基于细菌选择和生长的盘状细胞基因工程

Genetics
 

Summary

双翅目是研究细胞迁移、内吞和发育等复杂细胞过程的常用模型生物。生物体的效用取决于基因操纵的可行性。在这里, 我们提出了方法, 以转移牙菌细胞, 克服现有的限制培养细胞在液体介质。

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Paschke, P., Knecht, D. A., Williams, T. D., Thomason, P. A., Insall, R. H., Chubb, J. R., Kay, R. R., Veltman, D. M. Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58981, doi:10.3791/58981 (2019).

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Abstract

线粒体是研究细胞发育过程、细胞信号转导等重要细胞生物学问题的有趣的模型生物。基因操纵的双翅目细胞技术已经很好地发展。可以使用不同的可选择标记和标记重新循环进行转换, 包括同源重组和插入突变。这是由一个注释良好的基因组支持的。然而, 这些方法针对在液体培养中生长的轴突细胞系进行了优化, 很难应用于只以细菌为食的非无轴野生型细胞。轴系中存在的突变干扰 ras 信号, 导致喂养所需的过度红细胞缺乏, 并损害细胞迁移, 这混淆了这些菌株中信号转导和趋化实验的解释。早期试图对非无源性细胞进行基因操作的努力缺乏效率, 需要复杂的实验程序。我们开发了一个简单的转染协议, 首次克服了这些限制。这些对双细胞分子遗传学的一系列重大改进使野生类型的细胞能够像标准的实验室菌株一样容易纵。除了研究未损坏的信号和运动过程的优势外, 破坏基于农氏核细胞生长的突变体现在可以很容易地被隔离。此外, 整个转染工作流程大大加快, 重组细胞可以在几天而不是几周内生成。另一个优点是分子遗传学可以进一步进行新鲜隔离的野生类型的双星样本从环境。这有助于扩大在这些研究领域使用的方法的范围。

Introduction

是以细菌为食的土壤生活的社会阿米巴。被放置在阿莫博佐阿的植物中, 大量的物种被分离, 可以分为四个不同的 1.虫已成为研究细胞迁移和吞噬等复杂细胞过程的流行模式生物。为了控制和规范实验条件, 开发了能够在没有细菌2的情况下在复杂或确定的液体介质中生长的无菌细胞系。特别重要的是 ax2、ax3 和 ax4 菌株, 它们都是在1970年代产生的, 最终来自单一的野生分离 nc4 3.基因工程工具是在这些轴系中开发的, 导致1987年首次公布淘汰赛 4,5。进一步开发和优化了在无菌条件下使用的协议 67

一些实验室试图将这些协议适应无法在液体肉汤中生长的野生d 型盘状菌株。然而, 这并没有完全成功, 因为转染协议是复杂的, 缺乏效率, 部分原因是细菌的能力作为选择性试剂 8,9的水池。因此, 基本上所有的分子数据 d . 盘虫来自一个单一的野生类型分离物的后代。我们希望克服这一局限性, 开发一种与在液体培养基中生长的能力无关的基因修饰 d. 二恶英细胞的方法。这种方法的必要性可以用过去的观察来解释, 过去的观察认为, 允许轴突生长的突变主要是中性的, 并不损害细胞生理。这种假设只是部分正确。一般来说, 有两个显著的区别;第一, 不同分离的轴源菌株之间, 其次, 当这些轴生菌株与非无轴野生分离株比较8,9

也许最关键的因素是关键的轴 b,最近被确定为拉斯加普 nf1。1型神经纤维瘤病作为 rsgap 的主要功能是抑制 ras 活性3。在所有的轴突菌株中, 酶的缺失会导致过多的 ras 活性, 表现为形成大量的活性 ras 斑块。这些扩大的 ras 补丁导致 pip3 在质膜中的积累。这些巧合出现的 pip3 和活动 ras 斑块是形成一个圆形褶皱的模板, 最终关闭, 并导致巨细胞因子10 的形成。其后果是共多营养细胞活性的过度增加。巨细胞素缺乏症是一个由作用素驱动的过程。结果是对细胞骨架成分的竞争, 以形成既形成了既多的巨无菌的组成, 也形成了假足类。它对细胞行为的影响反映在几乎完全防止植物细胞的趋化性叶酸11。大规模放大的 pip3 补丁是非常持久的。即使在饥饿的细胞中, pip3 斑块仍然存在, 并可能被误解为伪足类动物, 这可能会导致解释化学作用研究的问题到 camp。

在某些情况下, nf1 突变在实验上是有用的。这就引出了开发细菌生长的 d .盘虫细胞转染方法的第二个动机, 因为转化细胞增多的速度使轴突细胞对研究这一过程的基本方面很有价值..然而, 在基因的突变所需的巨细胞增多, 如 ras 和 pi3 激酶10, 几乎已经消除了无菌生长, 因此有必要通过细菌的生长来操纵这些细胞。另一个使基于细菌的转染有价值的原因是越来越多的使用的 Dictyostelids探索在进化的多纤维素13,14, 亲属识别15,16,和利他主义的细胞行为, 这主要取决于使用新鲜隔离的野生类型隔离剂 17.所有上述研究领域都可以通过有效的方法对野生分离物进行基因操作, 因为野生分离物是无轴的, 不会在液体肉汤中生长。

我们的协议允许克服所述的限制。综合来看, 对细菌生长的d. discoideum细胞进行基因操作的可能性对所有的双翅目研究人员都有好处, 即使这只是由于速度更快而提高了选择过程的速度与在无菌介质中的生长 (10小时翻倍时间) 相比, 阿米巴在细菌上的生长 (4小时翻倍时间)。

Protocol

1. 细胞和材料的制备

  1. 索尔管理公司的缓冲准备
    1. 通过在100毫升的 ddh 2o 水中溶解 20.36 g 的 kh 2 po 4 (15 mm) 和 5.47 g 的 na 2 hpo 4·7 h2o (2mm), 制备 100 ml 的 100xsormc (索伦森缓冲液, 包括 mgcl 2 和 cacl 2) 缓冲液. 在室温 (rt) 下搅拌溶液, 使体积达到100毫升, dh 2o.
      请注意:所产生的缓冲液的 ph 值为 6, 不需要进一步调整。
    2. 在 ddh2o 中生产1000毫升的1x 工作溶液, 分别加入 50μl mgcl2和 ccl2 , 以达到每个 5 0μm 的最终浓度。使用0.22μm 滤清器对溶液进行灭菌。
      请注意:始终将 mgcl 2 和 ccl2添加到1x 缓冲液中, 以避免100x 库存溶液中的盐沉淀.
    3. 或者, 准备 kk2缓冲液 (2.2 克 kh2 po4和 0.7 g k2hpo4作为 1 l 缓冲液), 辅以 50μm mgcl2和 50μm ccl2 (此处称为 kk 2 mc)。在整个过程中使用此缓冲区, 而不是 sormc。
  2. 细菌作为食物来源的制备
    1. 使用空气生成基的单菌落, 接种 lb 培养基 (溶酶原汤) 的1升。使用2升烧瓶。让细菌在37°c 下生长一夜, 在220转/分的情况下晃动。
      请注意:如果需要大量的细菌, 使用更丰富的媒体, 如 2xty (酵母提取物色氨酸培养基) 或 sob (超最佳肉汤), 而不是 lb。如果由于安全限制而不允许使用空气原菌, 则可以改用 bl21大肠杆菌
    2. 第二天将细胞以 ~ 6, 600 x 克的速度在两种500毫升的离心管中旋转, 用溶 mL 500 毫升的缓冲液清洗一次细菌。
    3. 将颗粒在索姆斯克公司20毫升中重新出。使用分光光度计检查 od 600 (光学密度为600纳米)。用相同的缓冲液稀释到大约100的 od600
      请注意:k. 空气原菌很难颗粒, 因此为了避免食物细菌的损失, 必须以相对较高的速度将细菌纺掉。由此产生的细菌库存溶液可在4°c 的冰箱中储存长达 4个月, 并保持其作为d. discoideum食物来源的效用。在 lb 介质中生长的隔夜空气基因悬浮的1升通常产生20毫升的 od600 , 约100。
      注意事项:为了确保制备的细菌是空气生成基的单一培养, 在引擎盖下执行所有步骤。
  3. h40 电穿孔缓冲液的制备
    1. 制备100毫升缓冲液, 在 ddh2o中溶解0.952 克的 hepes, 并从 1 m 库存溶液中加入100μl 的 mgcl2 。使用 koh 进行滴定, 调整到 ph 值7。使用0.22μm 过滤器或高压灭菌器对缓冲液进行消毒。使用无酸 hpes, 而不是钠盐。
  4. 按照制造商的协议并使用材料中汇总的试剂盒进行质粒制备。使用表 1中汇总的质粒。
    请注意:用于转染的 dna 质量至关重要。在细菌上生长的d. 盘虫转染剂的选择对驱动选择和表达盒的促进剂有具体的要求 (见讨论)。
质粒名称 细菌中的耐药选择 电阻选择 标记
染色体外表达质粒
pdm123 安皮西林 g418
pdm1207 安皮西林 g418 n 端子 gfp
pdm1208 安皮西林 g418 n 端子 mcherry
ppi159 安皮西林 g418 n 端子 mneon
ppi437 安皮西林 g418 n 端子 mscarlet
ppi54 安皮西林 g418 n 端子 mturquoise2
pdm1209 安皮西林 g418 c 端 gfp
pdm1210 安皮西林 g418 c-终端 mcherry
ppi143 安皮西林 g418 c-终端 mneon
ppi459 安皮西林 g418 c 端子 mscarlet
ppi142 安皮西林 g418 c-终端 mturquoise2
穿梭质粒
pdm344 安皮西林
pdm1019 安皮西林 n 端子 gfp
pdm1018 安皮西林 n 端子 mcherry
ppi152 安皮西林 n 端子 mneon
ppi418 安皮西林 n 端子 mscarlet
ppi150 安皮西林 n 端子 mturquoise2
pdm1021 安皮西林 c 端 gfp
pdm1020 安皮西林 c-终端 mcherry
ppi153 安皮西林 c-终端 mneon
ppi457 安皮西林 c 端子 mscarlet
ppi151 安皮西林 c-终端 mturquoise2
诱导外染色体表达质粒
pdm1038 安皮西林 海霉素
pdm1047 安皮西林 海霉素 n 端子 gfp
pdm1046 安皮西林 海霉素 n 端子 mcherry
ppi450 安皮西林 海霉素 n 端子 mneon
ppi452 安皮西林 海霉素 n 端子 mscarlet
ppi449 安皮西林 海霉素 n 端子 mturquoise2
pdm1049 安皮西林 海霉素 c 端 gfp
pdm1048 安皮西林 海霉素 c-终端 mcherry
ppi470 安皮西林 海霉素 c-终端 mneon
ppi460 安皮西林 海霉素 c 端子 mscarlet
ppi469 安皮西林 海霉素 c-终端 mturquoise2
针对质粒的 act5 安全避难所
pdm1501 安皮西林 海霉素
pdm1513 安皮西林 海霉素 n 端子 gfp
pdm1514 安皮西林 海霉素 n 端子 mcherry
ppi231 安皮西林 海霉素 n 端子 mneon
ppi419 安皮西林 海霉素 n 端子 mscarlet
ppi228 安皮西林 海霉素 n 端子 mturquoise2
pdm1515 安皮西林 海霉素 c 端 gfp
pdm1516 安皮西林 海霉素 c-终端 mcherry
ppi230 安皮西林 海霉素 c-终端 mneon
ppi458 安皮西林 海霉素 c 端子 mscarlet
ppi229 安皮西林 海霉素 c-终端 mturquoise2
remi 表达质粒
pdm1220 安皮西林 海霉素
pdm1351 安皮西林 海霉素 n 端子 gfp
pdm1259 安皮西林 海霉素 n 端子 mcherry
ppi465 安皮西林 海霉素 n 端子 mneon
ppi468 安皮西林 海霉素 n 端子 mscarlet
ppi466 安皮西林 海霉素 n 端子 mturquoise2
pdm1352 安皮西林 海霉素 c 端 gfp
pdm1305 安皮西林 海霉素 c-终端 mcherry
ppi471 安皮西林 海霉素 c-终端 mneon
ppi467 安皮西林 海霉素 c 端子 mscarlet
ppi472 安皮西林 海霉素 c-终端 mturquoise2
目标在帧质粒
pdm1355 安皮西林 海霉素 c 端 gfp
ppi461 安皮西林 海霉素 c-终端 mcherry
ppi462 安皮西林 海霉素 c-终端 mneon
ppi464 安皮西林 海霉素 c 端子 mscarlet
ppi463 安皮西林 海霉素 c-终端 mturquoise2
淘汰赛质粒
pdm1079 安皮西林 布拉斯蒂西丁
pdm1080 安皮西林 食宁霉素
pdm1081 安皮西林 海霉素
pdm1082 安皮西林 g418
cre 表达质粒
pdm1483 安皮西林 食宁霉素
pdm1489 安皮西林 海霉素
pdm1488 安皮西林 g418

表 1: 非轴突转染质粒清单。

  1. 设置用于转染的双细胞
    1. 在 rt 夜间生长 k. 空气原体, 在 sm 培养基 (营养丰富的培养基) 中融合,培养物在4°c 下可储存长达2周。
    2. 将这种细菌悬浮液的大约400μl 添加到 sm 琼脂板 (peptone 10 g/l; 酵母提取物 1 g l; 葡萄糖 10g/l;kh2po4 1.9 gl;k2hpo4 x 3 h2 o, 1.3 gl;mgso4无水 0.49 g\ l;1.7% 琼脂), 并均匀分布。采取无菌循环, 并接种双囊细胞。将细胞分散在盘子的一个边缘。
    3. 在22°c 下将板材孵化 2天, 以确保有足够大的生长区进行转染。
      请注意:对于不形成大生长区 (ax3、dh1 或 jh10) 或经验不足的实验者的双磷酸菌株, 请改用清除板。为此, 请按照步骤中的说明 1.5.4 1.5.6。
    4. 采取无菌循环, 并接种双囊细胞 (约 2-4 x10 5 细胞)。将细胞转移到 sm 中致密的空气原体悬浮液的 800μl, 通过上下移液混合细胞。
    5. 在新鲜 sm 琼脂板上传输400μl、200μl、100μl 和50μl。在每个板材中加入400μl 的附加 sm k . 空气原体悬浮液, 均匀地涂抹, 干燥。
    6. 在22°c 下将板材加氢约 2天, 直到板材变为半透明。
      请注意:由于其生长速度较快, 细菌最初产生的是一个融合的草坪, 而阿米巴随后 "清除" 了细菌的板块。这一过程所需的时间可能因菌株背景和突变细胞在细菌上生长的能力而有所不同。

2. 基于细菌选择的线粒体细胞转染

Figure 1
图 1: 细菌培养的线粒体细胞转染的工作流. 转染的步骤如下所示。在用k. 空气原菌(红色) 播种的 sm 板块上生长 d. 盘状细胞。只从喂养前 (绿色) 收获细胞, 避免已经在发育的细胞 (深绿色)。清洗 h40 中的细胞。将细胞重新移植到 2-4 x 107 cellsl 的最终密度。将细胞悬浮液与1-2 微克的 dna 混合。将混合物转移到电穿孔立方和脉冲细胞。电穿孔后将细胞直接转移到与 sormc 和细菌的盘子中。在添加可选择的标记之前, 允许单元格恢复5小时。对于外染色体质粒, 将所选内容直接添加到盘中。经含有的消毒剂通常在 ~ 2天后可见。对于以单次整合到基因组的线性化结构, 按照指示设置三个稀释, 并添加选择。细菌取自 od 600 = 100 库存溶液。将试管很好地混合, 并将细胞转移到96孔平底组织培养板中。每次稀释使用两个板。移液器150μl 的细胞悬浮到每口井。大约需要5天的时间才能看到紧密的菌落。红井显示了一个通常获得的成功转化细胞数量的例子 (上板从以前的出版物22修改)。请点击这里查看此图的较大版本.

  1. 要制备具有空气原体悬浮液的板材, 请将含有k. 空气原菌的 sormc 缓冲液添加10毫升, 密度为 od600 = 2 (添加200μl 的制备 od600 = 100 k.用于所需的空气生成剂库存溶液细菌浓度) 成10厘米的组织培养处理培养皿。
    请注意:这个板块是后来需要培养转染的d. 盘状细胞。或者, 还可以使用6孔组织培养板。在外染色体质粒转染的情况下, 6 井组织培养板的资源效率更高。每口使用2毫升的 k . aerogenes sormc (od600 = 2) 悬浮液。
  2. 双翅目细胞的制备
    1. 使用10μl 一次性接种回路, 刮细胞从生长区 (约3厘米) 的培养板 (边缘的清除区) 或清除板。将细胞转移到含有1毫升冰凉 h40 缓冲液的 1.5 ml 管中。
      注: 从清除板中采集细胞的时间至关重要。过早收获产生的细胞太少, 而收获到后期会增加产生部分发育的细胞的风险。
    2. 用 1, 000 x 克的速度旋转 2分钟, 或在 10, 000 x 克的情况下进行 2秒的闪存旋转, 以清洗细胞。丢弃上清液并将 h40 缓冲液中的细胞重新悬浮至 2-4 x10 7 cellssl 的最终密度。在整个转染过程中保持细胞的低温。使用水煤浆, 以确保管道和冰的直接接触。
  3. 穿孔
    1. 在含有1-2 微克 dna 的试管中加入100μl 细胞。通过上下移液仔细混合。
    2. 将细胞 dna 混合物转移到预冷却的电穿孔立方 (2 毫米间隙) 中。
    3. 使用以下方波设置脉冲细胞: 350 v、8毫秒、2个脉冲和 1 s 脉冲间隔。
      请注意:不要添加超过2微克的 dna。较高的量对细胞有毒, 降低转染效率。添加的 dna 总量不应超过5μl。
    4. 将细胞立即转移到早期准备的10厘米培养皿中, 用k. aerogenes sormc, 使细胞恢复5小时。
      请注意:在倒置显微镜下检查培养皿中的细胞。细胞在电穿孔后会直接出现圆形, 但大约 3 0分钟后, 当它们有足够的时间适当连接到表面时, 就会恢复到阿米博德的形状。
  4. 转染剂的选择: 取决于转染的目的是产生敲除、敲入或检测5敲入, 还是表达来自外染色体质粒的荧光报告蛋白, 通过下面描述的方法。
    请注意:与轴突生长的细胞不同, 细菌生长的细胞对杀菌素具有很强的抵抗力。因此, 选择总是使用 g418 或湿霉素进行 (见讨论)。
    1. 淘汰赛、敲门砖和演员5敲门砖
      1. 通过反复将液体从移液器强迫到表面, 小心地从培养皿中分离出细胞。
      2. 在 osmc k. aerogenes 悬浮液 (od600 = 2) 中设置三个稀释剂, 并根据所使用的电阻添加选择性剂 (见图 1)。
      3. 低稀释: 将9毫升的细胞悬浮液与20.4 毫升的 sormc 和 600μl的空气原体库存溶液混合。
      4. 中稀释: 将900μl 的细胞悬浮液与28.5 毫升的 sormc 和 600μl的空气原体库存溶液混合。
      5. 高稀释: 将90μl 的细胞悬浮液与 29.3 ml 的 sormc 和 600μl的空气原体库存溶液混合。
      6. 添加30μl 的可选标记 (100x 库存解决方案)。
      7. 通过将150μl 细胞悬浮液移入每口井, 将制备的稀释液分配到96井平底组织培养板中。
        请注意:这一程序的目的是筛选单个克隆, 而不是种群。根据所使用的结构, 选择大约需要5-7。
    2. 外染色体质粒
      1. 将可选择的标记直接添加到 10 ml 盘 (参见图 1)。
        注: 没有必要设置稀释, 因为没有对克隆种群的欲望。由于d.盘状细胞中存在较高的复制数, 外染色体质粒的选择过程更快。预计在32小时至2天后可进行转染剂。
        注意: 用作可选择标记的抗生素是有毒的。戴上手套。
  5. 筛选所获得的克隆物中的阳性转染剂。对于淘汰赛或敲门砖尝试, 请按照指示步调一致2.5.1。使用步骤2.5.2 中的说明检查染色体外质粒的转染成功与否。
    1. 对于敲除、敲击和ac5 敲入,通过 pcr 执行初始筛选, 以确认构造集成到正确的基因组位点。
      请注意:为了最大限度地增加克隆种群的可能性, 使用尽可能高的稀释, 在选择后产生转染剂。针对最多占住三分之一的水井的板材。
      1. 为了扩大克隆种群, 将从96孔组织培养板中选择长大的克隆转移到12孔组织培养板中, 以生长足够的细胞来分离基因组 dna。为每口井提供1毫升的空气原(od600 = 2) 和新鲜的可选择标记。
        注: 1天通常足以获得适合 dna 分离的汇合井。
      2. 要进行微型基因组 dna 分离, 请按照制造商的指示, 使用微型 dna 提取试剂盒, 采集融合井的细胞并分离基因组 dna。
      3. 将分离的基因组 dna 与合适的引物和taq聚合酶 (见材料表) 一起用于 pcr 筛选阳性整合物。
        请注意:在确认正整合到正确的基因组位点后, 应进行南方印迹分析。这确保了对不特定基因组区域中没有发生额外插入事件的更大信心。
    2. 对于荧光记者蛋白, 直观地识别阳性荧光细胞, 并使用荧光显微镜进行检查。或者, 用合适的抗体进行西方印迹, 用于生化鉴定。
pcr 程序
温度 时间
初始变性 94°c 30秒
30个周期 94°c 15-30
42°c 15-60
68°c 1m/1 克
最后延期 68°c 5分钟
按住 4-10°c
反应成分
组件 25μl 反应 最终浓度
10μm 正向底漆 0.5μl 0.2μm
10μm 反向底漆 0.5μl 0.2μm
模板 dna 变量 (约 5μl) < 1 000 纳克
2倍主混合与标准缓冲器, 包括聚合酶 (见材料表) 12.5μl 1个
无核酸酶水 至25μl < 1 000 纳克

表 2: pcr 程序和样品组成, 用于扩增d. 盘状基因组 dna.

Representative Results

外染色体质粒用于记者研究, 其目的是确定细胞内某些蛋白质的定位或突变细胞细胞结构的变化。对于许多方法, 如监测细胞周期, 同时表达两名记者至关重要。现在可以使用我们的双记者染色体外质粒系统 (表 1)。第1天, 细胞被转染, 然后在5小时后添加可选择的标记 g418 (图 1)。在该示例中, 用质粒 ppi289 转染了 nc4、ddb、ax2 和独立衍生的野生分离株 v12m2 和 ws2162 (补充表 1), 该质粒编码为 gfp-tubulina, gfp-tuclina 是微管和 mcherry-pcna 的标记, 是一种蛋白质用于监测细胞周期 (图 2a)。32小时后, 在显微镜下观察到细胞。大多数细胞表达了两种荧光标记的融合蛋白, 这与此前有报道称, 来自同一质粒的两名记者的表达水平相似, 这在使用两种不同的质粒时几乎是不可能的18,19图 2b 显示了每个细胞系 (nc4、ddb、ax2、v12m2 和 ws2162) 表示所需双记者的代表性单元格。2c总结了转染效率。nc4 衍生细胞系显示出最佳的转染效率。然而, 对于 v12m2 和 ws2162 的细胞系, 获得了相当多的转染剂。

Figure 2
图 2: 染色体外质粒的表达。(a) 外染色体质粒以圆形形式直接转染。作为一个例子, 双记者 ppi289 显示。ngomiv 位点表明第二个记者插入外染色体表达质粒。(b) 对于所使用的五种不同的野生类型细胞系 (nc4、ddb、ax2、v12m2、ws2162), z-投射表示 GFP-TubulinA (细胞质) 和 mcherry-罪-多氯化萘 a (主要是核) 的代表性细胞。(c) 计算了 (b) 中所示的五个细胞系的转染效率。显示的是两个实验的意思。错误栏指示± sd. 请点击此处查看此图的较大版本.

将靶向载体集成到指定的基因组位点更具挑战性, 需要对生成的细胞系进行更仔细的分析。在图 3中, 尝试在 nc4 中使用ac5-mcherryki。首先, 质粒必须线性化, 以增加转染后重组事件的频率。为此, 质粒 pdm1514 被切割与ngomiv。在琼脂糖凝胶上运行消化后, 获得两个带。4127 bp 波段包含所需的构造 (图 3)。对于转染, 必须从凝胶中提取被消化的 dna, 并按照制造商的说明使用凝胶提取试剂盒进行纯化。

Figure 3
图 3:制备 act5敲入和 dna 转染.一个使用行为 5敲的例子, 质粒 pdm1514 显示。准备步骤如下所示。(a) 在电穿孔之前, 使用指示的ngomiv 位点对质粒进行线性化。(B、C)在琼脂糖凝胶上运行切割质粒, 直到两个预期的带被正确分离。剪下含有重组臂、mcherry 和耐药盒式磁带的 4127 bp 频段, 并凝胶提取 dna。dna 现在已经准备好转染了。请点击这里查看此图的较大版本.

纯化后的 dna 用于 nc4 细胞的转染。经过5-6 的选择, 获得克隆。表 3总结了具有代表性转染效率和几次行为5敲入尝试的阳性已确定克隆体的数量。通过 pcr 随机选择和分析 nc4 转染的两个克隆体 (图 4a), 这两个克隆都显示了预期的敲击带模式, 并通过南方印迹分析进行了进一步验证, 以确保单一的集成事件的构造到基因组 20。blot 显示了所需的act5位点中的清晰的单个集成 (图 4b)。生成的 nc4: ac5-mcherry细胞系现在可以用于实验。

Figure 4
图 4: 验证 nc4 中的 act5-mcherry ki. (a) 计划和控制 pcr, 以验证与act5位点的正集成。用所述引物对两个独立的克隆和父克隆进行了分析。两个克隆显示电阻盒式磁带和下游 (p1) 或上游底漆 (p2) 的预期带, 它们不存在于亲本应变中。底漆组合 (p天普2) 证实了 mcherry 和电阻盒式磁带正确集成到act5位点。野生类型 nc4 显示预期的 2800 bp 频段, 而两个 ki 克隆缺少此波段, 而是显示大约1400个基对的 pcr 产品。(b) 使用的限制摘要和南方印迹的方案。这两个敲入克隆显示较小的 3400 bp 带, 这是将构造集成到行为5 位点的结果, 特别是在 hygromycin 耐药盒磁带中的额外bcli 位点。野生类型控件显示了位于bcli 站点的两个下游站点所产生的预期 5.8 kb。为了清晰起见, 把污点剪下来拼接了一下。请点击这里查看此图的较大版本.

有针对性的构造到 act5 位点 质粒名称 被占用的水井数量 已检查克隆的数量 正克隆 正确的克隆 (%) 使用的双翅目菌株 转染效率 (转染技术/2x10^6/1 μg dna)
lifeact-mchery ppi226 7。 7。 1 14。2 ax2 3.5 x10^-6
lifeact-gfp ppi227 12 12 5 41。6 ax2 6x10^-6
Gfp pdm1513 3个 3个 2 6。6 ax2 1.5 x10^-6
mcherry pdm1514 3个 3个 1 33。3 ax2 1.5 x10^-6
Gfp pdm1513 66 9 5 55。5 ax2 3.3 x10r-5
mcherry pdm1514 221 12 10 83。3 ax2 1.1 x10^-4
h2b-mcherry ppi420 3个 3个 1 33。3 ax2 1.5 x10^-6
h2b-mcherry ppi420 7。 7。 6 85。7 ax2 3.5 x10^-6
mcherry pdm1514 10 10 7。 70 Ddb 5x10^-6
mcherry pdm1514 240 12 11 91。6 Ddb 1.2 x10r3-4
mcherry pdm1514 320 12 12 100元 nc4 1.6 x10^-4

表 3: 转染效率和获得的用于生成act5不同应变背景的 ki22.

第5幕位点提供了综合记者2 1 的相对同质化表达。生成的 nc4: ac5-mchry 细胞允许使用不同的荧光蛋白 (如 gfp) 与其他ac5敲门砖进行混合实验。为了强调该系统的巨大优势, 显示了与ax2:act5-gfp 的混合实验。由于无法转染非轴位野生类型的细胞, 这种类型的方法以前无法进行。混合实验是分析细胞行为的重要工具, 因为它们允许在经历相同实验条件的不同细胞系之间进行直接比较。nc4 细胞在细菌草坪上的生长速度快于 ax2 细胞 (图 5a)。这可能是由于吞噬细菌的能力较高, 或向食物来源移动和显示趋化的能力提高。使用下琼脂叶酸趋化剂分析, 对 nc4 的群体进行了直接比较: ac5-mcherryax2:ac5:ac5-gfp , 表明 nc4: ac5:ac5-mcherry在叶酸传感方面的效率要高得多。4小时后, 更多的 nc4: acf5-mcherry细胞能够在琼脂糖下爬行, 而不是ax2: acp5-gfp细胞 (图 5b)。分析琼脂糖下迁移细胞趋化的标准指标显示, nc4: ac5:5-樱桃细胞比 ax2:act5-gfp细胞更快, 表现出更强的趋化反应 (图 5c-e)).

Figure 5
图 5: 使用行为5 k 进行基于图像的趋化混合实验.(a) nc4: act5-mchryax2:act5-gfp从行为5位点表达指示的荧光蛋白, 对细菌草坪上生长的能力进行了分析。4天后, 测量单生镀层的斑块直径。无无轴行为 5:!nc4 细胞比无菌轴 2:: ac5-gfp细胞 (平均值±sd, * * * p < 0.0001, n = 3, 刻度条5毫米) 的斑块明显更大。(b) 用于使用琼脂糖下叶酸趋化剂测定22直接比较 nc4 的趋化能力: ac5-mcherryax2:act5-gfp用于 (a), 两种菌株的细菌培养的阿米巴混合在一起在50:50 的比例。细胞被允许在琼脂糖下爬行。4小时后, 用共聚焦显微镜对叶酸梯度迁移的细胞进行成像。然后确定nc4: ac5-mchryax2:act5-gfp细胞的数量。nc4:: act5-mry 细胞在检测叶酸方面更有效。与 ax2:ac5 -gfp 细胞 (平均值±sd, * * * p < 0.0001, n = 6, 刻度条 100μm) 相比, 约有10倍以上的 nc4: ac5-mchry 细胞。(C, D)对细胞进行了60分钟的摄像, 计算了细胞的速度和趋化指数。在预先选择了最化学反应灵敏的细胞 (只有那些在琼脂糖下迁移的细胞) 之后, ax2:act5-gfp细胞在细胞速度和趋化轴方面的值都较低。对每个细胞系50个细胞进行了分析。(中值±sd, * p < 0.01, n = 3)。(e) nc4: ac5:mchryax2:act5-gfact5 敲击的轨道绘制超过 60分钟, 显示更直接的运动向nc4: ac4: ac5:mchry 细胞 (中位数±sd, * ** p < 0.0001, n = 6)。请点击这里查看此图的较大版本.

act5敲击细胞系也可用于流式细胞仪。与细菌生长一样, 轴突菌株和非轴生野生类型在发育方面也存在重大差异。开发后, nc4 细胞的果体大约是从 ax2 细胞中提取的果体的两倍。如果细胞混合, 则获得中等大小的果体。为了更定量地分析这两个细胞系的贡献, 采用了流式细胞仪。这些分析清楚地表明, 中等大小的果体是由于两个细胞系的贡献水平不同。虽然 nc4: ac5: pre5-mcherry细胞约占测量孢子的 75%,但 ax2:act5-gfp仅占 25%, 显示出非无源菌株的潜在健身优势 (图 6)。由于分析不监测秸秆细胞群, 有两种可能性可以解释 ax2 和 nc4 之间发育不平衡的原因。一种可能是, ax2 细胞主要对茎细胞群作出贡献, 而不是进入孢子细胞群。或者, 更多的 nc4 细胞可能进入发育周期, ax2 相对延迟, 因此无法为果体的组装做出贡献。转染非轴位野生型细胞的可能性进一步发展了其他方法, 大大简化了实验程序。

Figure 6
图 6:第5克ki 允许使用流式细胞仪分析混合实验.(a) nc4: ac5-mchryax2:act5-gfp是在非营养琼脂板上单独开发或在50:50 混合物中开发的。nc4: act5-mry 细胞形成比ax2:act5-gfp更大的果体。混合显示的是中间尺寸 (刻度柱5毫米)。共聚焦荧光光显微镜表明, 从混合体中提取的孢子头中的nc4 : ac5:mchery 孢子含量较高。(b) 为了量化这一观察结果, 采用流式细胞仪分析了 (a) 中混合实验中收获的孢子头中的孢子量。大约75% 的孢子来自nc4:: ac5:mcherry细胞, 只有 25%来自 ax2:act5-gfp细胞。(c) 流式细胞仪散射中显示的两个细胞系的孢子的代表性分布。约0.05% 的人显示出正的 mcherry 和 gfp 信号, 这表明已经发生了寄生融合过程, 或者孢子相互粘附。请点击这里查看此图的较大版本.

细胞系 遗传学背景 参考编号 之前发布 类型
ax2 (ka) dbs0235521 bloamfield 等人, 2008年 野生类型
nc4 (s) bloamfield 等人, 2008年 野生类型
act 5: mcherry 克隆5 nc4 hm1912 paschke 等人, 2018年 act5 敲门砖
act 5:gfp 克隆2 ax2 hm1930 paschke 等人, 2018年 act5 敲门砖
v12m2 bloamfield 等人, 2008年 野生类型
ws2162 bloamfield 等人, 2008年 野生类型

补充表 1: 不同的双翅目植物研究.

Discussion

到目前为止, 非轴状、野生型双孢菌素细胞在分子研究中的使用非常有限。现有的这些菌株的基因工程方法缺乏可靠性和效率 23,妨碍了它们的普遍采用。本文介绍的生成材料和协议可用于任何d. 盘状菌株, 而不受其在液体介质中生长的能力的影响。应该提到的是, 该协议针对 nc4 衍生的细胞系进行了优化。来自野外的新分离菌株的转染效率与 nc4 不同, 正如我们以前观察到的那样, v12m2 和 ws21628,9。特别是电穿孔条件似乎对转染效率有相当大的影响, 可能需要对一些菌株进行进一步优化。一般来说, 在迄今测试的所有菌株中都观察到了足够数量的转染剂, 表明这些方法是可行的。使用 nc4 衍生菌株获得的阳性转染剂数量高于其他非轴源野生菌株, 但在所有情况下, 都获得足够数量的转染剂, 以便进行进一步的实验。这一点, 再加上我们协议的简单性, 与之前的 89 尝试相比, 是一大改进。

这些新的非轴突协议涵盖了所有标准的遗传程序, 并增加了进一步的优势, 因为转染可以快速有效地同时进行。阳性克隆可以在几天而不是几周内获得, 因为细菌的生长使分裂时间缩短了一半。新建立的质粒也在无动条件下工作, 可以在这两种生长条件下经常使用, 这是这一方法学22的另一个进步。正如该协议所介绍的, 用于细菌选择的质粒有特殊的要求, 这对转染的成功至关重要。特别是, 驱动表达的启动子和电阻盒式磁带对于成功转染非常重要。经常使用的 act6 (肌动蛋白 6) 启动子24用于驱动抵抗或表达盒缺乏效率, 当细胞生长在细菌上。在我们的质粒系统中, 高活性的作用 ac15 (肌动蛋白 15) 启动子驱动所有的表达盒, 而电阻盒式都在辅酶 (辅酶 a) 启动子的控制下, 这两个启动子在轴变条件下都是活跃的。在细菌上生长的细胞。对记者结构表达的要求以及敲入式和淘汰赛结构使得有必要使用我们的质粒曲目, 但不幸的是, 限制了使用效率低下的行为促进器已经创建的向量的使用。

启动子效率对于依赖于单个集成事件的转染来说尤其重要, 因为转染依赖于正确的基因组位点。由于我们对驱动抗性基因表达的启动子的改进, 单位点整合产生了足够的抗性蛋白。一个主要关切是, 在使用湿霉素或 g418 时, 倾向于将多种整合纳入基因组。到目前为止, 还没有观察到多个集成的偏好, 如以前报告的 g418 选择使用较旧的启动子系统25。这意味着, 湿霉素和 g418 都是适合产生干净的淘汰和敲素的可选择标记. 不幸的是, 可选择的标记 bl溶液素在非无动条件下不起作用。这是我们方法的一个主要缺点, 因为抗博电阻盒通常用于生成 d .discoideum 中的敲除结构。已经生成的结构与杀菌剂抵抗盒式磁带将需要重新推导使用一个可行的可选择的标记。克服这一限制的另一种可能性是将最近建立的无化 crispr 技术与这一转染协议26结合起来。与重建完整的敲除结构相比, 生成合适的单导轨 rna (sgrna) 更简单、更快。对于未来的方向, 使用 crispr/cas9 与这种转染协议相结合产生多个淘汰赛的可能性很有吸引力, 可能为双翅目动物社区的许多研究人员铺平道路。然而, 应仔细研究用于 crispr/cas9 在无动生长细胞中的已建立的瞬态表达系统的工作能力。

所介绍的ac5敲入系统为 d . discoideum稳定细胞系的生成提供了可靠和安全的集成系统, 其优势在于在其他生物22中建立了类似的位点。它还取决于基因组中的单个整合事件, 并为不同的研究方向提供了许多可能性。act5启动子是强烈活跃的并且保证几乎均匀的表示27独立于耕种条件。荧光报告蛋白可以很容易地集成到这个安全的避风港位点使用工程靶向质粒。例如, 这对于细胞跟踪而言是有用的, 如混合实验中所示。细胞表现出最小的细胞间表达可变性, 这可以帮助自动细胞跟踪。重要的是, 将所需的序列插入行为5位点看起来表型中性 28,29。由于该表达不依赖于可选择的标记来维持蛋白质表达, 如随机整合物或外染色体矢量携带细胞系中所示,因此 ac5系统也可用于抢救实验。由于细胞系是同质的, 所有细胞都可以进行分析。这是不可能使用外染色体质粒的表达, 其中有相当大的异质性的表达。

除了所有菌株的这些一般改进外, 使用非轴突型野生类型细胞进行分子研究的能力还可以评估目前实验室菌株中累积突变的影响。自1970年采用 ax2 菌株以来, 发现了多种基因重组, 如先前公布的微阵列分析26所示.由于这些突变的存在, 可以观察到合成表型。例如, 报告的 phg2突变体显示, 在一个实验室菌株背景下的粘附减少, 在另一个3 种菌株中增加粘附。现在可以通过在共同祖先应变 (在本例中为 ddb) 中重复实验来解决此类冲突数据。最近, 小型 gtpase rss 30、31显示了这一方法的强度。

在任何d. 盘虫菌株中进行基因实验的能力扩大了依赖于使用野生分离物的新研究方向的潜力, 特别是那些涉及社会进化、亲属识别和性周期22的研究方向。

Disclosures

提交人没有利益冲突可供披露。

Acknowledgments

作者感谢凯实验室对该方法的输入, 并感谢 lmb 显微镜和流式细胞仪设施提供了出色的科学和技术支持。这项工作由医学研究理事会向 r. r. kay 提供 MC_U105115237 资助, bbsrc (生物技术和生物科学研究理事会) 向 r. r. kay 提供 bbc/k0096 1, 英国癌症研究中心向 r. h. insall, wellcome 信托高级研究金 a15672202867/z/uzz 至 jonathan r chubb, 以及 mrc 向变革和协调中心 lmcb 大学股提供的资金 (MC_U12266B)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R ThermoScientific 05-400-002
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor ThermoScientific 12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers Sigma Aldrich EP6331000025
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules BioRad 1652660
Safety Cabinet Foruna - SCANLAF Labogene
BioPhotometer Plus Eppendorf
CLSM 710 Zeiss
Media & Agaroses
LoFlo Medium Formedium LF0501
Seakem GTG Agarose Lonza 50071
Low EEO Agarose BioGene 300-200
Purified Agar Oxoid LP0028
SM broth Formedium SMB0102
2x LB broth Formedium LBD0102
Chemicals
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoScientific S33102
1 Kb Plus DNA Ladder ThermoScientific 10787018
1 Kb DNA Ladder NEB N3232L
HEPES free acid Sigma Aldrich/Merck 391340 EMD
KH2PO4 VWR P/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2O VWR 10028-24-7
MgCl2 * 6 H2O Sigma Aldrich/Merck 5982 EMD
CaCl2 * 2 H2O Sigma Aldrich 442909
Folic Acid Sigma Aldrich F7876
KOH VWR 26668.263
Cultur Dishes
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3595
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3516
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 353003
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 MatTek Corporation P50G-1.5-30-F
Antibiotics
Geneticin G418-sulphate Gibco by Life Technologies 11811-023
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1
Additional Consumables
2 mm gap electroporation cuvettes, long electrode Geneflow Limited E6-0062
10 µL Inoculating Loop, Blue 10 Micro L ThermoScientific 129399
Spreader, L-shaped, sterile greiner bio-one 730190
Combitips advanced 5 mL Eppendorf BIOPUR 30089669
Kits
ZR Plasmid Miniprep Classic Zymoresearch D4016
Quick DNA Miniprep Kit Zymoresearch D3025
Zymoclean DNA Recovery Kit Zymoresearch D40002
Enzymes
Restriction enzymes NEB
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer NEB M0482L
T4 DNA Ligase NEB M0202S
PrimeSTAR Max DNA Polymerase TakaraBio R045A

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References

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