循环肿瘤细胞的微操作, 用于下游分子分析和转移电位评估

* These authors contributed equally
Cancer Research

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Summary

在这里, 我们提出了一个综合的工作流程, 以确定表型和分子特征的循环肿瘤细胞 (Ctc)。我们将单个和聚集 Ctc 的活体免疫染色和机器人微操作与单细胞技术结合起来, 对转移种子能力进行下游分析和评估。

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Donato, C., Szczerba, B. M., Scheidmann, M. C., Castro-Giner, F., Aceto, N. Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment. J. Vis. Exp. (147), e59677, doi:10.3791/59677 (2019).

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Abstract

血源转移是大多数癌症相关死亡的原因, 涉及循环肿瘤细胞 (Ctc), 这些细胞成功地在遥远的地点建立了新的肿瘤。Ctc 作为单细胞 (单 Ctc) 或多细胞聚集体 (CTC 簇和 ctc-白细胞簇) 存在于患者的血液中, 后者表现出较高的转移性。除了枚举, 表型和分子分析是非常重要的解剖 CTC 生物学和确定可操作的漏洞。在这里, 我们提供了一个工作流程的详细描述, 其中包括 CTC 免疫染色和微操作, 体培养, 以评估单个细胞的增殖和生存能力, 以及体内转移形成检测。此外, 我们还提供了一个协议, 以实现 CTC 集群分离到单个细胞和研究集群内异质性。例如, 通过这些方法, 我们精确地量化了 CTC 星系团中单个 Ctc 和单个细胞的存活和增殖潜力, 从而使我们能够观察到, 星系团内的细胞在 ctc 星系团中表现出更好的生存和增殖能力. 单个 Ctc 相比, 体内培养物. 总体而言, 我们的工作流程提供了一个平台, 可在单个细胞水平上剖析 Ctc 的特征, 旨在识别与转移相关的途径, 更好地了解 CTC 生物学。

Introduction

远处器官转移的临床表现是癌症进展的最后阶段, 占癌症相关死亡的90% 以上1.从局部疾病向转移性疾病的过渡是一个多步骤的过程, 通常由循环肿瘤细胞 (ctcs)2,3,4介导。这些细胞从原发肿瘤流到血液循环中, 输送到遥远的器官, 在那里它们可能会发生外渗, 并形成转移性病变5,6。虽然实体肿瘤可以释放出相对较高数量的 Ctc, 但由于循环中的高剪切力、负罪素介导的细胞死亡、免疫攻击或适应外来微环境的能力有限,大多数 Ctc 注定会死亡7。因此, 它是至关重要的, 建立工具, 使解剖分子特征的 Ctc 被赋予了转移种子能力。最近的临床前和临床研究表明, 单个 ctc 和 ctc 簇的存在和数量与不同类型的实体瘤患者更糟糕的结果 8, 9,10,11,12,13,14.Ctc 簇是两个或两个以上的 ctc 组, 在循环过程中相互附着, 与单个 ctc31516 相比, 更有效地形成转移。集群内的细胞通过脱粒体和粘连处保持强大的细胞粘附, 这可能有助于克服 anoikis17,18。最近, 我们观察到 Ctc 的聚类与干细胞结合位点和增殖相关转录因子的低甲基化有关, 从而提高了成功启动转移的能力19。CTC 聚类分离导致了关键结合位点的重塑, 从而抑制了它们的转移潜力19。除了癌细胞簇外, Ctc 还可以与白细胞 (最常见的中性粒细胞) 联系, 以保持循环中的高增殖水平, 并增加其转移能力20。然而, Ctc 的生物学只被理解在一定程度上, 几个问题仍然悬而未决, 包括潜在的分子特征和单个和聚集细胞的脆弱性。

近年来, 已经建立了几种策略, 利用细胞表面表达模式以及 ctc 的物理性质进行隔离 21,22,23, 24,25. 抗原依赖性分离方法主要依靠细胞表面上皮细胞粘附分子 (epcam)表达26。最常用的 (目前) fda 批准的 CTC 枚举平台是 Cell查除系统, 该系统基于两个步骤的程序来隔离 Ctc21。第一步, 等离子体成分通过离心去除, 而 Ctc 被捕获与抗 epcam 抗体耦合。第二步, 对表达细胞角蛋白 (ck) 8、1819的有核 (dapi 阳性) 细胞对 ctc 富集溶液进行染色,同时使用泛白细胞标记 CD45。最后, 捕获的细胞被放置在一个集成的筛选平台上, Ctc 通过 EpCAM、Ck 和 DAPI 的表达进行识别, 同时对 CD45 呈阴性。虽然这被认为是 CTC 枚举的黄金标准, 但由于 CTC 检索中固有的限制, 这种技术的下游分子分析具有挑战性。此外, 鉴于其分离过程, Cell查寻可能会倾向于富集 Ctc 具有较高的 Epcam 水平相比 Ctc 具有较低的 Epcam 表达, 例如由于癌症异质性27或降低上皮标记的调节28,29。为了克服这些限制, 出现了与抗原无关的技术来丰富 Ctc。例如, ctc-ichip 将包括 Ctc 和 Wbc 在内的有核细胞与剩余血液成分的流体动力分离结合起来, 然后对带有抗体标记的 wbc 进行免疫磁耗尽, 从而能够在解决方案25。此外, 由于大多数 ctc 比红血球 (rbc) 或 wbc 稍大, 因此开发了基于大小的四氯化碳浓缩技术2330 (例如 parsortix 系统 (angle)), 该技术利用了基于微流体的技术, 包括通过分离盒的狭窄通道, 将细胞带到10、8、6.5 或4.5 微米的终端间隙 (根据目标癌细胞的预期直径提供不同的大小)。大多数血细胞通过狭窄的缝隙, 而 Ctc 被困由于他们的大小 (但也由于他们的变形性较低), 因此, 被保留在盒式磁带。通过反转流动方向, 可以释放捕获的 Ctc, 这些 ctc 处于可行状态, 适合下游分析。然而, 除了选择的 CTC 隔离协议外, 典型的浓缩后程序仍然产生 Ctc, 而 Ctc 与相对较少的 Rbc 和 Wbc 混合在一起, 这使得对纯单一或批量 Ctc 的分析具有挑战性。为了解决这个问题, 我们建立了一个工作流程, 允许 CTC 操作, 而不会产生血细胞污染物带来的潜在偏差。事先添加免疫染色, 与可变抗体组合, 区分 Ctc 和血细胞, 甚至可以识别 Ctc 亚群具有明显的表面标记表达的轮廓。然后, 可以将此高度可自定义的过程与特定的下游应用程序进一步结合。

在这里, 我们描述了一个工作流程, 它从 ctc 浓缩产品 (获得任何 CTC 浓缩技术的选择) 开始, 并结合了几种方法, 以便在单细胞分辨率下深入了解 CTC 生物学。简而言之, 我们的工作流程通过活体免疫染色功能识别单个 CTCs、CTC 簇和 CTC-WBC 簇, 然后使用体内培养协议、单细胞进行单细胞微操作和下游分析测序和体内转移检测。

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Protocol

所有涉及患者血液样本的手术都是在参与者签署知情同意的情况下进行的。程序是根据 EKNZ BASEC 2016-00067 和 ek 21/10 协议进行的, 该议定书得到了道德和体制审查委员会 (瑞士西北/欧洲伦理委员会 [EKNZ]) 的批准, 并符合《赫尔辛基宣言》。

所有有关动物的程序都是按照机构和州准则 (经批准的老鼠议定书 #2781, 巴塞尔市州兽医办公室) 进行的。

1. 患者样品制备

  1. 在开始之前, 确保使用无菌解决方案和材料, 以在整个过程中保持无菌。
  2. 将7.5 毫升的外周血从乳腺癌患者身上提取到10毫升 EDTA 血液收集管中。
  3. 在室温 (rt) 下, 以每分钟40振荡 (OSC/min) 的速度, 将含血管在室温 (rt) 上培养。
  4. 使用首选 212223、25的ctc 隔离方法, 丰富单个 ctc 和 ctc 集群.在 1x DPBS 解决方案中释放 Ctc。
    注: 根据所选择的 ctc 浓缩技术, 可能会存在剩余的白细胞和红细胞。调整释放压力, 以保持 CTC 集群结构。
  5. 立即继续执行第3节中的下一步。

2. 鼠标样品制备

  1. 开始之前, 用25G 针、5 ML EDTA 过滤溶液和2毫升 EDTA 采血管准备1毫升胰岛素注射器。
  2. 确保在整个过程中使用无菌解决方案和材料, 以保持无菌状态。
  3. 用 5 mM EDTA 溶液预清洗注射器。
  4. 用 5 Mm edta 的100Μl 装入注射器并去除气泡。
  5. 使用 80% CO2/20% o2 气体吸入对鼠标进行安乐死 , 并立即进入下一步。
    注: 二氧化碳吸入方法的另一种方法是异氟醚麻醉 (3 vol% 异氟醚和氧气 (载气), 流量为 600 mL/min), 然后是宫颈脱位, 或过量注射酮胺/木胺溶液。具体的安乐死方法可能会有所不同, 这取决于批准的鼠标协议。
  6. 确认动物的死亡是由缺乏呼吸活动, 角膜反射缺失, 排尿没有外部刺激。
  7. 通过小心地将 EDTA 预加载注射器的针头从胸骨到心脏的胸部引入30°角, 进行心脏穿刺。
    注: 对于经验不足的实验者, 建议先打开胸腔, 然后再进行心脏穿刺, 以更好地显示心脏。
  8. 提取高达1毫升的血液。在不释放柱塞的情况下, 从动物胸部取出注射器, 安全地取出针头, 打开2毫升 EDTA 采血管的盖子, 直接在里面分发血液。合上盖子, 倒置管10倍。
  9. 在 rt 的摇摇振动台上, 在 40 osc/min 处将含血管长期 (长达 1小时)。
    注意: 针头必须在锐化安全的生物危害处置中进行处理。
    注: 可能会出现多次穿刺, 以增加总血量。使用单独的注射器预装 EDTA 为不同的提取, 以避免吸气在以前的针存在的凝血。
  10. 使用选择21222325的 ctc 隔离方法, 丰富单个 ctc 和 ctc 集群。在 1x DPBS 解决方案中释放 Ctc。
    注: 根据所选择的 ctc 浓缩技术, 可能存在剩余的白细胞和红细胞。调整释放压力, 以保持 CTC 集群结构。
  11. 立即继续执行第3节中的下一步。
    注: 对于以下所有过程, 请确保使用未固定和新隔离的血液。

3. Ctc 活体免疫染色

  1. 在 72 x g 的情况下离心 ctc 浓缩电池悬浮液4分钟。
    注:72 x对应于800转/分, 如果转子的直径为100毫米. 转换 g 力数根据转子。
  2. 在 1x DPBS 中轻轻重新悬浮 1% BSA 溶液中的颗粒, 并添加2μgml 的抗人类 Epcam-af488 抗体和1μg/抗人类 CD45-BV605 抗体或2μgml 抗小鼠 CD45-BV605 抗体的 ml, 总体积为500μl。
    注: 对于乳腺癌患者衍生的 Ctc、抗人类 EGFR-FITC 和反人类 HER2-AF488, 可在抗 epcam 和抗 CD45 中添加。这样可以更好地识别表达较低 EpCAM 级别的 Ctc。
  3. 在 RT 孵化 30分钟, 免受光线影响。
  4. 用 1x DPBS 溶液中的 1% BSA 清洗 Ctc 悬浮液, 在 72 x 克离心 4分钟 . 重复两次。
  5. 在 1x DPBS 溶液中, 将 2% BSA 中的染色细胞重新处理, 并将其转移到6口超低附着板1井中的总体积。
  6. 在4°c 下将板材加氢 10-15, 防止光线照射, 从而使 Ctc 和残留血细胞沉淀。

4. Ctcc 的微操作和单细胞选择

注: 在开始之前, 请注意, 微机械手需要长达45分钟的完整设置。CTC 识别和微操作的程序一旦建立, 每个单元 (或集群) 最多需要2分钟。

  1. 请确保在染色结束后2小时内终止 CTC 领料程序。
  2. 启动微机械手软件, 并打开微机械手。通过按下 "连接" 按钮, 然后按英寸设备, 将微机械手连接到计算机, 并初始化机器人手臂和显微镜阶段。
  3. 每次操作机器后, 都要关闭保护柜, 以便能够通过电脑操纵。
  4. 喷洒乙醇和擦拭机柜内部表面, 清洁表面的灰尘和溢出物。一个干净的环境将确保过程的无菌。
  5. 在机械臂上安装新的玻璃毛细管。对于单细胞拾取, 使用20-30μm 毛细管, 而30-50μm 更适合 CTC 聚类采集。
  6. 通过分配或吸气系统油, 去除管材中存在的所有气泡。
    小心: 玻璃毛细管锋利易碎。小心处理。
  7. 用70% 乙醇填充灭菌槽 1, 用无菌无核酸酶h2o填充灭菌槽 2, 用无菌的 1X DPBS 填充灭菌罐。
    注意: 不要关闭储罐的盖子, 因为在接下来的步骤中, 毛细血管将需要自由进入储罐。
  8. 用70% 乙醇对毛细管进行两次消毒。
  9. 使用灭菌功能将灭菌槽1更换为罐2和 h2o 中的洗涤毛细管至少三次.
  10. 利用微机械手软件, 开始一个新的实验, 并在自动和手动选择模式之间选择拾取实验的类型。
    注: 根据操作的终点选择实验类型。手动模式使机械臂在毛细管进入细胞悬浮液后进行机动。这一步骤对于将 CTC 簇分离到单个细胞是必要的。在实验过程中可以更改采摘类型。
  11. 配置甲板托盘, 指定灭菌槽 (液体 1)、缓冲罐 (液体 2) 和沉积托盘 (目标1或 2) 的位置。目标1允许沉积在板中, 目标2允许沉积到 PCR 管或 PCR 板中。
  12. 将所选液体罐和沉积托盘的温度设置为4°c。
    注: 领料过程可能非常耗时。因此, 建议冷却液罐和沉积托盘
  13. 将含有释放的 ctc 溶液的超低附件板放置在微机械手机柜内的显微镜下。从盘子上取下盖子, 然后关闭机柜。在接下来的安装过程中, 并在领料过程中, 将板材保存在 RT。
  14. 手动选择用于拾取的显微镜目标 (10-20x) 和所有必要通道 (Brightfield、FITC 和 TRITC 通道) 的曝光时间。
  15. 从工具栏中选择显示良好的导航器以可视化并选择拾取板 (6 孔板) 的类型。
    注: 任何板材或良好的格式只能由制造商安装。
  16. 校准包含 Ctc 溶液的井中间的拾取位置, 但视野中央没有细胞。在井边进行校准可能会导致由于井面不均匀而导致校准错误。
  17. 使用传感器用毛细管轻轻触摸板的底部 (速度 0.01 mm/步和1% 的速度)。
  18. 将拾取位置设置在板材底部上方0.05 毫米处。
    注: 在继续之前, 请务必打开和卸下板材和储罐的盖子。毛细血管可能会在封闭或未拔的盖子上断裂。
    注意: 如果毛细管在与盖子接触时破裂, 在周围或溶液中可能会发现碎玻璃。
  19. 选择单元格类型和领料参数。每次启动时都可以设置和加载拾取参数。对于单细胞拾取, 请选择手动模式。
  20. 拾取准备设置中:
    1. 将系统油和样品之间的气隙体积设置为1Μl
    2. 缓冲液体积设置为每次拾取前占用的容积为0.5μl。
      注: 缓冲液体体积调整为总的最大拾取体积。小批量不会影响领料或存放效率。
    3. 将缓冲液的吸气速度设置在1-6 之间。
    4. 将缓冲区吸气后的等待时间设置为1秒。
      注: 如有必要, 可选择从目标井代替缓冲液罐接收缓冲液
    5. 设置为重复使用玻璃毛细血管 , 并没有灭菌之间的采摘
      注: 如果需要, 可以手动在拾取之间进行灭菌。在两次采摘之间进行h2o清洗, 或在乙醇中进行两次灭菌, 然后在h2o中进行多次清洗。
  21. "选取" 设置中:
    1. 将相机设置更改为 7, 500μs, 同时在显微镜下拾取和曝光时间。
    2. 选择固定领料高度
      注: 可以选择工具传感器或自动对焦。然而, 板材的小缺陷会干扰传感器或自动对焦的灵敏度, 从而导致毛细管撞击板。
    3. 进入源板的毛细管的吸气速度定为7-15。
    4. 启用交互式拾取
    5. 吸气体积设置为μl 至0-0.05。
    6. 将吸气速度设置为5%。
    7. 将愿望后的等待时间设置为0-1。
    8. 将每毛细管选择的颗粒数设置为1。
    9. 在同一位置不设置多个拾取,不设置刮擦功能。吸气特性必须根据实验类型进行设置 (例如, 自动拾取模式可能需要更大的吸气量)。
  22. 存款设置中:
    注: 沉积设置严格取决于沉积平台管。
    1. 对于单细胞采摘, 将毛细血管进入目标板的速度定义为25%。
    2. 将点胶速度设置为6%。
    3. 将分配后的等待时间设置为0。
    4. 将目标中分配的气隙量设置为100%。
    5. 存放后不要进行冲洗
      注: 灭菌后, 可以进行清洁毛细管。
    6. 设置每口井的最大颗粒沉积量和将颗粒分布为1的目标数。
    7. 在板的目标1的位置 A1 上或在目标2的位置 A1 上校准管道的沉积高度。放置一个没有盖子的开口管或板进行校准, 并使用传感器轻轻触摸沉积良好 (速度 0.01 mm/步和1% 的速度)。将沉积高度设置在板底部上方1毫米处。
  23. "设置" 中:
    1. 将拾取过程中的舞台速度设置为5-10。
      注: 板材的快速运动可能会导致细胞在悬浮液中的运动, 以及由于定位错误而难以在多个细胞的拾取中出现困难。
    2. 使用冲洗体积将灭菌特性设置为 1μl, 每次灭菌轮可使用3个冲洗回路和2个等待时间。
    3. 关闭前应用更改。
  24. 使用井中的操纵杆导航玻璃毛细管, 并将其放置在感兴趣的单个细胞的顶部。选择在距离井界 (1 毫米) 的安全距离取位, 因为毛细管可能会在井边断裂。
  25. 使用操纵杆的按钮手动添加粒子, 或从菜单中手动选择。
  26. 选择拾取激活的粒子以开始拾取。
  27. 由于互动采摘 (手动模式), 毛细管将停止在板底部上方0.05 毫米以上, 并在选定的拾取位置的顶部停止。轻轻转动操纵杆的旋钮顺时针旋转, 手动吸气粒子和周围的 DPBS 溶液。当手动模式打开时, 最大音量不固定。但是, 注射器中允许的最大体积为25μl。
  28. 通过逆时针轻轻转动操纵杆的旋钮, 分配多余的 DPBS 溶液或不需要的粒子。过多的点胶会释放注射器的气隙, 在溶液中形成气泡, 并损害可见性。
  29. 下下一步继续存款。
  30. 观察毛细血管进入沉积 PCR 管或 PCR 板, 释放体积, 并以空毛细管返回起始位置。
    注: 如果毛细管中仍有体积, 请进行灭菌。然后, 在执行新的领料之前, 重新检查设置、油位和油高。
  31. 从第4节第25点开始, 开始新的单细胞拾取。在采摘过程中, 可能需要更换毛细管。安装完成后, 必须对拾取位置进行新的校准。在校准结束时, 选择 "将 z 高度的校准更改应用于沉积高度" 的功能, 以便将沉积高度校正到新的毛细管校准, 并跳过沉积高度校准 (第4.16 节)。
    注: 第1-4 节所述步骤适用于大多数 Ctc 浓缩和隔离方法。在这里, 我们报告特定 Ctc 分析的可选步骤。

5. 单细胞采摘和播种, 用于生存和增殖分析

  1. 确保在整个过程中使用无菌解决方案和材料, 以保持无菌状态。
  2. 准备一个384个井板, 以包含选择的单个 CTC, 用于使用 20μl CTC 培养介质31进行培养。确保 Ctc 在操作后以少量的介质播种 (例如, 384 孔板的 10-20μl)。
  3. 将溶液向下旋转到板的底部。将384井板放入目标1中, 保持在4°c。
  4. 使用第4节中描述的微机械手执行所有步骤, 以设置微机械手并开始新的拾取。
    注: 对单个单元格的多个选择将导致领料单的形成。这些颗粒将在连续的油井中逐一被挑选和沉积 (见4.22.6 部分)。然而, 交互模式 (手动模式) 将停止毛细管的权利之前的渴望, 因此允许实验者控制这一关键步骤, 并确保成功采摘。板材的快速运动可能会导致细胞在悬浮状态下的运动, 并在多个细胞的采摘中遇到困难。
  5. 存款后, 重复步骤4开始新的领料。
  6. 采摘结束时, 将板离心为 72 x g , 每次 4分钟, 以确保拾取的细胞被放置在井底。

6. ctc 集群断裂和单细胞选择测序

  1. 确保与无菌解决方案和材料合作, 在整个过程中保持无菌。
  2. 准备单个 PCR 管或 PCR 板, 其中包含破碎星团的单个细胞, 总细胞裂解溶液中含有 1 Uμμl rna 抑制剂。
  3. 快速旋转溶液到底部的管。将存放的容器放入目标2中, 并保持在4°c。
  4. 使用微机械手执行第4节中描述的所有步骤, 以设置微机械手。
  5. 开始新的领料。由于交互式拾取 (手动模式), 毛细管将停止在板底部上方0.05 毫米以上和选定 CTC 集群的顶部。
  6. 轻轻按顺时针方向转动操纵杆的旋钮, 手动吸气群集和周围的 DPBS 解决方案。通过逆时针轻轻转动操纵杆的旋钮, 分配吸入的体积, 包括 CTC 集群。
  7. 重复步骤6中描述的 CTC 集群的吸气/处理, 直到形成该集群的单个单元破裂。
    注: 过多的点胶会释放注射器的气隙, 形成溶液中的气泡, 并影响可见性。
  8. 按眼睛跟随单个细胞的位置。使用操纵杆的按钮手动添加粒子, 或从菜单中手动选择。
    注: 对单个单元格的多个选择将导致领料单的形成。这些颗粒将在连续 PCR 管井中逐一采摘和沉积 (见4.22.6 部分)。然而, 交互模式 (手动模式) 将停止毛细管的权利之前的渴望, 因此, 让实验者控制这一关键步骤, 并确保成功采摘。
  9. 选择拾取激活的粒子以开始拾取。
    注: 细胞裂解溶液的量将允许单个细胞完全裂解。然而, 长期接触裂解的内容到裂解剂可能会降解 DNA 或 mRNA。因此, 请立即执行下一步。
  10. 立即关闭含有所选单细胞的管, 并在干冰上转移, 以进行快速冻结。
  11. 快速旋转管, 并检查是否没有滴在管的两侧, 以确保一个适当的碱液沉积细胞。
  12. 重复第5步中的步骤, 开始新的领料。
    注: 显微镜阶段将以4.23.1 部分所述的速度从一个添加的粒子移动到另一个粒子。超低附件板中的 Ctc 悬挂可能会移动, 导致由于定位错误导致拾取错误。

7. 小鼠注射 Ctc 隔离

  1. 确保在整个过程中使用无菌解决方案和材料, 以保持无菌状态。
  2. 制备含有5μl 无菌 1x DPBS 的 PCR 管。
  3. 快速旋转溶液到底部的管。将存放的容器放入目标2中, 并保持在4°c。
  4. 在存款设置中, 在步骤4.22.6 应用更改: 将每口井的最大颗粒存储量设置为 1, 000,将颗粒分布的目标数量设置为1。此步骤可确保被选中的细胞将在同一管中沉积 1, 000次。
  5. 仅使用交互模式 (手动模式) 精确控制拾取步骤, 并使拾取的溶液不受污染物细胞的影响。
    注: 如果需要 1, 000多个细胞,请增加分布粒子的目标数, 以避免 1, 000个细胞后的样品丢失。
  6. 继续执行第4.26 节的步骤, 开始新的领料。重复步骤6以执行多个选取。注释在每次采摘时收集的单元格数, 以跟踪可用于小鼠注射的细胞数量。
  7. 采摘结束时, 以 72 x g 离心管 4分钟 (见 3.1 节), 并吸气上清液。
  8. 将收集到的 Ctc 重新注入所选择的缓冲液中, 适合小鼠注射。对于乳腺脂肪垫注射, 以 1x DPBS 的比例重新悬浮收集到的 Ctc, 并重组基底膜提取, 并保持在 4°c, 直到注射。对于静脉注射, 仅在 DPBS 中重新暂停收集的 Ctc。
    注: 解决方案的体积严格取决于将注入的 Ctc 的数量。建议在乳腺脂肪垫或静脉注射最多每只小鼠100Μl。在计算体积时, 请始终考虑操作和注射器加载的死体积。

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Representative Results

所提供的工作流程允许从单个 Ctc 或从 CTC 集群中分离出单个 Ctc 进行准备。患者或荷瘤小鼠的 Ctc 通过可用的 ctc 浓缩方法从全血中浓缩, 然后对癌症相关标记 (如 EpCAM、green) 和 wbc 特异性标记 (如 Cd45、红色) 进行抗体染色 (图 1 a)).然后将染色的 CTC 产品转移到微操作站, 如果提取单个细胞, 沉积在 PCR 管或多井板中, 并准备进行下游分析, 包括单细胞测序、体外培养或体内检测 (图 1 b)。

这种方法的可靠性是基于在手动拾取细胞过程中正确的目标细胞区分。使用抗 epcam 抗体进行实时免疫染色可将悬浮液中的癌细胞可视化, 并与 CD45 阳性事件 (最有可能的 Wbc) 进行准确区分 (图 2 a)。如果进行了正确的校准和维护, CellCelector 可提供控制良好的电池操作。精确的 CTC 隔离的特点是只在没有周围污染物细胞 (Rbc 或 Wbc) 的情况下提取所需的目标, 如 CTC 集群抽吸前后拍摄的照片所示 (图 2B, c)。

如前所述, 与匹配的单个 Ctc 19 相比, CTC 簇显示出更多的转移表型。然而, 邻近细胞的存在是否足以提高集群内细胞的增殖率尚不清楚。为了解决这一问题, 对来自 ctc 衍生的 br16 细胞系20的2至17个单元 (其中99.5% 为2-17 个细胞群) 的1009个单一 ctc 和 1009 ctc 簇进行了微操作, 并将其分解成384井的各个井超低附件板。每口井的活细胞数量在显微镜下手动计算, 每周记录一次。所有分析都是在细胞数正常化后进行的 (即将三细胞群分析为三个单独的细胞)。不成功的菌落的特点是在实验结束时井中缺乏活细胞。与单一 Ctc 相比, CTC 集群显示出生存率提高, 并在体外培养后56天内产生细胞菌落 (图 3 a, 3A)。值得注意的是, CTC 集群也显示出较高的增殖率, 从而达到较高的最终细胞数量 (图 3 c), 这表明与其他肿瘤细胞的直接接触对其活力和增殖率都有影响。

最后, 我们提供直接从乳腺癌患者中分离出的 Ctc 的单细胞 RNA 测序数据。特别是, 我们展示了来自单个 CTCs、CTC 簇或 CTC-WBC 簇的单个细胞的 t-分布式随机邻居嵌入 (TSNE) (图 4)。这种方法允许识别具有相似基因表达谱的细胞, 以及根据特定基因表达而不同的细胞群的区别。

Figure 1
图 1.实验工作流的原理图表示。(A) ctc 是从癌症患者的血液或小鼠癌症模型中获得的, 使用现有的方法进行浓缩, 并贴上抗体, 以区分肿瘤细胞 (绿色) 和白血球 (红色)。(B) Ctc 的精确微操作促进了多种程序和应用, 例如单细胞测序、CTC 培养或体内移植实验。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.微操作前后 Ctc 的代表性图片. (A)来自 ctc 衍生异种移植 (nsg-cdx-br16) 并用抗 epcam (绿色) 和抗 cd45 (红色) 抗体染色的 ctc 的代表性图像, 分别用于 ctc 和白细胞的可视化。显示放大 40 x。(B、C)微操作允许从不需要的细胞中精确分离 Ctc, 如在 () 和之后 () 细胞抽吸程序之前和之后的图像中所示。放大倍率10倍。分别显示了较大的视场 ( b)和较窄的视场 ( c)请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.单个 Ctc 和 CTC 集群的生存和增殖分析.从单个 ctcs 或 CTC 簇产生的单个 Ctc 细胞或 CTC 团培养的 br16 细胞被微操作地分解成384孔板。(A)卡普兰-梅耶尔图显示种子单细胞相对于细胞簇的存活概率。通过对对数排名测试的 p & lt;0.0001。(B)条形图, 表示实验结束时由活细胞组成的菌落的比例 (第56天)。P& lt;0.0001 通过卡方测试。(C)热图可视化归一化的细胞数量分布在实验过程中 (第0、8、32、56天)。每个块表示一个起始单元, 热图显示给定时间点上每个井的单元数。d = 天。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.单细胞 RNA 测序。利用 t-分布式随机邻居嵌入 (tSNE) 可视化 ctc rna 表达数据。每个点表示来自单个 CTC、CTC 群集或 CTC-WBC 群集的单个单元。点的颜色与捐献者 ID 相对应。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

Ctc 的分子表征有望提高我们对转移过程的认识, 并指导新的抗转移疗法的发展。在这里, 我们提供了这些协议的详细描述, 使 CTC 微操作和下游分析, 包括单细胞功能分析, 基因表达分析和体内移植转移潜力评估20

在我们协议中最关键的步骤中, 微操作 ctc 丰富的产品旨在从相对异质的细胞悬浮液中获得单个细胞分辨率, 即允许达到最高的纯度水平并提高其质量。随后的功能或分子分析。例如, Ctc 的单细胞选择使我们和其他人能够从分子角度和能够评估 CTC 集群的角度研究 CTC 的异质性 (例如, 单个 Ctc、CTC 集群和 CTC-WBC 簇之间的差异)转移-启动能力。虽然我们通常倾向于选择细胞协议, 使实验者能够手动隔离 Ctc (即允许更高的灵活性, 具体取决于个别目标的特点), 但自动化解决方案现在可以帮助细胞选择, 并在控制良好的实验中加速 CTC 隔离过程。

在 CTC 分析的背景下考虑单细胞微操作时, 时间是一个非常关键的限制因素。由于我们的协议是在活细胞上进行的, 因此必须尽快进行, 以最大限度地减少因体外环境而产生的变化, 例如对与上下文相关的基因的上行或下调。与现有的 CTC 分析技术相比, 实时 Ctc 的单细胞微操作为选择的下游分析提供了更高的灵活性, 从单细胞测序到直接功能检测。

在这份手稿中, 我们还提供了新的数据, 通过微操作和播种来自 ctc 衍生细胞系的一千多个单一 CTCs 或 CTC 集群 (具有明确定义的大小), 突出了单个 ctc 和集群 Ctc 之间的重要差异。微滴板的单个井。首先, 我们观察到 CTC 集群 (即相邻细胞的存在) 足以实现更好的种子细胞存活率, 这支持了我们体内的数据表明, 在遥远的地点播种时, ctc 集群的凋亡率降低19. 此外, 即使在种子细胞数量正常化后, 作为集群生长的癌细胞也显示出更高的增殖率, 进一步强化了集群 Ctc 是高效转移的概念。

我们共同提出具体的议定书供反恐委员会进行分析, 目的是促进反恐委员会领域与单一细胞有关的调查。在未来, 我们预计这些方案可能是有用的 ctc 相关的调查, 旨在更好地了解生物学的特点, 血液传播转移的特点, 在各种癌症类型。

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Disclosures

在与循环肿瘤细胞和癌症治疗有关的专利申请中, n. a. 和 b. m. s. 被列为发明者。N. a. 是对液体活检感兴趣的制药和保险公司的有偿顾问。

Acknowledgments

我们感谢所有为我们的研究献血的病人, 以及所有参与临床医生和研究护士的病人。我们感谢 Jens Eberhardt、Uwe Birke 和 ALS 自动化实验室解决方案 GmbH 的 Katarina Uhlig 博士的持续支持。我们感谢 Aceto 实验室的所有成员的反馈和讨论。Aceto 实验室的研究得到了欧洲研究理事会、欧盟、瑞士国家科学基金会、瑞士癌症联盟、巴塞尔癌症联盟、通过苏黎世 eth 的巴塞尔两个州和巴塞尔大学的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human EpCAM-AF488 Cell Signaling Technology CST5198 clone: VU1D9
1X DPBS Invitrogen 14190169 no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate Corning 3471
Anti-human CD45-BV605 Biolegend 304041 clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC  GeneTex GTX11400 clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488  Biolegend 324410 clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605 Biolegend 103139 clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA BD 366643 for human blood collection
Cell Celector ALS CC1001 core unit 
CellD software ALS version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 R&D Systems 3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA Sarstedt 41.3395.005 for mouse blood collection
PCR tubes Corning PCR-02-L-C
RLT Plus Quiagen 1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor Thermo Fisher AM2696  1 U/µL 

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References

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