutischen Strategien, die mit der nächsten Welle der neuen Immuntherapie Agenten wichtig sein wird.

Mit dem Einsatz der Vorkonditionierung es wird darauf hingewiesen, dass alle Mäuse in der Regel das Lymphom klar. Mit ist bis zu 90 % komplette Response-Raten in den Menschen, das Vertreter. Allerdings werden die Herausforderungen für CD19 Auto T-Zell-Therapie abhängen verhindert die hohe Frequenz der Schübe beobachtet, sind oft CD19. Rückfälle sind nicht in diesem Modell bis zu, und oft über 100 Tage beobachtet worden. Änderungen an der Rückfälle in der Klinik gesehen imitieren konnte bei den zukünftigen Herausforderungen des CD19 Auto T-Zell-Therapie helfen.

Disclosures

David Gilham arbeitet für Celyad, die bei der Herstellung von Auto-T-Zellen beteiligt ist. Der Rest der Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir möchten Bloodwise Danke für die Finanzierung dieser Forschung (Grant 13031) und die CRUK Manchester biologischer Ressourcen Einheit, Bildgebung und zytometrie und Molekularbiologie Kern Einrichtungen für die Unterstützung dieser Arbeit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Appleton Woods FC121
0.45 µm syringe filter Appleton Woods FC122
1.5ml pestle and microtube VWR 431-0098
100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) Gibco 10378016
2-Mercaptoethanol (50 mM) Gibco 31350-010
Blasticidine S hydrochloride Sigma- Aldrich 15205
Bottle Top Filter (0.2 µm) Scientific Laboratory Supplies FIL8192
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100759 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100552 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5
Calcium chloride dihydrate Sigma- Aldrich C7902
Cell counting beads – CountBright absolute counting beads Molecular Probes C36950
Cell Strainer 100μm VWR 734-0004
Cyclophosphamide Monohydrate Merck 239785-1GM
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose Sigma Aldrich D6546
Dynabeads Gibco 11131D
Ficoll Paque Plus GE Healthcare GE17-1440-03 Sold by Sigma- Aldrich
Flow cytometer - LSR Fortessa x20 BD Biosciences 658222R1
Foetal Bovine Serum Gibco 10270
Haemacytometer Appleton Woods HC001
HEPES solution Sigma- Aldrich H0887 
IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit Invitrogen 88-7121-76
IL2, Proleukin Novartis PL 00101/0936
in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system Bruker T149094
Ionomycin Calcium Salt Sigma- Aldrich I0634
Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit BioLegend 423114 1 in 100 staining dilution
Luminometer - Lumistart Omega BMG Labtech 415-301
Murine IFN-γ ELISA kit Diaclone 861.050.010
Paraformaldehyde Sigma- Aldrich 16005
pCL-Eco Novus Biologicals NBP229540
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma- Aldrich P8139
Platinum E cell line Cell Biolabs RV-101 (RRID:CVCL_B488)
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 BD Biosciences 553294 Clone  37.51
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε BD Biosciences 553057 Clone  145-2C11 
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Biosciences 553142 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2
Puromycin Dihydrochloride Sigma- Aldrich P8833
Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent TaKaRa T100B
Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) BioLegend 577806
Red cell lysis buffer eBioscience 004-4333-57
RPMI 1640 Medium Lonza BE12-167F
Trypsin - EDTA solution Sigma- Aldrich T3924 
XenoLight D-Luciferin Perkin Elmer 122799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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