하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

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Cancer Research

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Summary

여기서, 우리는 순환 종양 세포 (CTCs)를 특성화 하는 표현 형 및 분자 특징을 식별 하는 통합 워크플로우를 제시 합니다. 당사는 단일 및 클러스터형 CTCs의 살아있는 면역 염색 및 로봇 미세 조작을 단일 세포 기반 기술로 결합 하 여 전이 시드 능력의 다운스트림 분석과 평가를 제공 합니다.

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Donato, C., Szczerba, B. M., Scheidmann, M. C., Castro-Giner, F., Aceto, N. Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment. J. Vis. Exp. (147), e59677, doi:10.3791/59677 (2019).

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Abstract

혈액 매개 전이 대부분의 암 관련 죽음에 대 한 계정 및 순환 종양 세포를 포함 (CTCs) 먼 사이트에서 새로운 종양을 확립에 성공 하는. CTCs는 환자 들의 혈 류에서 단일 세포 (단일 CTCs)로 또는 멀티 세포 집합체 (CTC 클러스터와 CTC 백혈구 군집)로 서, 후자는 더 높은 전이성 능력을 표시 합니다. 열거를 넘어서, 표현 형 및 분자 분석은 CTC 생물학을 분해 하 고 실행 가능한 취약점을 식별 하는 것이 매우 중요 합니다. 여기서, 우리는 CTC 면역 염색 및 미세 조작, 개별 세포의 증식 및 생존 능력을 평가 하기 위한 생체 내 배양, 및 생체 내 전이 형성 분석을 포함 하는 워크플로우에 대 한 상세한 설명을 제공 한다. 또한 CTC 클러스터를 개별 셀로 해리 하 고 군집 내 이질성을 조사 하는 프로토콜을 제공 합니다. 예를 들어, 이러한 접근법을 통해 우리는 CTC 클러스터 내에서 단일 CTCs 및 개별 세포의 생존과 증식 가능성을 정확 하 게 정량화 하 여 클러스터 내의 세포가 ex에서 더 나은 생존과 증식을 표시 한다는 관찰을 이끌어 냅니다. 생체 배양은 단일 ctcs에 비해. 전반적으로, 우리의 작업 흐름은 전이 관련 경로의 식별과 CTC 생물학의 더 나은 이해를 목표로, 단일 세포 수준에서 CTCs의 특성을 분해 하는 플랫폼을 제공 합니다.

Introduction

먼 장기에서의 전이의 임상 징후는 암 진행의 최종 단계를 나타내며 암 관련 사망자의 90% 이상을 차지 합니다. 국 소화 된 전이성 질환에서의 전환은 종종 순환 종양 세포 (ctcs)2,4에 의해 매개 되는 다단계 과정 이다. 이 세포는 1 차적인 종양에서 혈액 순환을 안으로 흘리 고 먼 기관으로 수송 됩니다, 어디 그들은 배설 하 고 전이성 병 변5,6를 수립할 수 있습니다. 고 형 종양이 CTCs의 상대적으로 높은 수를 방출 할 수 있더라도, 대부분의 CTCs는 순환에 있는 높은 전단 력, anoikis 매개 세포 사 멸, 면역 공격 또는 외국 미세 환경에 적응 하는 제한 된 기능 때문에 죽을 운명입니다7. 따라서 전이 파 종 능력을 부여 받은 CTCs의 분자 특징에 대 한 해 부를 가능 하 게 하는 도구를 확립 하는 것이 중추적인 역할을 합니다. 최근의 전 임상 및 임상 연구는 단일 ctcs 및 CTC 클러스터의 존재 및 양이 다양 한 종류의 고 형 종양을 가진 환자에서 더 나쁜 결과와 연관 되어 있음을 시사 한다8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 . CTC 클러스터는 순환 중에 서로 연결 된 2 개 이상의 ctcs의 그룹으로 서, 단일 ctcs3,15,16에 비하여 전이 형성에 보다 효율적 이다. 클러스터 내의 세포는 아 노 ikis17,18을 극복 하는 데 도움이 될 수 있는 desmosomes 및 피 착 체 접합을 통해 강력한 세포 세포 부착을 유지 합니다. 최근에, CTCs의 군집은 형태소-및 증식 관련 전사 인자에 대 한 결합 사이트의 저 메 틸 화에 연결 되어, 전이19를 성공적으로 개시 하는 증가 된 능력으로 이어지는 것을 관찰 하였다. CTC 군집 해리는 키 결합 부위를 리 모델링 하 고, 결과적으로 그들의 전이성 전위의 억제를 초래 한다 (19). 암 세포의 클러스터에 추가적으로, CTCs는 또한 백혈구 (가장 빈번 하 게 호 중구)에 연결 하 여 순환의 높은 증식 수준을 유지 하 고 전이성 능력20을 증가 시킬 수 있습니다. 그러나 CTCs의 생물학은 부분적 으로만 이해 되며 단일 및 클러스터 된 세포의 기본 분자 특징 및 취약점을 포함 하 여 여러 가지 질문이 열려 있습니다.

최근 몇 년 동안, 세포 표면 발현 패턴을 악용 하는 여러 가지 전략 들이 확립 되 고 그들의 격리를 위한 ctcs의 물리적 성질 들도,22,23,24 25. 항 원 의존성 분리 방법은 세포 표면 상피 세포 부착 분자 (epcam)26의 발현에 주로 의존 한다. 가장 자주 사용 되는 (현재) CTC 열거를 위한 유일한 FDA 승인 플랫폼은 CTCs21을 분리 하는 2 단계 절차를 기반으로 하는 cellsearch 시스템입니다. 첫 번째 단계에서, 혈장 성분은 원심 분리에 의해 제거 되 고, CTCs는 항 EpCAM 항 체에 결합 된 자성 강 유전으로 포착 됩니다. 상기 제 2 단계에서, 상기 CTC 농축 용액은 백혈구 케 라틴을 발현 하는 핵 (dapi 양성) 세포를 염색 하여 적혈구 (wbc)를 사용 하 여 식별 되는 동안 범 백혈구 마커 CD45. 마지막으로 캡처된 셀은 통합 스크리닝 플랫폼에 배치 되 고 CTCs는 EpCAM, CKs 및 DAPI의 표현식을 통해 CD45에 대해 부정적으로 식별 됩니다. 이는 CTC 열거에 대 한 금 표준으로 간주 되지만, 하류 분자 분석은 CTC 회수에 내재 된 제약으로 인해이 기술에 도전 한다. 또한, 분리 절차를 고려할 때, CellSearch는 암 이질성 (27 ) 또는 상피 마커의 하향 조절 때문에 더 낮은 epcam 발현을 갖는 ctcs 보다 높은 Epcam 수준으로 ctcs의 농축을 선호 할 수 있습니다. 28,29. 이러한 한계를 극복 하기 위해 CTCs의 농축을 위한 항 원 독립적인 기술이 등장 했습니다. 예를 들어, CTC-iChip는 잔류 혈액 성분 으로부터의 CTCs 및 백혈구를 포함 한 핵 세포의 유체역학 적 분리를 통합 하 고, 항 체 태그 immunomagnetic 고갈에 이어서, 태그 없는 및 실행 가능한 CTCs의 정제를 허용 합니다. 솔루션25. 추가적으로, 대부분의 ctcs는 적혈구 (rbcs) 또는 wbc 보다 약간 더 큰 것은 크기 기반 CTC 보강 기술 (예를 들어,30 )의 개발로 이어졌다 (예컨대, parsortix 시스템 (ANGLE) 미세 유체 기반 기술은, 분리 카세트에 걸친 협 착 채널을 포함 하 고, 10, 8, 6.5 또는 4.5 µm의 말단 갭을 선도 하는 세포 (상이한 크기는 타겟 암 세포의 예상 직경에 따라 이용 가능 하다). 혈액 세포의 대부분은 좁은 간격을 통과 하 고, CTCs는 그들의 크기 때문에 (그러나 또한 그들의 낮은 변형 성 때문에) 포획 되 고, 그러므로, 카세트에서 유지 됩니다. 흐름 방향을 되돌리면 실행 가능한 상태에 있으며 다운스트림 분석에 적합 한 캡처된 CTCs를 릴리스할 수 있습니다. 그러나 CTC 격리에 대해 선택 된 프로토콜과는 별개로, 일반적인 사후 보강 절차는 비교적 적은 수의 RBCs 및 Wbc와 혼합 된 CTCs를 생성 하 여 순수한 단일 또는 벌크 CTCs의 분석을 어렵게 합니다. 이 문제를 해결 하기 위해, 우리는 혈액 세포 오염 물질에 의해 도입 잠재적인 편견 없이 CTC 조작을 허용 하는 워크 플로우를 설립 했다. 다양 한 항 체 조합으로 면역 염색을 미리 첨가 하면 CTCs를 혈액 세포와 구별 하 고, 고유한 표면 마커 발현 프로필이 있는 CTC 하위 그룹을 식별할 수 있습니다. 이 고도로 사용자 정의 절차는 특정 다운스트림 응용 프로그램과 추가로 결합 될 수 있습니다.

여기에서 우리는 ctc 농축 제품 (선택의 CTC 보강 기술로 얻은)에서 시작 하 고 단일 셀 해상도에서 CTC 생물학에 대 한 통찰력을 얻기 위해 여러 접근법을 결합 하는 워크 플로우를 설명 합니다. 간단히 말해서, 우리의 작업 흐름은 살아있는 면역 염색에 의해 단일 CTCs, CTC 클러스터 및 CTC-WBC 클러스터의 식별을 가능 하 게 하 고, 단일 세포 미세 조작 및 전 생체 배양 프로토콜을 사용한 하류 분석, 단일 세포 시퀀싱 및 생체 내 전이 분석 법.

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Protocol

환자의 혈액 샘플과 관련 된 모든 절차는 참가자의 서명 된 정보에의 한 동의 시 수행 되었습니다. 윤리 및 제도적 검토 위원회가 승인한 EKNZ BASEC 2016-00067 및 EK 321/10에 따라 절차를 실행 하 고, 헬싱키의 선언을 준수 하 여 윤리 위원회를 운영 하 고 있습니다.

동물에 관한 모든 절차는 기관 및 캔 토 날 가이드라인 (승인 된 마우스 프로토콜 #2781, 바젤 시의 토 널 수의학 사무실)을 준수 하 여 수행 되었습니다.

1. 환자 샘플 준비

  1. 시작 하기 전에 전체 절차 중에 멸 균을 유지 하기 위해 무 균 솔루션 및 재료와 함께 작동 하는지 확인 하십시오.
  2. 유방암 환자 로부터 말 초 혈액 7.5 mL를 10 mL EDTA 혈액 채취 튜브로 인출 합니다.
  3. 40 분당 발진 (osc/min)에서 흔들 셰이 커에 있는 실 온 (RT)에서 짧은 기간 동안 혈액 함유 튜브를 배양 합니다.
  4. 선택의 ctc 격리 방법을 사용 하 여 단일 ctcs 및 ctc 클러스터에 대 한 보강21, 22,25. 1x DPBS 솔루션에서 CTCs를 릴리스 합니다.
    참고: 선택한 CTC 강화 기술에 따라 남아 있는 백혈구 및 적혈구가 존재할 수 있습니다. CTC 클러스터 구조를 유지 하기 위해 해제 압력을 조정 합니다.
  5. 섹션 3의 다음 단계로 즉시 진행 합니다.

2. 마우스 샘플 준비

  1. 시작 하기 전에 25G 바늘, 5mm EDTA 여과 액, 2 mL EDTA 혈액 채취 튜브가 있는 1 mL 인슐린 주사기를 준비 하십시오.
  2. 전체 절차 중에 멸 균을 유지 하기 위해 무 균 솔루션 및 재료와 함께 작동 하도록 보장 합니다.
  3. 주사기를 5mm EDTA 용액으로 사전 세척 합니다.
  4. 5 mM EDTA의 100 μ l를 사용 하 여 주사기를 로드 하 고 기포를 제거 하십시오.
  5. 80% CO2 가스 흡입을 사용 하 여 마우스를 안락사 시키고 다음 단계로 즉시 진행 합니다.
    참고: CO2 흡입 방법에 대 한 대안은 아이 소 루 레인 마 취 (600 mL/min의 유 속에서의이 소 피 루 레인 및 산소 (캐리어 가스)가 자 궁 경부 탈 구 또는 케 타 민/자일 라 진 용액의 과다 주입에 의해 수행 됩니다. 특정 안락사 방법은 승인 된 마우스 프로토콜에 따라 달라질 수 있다.
  6. 외부 자극 없이 호흡 활동, 누락 된 각 막 반사 및 배 뇨의 부재에 의해 동물의 죽음을 확인 합니다.
  7. 흉 골에서 심장 쪽으로 흉부에 30 ° 각도로 EDTA 사전 적재 된 주사기의 바늘을 조심 스럽게 도입 하 여 심장 천자를 수행 하십시오.
    참고: 경험이 부족 한 경험을 위해 심장 천자를 수행 하기 전에 가슴 구멍을 먼저 열어 심장의 시각화를 향상 하는 것이 좋습니다.
  8. 최대 1 mL의 혈액을 회수 합니다. 플런저를 방출 하지 않고, 동물 가슴에서 주사기를 꺼내 안전 하 게 바늘을 제거 하 고, 2 mL EDTA 혈액 수집 튜브의 뚜껑을 열고 혈액을 직접 내부에 분주 합니다. 뚜껑을 닫고 튜브를 10 배 뒤집습니다.
  9. 40 osc/min에서 흔들 셰이 커에서 짧은 기간 (최대 1h)에 대 한 혈액 함유 튜브를 배양 합니다.
    주의: 바늘은 날카로운 생물학적 위험 처리로 폐기 해야 합니다.
    참고: 여러 개의 구멍이 있어 총 혈액 량을 늘릴 수 있습니다. 다른 철회를 위해 EDTA가 미리 적재 된 별도의 주사기를 사용 하 여 이전 바늘에 존재 하는 혈액을 흡입 하지 않도록 하십시오.
  10. 선택의 ctcs 격리 방법을 사용 하 여 단일 ctcs 및 CTC 클러스터에 대 한 보강21, 22,25. 1x DPBS 솔루션에서 CTCs를 릴리스 합니다.
    참고: 선택한 CTC 강화 기술에 따라 남아 있는 백혈구 및 적혈구가 존재할 수 있습니다. CTC 클러스터 구조를 유지 하기 위해 해제 압력을 조정 합니다.
  11. 섹션 3의 다음 단계로 즉시 진행 합니다.
    참고: 다음 절차를 모두 수행 하려면 고정 되지 않고 갓 분리 된 혈액이 사용 되었는지 확인 하십시오.

3. CTCs 살아있는 면역 염색

  1. 원심 분리기 CTC-농축 세포 서 스 펜 션을 72 x g 에서 4 분 동안
    참고: 72 x g 는로 터의 직경이 100 mm 이면 800 rpm에 해당 합니다. 회전자에 따라 g 힘 번호를 변환 합니다.
  2. 1% BSA 용액에 펠 렛을 부드럽게 소생 하 고 2 μ g/m l의 항 인간 EpCAM-AF488 항 체와 1 μ g/m l의 항-BV605 항 체 또는 2 μ g/ml 항-BV605 항 체를 500 μ l의 총 부피로 첨가 한다.
    참고: 유방암 환자 유래 CTCs의 경우, 항-인간 EGFR-FITC 및 항 인간 HER2-AF488 항-EpCAM 및 항-CD45에 추가적으로 첨가 될 수 있다. 이를 통해 더 낮은 EpCAM 레벨을 표현 하는 CTCs를 더 잘 식별할 수 있습니다.
  3. RT에서 30 분 동안 배양 하 고 빛 으로부터 보호 하십시오.
  4. 1% BSA를 1x DPBS 용액에 사용 하 여 CTCs 현 탁 액을 세척 하 고, 72 x g 에서 4 분간 원심 분리 합니다. 본 제품을 두번 반복 해 서 씻어 주세요.
  5. 1DPBS 용액에서 1% BSA의 2 mL에 스 테 인 세포를 소생 하 고 6 웰 초 저 부착 판의 well에 총 부피를 전달 한다.
  6. CTCs 및 잔류 혈액 세포의 침전을 허용 하기 위해 빛 으로부터 보호 되는 4°c에서 10-15 분 동안 플레이트를 배양 합니다.

4. CTCs 및 단일 셀 피킹의 미세 조작

참고: 시작 하기 전에 마이크로 매니 퓰 레이 터가 완전 한 설정에 최대 45 분을 필요로 한다는 점에 유의 하십시오. 설정 되 면 CTC 식별 및 미세 조작 절차는 셀 (또는 클러스터) 당 최대 2 분이 소요 됩니다.

  1. 염색이 끝난 후 2 시간 이내에 CTC 피킹 절차를 종료 해야 합니다.
  2. 마이크로 매니 퓰 레이 터 소프트웨어를 시동 하 고 마이크로 매니 퓰 레이 터를 켭니다. 마이크로 매니 퓰 레이 터를 컴퓨터에 연결 하 고 연결 버튼을 누른 다음 Int 장치를 눌러 로봇 암 뿐만 아니라 현미경 단계를 초기화 합니다.
  3. 컴퓨터를 조작 하 여 시스템을 조작할 때마다 보호 캐비닛을 닫으십시오.
  4. 에탄올을 분무 하 고 캐비닛의 내부 표면을 닦아 서 먼지와 액체 로부터 표면을 청소 합니다. 깨끗 한 환경은 공정의 무 균 성을 보장 합니다.
  5. 로봇 팔에 새로운 유리 모 세관을 설치 합니다. 단일 셀 피킹의 경우, 20-30 μ m의 모세 혈관을 사용 하 고 30-50 μ m는 CTC 클러스터 피킹에 선호 됩니다.
  6. 시스템 오일을 분주 하거나 흡입 하 여 튜빙에 존재 하는 모든 기포를 제거 합니다.
    주의: 유리 모 세관은 날카롭고 깨지기 쉽습니다. 주의 해 서 다루십시오.
  7. 멸 균 탱크 1을 70% 에탄올로 채 웁 니다. 멸 균 탱크 2는 멸 균된 뉴 클레 아 제 없는 h2o와 완충 조를 가진 1X dpbs를 멸 균 합니다.
    주의: 다음 단계에서는 모 세관이 탱크에 자유롭게 접근 해야 하기 때문에 탱크의 뚜껑을 닫지 마십시오.
  8. 70% 에탄올로 모 세관을 두 번 살 균 합니다.
  9. 살 균 탱크 1을 탱크 2로 교체 하 고 살 균기능을 사용 하 여 적어도 세 번 h2o의 모 세관을 세척 합니다.
  10. 마이크로 매니 퓰 레이 터 소프트웨어를 사용 하 여 새로운 실험을 시작 하 고 자동 및 수동 선택 모드 사이에서 피킹 실험의 유형을 선택 합니다.
    참고: 조작의 끝점을 기준으로 실험 유형을 선택 합니다. 수동 모드는 모 세관이 세포 현 탁 액에 들어간 후 로봇 암의 기동을 가능 하 게 합니다. 이 단계는 CTC 클러스터를 개별 셀로 해리 하기 위해 필요 합니다. 실험 중에 피킹 유형을 변경할 수 있습니다.
  11. 멸 균 탱크의 위치 (액체 1), 완충 탱크 (액체 2) 및 증 착 용지함 (대상 1 또는 2)을 지정 하 여 데크 트레이를 구성 합니다. 목표 1 플레이트에 입금 할 수 있습니다, 대상 2 PCR 튜브 또는 PCR 플레이트에 입금 할 수 있습니다.
  12. 액체 탱크의 온도를 설정 하 고 4 ° c로 선택한 증 착 트레이.
    참고: 피킹 프로세스는 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 따라서 액체 탱크 및 증 착 트레이의 냉각이 권장 됩니다.
  13. 방출 된 CTCs 용액을 포함 하는 초 저 부착 판을 마이크로 매니 퓰 레이 터 캐비넷 내부에 현미경으로 위치 시킵니다. 플레이트에서 뚜껑을 분리 하 고 캐비넷을 닫습니다. 세트의 나머지 부분과 피킹 절차 중에는 플레이트를 RT에 보관 하십시오.
  14. 모든 필요한 채널 (명시 야, FITC 및 TRITC 채널)의 피킹 (10 ~ 20 배) 및 노출 시간에 대 한 현미경 목표를 수동으로 선택 합니다.
  15. 도구 모음에서 잘 네비게이터 표시 를 선택 하 여 픽업 플레이트 (6 웰 플레이트)의 유형을 시각화 하 고 선택 합니다.
    참고: 모든 플레이트 또는 잘 포맷은 제조 업체에 의해 설치 될 수 있다.
  16. CTCs 솔루션을 포함 하는 우물 중간에서 픽업 위치를 보정 하지만 시야의 중심에는 셀이 없습니다. 웰의 가장자리에서 보정을 수행 하면 고르지 않은 웰 표면으로 인해 교정이 잘못 될 수 있습니다.
  17. 센서를 사용 하 여 플레이트의 바닥을 모 세관 (속도 0.01/스텝 및 1% 속도)으로 부드럽게 터치 합니다.
  18. 플레이트 하단에 0.05 mm의 픽업 위치를 설정 합니다.
    참고: 계속 하기 전에 플레이트와 탱크의 뚜껑을 열고 제거 하십시오. 모 세관은 밀폐 되거나 제거 되지 않은 뚜껑에서 깨질 수 있습니다.
    주의: 모 세관이 뚜껑과 접촉 시 파손 되 면 주변 이나 용액에서 깨진 유리가 발견 될 수 있습니다.
  19. 셀 유형 및 선택 매개 변수. 선택 매개 변수는 각 시작 시 설정 하 고 로드할 수 있습니다. 단일 셀 피킹의 경우 수동 모드를 선택 합니다.
  20. 선택 준비 설정 내에서 다음을 수행 합니다.
    1. 시스템 오일과 시료 사이의에 어 갭 체적 을 1 μ l로 설정 합니다.
    2. 0.5 μ l를 선택 하기 전에 완충 액 부피를 차지 하도록 설정 합니다.
      주: 버퍼 액체 체적은 총 최대 픽업 볼륨으로 조정 됩니다. 소량은 피킹 또는 증 착 효율에 영향을 미치지 않습니다.
    3. 완충 액의 흡 인 속도 를 1-6% 사이로 설정 합니다.
    4. 버퍼의 흡 인 후 대기 시간 을 1 초로 설정 합니다.
      참고: 버퍼 액체 탱크 대신 대상 우물에서 버퍼를 차지 하는 옵션은 필요한 경우 사용할 수 있습니다.
    5. 유리 모세 혈관을 재사용 하 고 선택 사이에 살 균을 사용 하지 않습니다.
      참고: 필요한 경우 픽업 간 살 균을 수동으로 수행할 수 있습니다. 1 개 또는 2 개의살 균을 에탄올에 여러 번 세척 한 후 h2o에서 여러 번 세척을 수행 합니다.
  21. 선택 설정 내에서 다음을 수행 합니다.
    1. 7500 μ s의 현미경 아래에서 피킹 및 노출 시간 동안 카메라 설정을 변경 합니다.
    2. 고정 피킹 높이를 선택 합니다.
      참고: 도구 센서 또는 자동 초점을 대신 선택할 수 있습니다. 그러나, 플레이트의 작은 결함은 센서의 감도 또는 플레이트에 모 세관의 영향을 일으킬 수 있는 자동 초점을 방해 할 수 있습니다.
    3. 소스 플레이트에 들어가는 모 세관의 흡 인 속도 를 7-15%로 설정 합니다.
    4. 대화식 피킹을 활성화 합니다.
    5. 흡 인 을 0 ~ 0.05로 설정 합니다.
    6. 흡 인 속도 를 5%로 설정 합니다.
    7. S에서 0-1에 포부 후 대기 시간 을 설정 합니다.
    8. 모 세관 당 고른 입자 수 를 1로 설정 합니다.
    9. 동일한 위치에 여러 선택 및 스크 래핑 기능을 설정 하지 않습니다. 흡 인 속성은 실험의 종류에 따라 설정 해야 합니다 (예를 들어, 자동 선택 모드는 더 큰 흡 인 볼륨이 필요할 수 있습니다).
  22. 입금 설정 내에서:
    참고: 입금 설정은 엄격 하 게 증 착 플레이트/튜브에 따라 달라 집니다.
    1. 단일 셀 피킹의 경우 대상 플레이트에 들어가는 모 세관의 속도 를 25%로 정의 합니다.
    2. 분주 속도 를 6%로 설정 합니다.
    3. 추출 후 대기 시간 을 s에서 0으로 설정 합니다.
    4. 대상 웰에서 분주 한에 어 갭의 양을 100%로 설정 합니다.
    5. 입금 후 린스를 설정 하지 마십시오.
      주: 모 세관을 청소 하기 위해 증 착 후 살 균을 수행할 수 있습니다.
    6. 입자를 1로 분배할 대상의 수와 웰 당 최대 입자 량 을 설정 합니다.
    7. 플레이트의 경우 타겟 1의 위치 A1 또는 튜브 용 타겟 2의 위치 A1에 있는 입금 높이를 교정 합니다. 교정을 위해 뚜껑이 없는 열린 튜브 나 판을 놓고 센서를 사용 하 여 증 착 우물 (속도 0.01/단계 및 1% 속도)를 부드럽게 터치 합니다. 플레이트의 바닥 위에 1 mm의 증 착 높이 를 설정 합니다.
  23. 설정내에서:
    1. 선택 하는 동안 스테이지 속도 를 5-10%로 설정 합니다.
      참고: 판의 빠른 움직임은 현 탁 액에서 세포의 움직임 및 mispositioning에의 한 여러 셀 따기의 어려움을 초래할 수 있습니다.
    2. 헹 굼 량을 사용 하 여 멸 균 특성 을 1 μ l, 세 개의 헹 굼 루프 및 2 초 동안 살 균 라운드 당 대기 시간으로 설정 합니다.
    3. 닫기 전에 변경 사항을 적용 합니다.
  24. 우물의 조이스틱을 사용 하 여 유리 모 세관을 탐색 하 고 관심 있는 단일 셀 위에 놓습니다. 모세 혈관이 우물 가장자리에서 깨질 수 있으므로 우물 국경 (1mm)에서 안전한 거리에서 위치를 선택 하십시오.
  25. 조이스틱 버튼을 사용 하거나 수동으로 메뉴에서 선택 하 여 파티클을 수동으로 추가할 수도 있습니다.
  26. 활성화 된 파티클 선택을 선택 하 여 선택을 시작 합니다.
  27. 모 세관은 (수동 모드) 대화식 피킹 때문에 플레이트의 하단 및 선택 된 픽업 위치 위에 0.05 mm을 중지 합니다. 조심 스럽게 조이스틱의 노브를 시계 방향으로 돌려 입자와 주변 DPBS 솔루션을 수동으로 흡입 합니다. 수동 모드가 켜져 있으면 최대 볼륨이 고정 되지 않습니다. 그러나 주사기에 허용 되는 최대 부피는 25 μ l가 됩니다.
  28. 조이스틱의 손잡이를 반시계 방향으로 부드럽게 돌려 과량의 DPBS 용액 또는 불필요 한 입자를 분주 합니다. 분주가 너무 많으면 주사기의 공 극이 방출 되어 용액에 기포가 형성 되 고 시야가 손상 됩니다.
  29. 다음 을 눌러 입금을 진행 합니다.
  30. PCR 튜브 또는 PCR 플레이트를 증 착 하는 모 세관을 관찰 하 고 부피를 방출 하 고 빈 모 세관으로 다시 시작 위치로 이동 합니다.
    주: 모 세관에 볼륨이 남아 있는 경우 멸 균을 진행 하십시오. 그런 다음 새 피킹을 수행 하기 전에 설정, 오일 레벨 및 오일 높이를 다시 확인 합니다.
  31. 섹션 4의 점 26에서 새로운 단일 셀 피킹을 시작 하십시오. 선택 하는 동안 모 세관을 교체 해야 할 수도 있습니다. 설치 후에는 픽업 위치의 새로운 보정이 수행 되어야 합니다. 보정이 끝나면 Z 높이에 보정 된 변경 사항을 적용 하 여 새 모 세관 교정에 대 한 퇴적 높이를 보정 하 고 예금 높이 교정을 건너뛰려면 (4.16 절) 기능을 선택 합니다.
    참고: 1-4 절에 설명 된 단계는 대부분의 CTCs 보강 및 격리 방법에 적용 됩니다. 여기에서는 특정 CTCs 분석에 대 한 선택적 단계를 보고 합니다.

5. 생존 및 증식 분석을 위한 단일 셀 피킹 및 시드

  1. 전체 절차 중에 멸 균을 유지 하기 위해 무 균 솔루션 및 재료와 함께 작동 하도록 보장 합니다.
  2. 384 웰 플레이트를 준비 하 여 20 μ l를 배양 하는 것에 대해 고른 단일 CTCs를 포함 하는 CTC 배양 배지 (31). CTCs가 조작 후 소량의 매체 (예: 384 웰 플레이트의 경우 10-20 μ l)에 시드할 수 있도록 하십시오.
  3. 용액을 플레이트 하단으로 돌립니다. 대상 1에 384 웰 플레이트를 넣고 4°c에서 보관 하십시오.
  4. 섹션 4에 설명 된 마이크로 매니 퓰 레이 터로 모든 단계를 수행 하 여 마이크로 매니 퓰 레이 터를 설정 하 고 새로운 피킹을 시작 합니다.
    주의 사항: 단일 셀을 여러 번 선택 하면 선택 목록이 형성 됩니다. 입자는 연속 된 우물에서 하나 하나 선택 되 고 침착 됩니다 (섹션 4.22.6 참조). 그러나 대화식 모드 (수동 모드)는 포부 직전에 모세 혈관을 멈추게 하므로 실험 자가이 중요 한 단계를 제어 하 고 성공적인 선택을 보장 할 수 있습니다. 판의 빠른 움직임은 현 탁 액에서 세포의 움직임 및 다중 세포 따기의 어려움을 초래할 수 있다.
  5. 입금 후 4 단계를 반복 하 여 새 피킹을 시작 합니다.
  6. 피킹의 끝에서, 플레이트를 4 분 동안 72 x g 에서 원심 분리 하 여 고른 세포가 우물의 바닥에 놓여 있는지 확인 합니다.

6. CTC 클러스터 브레이킹 및 시퀀싱을 위한 단일 셀 피킹

  1. 무 균 솔루션 및 재료를 사용 하 여 전체 절차 중에 멸 균을 유지 하십시오.
  2. RNA 억제제의 1 U/μ l를 포함 하는 총 2.5 μ l 세포 용 리 싱 용액으로 깨진 클러스터의 단일 세포를 함유 하는 단일 PCR 튜브 또는 PCR 플레이트를 준비 한다.
  3. 용액을 튜브 하단으로 빠르게 회전 합니다. 증 착 용기를 목표 2에 넣고 4°c에서 유지 한다.
  4. 마이크로 매니 퓰 레이 터로 섹션 4에 설명 된 모든 단계를 수행 하 여 마이크로매니 퓰 레이 터를 설정 합니다.
  5. 새 피킹을 시작 합니다. 모 세관은 대화식 피킹 (수동 모드) 때문에 플레이트의 맨 아래와 선택한 CTC 클러스터의 상단에 0.05 mm를 중지 합니다.
  6. 조이스틱의 손잡이를 시계 방향으로 부드럽게 돌려 클러스터와 주변 DPBS 솔루션을 수동으로 흡입 합니다. 조이스틱의 손잡이를 반시계 방향으로 부드럽게 돌려 CTC 클러스터를 포함 한 흡입 된 부피를 분주 합니다.
  7. 클러스터를 이루는 단일 세포가 분리 될 때까지 6 단계에서 설명한 CTC 클러스터의 흡 인/폐기를 반복 한다.
    참고: 너무 많이 분주 하면 주사기의 공 극이 방출 되어 용액에 기포가 형성 되 고 가시성이 손상 됩니다.
  8. 눈에 의해 단일 세포의 위치를 따릅니다. 조이스틱 버튼을 사용 하거나 수동으로 메뉴에서 선택 하 여 파티클을 수동으로 추가 합니다.
    주의 사항: 단일 셀을 여러 번 선택 하면 선택 목록이 형성 됩니다. 입자는 연속적으로 PCR 튜브/웰에 하나씩 선택 되 고 증 착 될 것 이다 (섹션 4.22.6 참조). 그러나 대화식 모드 (수동 모드)는 포부 바로 전에 모 세관을 멈추게 하므로 실험 자가이 중요 한 단계를 제어 하 고 성공적인 선택을 보장 할 수 있습니다.
  9. 활성화 된 파티클 선택을 선택 하 여 선택을 시작 합니다.
    참고: 셀 일차 용액의 양은 단일 세포가 완전히 일차 할 수 있도록 합니다. 그러나, 용 해 화제에 용 해 함량의 긴 노출은 DNA 또는 mRNA를 저하 시킬 수 있다. 따라서 다음 단계로 즉시 진행 합니다.
  10. 즉시 선택 된 단일 셀을 포함 하는 튜브를 닫고 스냅 동결을 위해 드라이 아이스로 전송 하십시오.
  11. 신속 하 게 튜브를 회전 하 고 증 착 된 세포의 적절 한 lyse를 보장 하기 위해 튜브의 측면에 방울의 부재를 확인 합니다.
  12. 5 단계부터 반복 하 여 새 피킹을 시작 합니다.
    참고: 현미경 단계는 섹션 4.23.1에 설명 된 속도로 한 입자에서 다른 입자로 이동 합니다. 초 저 부착 플레이트의 CTCs 서 스 펜 션은 움직일 수 있으며,이로 인해 잘못 된 피킹이 발생 합니다.

7. 마우스 주입을 위한 CTCs 격리

  1. 전체 절차 중에 멸 균을 유지 하기 위해 무 균 솔루션 및 재료와 함께 작동 하도록 보장 합니다.
  2. 멸 균 1x DPBS의 5 μ l로 PCR 튜브를 제조 하였다.
  3. 용액을 튜브 하단으로 빠르게 회전 합니다. 증 착 용기를 목표 2에 넣고 4°c에서 유지 한다.
  4. 입금 설정 내에서 4.22.6 단계에서 변경 사항을 적용 합니다: 입자 의 최대 입 금액 을 1000로 설정 하 고 입자를 1로 분배할 대상 수 를 지정 합니다. 이 단계는 선택한 셀이 1000 시간 동안 동일한 튜브에 침착 되도록 합니다.
  5. 대화식 모드 (수동 모드)만 사용 하 여 피킹 단계를 정밀 하 게 제어 하 고 선택 된 솔루션을 오염 물 세포 로부터 자유롭게 유지 하십시오.
    참고: 1000 개 이상의 셀이 필요한 경우, 1000 셀 후 샘플의 손실을 방지 하기 위해 입자를 분산 하는 대상의 수 를 늘립니다.
  6. 4.26 절의 단계를 계속 하 여 새 피킹을 시작 합니다. 6 단계를 반복 하 여 여러 개의 pickings을 수행 합니다. 마우스 주입에 사용할 수 있는 셀 수를 추적 하기 위해 각 피킹에서 수집 된 셀 수에 주석을 답니다.
  7. 피킹의 끝에서 튜브를 4 분 동안 72 x g 에서 원심 분리기 (3.1 섹션 참조) 및 상 등 액을 흡입 합니다.
  8. 수집 된 CTCs를 마우스 주입에 적합 한 선택 버퍼로 소생 시킵니다. 유 방 팻 패드 주입의 경우, 수집 된 CTCs를 1DPBS 및 재구성 된 지 하 막의 1 ~ 1 비율로 추출 하 여 소생 하 고, 주입 될 때까지 4°c에서 유지 한다. 정 맥 주사의 경우, DPBS 에서만 수집 된 CTCs를 소생 시킵니다.
    참고: 솔루션의 볼륨은 주입 될 CTCs의 수에 따라 엄격 하 게 결정 됩니다. 유 방 팻 패드 또는 마우스 당 최대 100 μ l의 정 맥 내에 주사 하는 것이 좋습니다. 볼륨을 계산할 때는 항상 조작 및 주사기 로드에 대 한 데드 볼륨을 고려 하십시오.

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Representative Results

제시 된 워크플로를 통해 단일 CTCs 또는 CTC 클러스터에서 분리 된 개별 CTCs를 준비할 수 있습니다. 환자 또는 종양-베어링 쥐의 CTCs는 전 혈에서 사용 가능한 CTC 농축 방법으로 풍부 하며 암 관련 마커 (예: EpCAM, 녹색) 및 WBC 특이 적 마커 (예: CD45, 적색)에 대 한 항 체로 염색 됩니다 (그림 1a ). 염색 된 CTC 생성물이 미세 조작 스테이션으로 이송 된 후에 개별 세포가 포착 되 고, PCR 튜브 또는 멀티 웰 플레이트에 침착 되 고, 단일 세포 시퀀싱을 포함 하는 하류 분석을 위해 제조 되 고, 시험관 내 배양 또는 생체 내 분석 법 (도 1b).

이 방법의 신뢰성은 수동 셀 피킹 중에 적절 한 표적 셀 구별을 기반으로 합니다. 항-EpCAM 항 체를 가진 살아있는 면역 염색은 현 탁 액에 있는 암 세포를 가시화 하 고 CD45-양성 사건 (가장 가능성이 있는)에서 정확한 구별을 가능 하 게 한다 (도 2a). 셀 Celector는 적절히 교정 되 고 유지 관리 되 면 잘 제어 된 세포 조작을 제공 합니다. 정확한 CTC 절연은 CTC 클러스터 흡 인 전후에 촬영 된 사진에 도시 된 바와 같이 주변 오염 물 세포 (RBCs 또는 Wbc) 없이 원하는 표적의 흡 인을 특징으로 한다 (도 2b, C).

앞에서 설명한 바와 같이, CTC 클러스터는 단일 CTCs에 비교 하였을 때 더많은 전이성 표현 형을 표시 한다. 그러나, 이웃 하는 세포의 존재 여부는 알 수 없는 군집 내의 세포의 증식 속도를 증가 시키기에 충분 하다. 이 질문을 해결 하기 위해, 1009 단일 ctc 및 1008 ctc 클러스터 들 2-17 사이에 이르기까지 다양 한 (89.5%의 2-5 세포 클러스터 들로 서) ctc 유래 BR16 세포 주 (20) 로부터 유도 된 것은 384의 개별 웰 들로 미세 하 게 조작 되었다-웰 초 저 부착 플레이트. 모든 우물에 있는 살아있는 세포의 수는 현미경의 밑에 수동으로 계산 되 고 주간 기록 되었습니다. 모든 분석은 세포 수의 정상화 후에 수행 하였다 (즉, 3 개의 세포 군집을 3 개의 개별 세포로 서 분석 하였다). 실패 한 콜로 니는 실험 종료 시 웰에 살아있는 세포의 결핍을 특징으로 하였다. 의심 되는 것 처럼, CTC 클러스터는 단일 CTCs에 비해 증가 된 생존 율을 보이며 시험관 내 배양 에서 56 일 이내에 세포 콜로 니를 상승 시켰다 (도 3a, 3b). 특히, CTC 클러스터는 또한 더 높은 증식 율을 나타내 었 고 따라서 더 높은 최종 세포 수 (도 3c)에 도달 하 여 다른 종양 세포와의 직접적인 접촉이 그들의 생존 율 및 증식 속도 모두에 영향을 미치는 것을 나타낸다.

마지막으로 유방암 환자 로부터 직접 분리 된 CTCs의 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터를 제공 합니다. 특히, 우리는 단일 CTCs, CTC 클러스터 또는 CTC-WBC 군집에서 유래한 단일 세포의 t-분포 확률 이웃 임베딩 (tSNE)을 보여준다 (그림 4). 이러한 접근법은 특정 유전자의 발현에 기초 하 여 다른 세포 집단의 구별 뿐만 아니라 유사한 유전자 발현 프로필을 갖는 세포의 동정을 허용 한다.

Figure 1
그림 1 . 실험적 워크플로의 도식 적 표현. (A) ctcs는 암 환자 또는 마우스 암 모델의 혈액 으로부터 얻어 지 고, 사용 가능한 방법을 이용 하 여 농축 되어 백혈구 (red) 로부터 종양 세포 (green)를 감 별 하는 항 체로 표지 된다. (B) ctcs의 정밀한 미세 조작은 단일 세포 시퀀싱, CTC 배양 또는 생체 내 이식 실험 등 여러 절차 및 적용을 용이 하 게 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 미세 조작 전후의 CTCs의 대표 사진. (A) ctcs 및 백혈구의 가시화를 가능 하 게 하기 위해 BR16에서 유래한 ctcs의 대표적인 이미지 (NSG-cdx-)와 항 체 항-epcam (녹색) 및 항 CD45 (red)로 염색 하였다. 배율 40x가 표시 됩니다. (비, C) 미세 조작은 이전 (왼쪽) 및 이후 (오른쪽) 세포 흡 인 절차와 같이 원치 않는 세포 로부터 ctcs의 정밀한 분리를 가능 하 게 합니다. 배율 10 배. 더 큰 시야 (B) 와 좁은 시야 (C) 가 각각 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 3
그림 3 . 단일 CTCs 및 CTC 클러스터의 생존 및 증식 분석. 배양 된 CTC 유래 BR16 세포 로부터 단일 CTCs 또는 CTC 클러스터 로부터의 개별 세포를 384-웰 플레이트로 미세 조작 하였다. (A) 카 플 란-셀 군집과 비교 하 여 시드 단일 세포의 생존 확률을 나타낸 마이어 플롯. P< 0.0001-쌍별 로그 랭크 테스트. (B) 실험의 마지막에 살아있는 세포로 이루어져 있는 콜로 니의 비율을 나타내는 막대 그래프 (일 56). P< 0.0001 by 카이 제곱 테스트. (C) 히트 맵은 실험 과정에서 정규화 된 세포 수 분포를 시각화 합니다 (day 0, 8, 32, 56). 각 블록은 하나의 시작 셀을 나타내며 히트 맵은 주어진 timepoint에서 웰 당 셀의 수를 표시 합니다. d = 일입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 단일 세포 RNA 시퀀싱. T-분산 확률 이웃 임베딩을 이용한 CTC RNA 발현 데이터의 가시화 (tSNE). 각 점은 단일 CTC, ctc 클러스터 또는 CTC-WBC 클러스터 로부터 유도 된 단일 세포를 나타낸다. 점의 색은 기부자 ID에 해당 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

CTCs의 분자 특성화는 전이성 프로세스에 대 한 이해를 향상 시키고 새로운 항 전이 요법의 개발을 안내 하는 약속을 유지 합니다. 여기에서 우리는 단일 세포 기반 기능 분석, 유전자 발현 분석 및 전이성 전위에 대 한 생체 내 이식 모두를 포함 하 여 CTC 미세 조작 및 다운스트림 분석이 가능 하도록 하는 프로토콜에 대 한 상세한 설명을 제공 합니다. 평가20.

우리의 프로토콜의 가장 중요 한 단계 중, CTC 농축 제품의 미세 조작은 상대적으로 이종 세포 현 탁 액에서 단일 세포 분해능을 확보 하는 것을 목표로, 즉, 순도의 최고 수준에 도달 할 수 있도록 하 고 품질을 향상 시키기 위해 후속 기능 또는 분자 분석. 예를 들어 CTCs의 단일 셀 피킹은 분자 관점에서 그리고 평가할 수 있다는 관점에서 CTC 이질성 (예: 단일 CTCs, CTC 클러스터 및 CTC-WBC 클러스터의 차이)을 조사할 수 있게 했습니다. 전이 개시 기능. 우리는 일반적으로 실험 자가 CTCs를 수동으로 분리할 수 있도록 하는 셀 선택 프로토콜을 선호 하지만 (즉, 개별 타겟의 특성에 따라 더 높은 수준의 유연성을 허용) 자동화 된 솔루션을 사용 하 여 셀 피킹 및 잘 제어 된 실험에서 CTC 분리 과정을 가속화 한다.

CTC 분석의 맥락에서 단일 세포 미세 조작을 고려할 때, 시간은 매우 중요 한 제한 요인입니다. 우리의 프로토콜은 살아있는 세포에서 진행 되기 위한 것 이기 때문에, 문맥에 의존 하는 유전자의 상향 조정 또는 하향 조절과 같은 전 생체 환경에 기인한 변경을 극소화 하기 위하여 가능한 한 빨리 진행 하는 것이 필수적입니다. CTC 분석을 위한 기존 기술과 비교 했을 때, 라이브 CTCs의 단일 세포 미세 조작은 단일 세포 시퀀싱에서 직접 기능 분석에 이르기까지 선택의 다운스트림 분석에 더 높은 유연성을 제공 합니다.

이 원고에서, 우리는 또한 단일 및 클러스터 된 CTCs의 중요 한 차이점을 강조 하는 새로운 데이터를 제공 합니다 (명확 하 게 정의 된 크기의) 1000 개 이상의 단일 CTCs 또는 CTC 클러스터를 미세 조작 하 고 시드에 서 CTC에서 파생 된 세포 라인에서 마이크로 타이 터 플레이트의 개별 웰 첫째, 우리는 CTC 클러스터 (즉, 이웃 세포의 존재)가 시드 된 세포의 더 나은 생존 율을 달성 하기에 충분 하다는 것을 관찰 하 고, 먼 곳에서 시 딩에 따라 ctc 군집의 낮은 사 멸 비율을 제안 하는 생체 내 데이터를 지원 합니다. 19. 또한, 시드 된 세포의 수에 대 한 정상화 시에도, 클러스터로 성장 한 암 세포는 훨씬 더 높은 증식 율을 표시 하 고, 클러스터형 CTCs가 고도로 효율적인 전이 기여자 라는 개념을 더욱 강화 한다.

Ctc 필드에서 단일 세포 관련 조사를 촉진 하기 위한 목적으로 CTC 분석을 위한 특정 프로토콜을 함께 제시 한다. 미래에, 우리는 이러한 프로토콜이 다양 한 암 유형에 서 혈액 매개 전이를 특징 짓는 생물학에 대 한 더 나은 이해를 목표로 CTC 관련 조사에 유용 할 수 있다고 예상.

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Disclosures

N.A. 및 B.M.S.는 종양 세포 순환 및 암의 치료와 관련 된 특허 출원에 발명자로 등재 되어 있다. N.A.는 액체 생 검에 관심을 가진 제약 및 보험 회사에 대 한 유료 컨설턴트입니다.

Acknowledgments

우리는 우리의 연구를 위해 혈액을 기증 한 모든 환자 뿐 아니라 모든 관련 된 임상의 및 연구 간호 원을 감사 합니다. 우리는 지속적인 지원을 위해 ALS 자동화 된 실험실 솔루션 GmbH의 Jens에 버 하르 트, 우베 비르 케, 닥터 카타리나 오 그 리그에 감사 드립니다. 우리는 피드백과 토론을 위한 Aceto 연구소의 모든 회원 들에 게 감사 드립니다. Aceto 연구소의 연구는 유럽 연구 위원회, 유럽 연합 (eu), 스위스 국립 과학 재단, 스위스 암 리그, 바젤 암 리그, ETH 취리히와 바젤의 대학을 통해 바젤의 두 개 톤에 의해 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human EpCAM-AF488 Cell Signaling Technology CST5198 clone: VU1D9
1X DPBS Invitrogen 14190169 no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate Corning 3471
Anti-human CD45-BV605 Biolegend 304041 clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC  GeneTex GTX11400 clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488  Biolegend 324410 clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605 Biolegend 103139 clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA BD 366643 for human blood collection
Cell Celector ALS CC1001 core unit 
CellD software ALS version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 R&D Systems 3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA Sarstedt 41.3395.005 for mouse blood collection
PCR tubes Corning PCR-02-L-C
RLT Plus Quiagen 1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor Thermo Fisher AM2696  1 U/µL 

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References

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