Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Hier presenteren we een protocol om te bevriezen en afdeling hersenweefsel van meerdere dieren als een tijdbesparende alternatief voor één hersenen verwerken. Dit vermindert kleuring variabiliteit tijdens immunohistochemistry en vermindert de tijd cryosectioning en beeldvorming.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Green, T. R., Ortiz, J. B., Harrison, J. L., Lifshitz, J., Rowe, R. K. Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains. J. Vis. Exp. (139), e58513, doi:10.3791/58513 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Histologie en immunohistochemistry zijn routine analysemethoden te visualiseren van microscopische anatomie en lokaliseren van eiwitten in biologische weefsels. In neurowetenschap, evenals een overvloed van andere wetenschappelijke disciplines, worden deze technieken gebruikt. Immunohistochemistry kan worden gedaan op dia gemonteerd weefsel of de zwevende delen. Voorbereiding van monsters dia gemonteerde is een intensief proces van tijd. Het volgende protocol voor een techniek, genaamd de Megabrain, verminderd de tijd genomen om cryosection en mount hersenweefsel door tot 90% door het combineren van meerdere hersenen in een enkele diepgevroren blok. Bovendien, deze techniek verminderd variabiliteit tussen de rondes, in een grote histochemische studie kleuring gezien. De huidige techniek is geoptimaliseerd voor het gebruik van knaagdier hersenweefsel in downstream immunohistochemische analyses; echter kan het worden toegepast op verschillende wetenschappelijke gebieden die gebruikmaken van cryosectioning.

Introduction

Hier presenteren we het protocol voor een nieuwe methode, die wij Megabrain noemen, ontwikkeld om meerdere knaagdier gelijktijdig voor downstream immunohistochemische procedures hersenen cryosection. Een Megabrain zorgt voor de productie van afzonderlijke dia's met weefsel van meerdere dieren. Deze techniek is geoptimaliseerd voor het knippen van coronale secties uit 9 volwassen ratten hemisferen, of 5 volwassen volledige hersenen, tegelijkertijd. De techniek is daarom meest toepasselijke in grote immunohistochemische studies of andere analyses gedaan op dia gemonteerde hersenweefsel van een grote cohort van dieren.

Immunohistochemistry impliceert het gebruik van specifieke antilichamen gericht tegen proteïnen van belang om te begrijpen en karakteriseren van hun expressie en cellulaire veranderingen in specifieke weefsel1,2,3. Het gebruik van immunohistochemistry heerst in onderzoek neurowetenschap, onder andere wetenschappelijke disciplines, helpend in het cellulaire en moleculaire begrip van de hersenen-4. Grootschalige studies waarbij veel dieren en delen van de hersenen kunnen zowel de resource en de tijd intensief zijn. Als zodanig, is er een veelzijdig grondgedachte achter de ontwikkeling van het Megabrain: om tijd doorgebracht cryosectioning, montage en kleuring van weefsel, tijdens het gebruik bijgevolg minder reagentia. Bovendien is de mogelijkheid om het proces te stroomlijnen en vlek meerdere hersenen in dezelfde ronde draagt bij tot verlichting van enkele van de variabiliteit tussen de partijen, een beperking van immunohistochemistry3kleuring. Daarnaast segmenteren van een Megabrain is een tijdbesparende alternatief voor het segmenteren van individuele bevroren knaagdier hersenen en zorgt voor een snelle vergelijking van weefsel tussen dieren of zelfs behandelgroepen door microscopie technieken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De Megabrain-techniek is geoptimaliseerd met behulp van geheel en hemisected hersenen van mannelijke volwassen C57Bl6 muizen5, jonge Sprague-Dawley ratten en volwassen Sprague-Dawley ratten die transcardially geperfundeerd met 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS waren) gevolgd door 4% paraformaldehyde6. Vergelijkbare uitkomsten kunnen worden bereikt in andere stammen van de muis en rat, in beide geslachten en op verschillende leeftijden. De studie voor het genereren van gegevens voor dit manuscript jonge Sprague-Dawley ratten gebruikt en is goedgekeurd door de Universiteit van Arizona institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité, en proefdieren werden verzorgd volgens de gids voor de zorg en het gebruik van laboratorium Dieren7.

1. Cryoprotection van geperfundeerd hersenen

  1. Volgende succesvolle transcardial perfusie6, de volledige hersenen6,8 van dieren te verzamelen en na oplossen door te plaatsen in een 25 mL flesje van 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 24 uur.
    Let op: Paraformaldehyde is een giftige weefsel fixatief; voorzichtig behandelen. Paraformaldehyde overboeken naar een specifiek gelabelde afval container waarmee zijn concentratie en het volume binnen een chemische zuurkast en klik vervolgens op te slaan in het chemisch afval kabinet totdat verwijderd door chemische veiligheid of goed opgeleid personeel.
  2. Na 24 uur is verstreken, in een zuurkast, verwijder hersenen uit 4% paraformaldehyde met behulp van een spatel. Breng de hersenen in een flesje van ongeveer 20 mL 15% sacharoseoplossing in 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) totdat de hersenen zinkt naar de bodem van de flacon (ongeveer 24 h).
  3. Daarop overbrengen in de hersenen een flesje ongeveer 20 ml 30% sacharoseoplossing in 1 x TBS, totdat de hersenen naar de bodem van de flacon (ongeveer 24-48 h zinkt).

2. brain bevriezing

  1. Plaats een bekerglas van 500 mL glas op een bedje van droog ijs in een ijsemmer. Giet 300 – 400 mL tolueen (2 methyl-butaan) in het bekerglas van glas.
  2. Laat de temperatuur van de tolueen te bereiken tussen-45 ° C en -50 ° C. Monitoren en onderhouden van deze temperatuurbereik met een thermometer, het constant gedurende de hele procedure te houden. Ervoor dat de temperatuur lezingen zijn genomen uit het midden van de oplossing, en niet tijdens het aanraken van de onderkant of zijkant van het bekerglas.
  3. Vul op de benchtop, een wegwerp schimmel te embedding (zie lijst van de materialen) ongeveer 1/2 vol met optimale snijden temperatuur (OCT; Zie Tabel van materialen) Compound. Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de LGO. Als er luchtbellen verwijderen met een spatel of naald.
  4. De eerste hersenen uit de flacon van 30% sucrose verwijderen met een spatel. Op dit punt, bevriezen ofwel hersenen geheel of hemisect, afhankelijk van het ontwerp van de studie.
    1. Gebruik voor hemisected de hersenen, een nieuwe scheermesje te maken van een schoon gesneden door het weefsel te scheiden van de hemisferen. Als niet vereist voor de studie, verwijdert u het cerebellum en de bulbus bollen in dit stadium. Als het cerebellum nodig is voor de studie, wordt voorgesteld om te snijden een vlak stuk posterieure eind van de hersenen om hulp van de hersenen in staande recht in de mal. Als de studie alleen weefsel van een gelokaliseerde regio vereist, kan een knaagdier hersenen-matrix worden gebruikt voor het blokkeren van de hersenen op basis van bekende coördinaten.
  5. Geven de hersenen een numeriek systeem naamgeving. Teken een diagram zoals afgebeeld in Figuur 1. Schrijf het nummer van de eerste hersenen worden geplaatst in de mal van de Megabrain in positie 2, positie 1 verlaten als een spatie om te helpen bij een snelle identificatie van de richting waarin de hersenen waren bevroren.
  6. Met behulp van botte pincet of pincet, halen de hersenen in positie 1 worden geplaatst. Oriënteren op de hersenen met de kant te snijden eerste naar boven. De hersenen in de LGO in de juiste locatie, met behulp van het pincet te zijn positie aanpassen tot het lager onafhankelijk staat.
  7. Herhaal stap 2.3-2.5 voor de resterende hersenen/hemisferen worden bevroren in posities 3 – 10. Vermijd plaatsing hersenen/hemisferen in een symmetrische indeling.
  8. Bekijk alle 9 hersenen in de Megabrain schimmel. Zodra de hersenen staan zelfstandig rechtop, en goed georiënteerd in de LGO (zoals weergegeven in figuur 2B), toevoegen meer OCT aan de mal (tot de bovenkant van de hersenen vallen). Opnieuw, ervoor zorgen dat er geen zichtbare luchtbellen in de LGO.
  9. Gebruik het pincet te houden van de hoek van de mal, ervoor te zorgen dat de verlostang doen niet gedeeltelijk worden ondergedompeld in de LGO (figuur 3A). Voorzichtig om te houden van het niveau van de schimmel, lager de mal in de tolueen (-45 ° C tot-50 ° C) zodat het onderste derde van de mal is ondergedompeld. Houd het hier om eventuele luchtbellen in de LGO te stijgen naar de oppervlakte en weg van het weefsel (figuur 3B).
  10. Na 30 s, lagere de hele schimmel in het tolueen en de introductie van de verlostang, waardoor de Megabrain ondergedompeld gedurende ten minste 3 minuten (Figuur 3 c). Verzekert dat schimmel is niveau, zodat de hersenen blijven rechtop en equidistante (figuur 3D).
  11. Gebruik het pincet te verwijderen van de schimmel met de bevroren, OCT ingesloten na 3 min, hersenen (figuur 3E) van de tolueen.
  12. Onmiddellijk, de schimmel en de inhoud ervan wikkel in aluminiumfolie en geef deze het label met de dierlijke cijfers of Megabrain identificatie. Raak de bevroren Megabrain zo spaarzaam mogelijk om te voorkomen dat het ontdooien van het weefsel.
  13. Deze Megabrain kan nu worden overgedragen naar een vriezer van-20 ° C en opgeslagen gedurende ten minste 24 h.
    Opmerking: Protocol kan hier worden onderbroken en de Megabrain kan worden opgeslagen bevroren totdat cryosectioning plaatsvindt.

3. voorbereiding van de Megabrain voor het segmenteren op de cryostaat

  1. Het kabinet temperatuur van de cryostaat instellen tot-19 ° C. Zorg ervoor dat deze temperatuur wordt bereikt voordat u verdergaat. In de gehele afdelen, zorgen dat de temperatuur in de kast tussen-18 ° C en -20 ° C. blijft
  2. Neem de Megabrain uit de diepvries van-20 ° C en plaats het in de cryostaat. Plaats ook een klauwplaat van de afmetingen van de juiste grootte, en twee dunne omver te werpen schilderskwast in de cryostaat. Laat de Megabrain zowel de chuck in de cryostaat gedurende ten minste 15 minuten om te komen tot de temperatuur van de cryostaat.
  3. Label dia's op de juiste manier met het identificatienummer van de Megabrain en het dianummer. Leg deze dia's op een dia warmer (35-45 ° C).
  4. Het uitpakken van de Megabrain van de aluminiumfolie. Gebruik een scheermesje te snijden verticaal de hoeken van de schimmel makkelijk verwijderen van het blok van LGO worden toegestaan van de schimmel (figuur 4A).
  5. Afzien van een dunne laag (ongeveer 3 mm dik) van LGO op de chuck.
  6. Snel, met minimale contact tussen de vingers en de LGO, plaats u de Megabrain op de chuck, in de gewenste richting. Grote pincet kan ook worden gebruikt voor deze stap te minimaliseren ontdooien. Voordat u begint met de sectie, laat de Megabrain gemonteerd chuck in de cryostaat gedurende 15-20 minuten om de LGO's naar het volledig bevriezen.
  7. Zodra de basislaag van LGO heeft bevroren, breng een dikke laag van 2 mm OCT rond de zijkanten van de Megabrain en laten uitvoeren naar beneden vanaf de zijkanten op de chuck. Dit helpt beveiligen van de Megabrain naar de chuck. Nogmaals, voordat u verdergaat, laat de chuck Megabrain gemonteerd in de cryostaat gedurende 15-20 minuten om de LGO te bevriezen.
  8. Gebruik een scheermesje te verwijderen alle overtollige OCT van de partijen of de onderkant van de chuck (figuur 4B).

4. Cryosectioning de Megabrain

  1. Voordat u begint, zorg ervoor dat een bekerglas van ten minste 20 mL 1 x PBS toegankelijk.
  2. Plaats de chuck, gemonteerd met de Megabrain, in het hoofd van de chuck op de cryostaat (figuur 4B).
  3. Stel de cryostaat te snijden op de gewenste dikte. De huidige methode is geoptimaliseerd voor 10 µm tot 50 µm secties.
  4. Trim de LGO en weefsel zoals die nodig zijn voor het bereiken van de gewenste hersenen regio voor weefsel collectie (figuur 4C).
  5. Als u klaar bent voor het verzamelen van weefsel, de anti-roll plaat verlagen, totdat het rust op het podium en draai aan de hendel van de cryostaat te nemen van één afdeling. Langzaam til van de anti-roll plaat, voorzichtig dat de verdeelde Megabrain niet is gekoppeld aan de plaat van de anti-roll en niet naast het podium Figuur 4 d valt).
  6. Zachtjes kunt de schilderskwast uitrollen van de Megabrain-sectie totdat het ligt plat op het podium van de cryostaat (figuur 5A). (Indien nodig, houd de LGO plat met behulp van de verfborstels ter voorkoming van rollen).
  7. Dia verwijderen uit dia warmer en beweeg de dia, de labelkant omlaag, over de Megabrain-sectie in het werkgebied de sectie vast te houden aan de dia toe te staan.
  8. Snel een daling van 1 x PBS van toepassing op elke weefselsectie op de dia en laat dit drogen totdat ze hebben platte geborsteld niet (zie stap 4.9).
  9. Gebruik een fijne omver te werpen verfkwast gedipt in 1 x PBS borstel uit alle bubbels in het weefsel te ontvouwen van het weefsel, dus het ligt plat op de dia (figuur 5B). Wees voorzichtig niet te veranderen van de positie van de secties van de hersenen en dus verliest de relatieve positie naar de andere weefselsecties. Manipuleren van het weefsel zorvuldig te vermijden van tranen. Houd hersenen secties uit de buurt van de randen van de dia, zoals perifere ruimte benodigd voor een dekglaasje aan PAP pen in sommige kleuring protocollen is.
  10. Plaats de dia weer op de dia warmer en droog zijn voor 45 min. Cover zo nodig om te voorkomen dat stof afwikkeling op het weefsel. Eenmaal droog, slaat u de dia's in bij-80 ° C tot verder gebruik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een positief eindresultaat voor deze procedure is weefsel dat ligt plat op de dia, met geen blaasjes of tranen, in de richting waarin ze werden bevroren. Weefselsecties zijn gelijkmatig uit elkaar en herkenbaar als gevolg van goede plaatsing van de hersenen in de LGO en de goede notatie zoals aangetoond in Figuur 1. Ervan uitgaande dat het hersenweefsel werd bijeengezocht uit dieren van dezelfde leeftijd, en dat het weefsel was correct wordt uitgelijnd in de LGO, moeten secties verzameld op een dia vertegenwoordigen een soortgelijke coronale vlak, waardoor vergelijking van hersengebieden tussen dieren. Voorwaarde dat het weefsel heeft bevroren Nou, met minimale bevriezen artefact, kan H & E vlek worden uitgevoerd om te beoordelen van de kwaliteit van cryoprotection9. Immunohistochemistry kan worden uitgevoerd, zoals blijkt met de kleuring getoond in Figuur 6.

Figure 1
Figuur 1: diagram van de vertegenwoordiger van een voorgestelde indeling van de Megabrain. Dit toont de notatie van de positie van weefsel afgeleid van 9 verschillende dieren. Het stelsel is ontworpen als aangetoond; een nummeringssysteem mogen evenwel worden gebruikt. 'X' is een vertegenwoordiger van de lege ruimte ter tonen duidelijk de richting waarin het weefsel was bevroren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: onjuist en correct gepositioneerd hersenen in mal. (A) Brain hemisferen slecht uitgelijnd in LGO van de bovenkant en de zijkant. (B) goed uitgelijnde hersenen hemisferen in LGO van de bovenkant en de zijkant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: stadia van hersenen bevriezing. (A) Megabrain alvorens te worden ondergedompeld in-45 ° C tolueen. (B) Megabrain wanneer ondergedompeld in tolueen. (C) Megabrain ondergedompeld volledig in tolueen. (D) Megabrain wordt verlaagd in tolueen, waaruit blijkt dat de hersenen rechtop en gelijke afstanden van elkaar tijdens dit proces moeten blijven. (E) A bevroren Megabrain in een insluiten schimmel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: belangrijke fasen in het snijden van een Megabrain. (A) Megabrain uit de mal te embedding in cryostaat worden verwijderd. (B)-Chuck gemonteerd met Megabrain. (C) afgesneden Megabrain. (D) Megabrain afdeling op het podium van de cryostaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: sectie van pre en post gemonteerde Megabrain. (A) bevroren Megabrain afdeling (40 µm) op het podium van de cryostaat. (B) glasplaatje gemonteerd met weefsel van het Megabrain. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Immunohistochemie van een Megabrain-dia gekleurd met Iba1. (A) weefsel ontleend aan een Megbrain van uniforme kleuring tussen verschillende hersenen in een studie toont. (B) 20 x microscopische beelden uit de somatosensorische vat veld (S1BF) cortex regio van elke gekoppelde hersenen, toont consistente geïoniseerd calcium-bindende adapter molecuul 1 (Iba1) kleuring van microglia tussen hersenen. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit moet worden beschouwd tijdens deze procedure dat de temperatuur van de Megabrain en de omgeving moet voortdurend worden gecontroleerd om te voorkomen dat ontdooien en weer bevriezen van het weefsel. De hersenen kan alleen worden verwijderd uit de diepvries van-20 ° C tot aan 3 keer als telkens als het wordt aangeraakt en links in de cryostaat, met een warmere wisselende temperatuur, het weefsel ontdooit en refreezes, waardoor een gelei als textuur en abnormale weefsel integriteit10. Daarom is het optimale te snijden de Megabrain allemaal tegelijk.

Weefsel fixatie en cryoprotection zijn belangrijke onderdelen van dit protocol te minimaliseren ijs kristal vorming, verminderen van externe microbiële groei en enzymatische reacties, waardoor het behoud van weefsel integriteit10stoppen. Als de hersenen niet cryoprotected met sacharose, vervolgens de water binnen het weefsel kan ijskristallen tijdens het vriesproces, die het weefsel te versnipperen en veroorzaken gaten aan formulier vormen. Terwijl we seriële verdunningen van sacharose in TBS suggereren, kunnen hersenen geplaatst worden rechtstreeks in 30 gewichtspercenten sacharose voor een langere periode (48-72 uur) om soortgelijke cryoprotection. Het is echter sterk aanbevolen dat de sacharose oplossingen zijn gemaakt met eetlepels variaties zoals het gebruik van PBS of water in slecht cryoprotection van de Megabrain en de kwaliteit van de arme weefsel resulteren zal. Haematoxylin en eosine (H & E) vlek kan worden gebruikt om te beoordelen van de kwaliteit van de cryoprotection en de daaruit voortvloeiende bevriezen artefact11. Goede weefsel kwaliteit (met minimale gaten) is essentieel in histologische studies zoals de gaatjes verstoren kunnen de binding van antilichamen, alsmede het terugdringen van de integriteit van de weefsels van cellen met fijne processen, die invloed kunnen zijn op de analyse van sommige vlekken. Vermijd symmetrische plaatsing van de hersenen, omdat dit verwarring veroorzaken kan wanneer proberen te identificeren van het dier waaruit elke hersenen is verkregen.

De huidige techniek is geoptimaliseerd voor coronale secties; echter kan het gemakkelijk worden aangepast om te snijden Sagittaal- en dwarswapening secties. Deze wijzigingen snijden vergt passende variatie van hersenen plaatsing in stappen 2.5 via 2.7. Opgemerkt moet worden dat deze aanpassingen kunnen verminderen het aantal hersenen die in één insluiten schimmel passen kunnen.

Een belangrijke wijziging van deze techniek is de lege ruimte op positienummer 1 (zoals weergegeven in Figuur 1). Deze ruimte is ontworpen voor gemakkelijke identificatie van de Megabrain richting toestaan en daarom identificeren het dier elk hersenen is gekoppeld.

Deze techniek is gewijzigd waardoor weefsel uit een groter aantal dieren worden bevroren en gelijktijdig in de Megabrain gesneden. De grootte van de knaagdier hersenen is afhankelijk van geslacht, leeftijd en geslacht het aantal hersenen die in de mal passen kan variëren. Het is niet aangeraden om te scheiden van verschillende leeftijden, geslachten of behandelgroepen in aparte Megabrains. Hoewel dit voor uniformiteit van de grootte zorgen kan, kan het ook verhogen bias en subjectiviteit tijdens beeldvorming en analyse. Bovendien, is er onvermijdelijk variantie tussen dia's tijdens immunohistochemistry in elk protocol, die tot kleuring inconsistentie tussen groepen van leeftijd/geslacht leiden kan.

Een rechthoekige, grotere chuck werd gebruikt, in plaats van een circulaire transactie, die meer steun achter de Megabrain.

Als de schimmel en de inhoud ervan van een groter volume dan dat van een enkelvoud hersenen in een OCT schimmel waren, had meer tijd moeten bevriezen van de hersenen in de tolueen. Via trial and error, werd een tijdsduur die bevriezing van goede kwaliteit (3,5 minuten) vastgesteld. De Megabrain kan worden overgelaten in de tolueen langer; echter, de temperatuur moet blijven in de range van-45 ° C tot-50 ° C om te voorkomen dat kraken de LGO.

Aangezien er vele afzonderlijke stukjes weefsel op de dia van Megabrain, is het mogelijk dat weefsel kan uitdrogen en dus meer broos tijdens het poetsen stappen worden. Ter bestrijding van dit probleem, moet een daling van PBS worden gelegd op elke individuele hersenen sectie het om vochtig te houden totdat het is geborsteld uit.

De techniek van hemisecting de hersenen, voor een studie waarin dit vereist is, is van cruciaal belang voor het verkrijgen van goede resultaten. Wanneer hemisecting de hersenen, het is belangrijk dat deze doorsnijding gebeurt juist om ervoor te zorgen alle hersengebieden met het juiste halfrond intact. Als het cerebellum of bulbus bollen niet relevant voor de studie zijn, kunnen ze worden verwijderd. Het verwijderen van dit 'overtollige' weefsel vermindert de hoeveelheid weefsel dat moet worden bijgesneden wanneer cryosectioning. Door verwijderen van het cerebellum, kunt de hersenen meer gemakkelijk opkomen in de LGO vóór het invriezen.

Terwijl wordt geborsteld uit, houd de weefselsecties uit de buurt van de rand van de dia. Hierdoor kan de kamer voor een lijn van PAP pen, een hydrofobe barrière om te omringen het weefsel, dat een eis van sommige immunohistochemistry protocollen is. Daarnaast is ruimte nodig voor het dekglaasje aan.

Als de halfrond/hersenen valt of kantelt tijdens het Megabrain bevriezen, dan zullen de secties niet mede planer. Een vergelijkbare uitslag kan leiden tot als één hersenen groter dan de anderen in een enkele Megabrain is. Om dit te verhelpen, kunnen meer dia's worden geselecteerd om vlek waar de brain(s) in kwestie op het gewenste gebied van belang zijn.

Een beperking van deze techniek is dat alle van het weefsel wordt bevroren in een blok van LGO; Als er technische fout, zoals een slechte bevriezen wegens een onjuiste temperatuur, dan het weefsel van meerdere dieren zal worden getroffen (5-9 dierlijke hersenen in plaats van slechts 1). Dit is meer een probleem bij het gebruik van de volledige hersenen en niet hemisected secties, omdat de resterende halfrond kan worden bevroren en gesegmenteerd afzonderlijk te verkrijgen van de gewenste secties.

Een andere beperking van deze methode is dat bij het aanpassen van de cryostaat te snijden van de Megabrain, een optimale aanpak moet worden gehouden. Dit is toe te schrijven aan alle hersenen zich in iets verschillende hoeken aan elkaar, terwijl dit niet een probleem is wanneer een zonderling bevroren hersenen segmenteren. De gevolgen hiervan kunnen geminimaliseerd worden tijdens het bevriezen door te zorgen voor hersenen zijn rechtop en van een gelijkaardige grootte.

Een van de grootste voordelen van met behulp van deze techniek over bevriezing hersenen singulier is dat het de totale tijd doorgebracht bevriezing verkort en snijden hersenen tot 90%, als 9 in hetzelfde tempo als 1 hersenen wordt bezuinigd. Het andere belangrijke voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt een kleiner aantal dia's die bevatten weefsel van de vereiste dieren worden gekleurd. Dit verhoogt de betrouwbaarheid en uniformiteit van immunohistochemische kleuring, aangezien alle dia's zijn gekleurd in dezelfde ronde. Er is inconsistentie tussen dia's gekleurd op hetzelfde moment, maar een Megabrain kunnen verschillende studie hersenen worden vertegenwoordigd op een enkele dia, dus vermindering van de variabiliteit en verhogen van de geldigheid van de analyse. Met consistente kleuring is een belangrijk voordeel in een histologisch onderzoek en een grote betekenis van het gebruik van deze techniek. Tot slot kosten minder dia's ook lager aanbod.

Deze techniek kan eenvoudig worden aangepast voor snijden Sagittaal secties van een knaagdier hersenen. Het kan ook worden aangepast voor gebruik in cryosectioning het weefsel uit verschillende diermodellen en verschillende soorten weefsel, zoals spieren of lever monsters. Aanpassingen aan het protocol zou moeten worden gemaakt, met inbegrip van de optimalisatie van de hoeveelheid oplossingen gebruikt, de grootte van de cryostaat blade/fase en het volume van de insluiten schimmel.

Deze techniek kan ook worden aangepast voor vrij zwevende technieken, waar het protocol zou blijven hetzelfde tot stap 4.6. Bij deze stap zou hersenen moeten worden gescheiden en opgeheven in afzonderlijke plaat putten te worden gekleurd. Extra zorg zou moeten worden genomen niet te verwarren hersenen segmenten van het sorteren proces.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen informatieverschaffing.

Acknowledgments

PCH missie steunfondsen ondersteund het onderzoek gemeld in dit manuscript. De auteurs bedank Daniel Griffiths voor het nemen van de beelden die worden gebruikt in de cijfers.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) Fisher Scientific 14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Fisher Scientific 18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap Fisher Scientific 03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg Fisher Scientific S2-212 Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical Fisher Scientific O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers Fisher Scientific 02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C) Fisher Scientific 13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula Fisher Scientific 14-357Q
STANLEY Razor Blade Grainger 4A807
Edge-Rite Microtome blades Fisher Scientific 14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white Fisher Scientific 22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2 Fisher Scientific 70-013-032 Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes Amazon B079J12ZRV
PAP pen abcam ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. Electron Microscopy Sciences EMS065

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56, (3), 201-221 (2008).
  2. Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology? Pathologica. 87, (3), 300-309 (1995).
  3. Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49, (4), 406-410 (2006).
  4. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  5. Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
  6. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  7. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8, (6), e1000412 (2010).
  8. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40, (2), 53-57 (2011).
  9. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).
  10. Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15, (5), 475-483 (2017).
  11. Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20, (1), 5-13 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics