Syngena mus B-cells lymfom modell för preklinisk utvärdering av CD19 CAR T-celler

Cancer Research
JoVE Journal
Cancer Research
AccessviaTrial
 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för produktion och prekliniska test av murina CD19 CAR T-celler av retrovirala transduktion och utilization som en terapi mot etablerade syngena A20 B-cells lymfom hos BALB/c-möss med eller utan lymphodepleting förkonditionering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kueberuwa, G., Zheng, W., Kalaitsidou, M., Gilham, D. E., Hawkins, R. E. A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells. J. Vis. Exp. (140), e58492, doi:10.3791/58492 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den häpnadsväckande klinisk framgången av CD19 chimära antigen receptorn (bil) T-cell terapi har lett till godkännande av två andra generationens chimära antigen receptorer (bilar) för akut lymfatisk leukemi (ALL) andnon-Hodgkin lymfom (NHL). Fokus för fältet är nu på efterlikna dessa framgångar i andra hematologiska maligniteter där mindre imponerande komplett svarsfrekvens observeras. Ytterligare tekniska CAR T-celler eller samtidig administrering av andra behandlingsmetoder kan lyckas övervinna hinder för framgångsrik terapi i andra cancer inställningar.

Vi presenterar därför en modell där andra kan genomföra prekliniska tester av CD19 CAR T-celler. Resultaten i denna väl testade B-cells lymfom modell är sannolikt att vara informativ bil T-cell terapi i allmänhet.

Detta protokoll tillåter reproducerbara produktion av mus CAR T-celler genom kalciumfosfat transfection Plat-E producent celler med MP71 retrovirala konstruktioner och pCL-Eco förpackning plasmid följt av samlingen utsöndrade retrovirala partiklar och transduktion med hjälp av rekombinant human Fibronektin fragment och centrifugering. Validering av retrovirala transduktion, och bekräftelse av bil T cellernas förmåga att döda mål lymfom celler ex vivo, med hjälp av flödescytometri, luminometry och enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), beskrivs också.

Protokoll för provning CAR T-celler i vivo i lymphoreplete och lymphodepleted syngena möss, med etablerade, systemisk lymfom beskrivs. Anti cancer verksamhet övervakas av i vivo Mareld och sjukdom progression. Vi visar typiska resultat av utrotning av etablerade B-cells lymfom när utnyttja 1st eller 2nd generation bilar i kombination med lymphodepleting förkonditioneringen och en minoritet av möss att uppnå långsiktiga remissioner när utnyttja bil T celler som uttrycker IL-12 i lymphoreplete möss.

Dessa protokoll kan användas för att utvärdera CD19 CAR T-celler med olika ytterligare modifiering, kombinationer av CAR T-celler och andra terapeutiska medel eller anpassats för användning av CAR T-celler mot olika mål antigener.

Introduction

Chimära antigen receptorn (bil) T-cell terapi har visat häpnadsväckande klinisk framgång vid behandling av CD19+ maligniteter leder till godkännande av tisagenlecleucel för recidiverande akut lymfoblastisk leukemi1 och axicabtagene ciloleucel för progressiv stora B-cells non-Hodgkins lymfom2 2017.

Betydelsen av interaktioner mellan cancer och immunsystemet i både sjukdomsprogression och terapeutiska mekanismer blir allt mer erkänd3,4,5. Till exempel är det väl dokumenterat att den tumör närmiljön (TME) är full med faktorer som kan dämpa de effektor funktionerna av immunceller6,7,8. Priming av endogena immunceller och epitop sprida kan alternativt vara nyckeln i tumör utrotning och långsiktiga motstånd mot tumören challenge9,10. Båda dessa fenomen kan inte utvärderas i xenogena modeller som saknar ett immunförsvar. Jämväl, system utnyttja transgen proteiner inte korrekt återspeglar utmaningen att bryta immuntolerans som krävs för epitop sprida11,12. En syngena modell med en fullt fungerande immunförsvar är därför avgörande för modellering dessa viktiga aspekter av cancer sjukdom progression och immunförsvaret therapeutics.

Ett viktigt förbehåll av bil T-cell terapi är att lymphodepleting förkonditioneringen krävs för terapeutisk framgång13,14. Detta uppnås vanligtvis hos patienter genom att administrera kemoterapi före infusion bil T celler15,16. Som standard metod, för att efterlikna lymphodepletion används i patientens inställning administrera vi 5 Gy kroppens totala bestrålning (TBI) för att uppnå lymphodepletion före administrering av terapeutiska CAR T-celler till möss med systemisk A20 B-cellslymfom.

Lymphodepleting förkonditioneringen är inte en fråga för flesta patienter, innebär toxicitet som kommer med kemoterapeutika att patienter med låg prestandastatus inte är berättigade för bil T-cell terapi. För att skapa ett testsystem som representerar patienterna som är berättigade till lymphodepletion, etablerade vi en lymphoreplete syngena musmodell där vi modell bil T-cell terapi av lymfom. I denna modell, vi har visat att utsöndringen av IL-12 från inom CAR T-celler kan leda till utrotning av etablerade lymfom med en framgång på ~ 25%17. Dessutom visade vi att endogena immunceller var inblandade i cancer utrotning.

Här beskriver vi i detalj protokollet för produktion av mus CAR T-celler, om lymfom i syngena möss, och behandling av lymfom med CAR T-celler med eller utan användning av lymphodepleting förkonditioneringen. Detta kan användas för kombinationsstudier av CAR T-celler med andra agenter, testning CAR T-celler med andra transgener eller för användning av andra adoptivföräldrar cell terapi eller immunterapi strategier mot lymfom.

Protocol

Alla djurförsök genomfördes under överinseende av djur (vetenskapliga förfaranden) Act 1986 och under UK samordningskommittén för cancerforskning riktlinjer. Alla djurstudier utfördes vid cancer Research UK-Manchester institute och godkänts av den lokala djurskyddet och etik granska kroppen (cancer Research UK-MI AWERB).

1. förberedelser

  1. Maxiprep pMP71 retrovirala konstruera plasmid och pCL-Eco retrovirus förpackning plasmider18.
    Obs: pMP71 kodar mCherry och bilen åtskilda av en FMDV2A sekvens. Detta är utbytbara med andra retrovirala konstruktioner. pCL-Eco kodar gag, pol och ecotropic kuvert proteiner.
  2. Förbereda komplett T cell medium (TCM) för odling mus T celler använder RPMI 1640 medium, 10% FCS, 1% 100 x penicillin-streptomycin-glutamin (PSG).
    Obs: Lösningen innehåller 100 IE/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 2 mM av L-glutamin), 50 μM β-merkaptoetanol och 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES).
  3. Kultur A20 celler i RPMI 1640, 10% FCS och 0,05 mM β-merkaptoetanol vid 37 ° C, 5% CO2.
  4. Kultur Platinum-E (Plat-E) cellerna i komplett Dulbeccos modifierade eagle medium (DMEM) (DMEM med 10% fetalt kalvserum (FCS), 2 mM L-glutamin, 1 μg/mL puromycin och 10 μg/mL blasticidin) vid 37 ° C, 5% CO2.
    Obs: Plat-E celler härrör från 293T celler och express gag, pol och ecotropic kuvert retrovirala proteiner.
  5. Förbereda transfection medialösningar 1 och 2 omedelbart före transfection. Bered 1 (pH 7,9) innehålla DMEM + 10% FCS + 25 mM HEPES, lösning 2 (pH 7.1) innehålla DMEM + 25 mM HEPES.
  6. Förbereda 10 μg/mL rekombinant humant Fibronektin fragment lösning genom att späda med steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och förvaras vid-20 ° C fram till användning.
  7. Steril filtrera alla medier genom 0,2 μm filter före användning (exklusive rekombinant humant Fibronektin fragment).

2. retrovirala transduktion av T-celler

  1. Dag 1: Förberedelse för transfection
    1. Utsäde 7,5 x 106 Platinum-E (Plat-E) celler i 15 cm2 vävnadsodling rätter i 18 mL komplett DMEM och inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO2.
  2. Dag 2: Transfection av Plat-E retrovirala förpackning cellinje
    1. Förbereda 20,4 μg av pcl-Eco förpackning vektor DNA, 39,6 μg av plasmid DNA-kodning retrovirala bil konstruera och 150 μl av 1 M CaCl2 till slutlig volym av 3 mL transfection lösning 2 per 15 cm2 maträtt att vara transfekterade. Vortex för 10 s och vila i 5 min
    2. Ta bort DMEM media från de 15 cm2 rätterna och ersätta med 12 mL transfection lösning 1.
      Försiktighet När du ändrar media, kan de 15 cm2 rätterna torka på center. Detta kan orsaka betydande död transfekterade Plat-E celler. Arbeta snabbt och ta bort medier från bara 1-2 tallrikar på en gång.
    3. Lägga till 3 mL transfection lösning 2 innehållande DNA och CaCl2 till varje 15 cm2 maträtt drop-wise, jämnt över varje tallrik. Skaka försiktigt plattor med en sida till sida rörelse för 10 s. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 över natten.
  3. Dag 3: Förberedelse av virusinnehållande supernatanten för Signaltransduktion
    1. Ersätt media transfekterade plattan-E celler med 18 mL slutföra TCM och återgå till inkubatorn.
      Försiktighet När ändrar media 15 cm2 rätter kan torka på center. Detta kan orsaka betydande död transfekterade Plat-E celler. Arbeta snabbt och ta bort medier från bara 1-2 tallrikar på en gång.
  4. Dag 3: Isolering och in vitro- aktivering av mus mjälten T-celler
    1. Ta bort mjälte från 6-8-vecka-gammal BALB/c-möss som tidigare beskrivs av Parkinson m.fl. 19 och doppa dem i steril, iskall, PBS i en 50 mL konisk tub.
    2. Använda pincett för att överföra en mjälte till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och homogenisera med en mortelstöt med minimal kraft.
    3. Använda en 1000 μl pipett och ~ 800 μL PBS att överföra Homogenatet till en 100 μm porstorlek cell SIL fästs till en 50 mL tub innehållande 5 mL PBS att uppnå en enda cellsuspension. Upprepa steg 2.4.2 för de ytterligare mjälte. Överskrid inte 3 mjälte per rör.
      Försiktighet Splenocytes passerade genom filtret kan bilda klumpar om vänster stående. Manuellt snurra rören periodvis om bearbetning flera mjälte Undvik cell klumpar. Återstående fragment på cell silen kan vara ytterligare mosade med en kolv från en 5 mL spruta med minimal kraft.
    4. Top upp till 20 mL med PBS. Skikt 20 mL cellsuspension varsamt på 20 mL täthet lutning media (Tabell för material) i en 50 mL tub. Centrifugera resulterande putsade suspensionen vid 800 x g i 20 min med ingen broms som tillämpas.
    5. Skörda celler på gränssnittet lager med en steril Pasteur-pipett och överföring till en 50 mL tub. Top upp till 50 mL med PBS och centrifugera vid 800 x g i 10 min för att tvätta. Avlägsna supernatanten och slamma cellerna i fullständig TCM.
    6. Räkna antalet celler som använder en hemocytometer.
    7. Kultur celler med en täthet på 5 x 106 celler/mL i fullständig TCM med 30 ng/mL anti-CD3ε antikropp (klona 145-2 C 11), 30 ng/mL anti-CD28 antikropp (klon 37.51), 100 U/mL rekombinant humant IL-2 och 2 ng/mL rekombinant murin IL-7. Använd en lämplig storlek vävnadsodling kolv för volymen av celler skördas.
      Obs: Antigen presenterande celler krävs för T-cells aktivering av CD3 och CD28 antikroppar, om arbetar med renat T celler det är nödvändigt att coat plattor med antikroppar, eller använda magnetiska pärlor (Tabell för material)
    8. Inkubera mus splenocytes vid 37 ° C, 5% CO2 över natten.
  5. Dag 3: Förberedelse av plattor för Signaltransduktion
    1. Coat icke-vävnad-kultur 6-väl plattor med 2 mL 10 μg/mL rekombinant humant Fibronektin fragment och inkubera över natten vid 4 ° C.
  6. Dag 4: Transduktion mus T celler
    1. Överföra rekombinant humant Fibronektin fragment från plattorna till färska icke-vävnad-kultur 6-väl plattor. Inkubera plattorna övernattning på 4 ° C för rond 2 av transduktion.
    2. Tillsätt 2 mL TCM till varje brunn av ursprungliga rekombinant humant Fibronektin fragment-belagda plattor och låt stå 30 min i rumstemperatur att blockera icke-specifik bindning.
    3. Skörda retrovirus-innehållande supernatanten från transfekterade Plat-E celler i 15 cm vävnadsodling rätter och ersätta med 18 mL fullständig TCM.
      Försiktighet Arbeta snabbt för att undvika uttorkning av Plat-E celler.
      Obs: Framgången för transfection kan kontrolleras i detta skede av fluorescensmikroskopi om utnyttja en fluorescerande markörgen såsom mCherry (figur 1).
    4. Filtrera supernatanten retrovirus-innehållande genom 0,45 μm filter ta bort cellfragment. Ta bort TCM från rekombinant humant Fibronektin fragment-belagd 6-bra plattor och tillsätt 2,5 mL filtrerade retrovirus-innehållande supernatant eller till varje brunn (Använd komplett TCM för håna transfection). Märk varje brunn att tillägg av retrovirus eller håna media.
    5. Centrifugera plattorna vid 1200 x g i 30 min i rumstemperatur.
    6. Samtidigt snurrar plattor, samla aktiverade T-celler och räkna med en hemocytometer.
      1. Transduktion utförs med 5 x 106 aktiverat splenocytes i sammanlagt 5 mL per brunn. Pellet erforderligt antal splenocytes för mock/transduktion i separat rör genom centrifugering vid 500 x g i 5 min.
      2. Återsuspendering splenocytes med en täthet av 5 x 106 celler per 2,5 mL filtrerade retrovirus-innehållande supernatant från steg 2.6.4 eller TCM som en negativ kontroll. Lägga till rekombinant humant IL-2 (hIL-2) och rekombinant mus IL-7 (mIL-7) till en slutkoncentration på 200 IE/mL och 4 ng/mL respektive.
    7. Samla 6 brunnar från centrifugen vid slutförandet av steg 2.6.5 och tillsätt 2,5 mL per brunn åter svävande splenocytes i lämpliga brunnar att göra en slutlig volym av 5 mL/väl och en slutlig koncentration på 100 U/mL hIL-2 och 2 ng/mL mIL-7.
    8. Centrifugera plattorna vid 1200 x g under 90 minuter vid rumstemperatur. Efter centrifugering, inkubera plattorna vid 37 ° C, 5% CO2 över natten.
  7. Dag 5: Omgång 2 av Signaltransduktion
    1. Samla rekombinant humant Fibronektin fragmentet från plattorna som detta kan återanvändas. Upprepa steg 2.6.2 - 2.6.5.
    2. Samtidigt snurrar plattor, samla celler från 1st runda av transduktion använder en Pasteur-pipett. Skölj varje brunn med 2 mL PBS, snurra och samla alla resterande celler i varje brunn.
      Obs: Pipettera upp och ner för att resuspendera sedimenterade celler. Samla varje kontroll/transduktion grupp i separata rör.
    3. Centrifugrör vid 500 x g i 5 min. resuspendera cellerna i 2,5 mL per brunn av transduktion med 200 IE/mL IL-2 och 4 ng/mL IL-7. Upprepa steg 2.6.7 - 2.6.8.
    4. Ta bort celler från centrifugen och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 för 4 h. samla sensorik celler som i steg 2.7.2-2.7.3.
    5. Räkna celler, Centrifugera 500 x g i 5 min och resuspendera i fullständig TCM med en täthet på 1 x 106 celler/mL med 100 U/mL hIL-2 och 2ng/mL mIL-7. Överför till en passande storlek kultur-kolv och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2.
    6. Lägga till färska TCM media som innehåller 100U/mL hIL-2 och 2ng/mL mIL-7 varannan dag, upprätthålla en cell densiteten 1 x 106 celler/ml.
      Obs: Skördade splenocytes innehåller en mängd olika celltyper. Under dessa kultur förhållanden, icke T-celler som dör under loppet av 2-3 dagar. Efter ~ 4 dagar i cellkultur, antalet T-celler är vanligtvis motsvarar det totala antalet skördade splenocytes dag 0.

3. mätning av transduktion effektivitet

  1. På dag 4 inlägg transduktion, samla ett exemplar av sensorik eller icke-sensorik T-celler (cirka 3 x 105 celler). Centrifugera cellsuspension vid 500 x g i 5 min, Kassera supernatanten, tvätta pelleterat cellerna en gång med PBS och centrifugera igen.
  2. Avlägsna supernatanten och tillsätt 100 μL av PBS som innehåller en lämplig amine reaktiva färgämne (t.ex., live/dead fläcken, 1 av 100 utspädning) per brunn. Inkubera i 15 min i rumstemperatur i mörkret.
  3. Tvätta två gånger med PBS och centrifugera 500 x g för 5 min. Kassera supernatanten och inkubera med 50 μl FACS buffert innehållande antimus CD16/CD32 antikroppar för Fc-receptorn blockera (1 av 100 utspädning). Inkubera i 10 minuter vid 4 ° C.
  4. Direkt Tillsätt 50 μL av antikropp färgning master mix som innehåller antimus CD4-BV786 och CD8-BV711 antikroppar (slutlig koncentration på 1 μL/brunn i FACS buffert). Inkubera i 30 minuter vid 4 ° C i mörker. Upprepa tvättningen 3.3. Slamma upp cellerna i 1% PFA buffert och hålla den i mörker vid 4 ° C fram till analys av flödescytometri.
  5. Analysera celler med motsvarande lämplig cytometer med BV711, BV785 och mCherry fluorescens som markörer av CD4 och CD8 delmängd och bil uttryck respektive gating liksom (figur 2).

4. in vitro -validering av bil T-cells aktivitet

  1. Utsäde syngena rikta CD19+ tumörceller med eller utan luciferas uttryck vid en densitet av 1 x 104 celler i 100 μL TCM/brunn i en 96-väl U-botten vävnadsodling plattan.
  2. Lägg till 1 x 104 CD19 bil T celler per brunn i en volym av 100 μL/brunn att uppnå en effektor-målet (E:T) förhållande 1:1.
    Obs: E:T nyckeltal bör fastställas för varje bil bygga och rikta cellinje.
  3. Använd T celler ensam och tumörceller ensam som negativa kontroller och T-celler stimuleras av phorbol-isopropylmyristat-acetat (PMA) (50 ng/mL) och ionomycin (1 μg/mL) som positiv kontroll för Interferon gamma (IFNγ) release. Samtidig kultur celler vid 37 ° C, 5% CO2 för 16-24 h.
  4. Efter samtidig kultur, Centrifugera plattorna vid 500 x g i 5 min och samla supernatanten för ytterligare IFNγ och IL - 12 p 70 ELISA analys.
    Obs: Detta kan lagras vid-80 ° C.
  5. Återsuspendering cell pellets i 100 μL av PBS som innehåller luciferin (koncentration på 1,5 mg/mL). Inkubera plattorna under 10 minuter vid 37 ° C. Mät sedan luminiscens från varje brunn med en lämplig luminometern.
    Obs: Exponeringstider måste optimeras för cellinjer och densitet. Representativa resultat visas i figur 3a. Ex-vivo cytotoxiciteten hos CAR T-celler kan ändras till express luciferin genom samtidig kultur med cellinjer som uttrycker målet antigen. Som CAR T-celler dödar målceller, luciferin släpps, därför en minskning av luminometry signal är korrelerad med cell döda. Icke-sensorik celler kan ofta ha en effekt på målet cellernas viabilitet, bestämt över långa inkubationstider perioder. Mätning av koncentrationen av murina IFNγ och IL - 12p 70 i supernatanten enligt tillverkarens ELISA protokoll. Representativa resultat visas i (figur 3b och 3 c). Ex-vivo aktivering av CAR T-celler av samtidig kultur med cellinjer som uttrycker målet antigen kan analyseras genom att analysera supernatant innehållet med hjälp av ELISA. Förhållandet mellan bil T cell till målceller och samtidig kultur periodens längd måste optimeras för varje bil konstruera, målet cellen fodrar och analyt. PMA och ionomycin behandling kan användas som positiv kontroll för att bekräfta kvaliteten på T-celler och deras förmåga att reagera.

5. Bedöm anti-cancer aktivitet hos möss

  1. Protokoll 1
    1. Utföra 100 mg/kg intravenöst (IV) leverans av cyklofosfamid i 6 till 8 veckors BALB/c möss. Detta tillåter tumör engraftment utan betydande lymphodepletion17 (figur 4).
      Obs: Lymfom kan ta över 2 månader med en suboptimal ta att upprätta A20. Detta kan förbättras genom användning av cyklofosfamid 1 dag före leverans av lymfomceller. För att studera lymphoreplete möss, identifierat vi en dos av cyklofosfamid som kan öka effektiviteten i lymfom utan att orsaka lymphodepletion.
    2. Nästa dag, injicera 100 µL av 5 x 105 syngena A20 B-cells lymfomceller är modifierade för att uttrycka luciferas och grönt fluorescerande protein (GFP) i möss genom intravenös (IV) injektion.
    3. Låta mössen att utveckla systemisk lymfom för ~ 17 dagar.
    4. Bekräfta förekomsten av systemisk lymfom av intraperitoneal (IP) injektion av 100 μL av 30 mg/mL luciferin och bildåtergivning med en in-vivo -Mareld imaging system.
      1. Använd avgränsare för att undvika signal spridningseffekter i intilliggande möss. Exponera möss för 1 min på den ventrala sidan med en konstant storlek region av intresse.
      2. Visa relativa ljus enheter (RLU) som fotoner per sekund (p/s). Inställningar måste optimeras för varje tumör modell; Använd en exponering som kan plocka upp tidig upptäckt av tumörer men leder inte till mättnad som tumörer nå slutpunkter.
      3. Spela in totalt RLU för varje mus med en konstant storlek regionen av intresse. (Figur 5a och b).
    5. Injicera en engångsdos av 1 x 106 CAR T-celler genom IV injektion i lymphoreplete möss med etablerade lymfom.
      Obs: (viktigt) Dosering nivåer måste fastställas för varje bil konstruera med hjälp av ett schema för upptrappning av dosen så att alla möjliga toxiciteter som härrör från CAR T-celler kännetecknas och kan åtgärdas. Även om antimus CD19 CAR T-celler inte visar toxiciteter, kan CAR T-celler ge upphov till oväntad toxicitet. Där flera bil konstruktioner och transduktion effektivitetsvinster inte är identiska, bör det totala antalet T-celler som administreras hållas lika genom tillsats av icke-sensorik T-celler in cell förberedelserna.
    6. Övervaka sjukdomsprogression veckovis genom IP-injektion av 100 μL av 30 mg/mL luciferin och bildåtergivning med en in-vivo -Mareld imaging system (bild 5 c).
    7. Noga övervaka möss avseende tecken på toxicitet och avliva alla möss som visar tidiga tecken på bakbenen förlamning (HLP) eller patologisk tumör bördor innan något lidande kan uppstå.
      Obs: Toxicitet från A20 lymfom kan inkluderar bakbenen förlamning genom tumör invasion av hjärnhinnorna. Kontrollera regelbundet efter tidiga tecken på förändrad gångstil. Jämväl, stora IP-tumörer kan uppstå vilket kan leda till obehag som visas av förändrat beteende.
    8. Övervaka överlevnad möss för 60-100 dagar (figur 5 d). Utföra eutanasi genom en schema-1 metod vid ingående av experimentet.
  2. Protokoll 2
    1. Leverera 200 mg/kg cyklofosfamid 6 till 8 - vecka-gammal BALB/c-möss genom svansen ven injektion i 100 μL av PBS per mus.
    2. Följande dag, injicera 5 x 105 syngena A20 B-cells lymfom celler uttrycker luciferas och god Jordbrukarsed i 100 μL PBS via svans ven injektion.
    3. Låta mössen att utveckla systemisk lymfkörtelcancer för ~ 7-14 dagar
    4. Bekräfta systemisk lymfom genom IP-injektion av 100 μL av 30 mg/mL luciferin och bildåtergivning med en in-vivo -Mareld imaging system.
    5. Utföra 5 Gy kroppens totala bestrålning (TBI) 0,02 Gy/min för lymphodepletion.
      Obs: Patienter som genomgår bil T-cell behandlingar genomgå en rad regimer att uppnå lymphodepletion innan administrering av CAR T-celler vilket avsevärt ökar engraftment av adoptively överförde CAR T-celler. Detta kan replikeras i möss med kroppens totala bestrålning (TBI) (figur 6).
    6. Injicera 1 x 106 CAR T-celler i 100 μL av PBS via svans ven injektion i möss med etablerade tumörer på nästa dag.
    7. Samla in blod prover via svans ven blödningar efter 7 dagar.
    8. Till röda blodkroppar lyseringsbuffert till varje blodprov och sedan förbereda för flödescytometri som beskrivs i avsnitt 3. Analysera bil T cell persistens i cirkulationen genom flödescytometri (figur 2).
      Obs: Tillägg av räknande pärlor omedelbart före flödescytometri tillåter bestämning av antalet CAR T-celler per milliliter blod.
    9. Övervaka sjukdomen enligt beskrivningen i steg 5.1.5 - 5.1.8 (figur 7).

Representative Results

För hög effektivitet transduktion av T-celler är det nödvändigt att få färska retrovirala partiklar. Transfection av raden Plat-E cell med pCL-Eco producent plasmid och pMP71 retrovirus plasmid ger upphov till utsöndringen av retrovirala partiklar in i cellen supernatant. När en fluorescerande markörgen, såsom mCherry, kodas i retrovirus, kan framgångsrika transfection bekräftas genom fluorescensmikroskopi (figur 1). Virusinnehållande supernatanten från transfekterade Plat-E celler används för att transduce T-celler via 2 rundor av spin-fection på Fibronektin fragment-belagda plattor. Effektiviteten i signaltransduktion kan bestämmas 4 dagar efter signaltransduktion via flödescytometri. Framgångsrikt sensorik celler uttrycker genen markör kodade i retrovirus (figur 2). Transduktion effektivitetsvinster alltifrån ~ 50-90% effektivitet med första generationen receptorer till ~ 10-40% med bil konstruerar nära retrovirala förpackning kapacitet. Medan markör genuttryck visar framgångsrika retrovirala transduktion, är det avgörande att Visa funktionerna i CAR T-celler vid engagerande med celler den uttryckliga målet antigenen på sin yta. Målet cellinjer modifieras till express luciferas kan användas i luciferas analyser för att testa graden av cell-kill av CAR T-celler direkt (figur 3A). Frisättningen av effektor cytokiner från CAR T-celler vid samtidig kultur med målceller, bestäms av ELISA, kan också användas som ett indirekt mått på bil T cell cytotoxicitet (figur 3B och 3 C).

CAR T-celler som produceras i detta protokoll kan utvärderas i lymphoreplete möss genom att upprätta systemisk A20 lymfom med en dos på 100 mg/kg av cyklofosfamid (intravenöst), 1 dag före IV injektion av 5 x 105 A20 celler (figur 4). IP-injektion med luciferin och image capture använder en i vivo Mareld imager kan användas för att övervaka tumör börda med en konstant ROI och exponering tid hela (figur 5A-C). CAR T-celler modifieras till express IL-12 klarar av att utrota systemisk lymfom med lymphodepleting förkonditionering ger Sjukdomsfri överlevnad i ca 25% av möss (figur 5 d). Lymphodepleting prekonditionering, förbättrar uppnås genom 5 Gy TBI 1 dag före IV administrering av CAR T-celler, avsevärt engraftment (figur 6). I den här modellen klarar första generationen CAR T-celler att utrota systemisk A20 lymfom, vanligtvis inducerande Sjukdomsfri överlevnad i 100% av möss (figur 7).

Figure 1
Figur 1. Bekräftelse av framgångsrika transfection Plat E celler. Plat-E celler transfekterade med retrovirala bil konstruktion och pMP71 och pcl-Eco förpackning vektor plasmid DNA. Framgångsrika transfection framgår av uttrycket av genen mCherry fluorescerande markör. (A) ljusa fält mikroskopi, (B) fluorescensmikroskopi och (C) sammanslagna bilder visas. Förstoringen = 50 X. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Att bestämma transduktion effektivitet genom flödescytometri. Flödescytometri används för att bestämma transduktion effektiviteten av musen T celler på dag 4 inlägg transduktion, använda Zombie UV live/dead, mCherry, BV711 och BV785 för detektion av levande, bil konstruera, CD4 och CD8 celler, respektive. Representativa resultat av (A) icke-sensorik, (B) mCherry.αmCD19.mCD3z och (C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 visas med gating 1) undertröjor 2) levande celler 3) CD4 och CD8 4) och 5) bedömning av mCherry positiva celler som uttrycker bil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Validering av bil T-cells aktivitet. ΑmCD19 CAR T-celler var samtidig odlade med A20 lymfomceller modifieras till express luciferas (1 x 104: 1 x 104) för 16 h i en U-botten 96 brunnar tallrik. Efter samtidig kultur, celler var pelleterat, och supernatanten samlades. A) celler var åter svävande i PBS och luminometry användes för att bedöma lönsamheten för målcellerna. Supernatanten från samtidig kultur bedömdes för förekomst av IFNγ (B) och IL-12 (C). Förhållandet mellan bil T cell till målceller och samtidig kultur periodens längd måste optimeras för varje bil bygga och rikta cellinje. PMA och ionomycin behandling kan användas som positiv kontroll för att bekräfta kvalitet av T-celler och deras förmåga celler att svara. Felstaplar visar SD. statistiska analysen utfördes med envägs ANOVA. p < 0,001). Denna siffra har ändrats från17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Om inrättande av A20 lymfom utan lymphodepletion. Cyklofosfamid kan öka effektiviteten i lymfom induktion utan att orsaka lymphodepletion. A) blodvärden hos 6-8-vecka-gammal BALB/c-möss efter IV leverans av 100 mg/kg av cyklofosfamid. Felstaplar visar SD B) lymfom bördan av 6-8-vecka-gammal BALB/c-möss efter IV leverans av 100 mg/kg av cyklofosfamid eller saltlösning på dag -1 och IV leverans av 5 x 105 A20 celler på dag 0 mätt med en luminometern. C) överlevnad möss i B). Felstaplar visar SD. statistiska analysen utfördes med 2-vägs ANOVA. ** p < 0,01, *** p < 0,001). Denna siffra har ändrats från Kueberuwa et al. 17. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Övervakning av lymfom börda och överlevnad. Möss med A20 lymfom uttrycker luciferas få 100 µL intraperitoneal (IP) injektioner av 30 mg/mL luciferin och var avbildas med en in-vivo -Mareld imaging system. (A) möss var utsatt för 1 min på den ventrala sidan och omedelbart vänt över bilden dorsala att plocka upp tumör massorna på båda sidor av organ (B). C) representativa resultat av lymfom bevisbördan för BALB/c-möss som får varierande αmCD19 CAR T-celler utan lymphodepletion. Felstaplar visar SEM. D) överlevnaden av samma möss. Denna siffra har ändrats från Kueberuwa et al. 17. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Effekterna av lymphodepletion. (A) blodvärden av 6-8-vecka-gammal BALB/c-möss efter 5 Gy TBI vid en dos på 0,02 Gy/min; felstaplar visar SD. statistisk analys av tvåvägs ANOVA. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. B) övervakning av CD4+ och CD8+ bil T-celler i perifert blod av möss av flödescytometri mCherry markör gen 7 dagar post förvaltning. Felstaplar visar SD. Denna siffra har ändrats från Kueberuwa et al. 17. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. BIL T cellsaktivitet med lymphodepleting förkonditioneringen. Typiska resultat som visar effekten av 5 Gy TBI dagen före administrering av CAR T-celler. (A) Imaging och (B) grafiska displayer för bildframställning av möss efter 100 µL intraperitoneal (IP) injektioner på 30 mg/mL luciferin använder en in-vivo -Mareld imaging system. Felstaplar visar SEM. C) överlevnad av samma möss. Denna siffra har varit modifierade fromKueberuwa o.a. 17. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Syngena musmodeller tillåter testning av sjukdomsprogression och terapi samtidigt som ett intakt immunsystem. Detta är av största vikt när det gäller behandlingar som samverkar med immunförsvaret och i synnerhet för immunoterapeutisk agenter.

Protokollet beskrivs här har två kritiska arbete strömmar, ena är genetiskt modifiera mus T-cell för att uttrycka bilar. Detta kräver 7 dagar från initiering till validering av transduktion. Samtidig med produktionen av CAR T-celler är inrättandet av systemisk lymfom hos möss. Bör bil T cellproduktion misslyckas, eller kvalitet är otillräcklig, det inte är normalt tillräckligt med tid att producera ersättning celler innan möss duka till lymfom. Det är därför viktigt att forskare som använder dessa modeller korrekt utför tumör progression studier dosering och sjukdom för att framgångsrikt tid produktionen av CAR T-celler för terapeutiska administrering.

Typiska skäl för låga T-cell transduktion effektivitet inkluderar dålig transfection effektivitet av producenten celler, orsakas oftast av dålig plasmid renhet eller felaktig bestämning av pH-värdet i transfection media. Det är rekommenderat att kontrollera effektiviteten i producent cell transfection innan du fortsätter med det fullständiga protokollet som fattiga transfection kommer att begränsa effektiviteten i T-cell transduktion. Rekombinant humant Fibronektin fragment kan samlas och lagras vid-20 ° C för återanvändning, dock flera frysa-töar resultera i minskad transduktion effektivitet. Snabb behandling av mus mjälte efter samling är också viktigt för att få hög avkastning av livskraftiga T-celler.

Det bör noteras att protokollet beskrivs här använder A20 celler som uttrycker luciferas. Detta är att föredra eftersom det ger möjlighet att mäta systemisk tumör bördan av Mareld imaging. I närvaro av ett fungerande immunförsvar, kunde dock Svaren till luciferas förvränga resultaten. Vi har tidigare testat immunreaktioner överleva möss till markör transgener17. Det är nyckeln till replikera nyckelexperiment använder A20 celler gratis av transgener för att validera som dessa inte spelar en betydande roll i tumör utrotning av immunceller.

Medan kliniska agenter kan endast användas i vivo i immun-brist möss, tillåter användning av musen CAR T-celler mot mus cancerceller oss att utvärdera bidrag från immunförsvaret att terapeutisk effekt eller sjukdom progression. Detta protokoll skulle kunna utnyttjas för preklinisk utvärdering av bilar som riktar sig till B-cells lymfom eller andra bilar med ytterligare ändringar, till exempel utsöndring av IL-12 som beskrivs här. Det måste noteras att även om samspelet mellan immunceller kan utvärderas i syngena musmodeller, de inte kan korrekt sammanfatta interaktion i människor i vivo. Av särskilt Observera, mänskliga och mus bilar varierar i strukturen som kan få nedströms konsekvenser; optimal aktivering och cell kultur villkoren för tillväxt av T-celler är olika20, vävnadsdistribution mål antigen uttryck kan variera mellan människor och möss och erfarna toxicitet kan vara radikalt annorlunda. Det är därför nödvändigt att utnyttja ex vivo och xenogena modeller att bekräfta resultaten.

I sammanfattning recapitulate det syngena lymphodepleted och lymphoreplete modell av lymfom patienter med och utan tidigare chemo/strålbehandling. Detta ger ett modellsystem att efterlikna de kliniska inställningarna för att tillåta testning av en rad terapeutiska strategier som kommer att vara viktigt med den kommande vågen av nya immun terapi agenter.

Med användning av förkonditioneringen, kommer det noteras att alla möss normalt klara lymfom. Med är upp till 90% komplett svarsfrekvens hos människor, detta representativt. Men utmaningarna för CD19 bil T-cell terapi kommer gångjärn på att förhindra den höga frekvensen av skov observerades som är ofta CD19. Skov har inte observerats i den här modellen upp till, och ofta mer än 100 dagar. Ändringar att efterlikna de skov som sett i kliniken kunde hjälpa med de framtida utmaningarna av CD19 bil T-cell terapi.

Disclosures

David Gilham fungerar för Celyad som är involverad i produktionen av CAR T-celler. Resten av författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Bloodwise för att finansiera denna forskning (grant 13031) och cancer Research UK Manchester biologisk resurs enhet, imaging och flödescytometri och molekylärbiologi corefaciliteter för att stödja detta arbete.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Appleton Woods FC121
0.45 µm syringe filter Appleton Woods FC122
1.5ml pestle and microtube VWR 431-0098
100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) Gibco 10378016
2-Mercaptoethanol (50 mM) Gibco 31350-010
Blasticidine S hydrochloride Sigma- Aldrich 15205
Bottle Top Filter (0.2 µm) Scientific Laboratory Supplies FIL8192
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100759 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100552 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5
Calcium chloride dihydrate Sigma- Aldrich C7902
Cell counting beads – CountBright absolute counting beads Molecular Probes C36950
Cell Strainer 100μm VWR 734-0004
Cyclophosphamide Monohydrate Merck 239785-1GM
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose Sigma Aldrich D6546
Dynabeads Gibco 11131D
Ficoll Paque Plus GE Healthcare GE17-1440-03 Sold by Sigma- Aldrich
Flow cytometer - LSR Fortessa x20 BD Biosciences 658222R1
Foetal Bovine Serum Gibco 10270
Haemacytometer Appleton Woods HC001
HEPES solution Sigma- Aldrich H0887 
IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit Invitrogen 88-7121-76
IL2, Proleukin Novartis PL 00101/0936
in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system Bruker T149094
Ionomycin Calcium Salt Sigma- Aldrich I0634
Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit BioLegend 423114 1 in 100 staining dilution
Luminometer - Lumistart Omega BMG Labtech 415-301
Murine IFN-γ ELISA kit Diaclone 861.050.010
Paraformaldehyde Sigma- Aldrich 16005
pCL-Eco Novus Biologicals NBP229540
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma- Aldrich P8139
Platinum E cell line Cell Biolabs RV-101 (RRID:CVCL_B488)
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 BD Biosciences 553294 Clone  37.51
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε BD Biosciences 553057 Clone  145-2C11 
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Biosciences 553142 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2
Puromycin Dihydrochloride Sigma- Aldrich P8833
Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent TaKaRa T100B
Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) BioLegend 577806
Red cell lysis buffer eBioscience 004-4333-57
RPMI 1640 Medium Lonza BE12-167F
Trypsin - EDTA solution Sigma- Aldrich T3924 
XenoLight D-Luciferin Perkin Elmer 122799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. Available from: https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf (2017).
  2. Malarkey, M., Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. Available from: https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf (2017).
  3. Liu, Y., Zeng, G. Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35, (4), Hagerstown, Md. 299-308 (2012).
  4. Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. The immune system in cancer metastasis: friend or foe. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, (1), 79 (2017).
  5. Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches. Journal of Immunology Research. 2016, 13 (2016).
  6. Vinay, D. S., et al. Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies. Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).
  7. Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. Immune Suppression in the Tumor Microenvironment. Journal of Immunotherapy. 29, (3), 233-240 (2006).
  8. Munn, D. H., Bronte, V. Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment. Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).
  9. Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 2, 85 (2002).
  10. Hardwick, N., Chain, B. Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients. Immunotherapy. 3, (6), 731-733 (2011).
  11. Makkouk, A., Weiner, G. Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge. Cancer research. 75, (1), 5-10 (2015).
  12. Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 6, (7), 833-852 (2014).
  13. Brentjens, R. J., et al. Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells. Journal of Clinical Oncology. 29, (15_suppl), 2534 (2011).
  14. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118, (18), 4817 (2011).
  15. Hay, K. A., et al. Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy. Blood. 130, 2295-2306 (2017).
  16. Zhang, T., et al. Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis. Oncotarget. 6, (32), 33961-33971 (2015).
  17. Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity. Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).
  18. Engels, B., et al. Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes. Human Gene Therapy. 14, (12), 1155-1168 (2003).
  19. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966 (2011).
  20. Kueberuwa, G., et al. CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo. Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics