Micromanipulation af cirkulerende tumor celler til downstream Molekylær analyse og metastatisk potentiel vurdering

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Her præsenterer vi en integreret arbejdsgang for at identificere fænotypiske og molekylære funktioner, der karakteriserer cirkulerende tumorceller (Ctc'er). Vi kombinerer levende immun farvning og robot-micromanipulation af enkelt-og klynge-Ctc'er med enkelt celle-baserede teknikker til downstream analyse og vurdering af metastaser-såning evne.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Donato, C., Szczerba, B. M., Scheidmann, M. C., Castro-Giner, F., Aceto, N. Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment. J. Vis. Exp. (147), e59677, doi:10.3791/59677 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Blodbårne metastaser tegner sig for de fleste kræftrelaterede dødsfald og involverer cirkulerende tumorceller (Ctc'er), der har succes med at etablere nye tumorer på fjerntliggende steder. Ctc'er findes i blodbanen af patienter som enkeltceller (enkelt Ctc'er) eller som flercellede aggregater (CTC-klynger og CTC-hvide blod celle klynger), hvor sidstnævnte udviser en højere metastatisk evne. Ud over optælling er fænotypiske og molekylære analyser overordentlig vigtig for at dissekere CTC-biologi og identificere handlingsrettede sårbarheder. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af en arbejdsgang, der omfatter CTC immunofarvning og micromanipulation, ex vivo kultur for at vurdere proliferativ og overlevelse kapaciteter af individuelle celler, og in vivo metastase-formation assays. Derudover leverer vi en protokol for at opnå afkobling af CTC-klynger i individuelle celler og undersøgelse af heterogenitet inden for klynger. Med disse tilgange, for eksempel, vi præcist kvantificere overlevelse og proliferativ potentiale af enkelt ctc'er og individuelle celler i CTC klynger, hvilket fører os til den observation, at celler i klynger viser bedre overlevelse og spredning i ex sammenlignet med enkelte ctc'er. samlet set tilbyder vores arbejdsgang en platform til at dissekere ctc's karakteristika på det enkelt celleniveau, der sigter mod at identificere metastaser-relevante veje og en bedre forståelse af CTC-biologi.

Introduction

Den kliniske manifestation af metastaser i fjerne organer repræsenterer den sidste fase af kræft progression og tegner sig for mere end 90% af kræftrelaterede dødsfald1. Overgangen fra lokaliseret til metastatisk sygdom er en multi-trins proces, ofte medieret af cirkulerende tumorceller (ctc'er)2,3,4. Disse celler er udgydt fra den primære tumor i blodcirkulationen og transporteres til fjerne organer, hvor de kan ekstravasere og etablere metastatiske læsioner5,6. Selv om solide tumorer kan frigive et relativt højt antal Ctc'er, er de fleste Ctc'er bestemt til at dø, på grund af høje forskydningskræfter i omløb, anoikis-medieret celledød, immun angreb eller begrænsede kapaciteter til at tilpasse sig et udenlandsk mikromiljø7. Derfor er det afgørende at etablere værktøjer, der muliggør dissektion af de molekylære træk ved de Ctc'er, der er udstyret med metastaser-såning evne. Nylige prækliniske og kliniske undersøgelser tyder på, at tilstedeværelsen og mængden af enkelt ctc'er og CTC-klynger er forbundet med et dårligere resultat hos patienter med forskellige typer af solide tumorer8,9,10 , 11 af , 12 ud af , 13 ud af , 14 ud af . CTC-klynger er grupper af to eller flere ctc'er, der er knyttet til hinanden under cirkulation og er mere effektive i dannelsen af metastaser sammenlignet med enkelt ctcs3,15,16. Celler i en klynge opretholder stærk celle-celle vedhæftning gennem desmosomer og klæber vejkryds, som kan bidrage til at overvinde anoikis17,18. For nylig bemærkede vi, at klyngedannelse af Ctc'er er knyttet til hypomethylering af bindingssteder for stemthed-og proliferation-associerede transkription faktorer, hvilket fører til en øget evne til at initiere metastase19. CTC klynge afkobling resulterer i remodeling af centrale bindingssteder, og dermed undertrykkelse af deres metastatisk potentiale19. Desuden til klynger af kræftceller, Ctc'er kan også associere til hvide blodlegemer (hyppigst neutrofiler) at opretholde høje proliferation niveauer i omløb og øge deres metastatisk kapacitet20. Imidlertid er CTCs ' biologi kun delvist forstået, og flere spørgsmål forbliver åbne, herunder de underliggende molekylære funktioner og sårbarheder i enkelt-og klynge celler.

I de seneste år er der blevet etableret flere strategier, som udnytter celleoverflade udtryks mønstre samt ctc'er ' fysiske egenskaber til deres isolation21,22,23,24, 25. antigen-afhængige isolations metoder stole mest på udtrykket af celleoverfladen epithelial celle vedhæftning molekyle (epcam)26. Den hyppigst anvendte og (i øjeblikket) den eneste FDA-godkendte platform for CTC-optælling, er CellSearch-systemet, som er baseret på en totrinsprocedure for at isolere CTCs21. I det første trin fjernes plasma komponenterne ved centrifugering, mens Ctc'er optages med magnetiske ferrovæsker, der er koblet til anti-EpCAM-antistoffer. I det andet trin er den CTC-berigede opløsning plettet for nukleerede (dapi-positive) celler, der udtrykker cytokeratin (CK)8,18,19, mens hvide blodlegemer (WBCs) identificeres ved hjælp af Pan-leukocyt markør CD45. Endelig er indfangede celler placeret på en integreret screening platform og Ctc'er identificeres gennem udtrykket af EpCAM, CKs, og DAPI samtidig være negativ for CD45. Selvom dette anses for at være guldstandarden for CTC-optælling, er downstream-Molekylær analyse udfordrende med denne teknologi på grund af iboende begrænsninger i CTC-hentning. Desuden, i betragtning af sin isolation procedure, cellsearch kan favorisere berigelse af ctc'er med højere epcam niveauer i forhold til ctc'er med lavere epcam udtryk, skyldes for eksempel kræft heterogenitet27 eller downregulation af epitel markører 28,29. For at overvinde disse begrænsninger er der opstået antigen-uafhængige teknologier til berigelse af Ctc'er. For eksempel integrerer CTC-iChip Hydrodynamisk adskillelse af nukleerede celler, herunder Ctc'er og Wbc'er fra de resterende blodkomponenter, efterfulgt af en immunomagnetisk nedbrydning af antistof-mærkede Wbc'er, der muliggør rensning af ukodede og levedygtige Ctc'er i opløsning25. Desuden har det forhold, at de fleste ctc'er er lidt større end røde blodlegemer (RBC'er) eller WBCs, ført til udvikling af størrelses baserede CTC-berignings teknologier23,30 (f. eks. parsortix-systemet (Angle)), som gør brug af en mikrofluidic-baseret teknologi, der omfatter en indsnævring kanal på tværs af separations kassetten, førende celler til en Terminal hul på enten 10, 8, 6,5 eller 4,5 μm (forskellige størrelser er tilgængelige afhængigt af den forventede diameter af Target cancerceller). De fleste af blodcellerne passerer gennem den smalle kløft, mens Ctc'er bliver fanget på grund af deres størrelse (men også på grund af deres lavere deformabilitet) og er derfor bevaret i kassetten. Revertering af strømningsretningen muliggør frigivelse af indfangede Ctc'er, som er i en levedygtig tilstand og egner sig til downstream-analyse. Uafhængigt af den valgte protokol til CTC-isolation giver typiske procedurer efter berigelse dog stadig Ctc'er, der blandes med et relativt lille antal RBC'er og Wbc'er, hvilket gør analysen af rene enkelt-eller bulk-Ctc'er udfordrende. For at løse dette problem, vi etableret en arbejdsproces, der tillader CTC manipulation uden potentiel bias introduceret af blodlegemer kontaminanter. Tilføjelsen af immun farvning på forhånd, med variable antistof kombinationer, adskiller Ctc'er fra blodlegemer og gør det endda muligt at identificere CTC-undergrupper med særskilte overflade-markør udtryks profiler. Denne meget tilpasselig procedure kan derefter yderligere kombineres med specifikke downstream applikationer.

Her beskriver vi en arbejdsproces, der starter fra et CTC-beriget produkt (opnået med en hvilken som helst CTC-berigelses teknologi) og kombinerer flere tilgange for at få indsigt i CTC-biologi ved enkelt celle opløsning. I en nøddeskal, vores workflow gør det muligt at identificere enkelt ctc'er, CTC klynger og CTC-WBC klynger ved levende immun farvning, efterfulgt af en enkelt celle micromanipulation og downstream analyse ved hjælp af ex vivo dyrkning protokoller, enkelt celle sekvensering og in vivo -metastase-assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der involverer blodprøver fra patienter, blev udført ved underskrevet informeret samtykke fra deltagerne. Procedurer blev kørt i henhold til protokoller EKNZ BASEC 2016-00067 og EK 321/10, godkendt af den etiske og institutionelle Review bestyrelse (etisk komité nordvest/centrale Schweiz [EKNZ]), og i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen.

Alle procedurer vedrørende dyr blev udført i overensstemmelse med de institutionelle og kantonale retningslinjer (godkendt muse protokol #2781, kantonal Veterinary Office of Basel-City).

1. forberedelse af patient prøver

  1. Før du starter, skal du sørge for at arbejde med aseptiske opløsninger og materialer for at opretholde steriliteten under hele proceduren.
  2. Udtag 7,5 mL perifert blod fra en brystkræft patient til et 10 mL EDTA-blodindsamlings glas.
  3. De blod holdige rør inkuberer i en kort periode (op til 1 time) ved stuetemperatur (RT) på en gynge shaker ved 40 svingning pr. minut (OSC/min).
  4. Berige for enkelt ctcs og CTC klynger ved hjælp af en CTC isolation Metodevalg21,22,23,25. Slip Ctc'er i en 1x DPBS-løsning.
    Bemærk: afhængigt af den valgte CTC-berigelses teknologi kan de resterende hvide blodlegemer og røde blodlegemer være til stede. Juster udløser trykket for at bevare CTC-klynge strukturerne.
  5. Fortsæt straks til næste trin i afsnit 3.

2. forberedelse af muse prøver

  1. Før du starter, skal du tilberede en 1 mL insulin sprøjte med en 25G nål, 5 mM EDTA filtreret opløsning og 2 mL EDTA blod opsamlings rør.
  2. Sørg for at arbejde med aseptiske opløsninger og materialer for at opretholde steriliteten under hele proceduren.
  3. Forvask sprøjten med 5 mM EDTA opløsning.
  4. Læg sprøjten med 100 μL 5 mM EDTA og fjern bobler.
  5. Euthanize musen ved hjælp af 80% CO2 /20% O2 gas indånding og Fortsæt straks til næste trin.
    Bemærk: et alternativ til CO2 inhalations metode er isofluran anæstesi (3 vol% isofluran og ilt (Carrier gas) ved strømningshastigheden på 600 ml/min) efterfulgt af cervikal dislokation, eller overdosering injektion af ketamin/xylazin opløsning. Specifik eutanasi-metode kan variere afhængigt af godkendt muse protokol.
  6. Bekræft dyrets død ved fravær af vejrtræknings aktivitet, manglende hornhinde refleks, og vandladning uden eksterne stimuli.
  7. Udfør en hjerte punktering ved forsigtigt at introducere nålen på den præbelastede injektionssprøjte med en 30 ° vinkel i brystkassen fra brystbenet mod hjertet.
    Bemærk: for uerfarne experimenters anbefales det at åbne brysthulen først, før du udfører hjerte punkturen, for bedre at kunne visualisere hjertet.
  8. Der kan hentes op til 1 mL blod. Uden at slippe stemplet, trække sprøjten ud fra dyre brystet, sikkert fjerne nålen, åbne låget af 2 mL EDTA blod opsamlingsrøret og dispensere blodet direkte indeni. Luk låget og vend røret 10x.
  9. De blod holdige rør inkuberer i en kort periode (op til 1 time) ved RT på en gynge shaker ved 40 OSC/min.
    Forsigtig: nålen skal bortskaffes i skarp sikker biologisk fare.
    Bemærk: flere punkteringer er muligt at øge den totale blodvolumen. Brug separate sprøjter, der er præbelastet med EDTA, til forskellige hævninger for at undgå at aspirere clotted Blood til stede i den foregående nål.
  10. Berige for enkelt ctc'er og CTC klynger ved hjælp af ctcs isolation Metodevalg21,22,23,25. Slip Ctc'er i en 1x DPBS-løsning.
    Bemærk: afhængigt af den valgte CTC-berigelses teknologi kan de resterende hvide blodlegemer og røde blodlegemer være til stede. Juster udløser trykket for at bevare CTC-klynge strukturerne.
  11. Fortsæt straks til næste trin i afsnit 3.
    Bemærk: for alle følgende procedurer skal du sørge for, at der anvendes ikke-fast og frisk isoleret blod.

3. Ctc'er lever immun farvning

  1. Der centrifugeres CTC-beriget cellesuspension ved 72 x g i 4 min.
    Bemærk: 72 x g svarer til 800 rpm, hvis rotoren har en diameter på 100 mm. Konverter g-kraft nummeret i henhold til rotoren.
  2. Skru forsigtigt pillen i 1% BSA-opløsning i 1x DPBS og tilsæt 2 μg/mL anti-humant EpCAM-AF488-antistof og 1 μg/mL anti-humant CD45-BV605-antistof eller 2 μg/mL anti-muse CD45-BV605-antistof i et samlet volumen på 500 μL.
    Bemærk: for brystkræft patient afledte Ctc'er, anti-Human EGFR-FITC, og anti-Human HER2-AF488 kan tilsættes yderligere til anti-EpCAM og anti-CD45. Dette gør det muligt bedre at identificere de Ctc'er, der udtrykker lavere EpCAM niveauer.
  3. Inkubeter i 30 min ved RT og Beskyt mod lys.
  4. Vask CTCs suspension med 1 mL 1% BSA i 1x DPBS opløsning og centrifugering ved 72 x g i 4 min. Gentag denne vask to gange.
  5. Opslæb farvede celler i 2 mL 1% BSA i 1x DPBS-opløsning og overfør det totale volumen i 1 brønd af en 6-Wells ultra-lav fastgørings plade.
  6. Pladen inkurueres i 10-15 min ved 4 °c beskyttet mod lys for at give mulighed for bundfældning af ctc'er og resterende blodlegemer.

4. mikromikromering af Ctc'er og enkelt celle plukning

Bemærk: før du starter, skal du være opmærksom på, at micromanipulatoren kræver op til 45 min. for komplet opsætning. Når det er oprettet, kræver proceduren for CTC-identifikation og micromanipulation op til 2 minutter pr. celle (eller klynge).

  1. Sørg for at afslutte CTC-pluk proceduren inden for 2 timer fra slutningen af farvningen.
  2. Start micromanipulator-softwaren, og tænd for micromanipulatoren. Tilslut micromanipulatoren til computeren, og Initialiser robotarmen samt mikroskopet ved at trykke på Connect -knappen efterfulgt af int-enhed.
  3. Luk beskyttelses kabinettet efter hver manipulation af maskinen for at kunne manøvrere det gennem computeren.
  4. Rengør overfladerne mod støv og spild ved at sprøjte ethanol og aftørre kabinettets indvendige overflader. Et rent miljø vil sikre steriliteten af processen.
  5. Installer et nyt glas kapillar på robotarmen. Ved enkelt celle plukning skal du bruge 20-30 μm kapillar, mens 30-50 μm er at foretrække for CTC-klynge plukning.
  6. Fjern alle bobler, der findes i slangen, ved at dispensere eller aspirere system olien.
    Forsigtig: glas kapillar er skarp og skrøbelig. Håndter med forsigtighed.
  7. Fyld steriliserings tanken 1 med 70% ethanol, steriliserings tanken 2 med steril nuklease-fri H2O og buffer tanken med sterile 1x dpbs.
    Forsigtig: Luk ikke låget på tankene, da kapillar i løbet af de næste trin skal have frit adgang til tankene.
  8. Steriliser kapillar to gange med 70% ethanol.
  9. Udskift steriliserings tanken 1 med tank 2 og vask kapillar i H2O mindst tre gange ved hjælp af steriliserings funktionen.
  10. Ved hjælp af micromanipulator-softwaren skal du starte et nyt eksperiment og vælge typen af pluk eksperiment mellem de automatiske og de manuelle markerings tilstande.
    Bemærk: Vælg typen af eksperiment baseret på slutpunktet af manipulationen. Manuel tilstand gør det muligt at manøvrere en robot arm, når kapillar-armen kommer ind i cellesuspensionen. Dette trin er nødvendigt for afkobling af CTC-klynger til individuelle celler. Det er muligt at ændre typen af plukning under eksperimentet.
  11. Konfigurer Deck bakken med angivelse af placeringen af steriliserings tanken (væske 1), buffer beholderen (væske 2) og deponerings bakken (mål 1 eller 2). Mål 1 gør det muligt at deponere i plader, mål 2 gør det muligt at deponere i PCR-rør eller PCR-plader.
  12. Indstil temperaturen på de flydende tanke og den deponere bakke, der er valgt til 4 °C.
    Bemærk: plukprocessen kan være tidskrævende. Køling af væsketanke og deponerings bakke tilrådes derfor
  13. Anbring den ultra-lave fastgørings plade, der indeholder den frigivne CTCs-opløsning, under mikroskopet inde i micromanipulatorkabinettet. Fjern låget fra pladen og luk kabinettet. Opbevar pladen på RT for resten af opsætning og under pluk proceduren.
  14. Manuelt vælge mikroskopet mål for plukning (10-20x) og eksponeringstid for alle de nødvendige kanaler (brightfield, FITC, og TRITC kanaler).
  15. Vælg Vis brønd navigatør fra værktøjslinjen for at visualisere og vælge typen af pickup plade (6-brønd plade).
    Bemærk: enhver plade eller brønd format kan kun installeres af producenten.
  16. Kalibrer pickup position i midten af brønden, der indeholder CTCs-løsningen, men uden celler i midten af synsfeltet. Kalibrering udført ved kanterne af brøndene kan resultere i defekt kalibrering på grund af ujævn brønd overflade.
  17. Brug sensoren til forsigtigt at berøre bunden af pladen med kapillar (hastighed 0,01 mm/trin og 1% hastighed).
  18. Indstil opsamlings positionen 0,05 mm over bunden af pladen.
    Bemærk: Sørg for at åbne og fjerne låg af plader og tanke, før du fortsætter. Kapillar kan knække på et lukket eller ikke-fjernet låg.
    Forsigtig: Hvis kapillar pauser ved kontakt med låg, kan der findes brækket glas i omgivelserne eller i løsningerne.
  19. Vælg celletype og pluk parametre. Pluk parameter kan konfigureres og indlæses ved hver opstart. Vælg manuel tilstand for enkelt celle pluk.
  20. Inden for indstillinger for Pluk forberedelse :
    1. Indstil luft mellemrums volumenet mellem system olien og prøven til 1 μl
    2. Indstil buffer væskevolumen til at tage op før hver plukning til 0,5 μl.
      Bemærk: buffer væskevolumen justeres til den samlede maksimale pickup volumen. Små mængder påvirker ikke plukningen eller depositiviteten.
    3. Indstil hastigheden for aspiration af buffer væsken mellem 1-6%.
    4. Indstil ventetiden efter aspiration af bufferen til 1 s.
      Bemærk: muligheden for at optage bufferen fra målet godt i stedet for buffer væske tank kan anvendes, hvis det er nødvendigt
    5. Indstil til Genbrug glas kapillærer og ingen sterilisation mellem hakker.
      Bemærk: sterilisering mellem plukninger kan udføres manuelt, hvis det er nødvendigt. Udfør flere skyller i H2o mellem hakker eller to sterilisering i ethanol efterfulgt af flere skyller i h2o.
  21. Inden for Pluk indstillingerne:
    1. Ændre kameraets indstillinger, mens picking og eksponeringstid under mikroskopet til 7.500 μs.
    2. Vælg fast pluk højde.
      Bemærk: værktøjs sensoren eller autofokus kunne vælges i stedet. Men små ufuldkommenheder af pladen kan forstyrre følsomheden af sensoren eller autofokus, som kan forårsage en indvirkning af kapillar i pladen.
    3. Sæt Aspirations hastigheden af kapillar ind i kilde pladen til 7-15%.
    4. Aktivér den interaktive pluk.
    5. Indstil Aspirations volumen i μl til 0-0,05.
    6. Indstil hastigheden på aspiration til 5%.
    7. Indstil ventetiden efter aspiration i s til 0-1.
    8. Indstil antallet af plukkede partikler pr. kapillar til 1.
    9. Indstil ingen flere pluk på samme position og ingen skrabning funktioner. Aspirations egenskaber skal indstilles i henhold til eksperiment typen (f. eks. kan automatisk pluk tilstand kræve større Aspirations volumener).
  22. Inden for indbetalings indstillingerne:
    Bemærk: deponering indstillinger afhænger nøje af deponering plade/tube.
    1. For enkelt celle plukning skal du definere hastigheden af kapillar indtastning af målpladen til 25%.
    2. Indstil hastig heden for dispensering til 6%.
    3. Indstil ventetiden efter dispensering i s til 0.
    4. Indstil mængden af luftspalte dispenseres i målet godt til 100%.
    5. Indstil ingen skylning efter deponering.
      Bemærk: sterilisering kan udføres efter deponering for at rense kapillar.
    6. Indstil maksimal mængde af partikler depositum per brønd og antallet af mål for at distribuere partikler til 1.
    7. Kalibrer indbetalings højden på position a1 i mål 1 for plader eller på position a1 i mål 2 for rør. Anbring en åben slange eller plade uden låg til kalibreringen, og brug sensoren til forsigtigt at røre ved deponeringen (hastighed 0,01 mm/trin og 1% hastighed). Sæt deponerings højden 1 mm over bunden af pladen.
  23. Inden for indstillingerne:
    1. Indstil stadie hastigheden under plukning til 5-10%.
      Bemærk: hurtige bevægelser af pladen kan resultere i bevægelse af celler i suspension og vanskeligheder i flere celle picking på grund af forkert positionering.
    2. Indstil steriliserings egenskaber ved hjælp af skylle volumen til 1 μl, 3 skylning sløjfer og 2 s ventetid pr. steriliserings runde.
    3. Anvend ændringerne, før du lukker.
  24. Naviger i glas kapillar ved hjælp af joysticket i brønden og Placer det oven på den enkelte celle af interesse. Vælg at afhente positioner i sikker afstand fra brøndens kant (1 mm), da kapillar kan knække på kanten af brønden.
  25. Tilføj partikler manuelt ved hjælp af joystickets knap, eller Vælg manuelt fra menuen.
  26. Vælg Pluk aktiverede partikler for at starte plukningen.
  27. Kapillar vil stoppe 0,05 mm over bunden af pladen og oven på den valgte pickup position på grund af den interaktive plukning (manuel tilstand). Drej forsigtigt joystickets knap med uret for manuelt at Aspirér partiklen og den omgivende DPBS-løsning. Den maksimale lydstyrke er ikke fast, når den manuelle tilstand er slået til. Den maksimalt tilladte mængde i sprøjten vil dog være 25 μL.
  28. Dispenserer den overskydende DPBS-opløsning eller uønskede partikler ved forsigtigt at dreje joystickets knap mod uret. For meget dispensering vil frigive lufthullet af sprøjten danner bobler i din løsning og kompromittere synlighed.
  29. Tryk på næste for at fortsætte med depositummet.
  30. Overhold kapillar ind i deponering PCR-røret eller PCR-pladen, frigivelse af volumen og gå tilbage til udgangspositionen med en tom kapillar.
    Bemærk: Hvis der er volumen tilbage i kapillar, Fortsæt med sterilisering. Kontroller derefter indstillingerne, olieniveauet og olie højden, før du foretager en ny plukning.
  31. Gå fra punkt 26 i afsnit 4 for at starte en ny enkelt celle plukning. Under plukning kan det være nødvendigt at udskifte kapillar. Efter installationen skal der foretages en ny kalibrering af afhentnings positionen. I slutningen af kalibreringen skal du vælge funktionen Anvend kalibrerede ændringer i Z-højde til depositum højde for at korrigere depositum højde til den nye kapillar kalibrering og for at springe depositum højde kalibrering (afsnit 4,16).
    Bemærk: de trin, der er beskrevet i afsnit 1-4, gælder for de fleste af CTCs berignings-og isolations metoder. Her rapporterer vi valgfrie trin til specifik CTCs-analyse.

5. enkelt celle plukning og såning til analyse af overlevelse og spredning

  1. Sørg for at arbejde med aseptiske opløsninger og materialer for at opretholde steriliteten under hele proceduren.
  2. Forbered en 384 brønd plade til at indeholde de udvalgte enkelt Ctc'er til dyrkning med 20 μL CTC-dyrkningsmedier31. Sørg for, at Ctc'er er seedede i små mængder af mediet efter manipulation (f. eks. 10-20 μL for en 384 brønd plade).
  3. Spin ned opløsningen til bunden af pladen. Anbring 384 brønd pladen i mål 1, og opbevar den ved 4 °C.
  4. Udfør alle trinene med den micromanipulator, der er beskrevet i afsnit 4, for at opsætte micromanipulatoren og starte en ny plukning.
    Bemærk: flere valg af de enkelte celler vil medføre dannelsen af en plukliste. Partiklerne vil blive plukket og deponeret en efter en i sammenhængende brønde (Se afsnit 4.22.6). Men den interaktive tilstand (manuel tilstand) vil stoppe kapillar ret før aspiration, derfor gør det muligt for eksperimentatoren at kontrollere dette kritiske skridt og for at sikre en vellykket plukning. Hurtige bevægelser af pladen kan resultere i flytning af cellerne i suspension og vanskeligheder i flere celle picking.
  5. Efter deponeringen skal du gentage trin 4 for at starte en ny plukning.
  6. Ved afslutningen af plukningen centrifugeres pladen ved 72 x g i 4 minutter for at sikre, at de plukkede celler placeres i bunden af brønden.

6. CTC klynge brydning og enkelt celle plukning til sekventering

  1. Sørg for at arbejde med aseptiske opløsninger og materialer for at opretholde steriliteten under hele proceduren.
  2. Forbered enkelt PCR-rør eller en PCR-plade, der vil indeholde de enkelte celler i den brudte klynge med den totale 2,5 μl-celle lyserende opløsning, der omfatter 1 U/μl RNA-hæmmer.
  3. Spin hurtigt opløsningen ned til bunden af røret. Anbring deponerings beholderne i mål 2, og opbevar den ved 4 °C.
  4. Udfør alle de trin, der er beskrevet i afsnit 4, med micromanipulator for at opsætte micromanipulatoren.
  5. Start en ny pluk. Kapillar vil stoppe 0,05 mm over bunden af pladen og oven på den valgte CTC-klynge på grund af den interaktive plukning (manuel tilstand).
  6. Drej forsigtigt joystickets knap med uret for manuelt at Aspirér klyngen og den omgivende DPBS-løsning. Den Aspirations volumen, herunder CTC-klyngen, skal drejes ved forsigtigt at dreje joystickets knap mod uret.
  7. Gentag aspiration/bortskaffelse af CTC-klyngen, der er beskrevet i trin 6, indtil de enkelte celler, der danner klyngen, bryder sammen.
    Bemærk: for meget dispensering vil frigive lufthullet af sprøjten danner bobler i din løsning og kompromittere synlighed.
  8. Følg med øjet positionen af de enkelte celler. Tilføj partiklerne manuelt ved hjælp af joystickets knap, eller Vælg manuelt fra menuen.
    Bemærk: flere valg af de enkelte celler vil medføre dannelsen af en plukliste. Partiklerne vil blive plukket og deponeret en efter en i efterfølgende PCR-rør/brønde (Se afsnit 4.22.6). Men den interaktive tilstand (manuel tilstand) vil stoppe kapillar ret før aspiration, derfor, så eksperimentatoren til at kontrollere dette kritiske skridt og for at sikre en vellykket plukning.
  9. Vælg Pluk aktiverede partikler for at starte plukningen.
    Bemærk: mængden af celle lyserende opløsning vil gøre det muligt for en enkelt celle til helt at lyse. Dog kan lang eksponering af det lyseret indhold til lyserende middel forringe DNA eller mRNA. Fortsæt derfor straks til næste trin.
  10. Luk straks røret, der indeholder den plukkede enkelt celle, og Overfør på tøris til fastfrysning.
  11. Hurtigt spin røret og kontrollere for fravær af dråber på siderne af røret for at sikre en ordentlig lyse af den deponerede celle.
  12. Gentag fra trin 5 for at starte en ny plukning.
    Bemærk: mikroskop stadiet vil bevæge sig fra en tilsat partikel til en anden ved den hastighed, der er beskrevet i punkt 4.23.1. CTCs suspension i den ultra-lav fastgørelse plade kan bevæge sig, forårsager defekt picking på grund af fejl positionering.

7. CTCs isolation til mus injektion

  1. Sørg for at arbejde med aseptiske opløsninger og materialer for at opretholde steriliteten under hele proceduren.
  2. Forbered et PCR-rør med 5 μL steril 1x DPBS.
  3. Spin hurtigt opløsningen ned til bunden af røret. Anbring deponerings beholderne i mål 2, og opbevar den ved 4 °C.
  4. Inden for indbetalings indstillingerne gælder en ændring på trin 4.22.6: Indstil den maksimale mængde af partikler depositum per brønd til 1.000 og antallet af mål for at distribuere partikler til 1. Dette trin sikrer, at de plukkede celler vil blive deponeret i samme rør for 1.000 gange.
  5. Brug kun den interaktive tilstand (manuel tilstand) til præcist at styre pluk trinnet og holde den plukkede løsning fri for kontaminerende celler.
    Bemærk: Hvis der er brug for mere end 1.000 celler, skal du øge antallet af mål til fordeling af partikler for at undgå tab af prøve efter 1.000 celler.
  6. Fortsæt trinnene i afsnit 4,26 for at starte en ny pluk. Gentag trin 6 for at udføre flere pickings. Annoter det antal celler, der er indsamlet ved hver plukning, for at holde styr på antallet af celler, der er tilgængelige for muse injektionen.
  7. Ved afslutningen af plukningen centrifugeres røret ved 72 x g i 4 min (se punkt 3,1.) og Aspirér supernatant.
  8. Opslæk de indsamlede Ctc'er i den valgte buffer, egnet til muse injektion. Til injektion af mælkefedt pad skal de indsamlede Ctc'er rekonstitueres i et 1 til 1-forhold på 1x DPBS og den rekonstituerede kælder membran ekstraheret og opbevares ved 4 °C indtil injektionen. Til intravenøs injektion skal de indsamlede Ctc'er kun resuspenderes i DPBS.
    Bemærk: volumen af opløsningen afhænger nøje af antallet af Ctc'er, der vil blive injiceret. Det tilrådes at injicere i mælke fedtpuden eller intravenøst maksimalt 100 μL pr. mus. Ved beregning af volumen, altid overveje den døde volumen for manipulation og sprøjte lastning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det præsenterede workflow gør det muligt at forberede individuelle Ctc'er, enten fra enkeltstående Ctc'er eller adskilt fra CTC-klynger. Ctc'er fra patienter eller tumor-bærende mus er beriget med fuldblod med tilgængelige CTC-berigelses metoder og derefter plettet med antistoffer mod cancer-associerede markører (f. eks. EpCAM, grøn) og WBC-specifikke markører (f. eks. CD45, rød) (figur 1a ). Det farvede CTC-produkt overføres derefter til micromanipulation-stationen, hvor individuelle celler plukkes, deponeres i PCR-rør eller flerhulsplader-plader og forberedes til downstream-analyse, herunder enkelt celle sekvensering, in vitro -kultur eller in vivo -analyser (figur 1b).

Pålideligheden af denne metode er baseret på en korrekt målcelle skelnen under manuel celle plukning. Levende immun farvning med anti-EpCAM antistoffer visualiserer kræftceller i suspensionen og muliggør en præcis sondring fra CD45-positive hændelser (mest sandsynligt, WBCs) (figur 2a). Når det er korrekt kalibreret og vedligeholdt, CellCelector giver velkontrolleret celle manipulation. Præcis CTC-isolation er karakteriseret ved aspiration af kun det ønskede mål uden omgivende kontaminerende celler (RBC'er eller WBCs), som vist på billederne taget før og efter CTC Cluster aspiration (figur 2b, C).

Som tidligere beskrevet viser CTC-klynger en mere metastatisk fænotype sammenlignet med matchede enkelt Ctc'er19. Men, om tilstedeværelsen af tilstødende celler er tilstrækkelig til at øge spredningen af celler i klynger er ukendt. For at løse dette spørgsmål, 1009 enkelt CTC og 1008 CTC klynger spænder mellem 2-17 celler (med 89,5% af dem er 2-5 celle klynger) afledt af CTC-afledte BR16 cellelinje20 var micromanipulated i individuelle brønde af 384-Well Ultra-lave fastgørelses plader. Antallet af levende celler i hver brønd blev talt manuelt under mikroskopet og indspillet ugentligt. Alle analyser blev udført efter normalisering af celle nummer (dvs., den tre-celle klynge blev analyseret som tre individuelle celler). Mislykkede kolonier var karakteriseret ved manglen på levende celler i brønden ved forsøgets afslutning. Som mistænkt viste CTC-klynger øget overlevelse sammenlignet med enkelt Ctc'er og gav anledning til celle kolonier inden for 56 dage efter in vitro -dyrkning (figur 3a, 3b). Især, CTC klynger også viste højere spredning sats og dermed nået højere endelige cellenumre (figur 3c), hvilket indikerer, at direkte kontakt med andre tumorceller har en indvirkning på både deres levedygtighed og spredning sats.

Endelig leverer vi enkelt celle-RNA-sekvensering af Ctc'er, der er direkte isoleret fra brystkræftpatienter. Især viser vi en t-distribueret stokastisk nabo integrering (tSNE) af enkeltceller, der stammer fra enten enkelt Ctc'er, CTC-klynger eller CTC-WBC-klynger (figur 4). Denne fremgangsmåde gør det muligt at identificere celler med samme genekspressions profil, samt at skelne mellem cellepopulationer, der er forskellige baseret på ekspression af bestemte gener.

Figure 1
Figur 1 . Skematisk gengivelse af den eksperimentelle arbejdsgang. (A) ctc'er er fremstillet af blod fra cancerpatienter eller mus Cancer modeller, beriget ved hjælp af tilgængelige metoder og mærket med antistoffer til at diskriminere tumorceller (grøn) fra hvide blodlegemer (rød). (B) præcis mikromikromatosering af ctc'er letter flere procedurer og anvendelser, f. eks., enkelt celle SEKVENS, CTC-kultur eller in vivo -transplantations eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Repræsentative billeder af Ctc'er før og efter micromanipulation. (A) repræsentative billeder af ctc'er afledt af et CTC-afledt xenograft (NSG-cdx-BR16) og plettet med antistoffer anti-epcam (grøn) og anti-CD45 (rød) for at muliggøre visualisering af henholdsvis ctc'er og hvide blodlegemer. Forstørrelse 40x vises. (B, C) Micromanipulation giver mulighed for præcis adskillelse af Ctc'er fra uønskede celler som vist i billederne før (venstre) og efter (højre) celle-aspiration procedure. Forstørrelse 10x. Det større synsfelt (B) og det smallere synsfelt (C) vises henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 . Analyse af overlevelse og spredning af enkelt Ctc'er og CTC-klynger. Individuelle celler fra enkelt Ctc'er eller CTC-klynger fra kultiverede CTC-afledte BR16-celler blev micromanipulated til 384-brønd plader. (A) Kaplan-Meier-plot, der viser sandsynligheden for overlevelse af seedede enkeltceller versus celle klynger. P< 0.0001 af parvis log-Rank-test. B) søjlediagram, der repræsenterer andelen af kolonier, der bestod af levende celler ved forsøgets afslutning (dag 56). P< 0.0001 af Chi-square test. (C) Heatmaps, der visualiserer normaliseret celle nummer fordeling i løbet af eksperimentet (dag 0, 8, 32, 56). Hver blok repræsenterer én startcelle, og heatmap viser antallet af celler pr. brønd på et givent tidspunkt. d = dag. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Enkelt celle-RNA-sekvensering. Visualisering af CTC-RNA-udtryks data ved hjælp af t-distribueret stokastisk nabo integrering (tSNE). Hver prik repræsenterer en enkelt celle, der er afledt af en enkelt CTC, en CTC-klynge eller en CTC-WBC-klynge. Farverne på prikkerne svarer til donor-id'et. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den molekylære karakterisering af Ctc'er holder løftet om at forbedre vores forståelse af den metastatiske proces og guide udviklingen af nye anti-metastaser behandlinger. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af de protokoller, der muliggør CTC micromanipulation og downstream analyse, herunder både enkelt celle-baserede funktionelle assays, genekspression analyse og in vivo transplantation for metastatisk potentiale vurdering20.

Blandt de mest kritiske trin i vores protokol er, at micromanipulation af CTC-berigede produkter har til formål at opnå enkelt celle opløsning fra relativt heterogene celle suspensioner, dvs. gør det muligt at nå de højeste renheds niveauer og forbedre kvaliteten af efterfølgende funktionelle eller molekylære analyser. For eksempel har enkelt celle plukning af Ctc'er gjort det muligt for os og andre at undersøge CTC-heterogenitet (f. eks. forskelle mellem enkelt Ctc'er, CTC-klynger og CTC-WBC-klynger), både fra et molekylært synspunkt og fra perspektivet om at kunne vurdere metastase-initieringsevne. Mens vi generelt favoriserer celle pluk protokoller, der gør det muligt for experimentoren at manuelt isolere Ctc'er (dvs. giver mulighed for en højere grad af fleksibilitet afhængigt af karakteristika af individuelle mål), er automatiserede løsninger nu tilgængelige for at lette celle plukning og for at fremskynde CTC-isolations processen i velkontrollerede eksperimenter.

Når man overvejer enkelt celle micromanipulation i forbindelse med CTC analyse, tid er en meget kritisk begrænsende faktor. Da vores protokol er beregnet til at blive udført på levende celler, er det bydende nødvendigt at fortsætte så hurtigt som muligt for at minimere ændringer på grund af ex vivo miljø, såsom Opregulering eller downregulation af gener, der er kontekstafhængige. Når man sammenligner med de eksisterende teknikker til CTC-analyse, giver enkelt celle-micromanipulation af levende Ctc'er større fleksibilitet til downstream-analyse af valg, lige fra enkelt celle sekvensering til direkte funktionelle assays.

I dette manuskript leverer vi også nye data, der fremhæver vigtige forskelle mellem enkelt-og klynge-Ctc'er ved hjælp af micromanipulating og såning af mere end tusind enkelt Ctc'er eller CTC-klynger (med en klart defineret størrelse) fra en CTC-afledt cellelinje i enkelte brønde på en mikrotiterplade. For det første bemærker vi, at CTC-klynger (dvs. tilstedeværelsen af tilstødende celler) er tilstrækkelige til at opnå bedre overlevelsesrater for seedede celler, hvilket understøtter vores in vivo -data, der tyder på lavere apoptotiske rater af CTC-klynger ved såning på et fjernt sted 19. yderligere, selv efter normalisering for antallet af seedede celler, kræftceller dyrket som klynger udviser meget højere spredning satser, yderligere at styrke konceptet, klyngeopdelte Ctc'er er yderst effektive metastaser bidragydere.

Sammen præsenterer vi specifikke protokoller for CTC-analyse med det formål at fremme enkelt celle relaterede efterforskninger i CTC-feltet. I fremtiden forventer vi, at disse protokoller kan være nyttige for CTC-relaterede undersøgelser, der sigter mod en bedre forståelse af den biologi, der karakteriserer blod-bårne metastaser i forskellige kræfttyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

N.A. og B.M.S. er opført som opfindere i patentansøgninger, der vedrører cirkulerende tumorceller og behandling af kræft. N.A. er en betalt konsulent for farmaceutiske og forsikringsselskaber med en interesse i flydende biopsi.

Acknowledgments

Vi takker alle patienter, der donerede blod til vores undersøgelse, samt alle involverede klinikere og studere sygeplejersker. Vi takker Jens Eberhardt, Uwe Birke og Dr. Katharina Uhlig fra ALS Automated Lab Solutions GmbH for kontinuerlig support. Vi takker alle medlemmer af Aceto Lab for feedback og diskussioner. Forskning i Aceto Lab støttes af det europæiske forskningsråd, den Europæiske Union, den schweiziske National Science Foundation, den schweiziske Cancer League, Basel Cancer League, de to kantoner i Basel gennem ETH Zürich, og universitetet i Basel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human EpCAM-AF488 Cell Signaling Technology CST5198 clone: VU1D9
1X DPBS Invitrogen 14190169 no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate Corning 3471
Anti-human CD45-BV605 Biolegend 304041 clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC  GeneTex GTX11400 clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488  Biolegend 324410 clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605 Biolegend 103139 clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA BD 366643 for human blood collection
Cell Celector ALS CC1001 core unit 
CellD software ALS version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 R&D Systems 3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA Sarstedt 41.3395.005 for mouse blood collection
PCR tubes Corning PCR-02-L-C
RLT Plus Quiagen 1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor Thermo Fisher AM2696  1 U/µL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Cancer Research. 70, (14), 5649-5669 (2010).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168, (4), 670-691 (2017).
  3. Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Trends in Cancer. 1, (1), 44-52 (2015).
  4. Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review). International Journal of Oncology. 49, (6), 2206-2216 (2016).
  5. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Review Cancer. 9, (4), 274-284 (2009).
  6. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147, (2), 275-292 (2011).
  7. Pantel, K., Speicher, M. R. The biology of circulating tumor cells. Oncogene. 35, (10), 1216-1224 (2016).
  8. Hou, J. M., et al. Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30, (5), 525-532 (2012).
  9. Long, E., et al. High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness. Cancer Medicine. 5, (6), 1022-1030 (2016).
  10. Wang, C., et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 161, (1), 83-94 (2017).
  11. Mu, Z., et al. Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 154, (3), 563-571 (2015).
  12. Zhang, D., et al. Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy. Cancer Cell International. 17, 6 (2017).
  13. Zheng, X., et al. Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer. Translational Oncology. 10, (3), 431-441 (2017).
  14. Chang, M. C., et al. Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Chemistry. 62, (3), 505-513 (2016).
  15. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158, (5), 1110-1122 (2014).
  16. Cheung, K. J., et al. Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (7), E854-E863 (2016).
  17. Giuliano, M., et al. Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize. Cancer Research. 78, (4), 845-852 (2018).
  18. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, 33 (2016).
  19. Gkountela, S., et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 176, (1-2), 98-112 (2019).
  20. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. (2019).
  21. Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment? Cancer Treatment Reviews. 41, (2), 144-150 (2015).
  22. Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nature Methods. 12, (7), 685-691 (2015).
  23. Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, (9), e0138032 (2015).
  24. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (43), 18392-18397 (2010).
  25. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Science Translational Medicine. 5, (179), 179ra147 (2013).
  26. Went, P. T., et al. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Human Pathology. 35, (1), 122-128 (2004).
  27. Soysal, S. D., et al. EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer. British Journal of Cancer. 108, (7), 1480-1487 (2013).
  28. Yu, M., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339, (6119), 580-584 (2013).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, (4), 704-715 (2008).
  30. Zheng, S., et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of Chromatography A. 1162, (2), 154-161 (2007).
  31. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, (6193), 216-220 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics