细胞外通量分析技术在视网膜组织外种中的能量代谢测定

Biology

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Summary

该技术描述了使用细胞外助焊剂分析仪实时记录小鼠视网膜组织的耗氧量和细胞外酸化率。

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Millman, J. R., Doggett, T., Thebeau, C., Zhang, S., Semenkovich, C. F., Rajagopal, R. Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (143), e58626, doi:10.3791/58626 (2019).

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Abstract

高敏锐度视觉是一个消耗大量能源的过程, 视网膜已经开发了几个独特的适应, 以精确地满足这些需求, 同时保持视觉轴的透明度。这种微妙平衡的扰动会导致致盲疾病, 如糖尿病视网膜病变。因此, 了解疾病期间视网膜能量代谢的变化, 对于开发合理的治疗各种原因的粘滞丢失至关重要。最近出现的商业细胞外通量分析仪使视网膜能量代谢的研究更容易获得。该协议描述了使用这种分析仪来测量通过其两个主要武器-氧化磷酸化和糖酵解-通过量化氧气消耗率 (ocr) 和细胞外的变化对视网膜能量供应的贡献酸化率 (ecar) 作为这些途径的代理。这项技术很容易在视网膜组织的移植中进行, 有助于在一个实验中评估对多种药理制剂的反应。利用该方法将缺乏棒光感受器信号的动物视网膜的代谢特征与野生型对照进行了比较。这项技术的一个主要局限性是缺乏区分光适应和暗适应能量利用的能力, 这是视网膜组织中的一个重要的生理考虑因素。

Introduction

视网膜是中枢神经系统中能量要求最高的组织之一 1.与大多数组织一样, 它通过细胞溶胶中的糖酵解或线粒体中的氧化磷酸化生成三磷酸腺苷 (atp)。氧化磷酸化比糖酵解产生 atp 的高能优势是显而易见的:36 分子的 atp 产生的前者与2分子产生的 atp产生后者。因此, 视网膜神经元主要依靠线粒体呼吸来获得能量供应, 这反映在它们的高密度线粒体2上。然而, 即使氧气丰富, 视网膜也严重依赖糖酵解机械。奥托尔·沃堡3号最初在癌细胞中描述了这种有氧糖酵解的过程, 他曾经指出, 视网膜是唯一能够产生这种代谢形式的有丝分裂后组织.自从这些初步观察, 许多有丝分裂后的组织已被描述为从事不同程度的糖酵解, 除了氧化磷酸化, 以满足他们的 atp 需求。

光转导、视觉色素回收、光感受器外段的生物合成和突触活动都是光感受器中的能量要求过程, 是视网膜中的主要神经元亚类。但在神经元1中, 积极地根据其电梯度和浓度梯度运输离子的需要是迄今为止最有活力的消耗过程。光感受器是一种特殊的神经元, 因为它们在没有刺激的情况下 (在黑暗中) 会去极化, 而光刺激会触发通道闭合和随后的超极化。因此, 在黑暗中, 视网膜消耗大量的 atp 来维持其去极化或通常所说的 "暗流"。从适应性的角度来看, 提供大量 atp 的一个主要挑战是生物体需要通过光轴保持视觉清晰度。在现代生物中看到的倒置视网膜结构是主要的解决方案, 因为它使密集的毛细管网络远离光的路径提供光感受器。但这种自然生物工程的奇迹使视网膜在代谢储备方面处于悬崖状态。即使是对视网膜的小侮辱, 也有可能破坏能源供应与需求的微妙平衡, 视觉功能障碍或坦率失明可能会很快接踵而至。

鉴于神经视网膜独特的能量需求, 再加上其对血管供应的严格限制, 准确测量视网膜中 atp 的消耗及其在疾病期间的变化可能对理解和治疗产生深远的影响。致盲疾病, 如视网膜色素变性和糖尿病视网膜病变。传统上, 这些测量需要昂贵的、定制设计的设备, 大多数研究来自于少数完全致力于测量代谢活动2,5, 6、 7,8。技术包括针对特定代谢物的单独检测、使用无线电标记前体的示踪剂研究、使用克拉克电极的耗氧量记录以及代谢组学特征分析 9

随着高通量技术的进步和商业设备供应的增加, 记录视网膜代谢的技术越来越容易获得, 而且价格也越来越实惠。这里描述的方法测量氧化磷酸化和糖酵解在视网膜使用解释组织和一个商业上可用的细胞外通量分析仪9,10,11, 12.该分析仪单独记录耗氧率 (ocr) 和细胞外酸化率 (ecar), 分别作为氧化磷酸化和糖酵解的间接指标 13.这些测量是通过一个埋在所关注组织上的微腔内的探针完成的。这种对先前公布的方法的调整使用了最初为朗格汉胰岛设计的捕获板, 记录小鼠视网膜小的圆形部分的代谢活动。由于该系统包含每个样品井的4个注射端口, 因此在一次记录过程中, 可以将多种药物暴露传递给组织。使用该系统与单独的协议优化 ecar 和 ocr 记录, 野生类型视网膜的反应可以比较视网膜缺乏传感器(gnat1-/-), 一个先天性固定夜盲症的原因人类14.

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Protocol

这些议定书遵循了《动物使用视觉和眼科研究声明》, 并得到了华盛顿大学的批准。

1. 动物准备

  1. 将动物放在标准的住房中, 有12小时的黑暗到12小时的光循环。在标准化时间开始实验, 以避免生理影响, 通常在早晨打开灯后不久。

2. 解决方案准备

  1. 在双蒸馏 h2o (ddh2o)中溶解8.4 毫克粉末介质, 并使用 hcl 或 naoh 将 ph 值调整到 7.4, 最终体积为 1 l. 滤清器, 用0.22 微米的组织培养过滤器对该溶液进行灭菌。
    1. 在培养基中加入 1 m 葡萄糖和 100 mm 丙酮酸钠, 以达到 5 mm 葡萄糖和 1 mm 丙酮酸的最终浓度。
    2. 在37°c 的水浴中放置50毫升的基介质。
  2. 准备裂解溶液, 用于在通量分析结束时进行组织定量, 方法是将 tris 碱添加到 10 mm, 聚乙二醇叔八丁醚添加到 0.2% (v/v), edta 添加到 1 mm, 所有在 ddh2o 中混合, 直到所有成分完全溶解并进行调整ph 值为8.0。
  3. 对于线粒体应激协议, 准备一份11μm 的寡霉素, 一种 atp 合酶抑制剂, 溶解在基础介质中, 以达到井内1微米的最终浓度。制备一份11μm 的碳基氰化物-4-(三氟甲基氧) 苯氨 (fccp), 一种溶解在基介质中的分离剂, 以达到井内1微米的最终浓度。通过将鱼烯酮添加到 11μm, 将抗霉素 a 添加到 22μm, 在基介质中溶解, 以达到井中1微米的最终浓度为1μm 的鱼藤酮和2μm 的抗霉素 a, 制备电子转运链抑制剂、鱼藤酮和抗霉素 a (raa) 的混合物。
  4. 对于糖酵解协议, 准备一个 220 mm 的葡萄糖库存溶解在基础介质中, 以井内的最终浓度为 20 mm 为目标。还准备一个 1.1 m 库存的 2-脱氧葡萄糖 (2-dg), 葡萄糖和糖酵解拮抗剂的竞争抑制剂, 通过溶解它在基础介质。这将以井内 100 mm 2-dg 的最终浓度为目标。

3. 仪器校准

  1. 要校准用于细胞外通量检测的仪器, 请在传感器盒的每口井 (共24口) 上添加1毫升的校准溶液, 并在37°c 时在无 co 2孵化器中孵育一夜 (或至少 8小时)。
  2. 将线粒体应力协议或糖酵解协议的添加剂加载到传感器墨盒上的每个喷射器端口 a 至 d 中, 根据井体的体积变化进行调整。
    请注意:例如, 一个典型的检测方法将包括45μl 的添加剂进入第一个喷射器端口, 49.μl 进入第二个, 54.5μl 进入第三个端口, 60μl 进入最后一个端口, 假设初始井量为450μl。
  3. 在最初的几个实验中, 将基基介质加载到端口 a 中, 以测量端口注入后发生的组织运动/人工制品的数量。
  4. 允许加载的传感器板在37°c 下在非 co2孵化器中孵育至少60分钟。

4. 新鲜小鼠视网膜组织的分离

请注意:这一步是根据巴里·温克勒博士15的技术改编而成的。

  1. 使用标准的酮胺/木糖鸡尾酒进行深度麻醉后, 用颈椎脱位对小鼠进行安乐死。
  2. 使用一对中等大小的弯曲钳抓住视神经的后地球, 轻轻地施加向前压力, 以推进眼睛 (图 1 a)。
    1. 用干净的剃须刀刀片, 使用刀片的单一、故意的传递, 创建一个限制, 在角膜上的边缘切口。
    2. 使用精细的角度麦克弗森式的钳子, 捏后地球, 以表达镜头和前透明质膜的角膜切口。丢弃这些纸巾。
    3. 用钳子重复夹紧动作来表达神经视网膜。
    4. 使用像勺子一样的钳子来抬起视网膜, 而不是抓住组织, 将视网膜从角膜切口移开, 并直接放入3厘米的盘子或6孔组织培养团块板的温暖介质中。
  3. 使用两对细, 角度麦克弗森风格的钳子轻轻地解剖剩余的玻璃体从视网膜。最好是抓住视网膜杯外围的玻璃体, 向中心拉, 最后将玻璃体从整体中心插入。使用钳子, 从视网膜的光感受器表面去除任何残留的视网膜色素上皮。
    1. 用剃须刀片切割 p1000 管尖, 形成一个 ~ 4 毫米的开口, 以防止在转移过程中对精致的视网膜组织造成不应有的创伤。
    2. 使用切割的 p1000 管尖将分离的视网膜组织转移到新鲜培养基中。
    3. 用装有柱塞的1毫米活检冲床在视神经周围切割1毫米的视网膜, 以移出组织, 以防组织卡入孔中 (图 1b)。将视网膜拳脚放在保存在37°c 块或加热垫上的清洁介质中。

5. 检测协议

  1. 使用切割的 p1000 尖端将单个冲孔转移到24口胰岛捕获微板上, 与组织一起吸气450μl 的培养基。
  2. 使用精细的直钳轻轻地操纵在微板中心的冲孔。保持拳击方向朝同一方向 (例如, 神经节细胞侧向上)。
    1. 将捕获板放在加热垫或加热块上, 设置为 37°c, 因为剩余样品重复执行这些步骤。
      请注意:对于每个实验, 留出3-4 个带有450μl 基介质的空白井作为负控制。在剩余的20-21 口井中, 测试每一个生物复制一式三份。因此, 每个24孔板将允许记录从6-7 种不同的动物或处理条件。
  3. 避免气泡, 使用钳子轻轻将胰岛捕获网格插入每口井, 并用金属柱塞或切割 p1000 管头固定刀片 (图 1c)。
    请注意:在这一步中避免过度的组织运动, 以保持视网膜冲孔位置在样品微室的中心。气泡严重扭曲 ocr 读数。尽管微室有足够的深度来容纳典型的小鼠视网膜 (图 1c), 但在网格插入物中偶尔会出现加工缺陷, 可能会导致组织在屏幕插入过程中过度压缩。如果发生这种情况, 只需记下压碎的组织, 并将该样本排除在最终分析之外。
  4. 将组织板孵育 37°c co 2 无孵化器至少60分钟。
  5. 使用 "混合"、"等待"、"测量" 和 "重复" 命令对细胞外流量分析仪进行编程。例如, 视网膜组织的典型实验可能包括以下内容: 混合 2分钟, 等待 2分钟, 测量5分钟。在以下三个步骤中重复实验, 进行基线记录5-8 次 (周期), 并在注入每个化合物后在运行过程中进行测试。
  6. 按下细胞外磁通分析仪上的程序开始按钮, 然后按照屏幕上的说明插入传感器墨盒进行校准。
  7. 校准结束时, 请按照屏幕上的说明, 将校准板替换为包含视网膜样本的板。
  8. 允许程序运行, 如编程的那样。运行完成后, 按照屏幕上的说明弹出组织板。查看运行的结果并存储数据文件。
  9. 用弯曲的20规格针和钳子, 从井上取出所有的网状刀片, 留下视网膜冲床。
  10. 小心地从组织中吸气, 用0.5 毫升的冷磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗组织两次。清洗后吸收 pbs。
  11. 在每个井中加入100μl 的裂解缓冲液, 上下移液, 使组织均匀。
  12. 根据总双链 dna (dsdna) 或总蛋白质含量定量输入水平。
    请注意:以下是基于商业上可用的 dsdna 检测。
  13. 稀释裂解样品 1:1, 加入100μl 的 tris-edta (te) 缓冲液, 并将稀释样品的100μl 转移到96井板上。
    1. 在每口井中添加100μl 的检测缓冲液。混合2-5 后, 在 480 nm 和 520 nm 的发射时定量荧光, 与标准曲线进行比较。
    2. 将对井内 dna 含量的原始细胞外通量追踪进行归一化。
      请注意:在这里给出的结果中, 样本被归一化为50纳克 dsdn--这是1毫米视网膜冲床的典型量。因此, 这里提出的绝对值可以与 "每个视网膜打孔" 数据的研究相比较。归一化对内部标准的跟踪, 例如在 5 mm 的葡萄糖浓度下运行基线。

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Representative Results

利用所述技术 (如图 1所示), 将8个一周龄野生小鼠的视网膜外植体与零小鼠 (gnat1-/-)的年龄和背景匹配的传感器进行了比较. 由于gnat1--/-动物缺乏关闭环核苷酸门控离子通道以响应光刺激的机制, 它们的棒光感受器即使在光14中也能保持去极化状态.随后需要保持钾的流出将产生大量的 atp 需求, 导致生物能量应变。为了确定这种能量需求的变化是否会增加氧化磷酸化或糖酵解通量, 使用细胞外通量分析仪对野生小鼠和gnat1--小鼠的组织进行了比较。在基线, 在存在 5 mm 葡萄糖和 1 mm 丙酮酸的情况下, 野生动物的视网膜组织的酸性流出率与Gnat1/突变体相似。添加 20 mm 葡萄糖和糖酵解抑制剂2-dg 后也会出现类似的模式 (图 2a)。这些数据也可以进行数学转换, 以表示基线的分数变化 (图 2b), 这种格式可以更好地比较不同的实验干预措施。

基线上的绝对 ocr 在 wt 和突变的视网膜组织之间是等效的 (图 3 a)。添加 20 mm 葡萄糖会增加线粒体呼吸, 但在绝对定量或基线变化方面, 两组之间没有观察到变化 (图 3b)。添加 1mm fccp (一种解偶联剂) 以显示最大线粒体呼吸速率不会显著提高 ocr 高于 wt 或gnat1---组织中高血糖水平。然而, 在添加 raa 鸡尾酒后, 两只老鼠发出的信号大幅下降。

理想情况下, 细胞外通量实验是在 atp 合酶抑制剂寡霉素存在的情况下进行的, 有助于识别质子泄漏的来源, 当通过电子传输链的运动与 atp 生产无关时发生16。在8个一周大的 C57BL/6J 小鼠视网膜外植体中, 寡霉素治疗有力地降低了 ocr, 如预期的那样 (图 4)。但随后增加 fccp, 以找到最大 ocr, 只是名义上增加 ocr 约60% 的基线, 符合先前的研究11

xf24 分析仪使用潜水探头, 使组织内的密封紧密, 创造了一个瞬态微环境, 用于测量氧气和酸通量。视网膜组织在井板中的定位 (相对于传感器) 可能会影响 ocr 记录, 并导致不需要的混淆, 一些储备人员主张将视网膜组织直接置于氧传感器下面, 并将面向传感器的光感受器外段 11.为了测试视网膜组织位置对 ocr 测量的影响, 对年轻的 c57bl/6j 小鼠 (8周大) 的组织进行了两个方向的分析: 视网膜神经节细胞朝下贴在盘子上 (照片感受器垂直放置在最接近传感器的地方)) 或朝上面对传感器。在对 fccp 或 raa 的反应中没有观察到相对 ocr 的差异, 这表明在两种方向上对最大和最小线粒体呼吸率都有相当的敏感性 (图 5a)。此外, 在两个方向的视网膜组织之间, 绝对 ocr 测量也是等效的 (图 5b)。

Figure 1
图 1: 隔离视网膜外植体, 并设置到细胞外通量分析仪. a.地球上用钳子施加推进力, 切割角膜, 并在丢弃晶状体和前透明质膜后去除视网膜, 从而原位隔离神经视网膜。b.准备用视网膜冲床制作通量记录的组织, 将单个冲孔放置在胰岛捕获微板上, 并使用网状刀片, 以最大限度地减少微室的组织运动 (刻度柱 = 1 毫米)。c.从制造商提供的数据中得出的示意图, 显示了程序大纲, 并证明微室的高度足以容纳小鼠视网膜。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 线粒体应力分析使用解释视网膜从8周大的动物。a.具有标准测量误差 (sem) 的平均示踪, 归一化为组织的 dna 含量, 从针对耗记录进行优化的实验, 将传感器敲除动物 (gnat1-/-) 与野生类型控制。b.对转换后的数据进行相同的实验, 以便将基线记录设置为参考。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 使用解释视网膜的糖酵解率分析8周龄动物。a.对用于酸流出记录的实验进行平均的、dna 内容归一化的追踪, 将传感器敲除动物 (gnat1-/-) 与野生类型对照进行比较。b.同一实验的数据归一化为基线记录。跟踪显示均为± sem. 请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 低霉素对视网膜呼吸率的不可逆影响.在8周龄的 C57BL/6J 小鼠的急性准备视网膜外植体中, 寡霉素治疗可降低随后添加 fccp 所诱导的最大 ocr。跟踪显示均为± sem. 请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 组织定位对 ocr 测量的影响.8个一周大的 C57BL/6J 小鼠的视网膜组织被放置在井中, 神经节细胞朝向传感器 (神经节细胞向上) 或远离传感器 (神经节细胞向下)。在群体之间, 类似的细胞外流量记录观察到 (a) 相对于基线的呼吸能力, 或 (b) 绝对定量。跟踪显示均为± sem. 请点击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

ocr 和 ecar 很容易测量在解释视网膜组织使用生物分析仪使用所述的技术。此方法在几个关键步骤中与其他组的方法不同。视网膜组织是通过一个大的角膜切口分离而不是在地球上摘除的, 正如温克勒15 最初所描述的那样。这种视网膜隔离方法允许从活眼快速转移到组织捕捉板 (通常在5分钟内)。在整个过程中, 组织保持在 37°c, 比放在冰上时更好地保持细胞呼吸。使用最少添加剂的介质用于初始测量, 省略任何缓冲剂, 如 hepes 或碳酸氢钠、血清或过量的宏量营养素, 因为这样可以更可靠地测量基本能量代谢, 并且不会抑制对 ecar 进行评估。视网膜拳打最好以24孔的形式记录, 而不是在96口井中记录, 以最大限度地减少对组织的创伤。视网膜组织被放置在井的中心, 在组织微腔内, 并与网状插入固定。这样做可以准确记录 ecar 和 ocr, 同时防止在运行过程中组织过度运动, 并消除对其他试剂 (如组织粘合剂) 的需求。建议在运行过程中进行车辆注射, 特别是在首次设置记录实验时, 因为这将提供一种感觉, 即组织在捕获板内的固定程度。使用这种技术的 ocr 记录与井内的视网膜方向无关, 但在实验中的样品之间必须保持方向一致。所有的测量都是在注射试验化合物后视网膜代谢达到稳定状态后才进行的。

该协议描述了数据对 dna 总含量的规范化, 作为细胞数的代理。这样的技术是有利的, 因为它将考虑到由视网膜厚度的变化, 冲床大小, 或基因不同的样本之间的纤维素差异所驱动的细胞数量的变化。基于蛋白质的完全归一化也是一种可靠的方法, 其优点是最大限度地减少视网膜样本之间的总线粒体质量差异。然而, 基于整个组织中蛋白质含量的归一化可能会被样本间细胞外基质的变化所迷惑。如代表性结果所示, 通量记录正常化到基线是有利的, 因为它最大限度地减少了重复之间视网膜冲床尺寸的变异性, 并且很容易解释由于药物干预而产生的变化。然而, 报告原始值可以更好地比较不同的实验和使用不同通量记录方法进行的实验。

使用这些技术的结果与其他地方报告的结果相当。虽然寡霉素-atp 合酶抑制剂-通常用于测量质子泄漏的组织或细胞感兴趣, 这种化合物有不利的影响视网膜代谢。在这里报告的实验中, fccp 引起的最大视网膜 ocr 减少了 60% (图 4), 与以前的研究11几乎相同。这一发现的一个潜在解释是 atp 合成酶抑制对视网膜线粒体的不可逆损害或修饰。此外, 正如 kooragayala 和他的同事首次报告的那样, 视网膜线粒体很可能在基部条件下以接近最大的速率运行, 因为电子传输链解耦剂 fccp 只增加了约15% 的 ocr (图 3)。,图 5)。

在被解释的视网膜组织中, 细胞外通量记录显示出巨大的储备糖酵解能力, 因为添加 20 mm 葡萄糖会使 ecar 增加两倍 (图 2)。由于通常用于测量最大糖酵解能力的寡霉素在视网膜组织中具有有害影响 (图 4), 使用高葡萄糖添加到记录中可能会更好地替代测量视网膜中的糖酵解储备。防止使用 ecar 作为糖酵解率的纯代名词的一个重要警告是, 柠檬酸循环释放的 co2 可以成为培养组织17中酸的重要来源. 过量丙酮酸不会使 ecar 高于高血糖引起的水平, 视网膜外植体中使用的摩尔比过量的2-dg 几乎消除了糖酵解通量 (图 2)。由于 atp 用于再生在暗适应视网膜中发生的去极化事件所产生的膜电位, 因此缺乏传感器的动物预计将比 wt 相比消耗更多的能量。然而, 在外植体中, gnat1--对照组之间的视网膜能量代谢差异在这里描述的实验中没有发现 (图 2和图 3)。这些结果与使用自定义灌注装置测量 gnnat1-- 动物18中 ocr 的结果是一致的。值得注意的是, du 和他的同事使用的定制设备允许在光线适应和暗适应条件下测量 ocr。通过这样做, 在野生视网膜中检测到光照射后 ocr 略有下降, 但在gnat1---视网膜 18没有发现.这说明了目前测量 ecar 和 ocr 技术在解释视网膜上的一个主要限制--这里使用的细胞外流量分析仪依赖于嵌入在氧气和 ph 传感器中的荧光的可见光激发, 从而消除了在适合黑暗的组织中进行测量的可能性。这种测量与视觉生理高度相关, 仍然需要使用专门为研究视网膜代谢而设计的旧技术。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢亚历山大·科列斯尼科夫博士和弗拉基米尔·凯法洛夫博士提供了 gnat1-/mics,提供了有益的反馈和建议, 并阅读了手稿。

这项工作得到了 nih ey025269 (rr)、华盛顿大学糖尿病研究中心-nih dk020579 (jrm 和 rr)、预防失明研究职业发展奖、霍恩克雷斯特基金会 (rr)、jdrf 职业发展奖 (jrm)、nih dk101392 (cfs)、dk020579 (cfs)、dk056341 (cfs) 和 dk114233 (jrm)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) Agilent, Santa Clara, CA 101174-100 Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution
RPMI 1640 Media (Powdered medium) Millipore-Sigma R1383 RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate
D-Glucose Millipore-Sigma G8270 1M D-Glucose filtered, for media preparation
Sodium pyruvate Corning 25000CI 100 mM sodium pyruvate
Antimycin-A Millipore-Sigma A8674 Mitochondrial stress protocol component
FCCP Millipore-Sigma C2920 Mitochondrial stress protocol component
Rotenone Millipore-Sigma R8875 Mitochondrial stress protocol component
2-deoxyglucose Millipore-Sigma D6134 Glycolysis protocol component
1 mm skin biopsy punches with plunger Integra-Miltex 33-31AA-P/25 Explanting retinal tissue tool
Dumont Mini-Forceps Straight Fine Science Tools 11200-10 Explanting retinal tissue tool
Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees Fine Science Tools 11253-25 Explanting retinal tissue tool
Dumont #7 Forceps - Curved Fine Science Tools 11271-30 Explanting retinal tissue tool
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit Fisher Scientific P7589 Loading normalization assay
Trizma base (Tris base) Millipore-Sigma T6066 Component of lysis buffer
Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) Millipore-Sigma X100 Component of lysis buffer
0.5M EDTA pH 8.0 Ambion AM9262 Component of lysis buffer
C57BL/6J mice  Jackson Laboratories  Strain 000664 Animals
Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+  Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine Animals

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References

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