下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

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Cancer Research

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Summary

ここでは、循環腫瘍細胞 (CTCs) を特徴付ける表現型および分子的特徴を同定するための統合ワークフローを紹介する。単一およびクラスタ化された CTCs の生免疫染色とロボットマイクロマニピュレーションを、下流解析および転移播種能力の評価のための単一細胞ベースの技術と組み合わせています。

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Donato, C., Szczerba, B. M., Scheidmann, M. C., Castro-Giner, F., Aceto, N. Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment. J. Vis. Exp. (147), e59677, doi:10.3791/59677 (2019).

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Abstract

血液によって媒介される転移は、ほとんどの癌に関連した死亡と、遠隔地での新しい腫瘍の確立に成功している循環腫瘍細胞 (CTCs) を含む。CTCs は、単一細胞 (単一 CTCs) または多細胞集合体 (CTC クラスターおよび CTC-白血球クラスター) として患者の血流に見られ、後者はより高い転移性能力を示す。列挙型を超えて、表現型および分子分析は CTC 生物学を分析し、実用的な脆弱性を識別するために非常に重要です。ここでは、CTC 免疫染色およびマイクロマニピュレーションを含むワークフローの詳細な説明を提供し、 ex インビボ培養は、個々の細胞の増殖および生存能力を評価し、インビボ転移形成アッセイを行う。また、CTC クラスタを個々の細胞に解離させ、クラスタ内の異質性を調べるためのプロトコルも提供しています。これらのアプローチによって、例えば、CTC クラスター内の単一の CTCs と個々の細胞の生存と増殖の可能性を正確に定量化し、クラスター内の細胞が ex においてより良い生存と増殖を表示するという観察に導いた。 インビボ培養は単一 CTCs と比較した。全体として、単一細胞レベルで CTCs の特性を分析するためのプラットフォームを提供し、転移関連経路の同定と CTC 生物学のより良い理解を目指します。

Introduction

遠隔臓器における転移の臨床的発現は、癌進行の最終段階を表し、癌関連死の 90% 以上を占める局在化から転移性疾患への移行は多段階プロセスであり、しばしば循環腫瘍細胞 (CTCs)234によって媒介される。これらの細胞は、原発腫瘍から血液循環に流され、遠くの器官に運ばれ、そこで転移性病変5,6を extravasate ことができる。固形腫瘍は比較的高い数の CTCs を放出することができるが、ほとんどの CTCs は死ぬ運命にあり、循環における高い剪断力、アノイキス媒介性細胞死、免疫攻撃、または外来微小環境7に適応する能力が限られている。したがって、転移播種能力を持つ CTCs の分子特性を解剖するためのツールを確立することが重要です。最近の前臨床および臨床研究は、単一の CTCs および CTC クラスターの存在および量が、様々なタイプの固形腫瘍の患者におけるより悪い結果と関連していることを示唆する8,9,10,11,12,13,14.CTC クラスタは循環の間に互いに付す2つ以上の CTCs のグループで、単一 CTCs31516と比較される転移を形成することでより有効である。クラスタ内の細胞は、デスモゾームおよび adherens 接合を介して強力な細胞細胞接着を維持し、アノイキス17,18を克服するのに役立つ可能性がある。最近、我々は、CTCs のクラスタリングが stemness および増殖関連転写因子の結合部位の hypomethylation にリンクされていることを観察し、転移19を首尾よく開始する能力を高めることにつながる。CTC クラスタ解離は、キー結合部位のリモデリングをもたらし、そして結果的に、それらの転移性電位19の抑制をもたらす。癌細胞のクラスターに加えて、CTCs は、白血球 (最も頻繁に好中球) に関連付けて循環中の高い増殖レベルを維持し、その転移性能力20を増加させることもできる。しかし、CTCs の生物学は部分的にしか理解されておらないし、単一およびクラスター化された細胞の根底にある分子的特徴と脆弱性を含め、いくつかの質問は開いたままである。

近年では、細胞表面発現パターンだけでなく、それらの分離のための CTCs の物理的特性を利用するいくつかの戦略が確立されています21,22,23,24,25. 抗原依存性分離法は、細胞表面上皮細胞接着分子 (EpCAM)26の発現に主に依存している。CTC 列挙のために最も頻繁に使用され、(現時点では) 唯一の FDA 承認プラットフォームは、CTCs21を分離するための2段階の手順に基づいている CellSearch システムです。最初のステップでは、血漿成分は遠心分離によって除去され、一方、CTCs は抗 EpCAM 抗体に結合した磁気 ferrofluids で捕捉される。第2工程において、CTC 富化溶液は、サイトケラチン (CK)81819を発現する有核 (DAPI −陽性) 細胞について染色され、一方白血球 (WBCs) は、パン-白血球マーカー CD45.最後に、捕捉した細胞は、統合スクリーニングプラットフォーム上に配置され、CD45 については陰性である一方、CTCs は EpCAM、中正、および DAPI の発現を介して同定される。これは CTC 列挙のための金本位と考えられていますが、CTC 検索に内在する制約により、下流の分子分析はこの技術では困難です。さらに、その分離手順を考えると、CellSearch は、癌の不均一性27または上皮マーカーの下方制御に例えば、より低い epcam 発現を有する CTCs と比較して、より高い Epcam レベルの CTCs の濃縮を支持することができる2829。これらの制限を克服するために、CTCs の富化のための抗原非依存性技術が出現してきた。例えば、iChip は、残りの血液成分からの CTCs および WBCs を含む有核細胞の流体力学的分離を統合し、続いて抗体タグ付き WBCs の immunomagnetic 枯渇により、タグなしおよび生存可能な CTCs の精製ができる。解決策25.さらに、ほとんどの CTCs が赤血球 (赤血球) や WBCs よりもわずかに大きいという事実は、サイズベースの CTC 濃縮技術23,30 (例えば、Parsortix システム (ANGLE)) を利用するマイクロ流体ベースの技術は、分離カセットを横切って狭窄チャネルを含む、10、8、6.5 または4.5 μ m のいずれかの末端間隙に細胞をリードする (異なるサイズは、標的癌細胞の予想される直径に応じて利用可能である)。血液細胞のほとんどは狭い隙間を通過し、一方、CTCs はそのサイズのために閉じ込められます (しかし、その低い変形性のためにも)、したがって、カセットに保持される。流れの方向を戻すことは捕獲された CTCs の解放を可能にし、下流の分析のために適している。しかし、CTC 分離のために選択されたプロトコルとは関係なく、典型的なポストエンリッチメント手順は、比較的少数の赤血球および WBCs と混合される CTCs を生成し、純粋な単一またはバルク CTCs の分析を困難にします。この問題に対処するために、我々は、血球汚染物質によって生じる潜在的なバイアスなしに CTC 操作を可能にするワークフローを確立した。事前に免疫染色を追加することで、可変抗体の組み合わせにより、CTCs を血液細胞から区別し、さらには異なる表面マーカー発現プロファイルを有する CTC サブグループを同定することができます。この高度にカスタマイズ可能な手順は、さらに特定のダウンストリームアプリケーションと組み合わせることができます。

ここでは、ctc が濃縮された製品 (任意の CTC エンリッチメント技術で得られる) から開始するワークフローについて説明し、1つのセルの分解能で CTC の生物学に関する洞察を得るためのいくつかのアプローチを組み合わせています。一言で言えば、私達のワークフローは生きて免疫染色によって単一の CTCs、CTC のクラスターおよび CTC-WBC のクラスターの識別を可能にし、前のインビボ培養プロトコルを使用して単一細胞のマイクロマニピュレーションおよび下流の分析に続いて、単一細胞配列決定、およびインビボ転移アッセイを行う。

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Protocol

患者からの血液サンプルを含むすべての手順は、参加者の書面によるインフォームドコンセントに基づいて行われた。手続きは、倫理的および制度的レビュー委員会 (倫理委員会北西部/中央スイス [EKNZ]) によって承認されたプロトコル EKNZ BASEC 2016-00067 と EK 321/10 に応じて実行し、ヘルシンキ宣言に準拠しています。

動物に関するすべての手順は、制度的および州ガイドライン (承認されたマウスプロトコル #2781、バーゼル市の州獣医事務所) に準拠して実施しました。

1. 患者のサンプル調製

  1. 開始する前に、手順全体の間に無菌性を維持するために滅菌ソリューションおよび材料で作業することを確認してください。
  2. 乳がん患者からの末梢血 7.5 mL を 10 mL EDTA 採血チューブに引き出します。
  3. 1分間に40の振動でロッキングシェーカー上で室温 (RT) で短時間 (最大 1h) 血液含有管をインキュベートします (osc/min)。
  4. 選択21222325の CTC 分離方法を使用して、単一の CTCs および ctc クラスタに対して強化します。1x DPBS ソリューションで CTCs をリリースします。
    注: 選択された CTC 濃縮技術に応じて、残りの白血球および赤血球が存在する可能性がある。CTC クラスタ構造を保持するために、解放圧力を調整します。
  5. セクション3の次のステップにすぐに進みます。

2. マウスのサンプル調製

  1. 開始する前に、25G 針、5 mM EDTA 濾過溶液、および 2 mL EDTA 採血チューブ付き1ml のインスリン注射器を準備します。
  2. 手順全体の間に無菌性を維持するために無菌溶液および材料で動作することを確認してください。
  3. シリンジを 5 mM EDTA 溶液でプレウォッシュします。
  4. 5 mM EDTA の100μ l のシリンジをロードし、気泡を除去します。
  5. 80% CO2/20% O2ガス吸入を使用してマウスを Euthanize し、次のステップに直ちに進む。
    注: CO2 吸入法に代わる方法は、イソフルラン麻酔 (3 容量% イソフルランおよび酸素 (キャリアガス) の流速で 600 mL/min) に続いて頸部脱臼、またはケタミン/キシラジン溶液の過剰摂取注入である。特定の安楽死方法は、承認されたマウスプロトコルによって異なる場合がある。
  6. 呼吸活動の欠如、角膜反射の欠損、および外部刺激のない排尿によって動物の死を確認する。
  7. 心臓に向かって胸骨から胸郭に30°の角度で EDTA 事前にロードされたシリンジの針を慎重に導入することによって心臓穿刺を実行します。
    注: 経験の浅い実験者のために、胸の空洞を最初に開き、心臓穿刺を行う前に、心臓をより良く視覚化することが推奨される。
  8. 最大1ml の血液を回収する。プランジャーを解放せずに、シリンジを動物の胸から引き抜き、針を安全に取り出し、2 mL EDTA 採血チューブの蓋を開き、血液を直接内部に分配します。ふたを閉めてチューブ10x を反転させます。
  9. 40 osc/min でロッキングシェーカー上の RT で短時間 (1 時間まで) 血液を含むチューブをインキュベートします。
    注意: 針は、鋭い安全な生物学的危険処分で処分されなければならない。
    注: 複数の穿刺は、総血量を増加させることが可能である。以前の針に存在する凝固したクロテッド血を避けるために異なる撤回のための EDTA と事前にロードされた別々のシリンジを使用してください。
  10. 選択21222325の CTCs 分離方法を使用して、単一の CTCs および CTC クラスタに対して強化します。1x DPBS ソリューションで CTCs をリリースします。
    注: 選択された CTC 濃縮技術に応じて、残りの白血球および赤血球が存在する可能性がある。CTC クラスタ構造を保持するために、解放圧力を調整します。
  11. セクション3の次のステップにすぐに進みます。
    注: 以下のすべての手順について、未固定および新たに孤立した血液が使用されていることを確認します。

3. CTCs ライブ免疫染色

  1. 72 x gにて4分間にわたり CTC を濃縮した細胞懸濁液を遠心分離します。
    注:72 x gは、ローターの直径が 100 mm の場合、800 rpm に対応します。ローターに応じて g 力数を変換します。
  2. 1% BSA 溶液中のペレットを 1x DPBS で優しく再懸濁し、抗ヒト CD45-AF488 抗体の2μ g/ml と抗マウス CD45-BV605 抗体または2μ g/ml の抗ネズミ抗体を合計500μ l の量で添加します。
    注: 乳癌患者由来 CTCs については、抗ヒト EGFR-FITC、および抗ヒト HER2 − AF488 を抗 EpCAM および抗 CD45 に加えて添加することができる。これにより、より低い EpCAM レベルを発現している CTCs をより正確に識別することができます。
  3. RT で30分間インキュベートし、光から保護します。
  4. 1x DPBS 溶液で 1% BSA の1ml を使用して CTCs 懸濁液を洗浄し、72 x gで4分間遠心分離します。この洗浄を2回繰り返してください。
  5. 再懸濁は 1x DPBS ソリューションで 1% BSA の2ml の細胞を染色し、6ウェル超低アタッチメントプレートの1ウェルに全量を移します。
  6. CTCs および残りの血球の沈殿を可能にするためにライトから保護される4° c の 10-15 min のための版をインキュベートしなさい。

4. CTCs と単細胞ピッキングのマイクロマニピュレーション

注: 開始する前に、マイクロ・マニュピュレーターは完全なセットアップのために最大45分を必要とすることに注意してください。設定が完了したら、CTC 識別とマイクロマニピュレーションの手順は、セル (またはクラスタ) ごとに最大2分かかります。

  1. 染色終了後2時間以内に CTC ピッキング手順を終了していることを確認してください。
  2. マイクロ・マニュピュレーターソフトウェアを起動し、マイクロ・マニュピュレーターのスイッチをオンにします。マイクロ・マニュピュレーターをコンピュータに接続し、接続ボタンを続けてInt デバイスを押して、ロボットアームと顕微鏡ステージを初期化します。
  3. コンピュータを介してそれを操縦することができるようにするために、マシンのすべての操作の後に保護キャビネットを閉じます。
  4. エタノールを噴霧し、キャビネットの内部表面を拭くことによって、ほこりやこぼれから表面をきれいにします。クリーンな環境は、プロセスの無菌性を保証します.
  5. ロボットアームに新しいガラス毛細管を取り付けます。単一細胞ピッキングの場合、20-30 μ m のキャピラリーを使用し、CTC クラスタピッキングには30-50 μ m を推奨します。
  6. システムオイルを分配するか、または吸い出すことによって管に存在するすべての泡を取除きなさい。
    注意: ガラス毛細管は鋭く、壊れやすいです。注意して取り扱ってください。
  7. 滅菌タンク1に 70% のエタノールを充填し、滅菌用ヌクレアーゼ− free h2o および緩衝タンクを滅菌 1x DPBS で殺菌タンク2に満たす。
    注意: 次の手順では、キャピラリーがタンクに自由にアクセスする必要があるため、タンクの蓋を閉じないでください。
  8. 70% エタノールで毛細血管を2回滅菌します。
  9. 滅菌タンク1をタンク2に交換し、滅菌機能を使用して h2s を少なくとも3回洗浄する。
  10. マイクロ・マニュピュレーターソフトウェアを使用して、新しい実験を開始し、自動と手動選択モードの間のピッキング実験の種類を選択します。
    注: 操作の終了点に基づいて、実験の種類を選択します。手動モードでは、毛細血管が細胞懸濁液に入ると、ロボットアームの操縦が可能になります。このステップは、CTC クラスターを個々のセルに解離させるために必要です。実験中にピッキングの種類を変更することができます。
  11. 滅菌槽 (液体 1)、緩衝槽 (液体 2) および堆積トレー (ターゲット1または 2) の位置を指定するデッキトレイを設定します。ターゲット1はプレートに堆積することができ、ターゲット2は PCR チューブまたは PCR プレートに堆積することができます。
  12. 4° c に選択した液体タンクと堆積トレーの温度を設定します。
    注: ピッキングプロセスには時間がかかる場合があります。従って液体タンクおよび堆積の皿の冷却は助言される
  13. リリースされた CTCs 溶液を含む超低アタッチメントプレートを、マイクロ・マニュピュレーターキャビネット内部の顕微鏡下に置きます。プレートから蓋を取り外し、キャビネットを閉じます。セットの残りの部分とピッキング手順の間、プレートを RT で保管してください。
  14. ピッキングのための顕微鏡目的 (10-20x) とすべての必要なチャネル (明視野、FITC、および TRITC チャネル) の露光時間を手動で選択します。
  15. [ツールバーから適切なナビゲータを表示] を選択して、ピックアッププレートのタイプ (6 ウェルプレート) を視覚化して選択します。
    注: 任意のプレートまたはウェルフォーマットは、メーカーのみでインストールすることができます。
  16. CTCs ソリューションが含まれていますが、視野の中心にセルを持たないウェルの中央にピックアップ位置を較正します。ウェルの端で行われた較正は、凹凸のある表面によるキャリブレーションの欠陥をもたらす可能性があります。
  17. センサーを使用して、プレートの底面をキャピラリー (速度 0.01 mm/ステップと 1% の速度) で優しくタッチします。
  18. プレート底面の 0.05 mm 上のピックアップ位置を設定します。
    注: 続行する前に、プレートとタンクの蓋を開いて取り除くようにしてください。毛管は閉鎖したか unremoved のふたで壊れるかもしれない。
    注意: 毛細血管が蓋と接触したときに破損する場合は、周囲または溶液中に割れたガラスが見つかることがあります。
  19. セルタイプとピッキングパラメータを選択します。ピッキングパラメータは、各起動時にセットアップしてロードすることができます。単一セルピッキングの場合は、手動モードを選択します。
  20. ピッキング準備の設定内:
    1. システムオイルとサンプルの間の空隙の容積を1μ l に置く
    2. 各ピッキング前に0.5 μ l になるまでバッファー液量を設定してください。
      注: バッファー液量は、合計最大ピックアップ量に合わせて調整されます。小さいボリュームはピッキングまたは堆積効率に影響を与えません。
    3. バッファー液の吸引速度を 1-6% に設定します。
    4. バッファの吸引後の待機時間を1秒に設定します。
      注: バッファー液体タンクではなくターゲットウェルからバッファを取得するオプションは、必要に応じて使用できます。
    5. ガラスの毛細血管を再利用し、ピック間に滅菌をしないように設定します。
      注: ピック間の滅菌は、必要に応じて手動で行うことができます。ピックまたはエタノール中の2つの滅菌の間に h2o で複数回の洗浄を行い、次いで h2o において複数回の洗浄を行う。
  21. ピッキング設定内:
    1. 顕微鏡下でのピッキングおよび露光時間の間にカメラの設定を7500μ s に変更してください。
    2. 固定のピッキングの高さを選択します。
      注: 代わりに、ツールセンサーまたはオートフォーカスを選択することができます。しかし、プレートの小さな不完全さは、センサーやオートフォーカスの感度を乱すことができ、これは、プレートに毛細管の影響を引き起こす可能性があります。
    3. ソースプレートに入る毛細血管の吸引速度を 7-15% に設定します。
    4. インタラクティブピッキングを有効にします。
    5. Μ l の吸引量を 0 ~ 0.05 に設定します。
    6. 抱負の速さを 5% に設定します。
    7. 吸引後の待機時間を s ~ 0-1 に設定します。
    8. キャピラリーあたりの選択されたパーティクルの数を1に設定します。
    9. 同じ位置に複数のピッキングを設定せず、削り出し機能はありません。吸引特性は、実験の種類に応じて設定する必要があります (例えば、自動ピッキングモードでは、より大きな吸引量が必要な場合があります)。
  22. 入金設定内:
    注: 堆積設定は、堆積プレート/チューブに厳密に依存します。
    1. 単一セルピッキングの場合、ターゲットプレートに入るキャピラリーの速度を 25% に設定します。
    2. 分注の速度を 6% に設定します。
    3. 分配後の待機時間を0に設定します。
    4. 100% にターゲットウェルで分配される空隙の量を設定します。
    5. 堆積後のリンスを設定しないでください。
      注: 殺菌は毛管をきれいにするために沈殿の後で行うことができる。
    6. 1ウェルあたりの粒子堆積量の最大値と、パーティクルを分散させるターゲットの数を設定します。
    7. プレートのターゲット1の位置 A1、またはチューブのターゲット2の位置 A1 に対して、デポジットの高さをキャリブレーションします。蓋のない開いたチューブまたはプレートをキャリブレーション用に置き、センサーを使用して堆積ウェルに優しく触れます (速度 0.01 mm/ステップと 1% の速度)。プレートの底面より 1 mm 上に堆積高さを設定します。
  23. 設定内:
    1. ピッキング中のステージ速度を 5-10% に設定します。
      注: プレートの速い動きは、懸濁液中の細胞の動きと mispositioning による複数の細胞のピッキングの難しさをもたらす可能性があります。
    2. 1μ l のすすぎ量、3つのリンスループ、滅菌ラウンドごとの待機時間の2秒を使用して、滅菌特性を設定します。
    3. 閉じる前に変更を適用します。
  24. ウェル内のジョイスティックを使用してガラス毛細管をナビゲートし、目的の単一セルの上に置きます。毛細血管が井戸の端で壊れる可能性があるので、井戸の境界線 (1mm) からの安全な距離での位置のピッキングを選択してください。
  25. ジョイスティックのボタンを使用して手動でパーティクルを追加するか、メニューから手動で選択します。
  26. [アクティブ化されたパーティクルを選択] を選択してピッキングを開始します。
  27. 毛管はインタラクティブなピッキング (手動モード) のために版の底の上のそして選択された積み込みの位置の上の 0.05 mm を停止する。ジョイスティックのつまみを静かに時計回りに回して、手動でパーティクルと周囲の DPBS ソリューションを吸引します。手動モードがオンの場合、最大ボリュームは固定されません。ただし、シリンジ内で許容される最大体積は25μ l となります。
  28. ジョイスティックのつまみを反時計回りにゆっくり回すことにより、余分な DPBS 溶液または不要な粒子を分配します。あまりにも多くの分配は、あなたのソリューションで気泡を形成するシリンジの空隙を解放し、視認性を損なうでしょう。
  29. [へ] を押して、デポジットを続行します。
  30. 堆積 PCR チューブまたは PCR プレートに入る毛細血管を観察し、容積を解放し、空の毛管で開始位置に戻る。
    注: 毛細血管に体積が残っている場合は、滅菌を進めてください。次に、新しいピッキングを実行する前に、設定、オイルレベル、およびオイルの高さを再確認します。
  31. セクション4のポイント26から、新しい単一セルピッキングを開始する。ピッキング中に毛細管を交換する必要があるかもしれません。インストール後、ピックアップ位置の新しいキャリブレーションを実行する必要があります。キャリブレーションの終了時に、新しいキャピラリーキャリブレーションに対してデポジットの高さを補正し、デポジットの高さのキャリブレーションをスキップするために、 Z 高さにキャリブレーションされた変更を適用することを選択してください (セクション 4.16)。
    注: セクション1-4 で説明されている手順は、ほとんどの CTCs エンリッチメントおよび分離方法に適用できます。ここでは、特定の CTCs 分析のためのオプションの手順を報告します。

5. 生存および増殖分析のための単一細胞ピッキングおよび播種

  1. 手順全体の間に無菌性を維持するために無菌溶液および材料で動作することを確認してください。
  2. 20μ l CTC 養殖培地31で培養するための選択された単一 CTCs を含むように384ウェルプレートを調製した。CTCs が操作後に培地の少量に播種されていることを確認してください (例えば、384ウェルプレートの場合は10-20 μ l)。
  3. 溶液をプレートの底までスピンダウンします。384ウェルプレートをターゲット1に入れ、4° c で保管してください。
  4. セクション4で説明されているマイクロ・マニュピュレーターを使用してすべてのステップを実行し、マイクロ・マニュピュレーターをセットアップして新しいピッキングを開始します。
    注: 単一セルを複数選択すると、ピッキングリストが形成されます。粒子をピックアップし、連続したウェルに1つずつ堆積されます (セクション4.22.6 を参照)。しかし、インタラクティブモード (手動モード) は、吸引の前に毛細管を停止させ、実験者がこの重要なステップを制御して、うまくピッキングを確実にすることを可能にします。プレートの速い動きは、細胞の動きを懸濁し、複数の細胞ピッキングにおける困難をもたらすことがある。
  5. 入金後、ステップ4を繰り返して新規ピッキングを開始します。
  6. ピッキングの最後に、72 x gのプレートを4分間遠心し、ピックしたセルが井戸の底に配置されるようにします。

6. シーケンスのための CTC クラスタ破断および単一セルピッキング

  1. 全体のプロシージャの間に生殖不能症を維持するために無菌解決および材料と働くことを保障しなさい。
  2. 1 U/μ l の RNA 阻害剤で構成される合計2.5 μ l 細胞溶解する溶液で、壊れたクラスターの単一細胞を含む単一の PCR チューブまたは PCR プレートを調製します。
  3. 溶液をチューブの底まで素早く回転させる。堆積容器をターゲット2に置き、4° c で保管してください。
  4. セクション4で説明したすべての手順をマイクロ・マニュピュレーターで実行して、マイクロ・マニュピュレーターをセットアップします。
  5. 新しいピッキングを開始します。毛細管はインタラクティブなピッキング (手動モード) のためにプレートの底部と選択された CTC クラスタの上に 0.05 mm を停止します。
  6. ジョイスティックのつまみを静かに時計回りに回して、手動でクラスターと周囲の DPBS ソリューションを吸引します。ジョイスティックのつまみを反時計回りにゆっくり回すことによって、CTC クラスタを含む吸気されたボリュームを分配します。
  7. ステップ6で説明した CTC クラスターの吸引/処分を繰り返し、クラスターを形成する単一のセルが分解されるようにします。
    注: 塗布量が多すぎると、溶液中の泡を形成するシリンジの空隙が解除され、視界が損なわれることになります。
  8. 単一のセルの位置を目でフォローします。ジョイスティックのボタンを使用して手動でパーティクルを追加するか、メニューから手動で選択します。
    注: 単一セルを複数選択すると、ピッキングリストが形成されます。粒子は、連続した PCR チューブ/ウェル内で1つずつピッキングおよび堆積されます (セクション4.22.6 を参照)。しかし、インタラクティブモード (手動モード) は、願望の前に毛細管を停止させ、実験者がこの重要なステップを制御し、うまくピッキングを確実にすることを可能にする。
  9. [アクティブ化されたパーティクルを選択] を選択してピッキングを開始します。
    注: セル溶解するの量は、単一のセルが完全に溶解することを可能にします。しかし、溶解した内容物を溶解する剤に長時間曝露すると、DNA または mRNA が劣化する可能性がある。そのため、すぐに次のステップに進みます。
  10. すぐに選ばれた単一の細胞を含んでいる管を閉め、スナップ凍結のためのドライアイスの移動。
  11. すぐにチューブを回転させ、堆積した細胞の適切な溶解を確保するために、チューブの両側に滴が存在しないことを確認してください。
  12. 手順5を繰り返して、新しいピッキングを開始します。
    注: 顕微鏡ステージは、セクション4.23.1 で説明した速度で、追加された1つの粒子から別のパーティクルに移動します。超低アタッチメントプレートの CTCs サスペンションが動くことがあり、mispositioning によるピッキング不良の原因となります。

7. マウスの注入のための CTCs の分離

  1. 手順全体の間に無菌性を維持するために無菌溶液および材料で動作することを確認してください。
  2. 5μ l の滅菌 1x DPBS を使用して PCR チューブを準備します。
  3. 溶液をチューブの底まで素早く回転させる。堆積容器をターゲット2に置き、4° c で保管してください。
  4. デポジットの設定では、ステップ4.22.6 に変更を適用します: 1ウェルあたりの粒子の堆積量の最大値を1000、パーティクルの分配先の数を設定します。このステップでは、選択したセルが1000回同じチューブに確実に堆積されるようにします。
  5. ピッキングステップを正確に制御するには、インタラクティブモード (手動モード) のみを使用し、選択したソリューションを汚染細胞から解放します。
    注: 1000 以上のセルが必要な場合は、1000のセルの後のサンプルの損失を避けるために、パーティクルを分配するターゲットの数を増やします。
  6. セクション4.26 の手順を続行して、新しいピッキングを開始します。手順6を繰り返して、複数のこみを実行します。マウス注射に使用できるセルの数を追跡するために、各ピッキングで収集されたセルの数を注釈付けします。
  7. ピッキングの終了時に、72 x gのチューブを4分間遠心分離し (セクション3.1 を参照)、上清を吸引します。
  8. 再懸濁は、収集した CTCs を、マウスインジェクションに適した、選択したバッファに挿入します。乳腺脂肪パッド注入については、回収された CTCs を1対1の割合で再懸濁、抽出した基底膜を再構成し、注入まで4° c に保つ。静脈内注射のために、再懸濁は DPBS のみで収集された CTCs を投与する。
    注: 溶液の体積は、注入される CTCs の数に厳密に依存します。乳房脂肪パッドまたは静脈内マウスあたりの最大100μ l を注入することをお勧めします。ボリュームを計算するときは、操作とシリンジのローディングのためのデッドボリュームを常に考慮してください。

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Representative Results

提示されたワークフローは単一 CTCs からのか、または CTC クラスタから分けられる個々の CTCs の準備を可能にする。患者または腫瘍を含むマウスからの CTCs は、利用可能な CTC 濃縮法を用いて全血から濃縮され、次いで癌関連マーカー (例えば、EpCAM、緑色) および WBC 特異的マーカー (例えば CD45、赤色) に対する抗体で染色した (図1a).染色された CTC 製品をマイクロマニピュレーションステーションに移し、個々の細胞をピックアップし、PCR チューブまたはマルチウェルプレートに堆積させ、単一細胞配列決定を含む下流分析のために準備し、インビトロ培養またin vivoアッセイ (図 1b)。

この方法の信頼性は、手動のセルピッキング中の適切なターゲットセルの区別に基づいています。抗 EpCAM 抗体による免疫染色は、がん細胞を懸濁液中で可視化し、CD45 陽性の事象 (最も可能性の高い、WBCs) との正確な区別を可能にします (図 2a)。適切に目盛りが付き、維持されるとき、CellCelector はよく制御された細胞操作を提供する。正確な CTC 分離は、CTC クラスタ吸引の前後に撮影された写真に示すように、周囲の汚染細胞 (赤血球または WBCs) を伴わない所望の標的のみの吸引によって特徴付けられる (図 2bC)。

前述のように、CTC クラスタは、一致した単一 CTCs19と比較した場合により多くの転移性表現型を表示する。しかし、隣接する細胞の存在がクラスタ内の細胞の増殖速度を増加させるのに十分であるかどうかは不明である。この問題に対処するために、1009の単一 CTC および 1008 CTC クラスターは、CTC 由来 BR16 細胞株20に由来する2-17 細胞 (それらの 89.5% が2-5 細胞クラスターである) 間の範囲で、384の個々のウェルに micromanipulated た超低アタッチメントプレート。すべてのウェル内の生細胞の数は、顕微鏡下で手動でカウントし、毎週記録しました。すべての分析は、細胞数の正常化後に行われた (すなわち、3細胞クラスターを3つの個々の細胞として分析した)。失敗したコロニーは実験の終わりに井戸で生きている細胞の欠乏によって特徴付けられました。疑いのあるように、CTC クラスターは単一 CTCs と比較して増加した生存を示し、インビトロ培養の56日以内に細胞コロニーを生じさせた (図 3a3b)。注目すべきことに、CTC クラスターはまた、より高い増殖速度を示し、したがって、より高い最終細胞数 (図 3c) に達し、他の腫瘍細胞との直接接触がそれらの生存率および増殖速度の両方に影響を及ぼしていることを示す。

最後に、乳癌患者から直接分離された CTCs の単一細胞 RNA 配列決定データを提供します。特に、単一 CTCs、CTC クラスター、または CTC-WBC クラスターに由来する単一細胞の t 分散確率近傍包埋 (tSNE) を示します (図 4)。このアプローチは、類似した遺伝子発現プロファイルを有する細胞の同定、ならびに特定の遺伝子の発現に基づいて異なる細胞集団の区別を可能にする。

Figure 1
図 1.実験ワークフローの概略表現。(A) CTCs は、癌患者またはマウス癌モデルの血液から得られ、利用可能な方法を用いて濃縮し、白血球 (赤色) から腫瘍細胞 (緑色) を識別する抗体で標識した。(B) CTCs の精密なマイクロマニピュレーションは複数のプロシージャおよび適用、例えば単一細胞の配列決定、CTCの文化またはインビボの移植の実験を促進する。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.マイクロマニピュレーション前後の CTCs の代表的な写真。 (A) CTC 由来異種移植片 (NSG − CDX − BR16) に由来する CTCs の代表的な画像を、抗 EpCAM (green) および抗 CD45 () の抗体で染色し、それぞれ CTCs および白血球の可視化を可能にする。倍率40倍が示されている。(B、C)マイクロマニピュレーションは、前 () と後 () の細胞吸引手順の画像に示すように、不要な細胞から CTCs を正確に分離することができます。倍率10倍より大きな視野(B)と狭い視野(C)がそれぞれ示されている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3.単一 CTCs および CTC クラスタの生存および増殖分析。培養した CTC 由来 BR16 細胞からの単一 CTCs または CTC クラスターからの個々の細胞を、384プレートに micromanipulated した。(A)カプラン−マイヤープロットは、細胞クラスターに対して単一細胞を播種する生存確率を示す。P<、ペアワイズログランクテストで0.0001 です。(B)実験終了時の生細胞から成っていたコロニーの割合を表す棒グラフ (56 日目)。カイ二乗検定でP< 0.0001。(C)実験の過程で正規化された細胞数分布を可視化するヒートマップ (0, 8, 32, 56)。各ブロックは1つの開始セルを表し、ヒートマップは指定された timepoint のウェルあたりのセル数を示します。d = 日。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4.単一細胞 RNA 配列。T 分布確率近傍包埋法 (tSNE) を用いた CTC RNA 発現データの可視化各ドットは、単一の CTC、CTC クラスタ、または CTC-WBC クラスタから派生した単一のセルを表します。ドットの色は、ドナー ID に対応しています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

CTCs の分子的キャラクタリゼーションは、転移性プロセスに対する我々の理解を改善し、新しい抗転移療法の開発を導くという約束を保持している。ここでは、CTC マイクロマニピュレーションおよび下流解析を可能にするこれらのプロトコルの詳細な説明を提供し、単一細胞ベースの機能アッセイ、遺伝子発現分析、および転移性電位に対するインビボ移植を含む評価20.

私たちのプロトコルの最も重要なステップの中で、CTC に富んだ製品のマイクロマニピュレーションは、比較的不均一な細胞懸濁液からの単一細胞分解能を獲得することを目的とし、すなわち、純度の最高レベルに到達し、品質を向上させることを可能にするその後の機能的または分子分析。例えば、CTCs の単一細胞ピッキングにより、私たちと他の人が、CTC の不均一性 (例えば、単一 CTCs、CTC クラスター、および CTC-WBC クラスター間の差異) を調査することが可能になり、両方の分子的観点から、および評価することができるという観点から転移-開始能力。一般的に、実験者が CTCs を手動で分離することを可能にするセルピッキングプロトコル (つまり、個々のターゲットの特性に応じて高い柔軟性が得られる) を使用して、自動化されたソリューションを利用できるようになりました。細胞ピッキングを行い、良好に制御された実験で CTC 分離プロセスを加速する。

CTC 分析の文脈でシングルセルマイクロマニピュレーションを検討する場合、時間は非常に重要な制限要因です。私たちのプロトコルは生きている細胞で行われることを意味しているので、コンテキスト依存的な遺伝子のアップレギュレーションや下方制御のような、ex vivo 環境による変化を最小限にするために、できるだけ早く進行することが不可欠です。CTC 分析のための既存の技術と比較されたとき、生きている CTCs の単一細胞のマイクロマニピュレーションは選択の下流の分析のためのより高い柔軟性を提供し、単一の細胞の配列決定から直接機能試金に及ぶ。

本稿ではまた、micromanipulating による単一およびクラスタ化された CTCs 間の重要な相違点を強調し、CTC 由来のセルラインから1,000 以上の単一 CTCs または CTC クラスタを (明確に定義されたサイズで) 播種する新しいデータも提供します。マイクロタイタープレートの個々のウェル。まず、CTC クラスター (すなわち、隣接する細胞の存在) が、播種された細胞のより良好な生存率を達成するのに十分であることを観察し、遠方の部位で播種する際の ctc クラスターのアポトーシス率の低いことを示唆するインビボデータを支持する19. さらに、播種された細胞の数についても正常化しても、クラスターとして成長した癌細胞は、はるかに高い増殖速度を示し、さらに CTCs をクラスター化したという概念をさらに強化することは、非常に効率的な転移寄与

Ctc 分析のための具体的なプロトコルを紹介し、CTC 分野における単一細胞関連の調査を促進することを目的としています。今後は、これらのプロトコルが CTC 関連の調査に役立つ可能性があることを期待しており、様々ながんの種類における血液由来の転移を特徴づける生物学の理解を深めることを目指しています。

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Disclosures

N.A. および B.M.S. は、循環腫瘍細胞および癌の治療に関連する特許出願に発明者として記載されている。N.A. は、液体生検に関心のある医薬品および保険会社の有償コンサルタントです。

Acknowledgments

私達は私達の研究のために血を寄付したすべての患者、またすべての関係の臨床医および研究の看護婦に感謝する。イェンス Eberhardt、Uwe コク birke、および ALS 自動化ラボソリューション GmbH からのカタリーナ Uhlig に感謝し、継続的なサポートを行っています。私たちは、フィードバックと議論のためにアセトラボのすべてのメンバーに感謝します。アセトラボでの研究は、欧州研究評議会、欧州連合、スイス国立科学財団、スイス癌連盟、バーゼル癌連盟、バーゼルの2州のチューリッヒを介して、バーゼル大学によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human EpCAM-AF488 Cell Signaling Technology CST5198 clone: VU1D9
1X DPBS Invitrogen 14190169 no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate Corning 3471
Anti-human CD45-BV605 Biolegend 304041 clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC  GeneTex GTX11400 clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488  Biolegend 324410 clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605 Biolegend 103139 clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA BD 366643 for human blood collection
Cell Celector ALS CC1001 core unit 
CellD software ALS version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 R&D Systems 3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA Sarstedt 41.3395.005 for mouse blood collection
PCR tubes Corning PCR-02-L-C
RLT Plus Quiagen 1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor Thermo Fisher AM2696  1 U/µL 

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References

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