Micromanipulation de cellules tumorales circulantes pour l’analyse moléculaire en aval et l’évaluation du potentiel métastatique

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Cancer Research

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Summary

Ici, nous présentons un workflow intégré pour identifier les caractéristiques phénotypiques et moléculaires qui caractérisent les cellules tumorales circulantes (CTCs). Nous combinons l’immunocoloration en direct et la micromanipulation robotisée de CTCS simples et groupés avec des techniques à cellules uniques pour l’analyse en aval et l’évaluation de la capacité d’ensemencement des métastases.

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Donato, C., Szczerba, B. M., Scheidmann, M. C., Castro-Giner, F., Aceto, N. Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment. J. Vis. Exp. (147), e59677, doi:10.3791/59677 (2019).

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Abstract

Les métastases transmises par le sang représentent la plupart des décès liés au cancer et impliquent des cellules tumorales circulantes (CTCs) qui réussissent à établir de nouvelles tumeurs dans des sites éloignés. Les CTCs se retrouvent dans la circulation sanguine des patients en tant que cellules individuelles (CTCs uniques) ou en agrégats multicellulaires (grappes de CTC et grappes de globules blancs CTC), ce dernier affichant une capacité métastatique plus élevée. Au-delà de l’énumération, l’analyse phénotypique et moléculaire est extraordinairement importante pour disséquer la biologie de la CCT et identifier les vulnérabilités exploitables. Ici, nous fournissons une description détaillée d’un workflow qui inclut l’immunocoloration et la micromanipulation de CTC, la culture ex vivo pour évaluer les capacités prolifératives et de survie des cellules individuelles, et les essais in vivo de formation de métastase. En outre, nous fournissons un protocole pour réaliser la dissociation des grappes de CTC dans les cellules individuelles et l’étude de l’hétérogénéité intra-grappe. Avec ces approches, par exemple, Nous quantifions précisément la survie et le potentiel prolifératif des CTCs uniques et des cellules individuelles dans les grappes de CTC, nous conduisant à l’observation que les cellules dans les grappes affichent une meilleure survie et prolifération dans les ex par rapport aux CTCS uniques. dans l’ensemble, notre flux de travail offre une plate-forme pour disséquer les caractéristiques des CTCS au niveau de la cellule unique, visant à identifier les voies pertinentes des métastases et à mieux comprendre la biologie de la CCT.

Introduction

La manifestation clinique des métastases dans les organes éloignés représente l’étape finale de la progression du cancer et compte pour plus de 90% des décès liés au cancer1. La transition de la maladie localisée à la métastatique est un processus à étapes multiples, souvent médiatisé par les cellules tumorales circulantes (CTCS)2,3,4. Ces cellules sont excréées de la tumeur primaire dans la circulation sanguine et sont transportées vers des organes éloignés, où elles peuvent extravasate et établir des lésions métastatiques5,6. Bien que les tumeurs solides puissent libérer un nombre relativement élevé de CTCs, la plupart des CTCs sont destinés à mourir, en raison de forces de cisaillement élevées en circulation, de la mort cellulaire induite par anoikis, d’une attaque immunitaire ou de capacités limitées pour s’adapter à un microenvironnement étranger7. Par conséquent, il est essentiel d’établir des outils qui permettent la dissection des caractéristiques moléculaires des CTCs qui sont dotés d’une capacité d’ensemencement des métastases. Des études précliniques et cliniques récentes suggèrent que la présence et la quantité de CTCS et de grappes de CTC uniques sont associées à un résultat pire chez les patients présentant divers types de tumeurs solides8,9,10 , le 11 , le 12 , le 13 , le 14 . Les grappes de CTC sont des groupes de deux ou plusieurs CTCS attachés les uns aux autres pendant la circulation et sont plus efficaces pour former des métastases comparativement aux CTCS simples3,15,16. Les cellules d’un cluster maintiennent une forte adhérence des cellules cellulaires par les desmosomes et les jonctions adhérentes, ce qui peut aider à surmonter anoikis17,18. Récemment, nous avons observé que le regroupement des CTCs est lié à l’hypométhylation des sites de liaison pour les facteurs de transcription associés à la prolifération et à la tige, conduisant à une capacité accrue à initier avec succès la métastase19. La dissociation du cluster CTC aboutit à la retouche de sites de liaison clés et, par conséquent, à la suppression de leur potentiel métastatique19. En plus des grappes de cellules cancéreuses, les CTCs peuvent également s’associer aux globules blancs (le plus souvent des neutrophiles) pour maintenir des niveaux élevés de prolifération en circulation et augmenter leur capacité métastatique20. Cependant, la biologie des CTCs n’est comprise que partiellement et plusieurs questions demeurent ouvertes, y compris les caractéristiques moléculaires sous-jacentes et les vulnérabilités des cellules individuelles et en grappes.

Au cours des dernières années, plusieurs stratégies ont été établies qui exploitent les modèles d’expression de surface cellulaire ainsi que les propriétés physiques des CTCS pour leur isolement21,22,23,24, 25. les méthodes d’isolement dépendantes de l’antigène reposent principalement sur l’expression de la molécule d’adhérence des cellules épithéliales de la cellule (EpCAM)26. Le plus fréquemment utilisé et (à l’heure actuelle) la seule plate-forme approuvée par la FDA pour l’énumération CTC, est le système CellSearch, qui est basé sur une procédure en deux étapes pour isoler CTCs21. Dans la première étape, les composants plasmatiques sont éliminés par centrifugation, tandis que les CTCs sont capturés avec des ferrofluides magnétiques couplés à des anticorps anti-EpCAM. Dans la deuxième étape, la solution enrichie en CTC est colorée pour les cellules nucléées (DAPI-positives) exprimant la cytokératine (CK)8,18,19, tandis que les globules blancs (WBCs) sont identifiés à l’aide de la marqueur Pan-leukocyte CD45. Enfin, les cellules capturées sont placées sur une plate-forme de filtrage intégrée et les CTCs sont identifiés par l’expression d’EpCAM, de CKs et de DAPI tout en étant négatifs pour CD45. Bien que ce soit considéré comme la norme d’or pour l’énumération CTC, l’analyse moléculaire en aval est difficile avec cette technologie en raison des contraintes inhérentes à la récupération de CTC. En outre, compte tenu de sa procédure d’isolement, CellSearch peut favoriser l’enrichissement des CTCs avec des niveaux plus élevés d’EpCAM par rapport aux CTCs avec une expression EpCAM inférieure, due par exemple à l’hétérogénéité du cancer27 ou à la rétrorégulation des marqueurs épithéliaux 28,29. Pour surmonter ces limitations, des technologies indépendantes de l’antigène pour l’enrichissement des CTCs ont émergé. Par exemple, la CTC-iChip intègre la séparation hydrodynamique des cellules nucléées, y compris les CTCs et les globules blancs des composants sanguins restants, suivie d’une déplétion immunomagnétique des globules blancs marqués par des anticorps, permettant la purification de CTCs non marqués et viables dans la solution25. En outre, le fait que la plupart des CTCS soient légèrement plus grands que les globules rouges (RBC) ou les CSSC a entraîné le développement de technologies d’enrichissement de la CCT basées sur la taille23,30 (p. ex., le système parsortix (angle)) qui utilise un technologie à base de microfluidique, comprenant un canal rétrécissant à travers la cassette de séparation, conduisant les cellules à un écart terminal de 10, 8, 6,5 ou 4,5 μm (différentes tailles sont disponibles en fonction du diamètre attendu des cellules cancéreuses cibles). La plupart des cellules sanguines traversent l’écart étroit, tandis que les CTCs sont piégés en raison de leur taille (mais aussi en raison de leur déformabilité inférieure) et sont donc conservés dans la cassette. Le rétablissement de la direction du flux permet la libération de CTCs capturés, qui sont dans un État viable et appropriés pour l’analyse en aval. Toutefois, indépendamment du protocole choisi pour l’isolement de la CCT, les procédures de post-enrichissement typiques donnent encore des CTCs mélangés à un nombre relativement restreint de globules rouges et de globules blancs, ce qui rend difficile l’analyse des CTCs purs ou en vrac. Pour résoudre ce problème, nous avons établi un workflow qui permet la manipulation CTC sans biais potentiel introduit par les contaminants des cellules sanguines. L’addition d’immunocoloration à l’avance, avec des combinaisons d’anticorps variables, distingue les CTCS des cellules sanguines et permet même d’identifier les sous-groupes de CTC avec des profils d’expression de marqueurs de surface distincts. Cette procédure hautement personnalisable peut ensuite être combinée avec des applications en aval spécifiques.

Ici, nous décrivons un workflow qui commence à partir d’un produit enrichi de CTC (obtenu avec n’importe quelle technologie d’enrichissement de CTC de choix) et combine plusieurs approches pour obtenir un aperçu de la biologie de CTC à la résolution d’une seule cellule. En un mot, notre workflow permet d’identifier des CTCs uniques, des grappes CTC et des grappes CTC-WBC par immunostaining en direct, suivie d’une micromanipulation à une seule cellule et d’une analyse en aval à l’aide de protocoles de culturation ex vivo , d’une seule cellule tests de métastase in vivo .

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Protocol

Toutes les procédures impliquant des échantillons sanguins de patients ont été effectuées sur consentement éclairé signé des participants. Les procédures ont été exécutées selon les protocoles EKNZ BASEC 2016-00067 et EK 321/10, approuvés par la Commission d’examen éthique et institutionnel (Comité d’éthique Nord-Ouest/Suisse centrale [EKNZ]), et conformément à la déclaration d’Helsinki.

Toutes les procédures concernant les animaux ont été exécutées en conformité avec les directives institutionnelles et cantonales (protocole de souris approuvé #2781, Office cantonal des vétérinaires de Bâle-ville).

1. préparation de l’échantillon du patient

  1. Avant de commencer, assurez-vous de travailler avec des solutions aseptiques et des matériaux pour maintenir la stérilité pendant toute la procédure.
  2. Prélever 7,5 mL de sang périphérique d’un patient cancéreux dans un tube de prélèvement sanguin EDTA de 10 mL.
  3. Incuber les tubes contenant du sang pendant une courte période de temps (jusqu’à 1 h) à température ambiante (RT) sur un agitateur à bascule à 40 oscillation par minute (OSC/min).
  4. Enrichissez pour les CTCS et les grappes de CTC simples utilisant une méthode d’isolement de CTC de choix21,22,23,25. Libérez les CTCs dans une solution 1x DPBS.
    Remarque: selon la technologie d’enrichissement de CTC choisie, les globules blancs restants et les globules rouges pourraient être présents. Ajustez la pression de relâchement afin de préserver les structures du cluster CTC.
  5. Passez immédiatement à l’étape suivante de la section 3.

2. préparation de l’échantillon de souris

  1. Avant de commencer, préparez une seringue d’insuline de 1 mL avec une aiguille de 25G, une solution filtrées EDTA de 5 mM et des tubes de prélèvement sanguin EDTA de 2 mL.
  2. Assurez-vous de travailler avec des solutions aseptiques et des matériaux pour maintenir la stérilité pendant toute la procédure.
  3. Prélavez la seringue avec une solution EDTA de 5 mM.
  4. Chargez la seringue avec 100 μL d’EDTA de 5 mM et enlevez les bulles.
  5. Euthanasier la souris à l’aide de 80% CO2 /20% O2 gaz inhalation et procéder immédiatement à l’étape suivante.
    Remarque: une alternative à la méthode d’inhalation de CO2 est l’anesthésie à l’isoflurane (3 vol% d’isoflurane et d’oxygène (gaz porteur) au débit de 600 ml/min) suivie d’une dislocation cervicale, ou d’une injection de surdose de solution de kétamine/xylazine. La méthode d’euthanasie spécifique peut varier selon le protocole de souris approuvé.
  6. Confirmez la mort de l’animal par l’absence d’activité respiratoire, le réflexe coréal manquant et la miction sans stimuli externes.
  7. Effectuer une ponction cardiaque en introduisant avec précaution l’aiguille de la seringue préchargée EDTA avec un angle de 30 ° dans le thorax du sternum vers le cœur.
    Remarque: pour les expérimentateurs inexpérimentés, il est recommandé d’ouvrir la cavité thoracique d’abord, avant d’effectuer la ponction cardiaque, pour mieux visualiser le cœur.
  8. Récupérez jusqu’à 1 mL de sang. Sans relâcher le piston, sortez la seringue de la poitrine animale, enlevez l’aiguille en toute sécurité, ouvrez le couvercle du tube de prélèvement sanguin EDTA de 2 mL et distribuez le sang directement à l’intérieur. Fermez le couvercle et inversez le tube 10x.
  9. Incuber les tubes contenant du sang pendant une courte période (jusqu’à 1 h) à RT sur un agitateur à bascule à 40 OSC/min.
    ATTENTION: l’aiguille doit être éliminée dans l’élimination des dangers biologiques.
    Remarque: des perforations multiples sont possibles pour augmenter le volume sanguin total. Utilisez des seringues séparées préchargées avec de l’EDTA pour différents retraits afin d’éviter d’aspirer du sang coagulé présent dans l’aiguille précédente.
  10. Enrichir pour les CTCS uniques et les grappes de CTC en utilisant la méthode d’isolement CTCS de choix21,22,23,25. Libérez les CTCs dans une solution 1x DPBS.
    Remarque: selon la technologie d’enrichissement de CTC choisie, les globules blancs et les globules rouges restants pourraient être présents. Ajustez la pression de relâchement afin de préserver les structures du cluster CTC.
  11. Passez immédiatement à l’étape suivante de la section 3.
    Remarque: pour toutes les procédures suivantes, assurez-vous que le sang non fixe et fraîchement isolé est utilisé.

3. les CTCS immunocoloration en direct

  1. Centrifuger la suspension à cellules enrichie CTC à 72 x g pendant 4 min.
    Remarque: 72 x g correspond à 800 tr/min si le rotor a un diamètre de 100 mm. Convertissez le nombre g-force en fonction du rotor.
  2. Résuspendez doucement le culot en solution de 1% de BSA dans 1x DPBS et ajoutez 2 μg/mL d’anticorps anti-Human EpCAM-AF488 et 1 μg/mL d’anticorps anti-CD45-BV605 de l’homme ou 2 μg/mL d’anticorps anti-souris CD45-BV605 dans un volume total de 500 μL.
    NOTE: pour le cancer du sein, les CTCs dérivés du patient, l’EGFR-FITC anti-humain et le AF488 anti-humain peuvent être ajoutés en plus à l’anti-EpCAM et à l’Anti-CD45. Cela permet de mieux identifier les CTCs qui expriment des niveaux inférieurs d’EpCAM.
  3. Incuber pendant 30 min à RT et protéger de la lumière.
  4. Lavez la suspension CTCs à l’aide de 1 mL de 1% de BSA dans la solution 1x DPBS et centrifugation à 72 x g pendant 4 min. répéter ce lavage deux fois.
  5. Resuspendre les cellules colorées dans 2 mL de 1% de BSA dans la solution 1x DPBS et transférer le volume total dans 1 puits d’une plaque de fixation ultra-basse à 6 puits.
  6. Incuber la plaque pendant 10-15 min à 4 ° c à l’abri de la lumière pour permettre la sédimentation des CTCs et des cellules sanguines résiduelles.

4. micromanipulation des CTCs et prélèvement à une seule cellule

Remarque: avant de commencer, sachez que le micromanipulateur nécessite jusqu’à 45 min pour une mise en place complète. Une fois mis en place, la procédure d’identification et de micromanipulation CTC nécessite jusqu’à 2 minutes par cellule (ou grappe).

  1. Assurez-vous de mettre fin à la procédure de prélèvement CTC dans les 2 h à partir de la fin de la coloration.
  2. Démarrez le logiciel micromanipulateur et allumez le micromanipulateur. Raccordez le micromanipulateur à l’ordinateur et initialisez le bras robotique ainsi que le stade du microscope en appuyant sur le bouton Connect suivi d’un appareil int.
  3. Fermez l’armoire protectrice après chaque manipulation de la machine pour pouvoir la manœuvrer à travers l’ordinateur.
  4. Nettoyez les surfaces de la poussière et des déversements en pulvérisant de l’éthanol et en essuyant les surfaces internes de l’armoire. Un environnement propre assurera la stérilité du processus.
  5. Installez un nouveau capillaire en verre sur le bras robotique. Pour la cueillette à une seule cellule, utiliser un capillaire de 20-30 μm tandis que 30-50 μM est préférable pour le prélèvement de grappes CTC.
  6. Enlevez toutes les bulles présentes dans le tube en distribuant ou en aspirant l’huile du système.
    ATTENTION: le capillaire en verre est pointu et fragile. Manipulez avec prudence.
  7. Remplir le réservoir de stérilisation 1 avec 70% d’éthanol, le réservoir de stérilisation 2 avec H2O stérile sans nucléase et le réservoir tampon avec 1x DPBS stérile.
    ATTENTION: ne fermez pas les couvercles des réservoirs, car pendant les prochaines étapes, le capillaire devra accéder librement aux réservoirs.
  8. Stériliser le capillaire deux fois avec 70% d’éthanol.
  9. Remplacer le réservoir de stérilisation 1 par le réservoir 2 et laver le capillaire en H2O au moins trois fois en utilisant la fonction de stérilisation.
  10. En utilisant le logiciel micromanipulateur, démarrez une nouvelle expérience et choisissez le type d’expérience de prélèvement entre les modes de sélection automatique et manuel.
    Remarque: choisissez le type d’expérience en fonction du point final de la manipulation. Le mode manuel permet de manœuvrer un bras robotisé après que le capillaire pénètre dans la suspension cellulaire. Cette étape est nécessaire pour la dissociation des clusters CTC en cellules individuelles. Il est possible de changer le type de prélèvement au cours de l’expérience.
  11. Configurez le plateau de pont en spécifiant la position du réservoir de stérilisation (liquide 1), du réservoir tampon (liquide 2) et du bac de dépose (cible 1 ou 2). La cible 1 permet de déposer en plaques, la cible 2 permet de déposer dans des tubes PCR ou des plaques PCR.
  12. Réglez la température des réservoirs de liquide et du bac de dépose choisi à 4 ° c.
    Remarque: le processus de prélèvement peut prendre beaucoup de temps. Le refroidissement des réservoirs de liquide et du plateau de dépose est donc conseillé
  13. Positionner la plaque de fixation ultra-basse contenant la solution de CTCs libérée sous le microscope à l’intérieur de l’armoire du micromanipulateur. Retirez le couvercle de la plaque et fermez l’armoire. Conservez la plaque à RT pour le reste de la mise en place et Pendant la procédure de prélèvement.
  14. Sélectionner manuellement l’objectif du microscope pour la cueillette (10-20x) et le temps d’exposition de tous les canaux nécessaires (canaux Brightfield, FITC et TRITC).
  15. Sélectionnez afficher le navigateur de puits dans la barre d’outils pour visualiser et sélectionner le type de plaque de ramassage (plaque de 6 puits).
    Remarque: tout format de plaque ou de puits ne peut être installé que par le fabricant.
  16. Calibrer la position de ramassage au milieu du puits contenant la solution CTCs, mais sans cellules au centre du champ de vision. L’étalonnage effectué sur les bords des puits peut entraîner un étalonnage défectueux en raison d’une surface de puits inégale.
  17. Utilisez le capteur pour toucher doucement le fond de la plaque avec le capillaire (vitesse 0,01 mm/pas et 1% de vitesse).
  18. Réglez la position de ramassage 0,05 mm au-dessus du fond de la plaque.
    Remarque: Assurez-vous d’ouvrir et d’enlever les couvercles des plaques et des réservoirs avant de procéder. Le capillaire peut se briser sur un couvercle fermé ou non enlevé.
    ATTENTION: si le capillaire se brise au contact des couvercles, du verre cassé peut se trouver dans les environs ou dans les solutions.
  19. Sélectionnez le type de cellule et les paramètres de prélèvement. Le paramètre picking peut être configuré et chargé à chaque démarrage. Pour le prélèvement sur une seule cellule, sélectionnez le mode manuel.
  20. Dans les paramètres de préparation de prélèvement :
    1. Réglez le volume d’Air Gap entre l’huile du système et l’échantillon à 1 μl
    2. Réglez le volume de liquide tampon à prendre avant chaque prélèvement à 0,5 μl.
      Remarque: le volume du liquide tampon est ajusté au volume total maximum de ramassage. Les petits volumes n’affectent pas l’efficacité du prélèvement ou du dépôt.
    3. Réglez la Vitesse d’aspiration du liquide tampon entre 1-6%.
    4. Réglez le temps d’attente après l’aspiration de la mémoire tampon à 1 s.
      Remarque: la possibilité de prendre la mémoire tampon du puits cible au lieu du réservoir de liquide tampon peut être utilisée si nécessaire
    5. Réglez pour réutiliser les capillaires en verre et aucune stérilisation entre les pics.
      Remarque: la stérilisation entre les pics peut être effectuée manuellement si nécessaire. Effectuer plusieurs lavages en H2o entre les pics ou deux stérilisations dans l’éthanol suivis de plusieurs lavages en h2o.
  21. Dans les paramètres de prélèvement :
    1. Changez les réglages de la caméra pendant le prélèvement et le temps d’exposition sous le microscope à 7 500 μs.
    2. Sélectionnez hauteur de prélèvement fixe.
      Remarque: le capteur d’outil ou l’autofocus peuvent être choisis à la place. Cependant, les petites imperfections de la plaque peuvent perturber la sensibilité du capteur ou de l’autofocus qui peut provoquer un impact du capillaire dans la plaque.
    3. Réglez la Vitesse d’aspiration du capillaire entrant dans la plaque source à 7-15%.
    4. Activez la sélection interactive.
    5. Réglez le volume d’aspiration en μl sur 0-0,05.
    6. Réglez la Vitesse de l’aspiration à 5%.
    7. Réglez le temps d’attente après l’aspiration en s à 0-1.
    8. Réglez le nombre de particules prélevées par capillaire sur 1.
    9. Ne réglez aucun prélèvement multiple à la même position et sans fonctions de graissement . Les propriétés d’aspiration doivent être définies en fonction du type d’expérience (par exemple, le mode de prélèvement automatique peut nécessiter des volumes d’aspiration plus importants).
  22. Dans les paramètres de dépôt :
    Remarque: les paramètres de dépôt dépendent strictement de la plaque/du tube de dépose.
    1. Pour la cueillette à une seule cellule, définissez la Vitesse du capillaire entrant dans la plaque cible à 25%.
    2. Réglez la Vitesse de distribution à 6%.
    3. Réglez le temps d’attente après la distribution en s à 0.
    4. Réglez la quantité d’espace aérien distribuée dans le puits cible à 100%.
    5. Ne réglez aucun rinçage après le dépôt.
      Remarque: la stérilisation peut être effectuée après le dépôt pour nettoyer le capillaire.
    6. Définissez la quantité maximale de dépôts de particules par puits et le nombre de cibles pour répartir les particules sur 1.
    7. Calibrer la hauteur de dépôt sur la position a1 de la cible 1 pour les plaques ou sur la position a1 de la cible 2 pour les tubes. Placez un tube ouvert ou une plaque sans couvercle pour l’étalonnage et utilisez le capteur pour toucher doucement le puits de dépose (vitesse 0,01 mm/pas et 1% de vitesse). Réglez la hauteur de dépose 1 mm au-dessus du fond de la plaque.
  23. Dans les paramètres:
    1. Réglez la Vitesse de la scène pendant le prélèvement sur 5-10%.
      Remarque: les mouvements rapides de la plaque peuvent entraîner un mouvement des cellules en suspension et des difficultés de prélèvement de cellules multiples en raison d’un mauvais positionnement.
    2. Réglez les Propriétés de stérilisation en utilisant le volume de rinçage à 1 μl, 3 boucles de rinçage et 2 s de temps d’attente par cycle de stérilisation.
    3. Appliquez les modifications avant la fermeture.
  24. Naviguez le capillaire en verre en utilisant le joystick dans le puits et placez-le au-dessus de la cellule unique d’intérêt. Choisissez des positions de ramassage à une distance de sécurité de la bordure du puits (1 mm) car le capillaire peut se briser sur le bord du puits.
  25. Ajoutez manuellement des particules en utilisant le bouton du joystick ou en sélectionnant manuellement dans le menu.
  26. Sélectionnez choisir les particules activées pour commencer la cueillette.
  27. Le capillaire s’arrêtera à 0,05 mm au-dessus du bas de la plaque et au-dessus de la position de ramassage choisie en raison de la cueillette interactive (mode manuel). Tournez doucement le bouton du joystick dans le sens des aiguilles d’une montre pour aspirer manuellement la particule et la solution DPBS environnante. Le volume maximal n’est pas corrigé lorsque le mode manuel est allumé. Cependant, le volume maximum autorisé dans la seringue sera de 25 μL.
  28. Distribuez l’excès de solution DPBS ou de particules indésirables en tournant doucement le bouton du joystick dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Trop de dosage libérera l’espace aérien de la seringue formant des bulles dans votre solution et compromettant la visibilité.
  29. Appuyez sur Next pour procéder au dépôt.
  30. Observez le capillaire entrant dans le tube PCR de dépôt ou la plaque PCR, libérant le volume et repartant à la position de départ avec un capillaire vide.
    Remarque: s’il reste du volume dans le capillaire, procéder à la stérilisation. Puis, vérifiez à nouveau les paramètres, le niveau d’huile et la hauteur d’huile avant d’effectuer une nouvelle cueillette.
  31. Passez du point 26 de la section 4 pour commencer une nouvelle cueillette à une seule cellule. Pendant la cueillette, il peut être nécessaire de remplacer le capillaire. Après l’installation, un nouvel étalonnage de la position de ramassage doit être effectué. À la fin de l’étalonnage, sélectionnez la fonction appliquer les changements calibrés en hauteur Z à la hauteur de dépôt afin de corriger la hauteur de dépôt à la nouvelle calibration capillaire et de sauter l’étalonnage de la hauteur de dépôt (section 4,16).
    Remarque: les étapes décrites dans la section 1-4 s’appliquent à la plupart des méthodes d’enrichissement et d’isolement des CTCs. Ici, nous rapmettons des étapes facultatives pour une analyse CTCs spécifique.

5. prélèvement et ensemencement à une seule cellule pour l’analyse de la survie et de la prolifération

  1. Assurez-vous de travailler avec des solutions aseptiques et des matériaux pour maintenir la stérilité pendant toute la procédure.
  2. Préparer une plaque de puits 384 pour contenir les CTCs uniques prélevés pour la culture avec 20 μL de milieux de culture CTC31. S’assurer que les CTCs sont ensemencés en petits volumes du milieu après manipulation (p. ex., 10-20 μL pour une plaque de puits 384).
  3. Faites tourner la solution vers le bas de la plaque. Placer 384 plaque de puits dans la cible 1 et conserver à 4 ° c.
  4. Effectuer toutes les étapes avec le micromanipulateur décrit dans la section 4 pour mettre en place le micromanipulateur et commencer une nouvelle cueillette.
    Remarque: plusieurs sélections des cellules individuelles provoquera la formation d’une liste de prélèvement. Les particules seront cueillies et déposées une par une dans des puits consécutifs (voir la section 4.22.6). Cependant, le mode interactif (mode manuel) arrêtera le capillaire juste avant l’aspiration, permettant ainsi à l’expérimentat de contrôler cette étape critique et d’assurer une cueillette réussie. Des mouvements rapides de la plaque peuvent entraîner le mouvement des cellules en suspension et des difficultés dans la cueillette de cellules multiples.
  5. Après le dépôt, répétez l’étape 4 pour commencer une nouvelle cueillette.
  6. À la fin de la cueillette, Centrifugez la plaque à 72 x g pendant 4 min pour vous assurer que les cellules cueillies sont placées au fond du puits.

6. CTC rupture de cluster et prélèvement à une seule cellule pour le séquençage

  1. Assurez-vous de travailler avec des solutions aseptiques et des matériaux pour maintenir la stérilité pendant toute la procédure.
  2. Préparez des tubes PCR simples ou une plaque PCR qui contiendra les cellules individuelles de la grappe cassée avec la solution de lyse cellulaire totale de 2,5 μL comprenant 1 U/μL d’inhibiteur d’ARN.
  3. Détournez rapidement la solution vers le bas du tube. Placer les récipients de dépôt dans la cible 2 et conserver à 4 ° c.
  4. Effectuer toutes les étapes décrites dans la section 4 avec le micromanipulateur pour mettre en place le micromanipulateur.
  5. Commencez une nouvelle cueillette. Le capillaire s’arrêtera à 0,05 mm au-dessus de la partie inférieure de la plaque et au-dessus du cluster CTC sélectionné en raison de la cueillette interactive (mode manuel).
  6. Tournez doucement le bouton du joystick dans le sens des aiguilles d’une montre pour aspirer manuellement le cluster et la solution DPBS environnante. Distribuez le volume aspirés, y compris le cluster CTC, en tournant doucement le bouton du joystick dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
  7. Répétez l’aspiration/l’élimination du cluster CTC décrit à l’étape 6 jusqu’à ce que les cellules individuelles formant le cluster se séparent.
    Remarque: une distribution trop grande libère l’espace aérien de la seringue formant des bulles dans votre solution et compromettant la visibilité.
  8. Suivre à l’œil la position des cellules individuelles. Ajoutez manuellement les particules à l’aide du bouton du joystick ou sélectionnez-les manuellement dans le menu.
    Remarque: plusieurs sélections des cellules individuelles provoquera la formation d’une liste de prélèvement. Les particules seront cueillies et déposées une par une dans des tubes/puits de PCR consécutifs (voir la section 4.22.6). Cependant, le mode interactif (mode manuel) arrêtera le capillaire juste avant l’aspiration, permettant ainsi à l’expérimentat de contrôler cette étape critique et d’assurer une cueillette réussie.
  9. Sélectionnez choisir les particules activées pour commencer la cueillette.
    Remarque: la quantité de solution de lyse cellulaire permettra à une seule cellule de se lyser complètement. Cependant, une longue exposition du contenu lysé à l’agent de lyse peut dégrader l’ADN ou l’ARNm. Par conséquent, passez immédiatement à l’étape suivante.
  10. Fermez immédiatement le tube contenant la cellule individuelle choisie et transférez-le sur de la glace sèche pour le gel à pression.
  11. Tourner rapidement le tube et vérifier l’absence de gouttes sur les côtés du tube pour assurer une bonne lyse de la cellule déposée.
  12. Répétez l’étape 5 pour commencer une nouvelle cueillette.
    Remarque: l’étape du microscope se déplace d’une particule ajoutée à une autre à la vitesse décrite dans la section 4.23.1. La suspension de CTCs dans la plaque de fixation ultra-basse peut se déplacer, provoquant une mauvaise cueillette en raison d’un mauvais positionnement.

7. isolation CTCs pour l’injection de souris

  1. Assurez-vous de travailler avec des solutions aseptiques et des matériaux pour maintenir la stérilité pendant toute la procédure.
  2. Préparer un tube PCR avec 5 μL de DPBS stérile 1x.
  3. Détournez rapidement la solution vers le bas du tube. Placer les récipients de dépôt dans la cible 2 et conserver à 4 ° c.
  4. Dans les paramètres de dépôt , appliquez une modification à l’étape 4.22.6: définissez la quantité maximale de dépôt de particules par puits à 1 000 et le nombre de cibles pour répartir les particules sur 1. Cette étape garantit que les cellules cueillies seront déposées dans le même tube pendant 1 000 fois.
  5. Utilisez uniquement le mode interactif (mode manuel) pour contrôler précisément l’étape de prélèvement et garder la solution choisie sans les cellules de contaminants.
    Remarque: si plus de 1 000 cellules sont nécessaires, augmentez le nombre de cibles pour répartir les particules afin d’éviter la perte d’échantillon après 1 000 cellules.
  6. Continuez les étapes de la section 4,26 pour commencer une nouvelle cueillette. Répétez l’étape 6 pour effectuer plusieurs pics. Annotez le nombre de cellules collectées à chaque prélèvement afin de garder une trace du nombre de cellules disponibles pour l’injection de souris.
  7. À la fin de la cueillette, centrifuger le tube à 72 x g pendant 4 min (voir section 3,1.) et aspirer le surnageant.
  8. Resuspendre les CTCs collectés dans le tampon de choix, adapté à l’injection de souris. Pour l’injection de graisse mammaire, Resuspendre les CTCs collectés dans un rapport de 1 à 1 de 1x DPBS et de la membrane de socle reconstitué extraite, et conserver à 4 ° c jusqu’à l’injection. Pour l’injection intraveineuse, Resuspendre les CTCs collectés dans DPBS seulement.
    Remarque: le volume de la solution dépend strictement du nombre de CTCs qui seront injectés. Il est conseillé d’injecter dans le tampon de graisse mammaire ou par voie intraveineuse un maximum de 100 μL par souris. Lors du calcul du volume, considérez toujours le volume mort pour la manipulation et le chargement de la seringue.

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Representative Results

Le workflow présenté permet la préparation de CTCs individuels, soit à partir de CTCs uniques, soit séparés des clusters CTC. Les CTCs des patients ou des souris porteuses de tumeurs sont enrichis de sang total avec les méthodes d’enrichissement de la CCT disponibles, puis colorées avec des anticorps dirigés contre des marqueurs associés au cancer (p. ex., EpCAM, vert) et des marqueurs spécifiques à la WBC (p. ex., CD45, rouge) (figure 1a ). Le produit teinté de CTC est ensuite transféré à la station de micromanipulation étaient des cellules individuelles sont cueillies, déposées dans des tubes de PCR ou des plaques multipuits et préparées pour l’analyse en aval, y compris le séquençage à une seule cellule, la culture in vitro ou essais in vivo (figure 1b).

La fiabilité de cette méthode repose sur une distinction appropriée entre les cellules cibles lors de la cueillette manuelle des cellules. L’immunostalisation en direct avec des anticorps anti-EpCAM visualise les cellules cancéreuses dans la suspension et permet une distinction exacte des événements CD45-positifs (très probablement, WBCs) (figure 2a). Lorsqu’il est correctement calibré et entretenu, CellCelector fournit une manipulation de cellules bien contrôlée. L’isolement précis de CTC est caractérisé par l’aspiration de seulement la cible désirée sans les cellules de contaminant environnantes (RBCs ou WBCs), comme indiqué sur les images prises avant et après l’aspiration de grappe de CTC (figure 2b, C).

Comme décrit précédemment, les clusters CTC affichent un phénotype plus métastatique comparé à un CTCs unique19apparié. Pourtant, si la présence de cellules voisines est suffisante pour augmenter le taux de prolifération des cellules dans les grappes est inconnue. Afin de répondre à cette question, 1009 des grappes de CTC et 1008 de CTC uniques variant entre 2-17 cellules (89,5% d’entre elles étant 2-5 grappes cellulaires) dérivées de la lignée de cellules BR16 dérivée de la CCT20 ont été micromanipulées dans des puits individuels de 384-puits plaques de fixation ultra-basses. Le nombre de cellules vivantes dans chaque puits a été compté manuellement sous le microscope et enregistré chaque semaine. Toutes les analyses ont été effectuées après la normalisation du nombre de cellules (c.-à-d., le groupe à trois cellules a été analysé comme trois cellules individuelles). Les colonies infructueuses ont été caractérisées par le manque de cellules vivantes dans le puits à la fin de l’expérience. Comme on le soupçonne, les grappes de CTC ont montré une survie accrue comparativement aux CTCs uniques et ont donné lieu à des colonies cellulaires dans les 56 jours suivant la culture in vitro (figure 3A, 3b). En particulier, les grappes de CTC ont également montré un taux de prolifération plus élevé et ont ainsi atteint des nombres cellulaires finaux plus élevés (figure 3C), ce qui indique que le contact direct avec d’autres cellules tumorales a un impact sur leur viabilité et leur taux de prolifération.

Enfin, nous fournissons des données de séquençage ARN à une seule cellule des CTCs directement isolés des patients atteints de cancer du sein. En particulier, nous montrons une incorporation de voisin stochastique distribué en t (tSNE) de cellules individuelles dérivées de CTCs uniques, de grappes CTC ou de grappes CTC-WBC (figure 4). Cette approche permet l’identification des cellules avec un profil d’expression génique similaire, ainsi que la distinction des populations cellulaires qui diffèrent en fonction de l’expression de gènes particuliers.

Figure 1
Figure 1 . Représentation schématique du workflow expérimental. (A) les CTCS sont obtenus à partir du sang des patients cancéreux ou des modèles de cancer de la souris, enrichis en utilisant les méthodes disponibles et étiquetés avec des anticorps pour discriminer les cellules tumorales (vert) des globules blancs (rouge). (B) la micromanipulation précise des CTCS facilite plusieurs procédures et applications, par exemple le séquençage à une seule cellule, la culture CTC ou des expériences de transplantation in vivo . S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
La figure 2 . Images représentatives des CTCs avant et après la micromanipulation. A) des images représentatives de CTCS dérivées d’une xénogreffe dérivée de la CCT (NSG-CDX-BR16) et colorées avec des anticorps anti-EpCAM (vert) et anti-CD45 (rouge) pour permettre la visualisation des CTCS et des globules blancs, respectivement. Grossissement 40x est affiché. (B, C) La micromanipulation permet la séparation précise des CTCs des cellules indésirables comme indiqué dans les images avant (gauche) et après (droite) la procédure d’aspiration cellulaire. Grossissement 10x. Le champ de vision plus large (B) et le champ de vision plus étroit (C) sont affichés, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 3
Figure 3 . Analyse de la survie et de la prolifération des CTCs et des grappes de CTC uniques. Des cellules individuelles de CTCs uniques ou de grappes de CTC provenant de cellules BR16 dérivées de CTC cultivées ont été micromanipulées en plaques de puits de 384. (A) diagramme de Kaplan-Meier montrant la probabilité de survie des cellules individuelles ensemencées par rapport aux grappes cellulaires. P< 0,0001 par pairwise log-Rank test. (B) graphique à barres représentant la proportion de colonies composées de cellules vivantes à la fin de l’expérience (jour 56). P< 0,0001 par test Chi-Square. (C) heatmaps visualisant la distribution normalisée des numéros de cellules au cours de l’expérience (jour 0, 8, 32, 56). Chaque bloc représente une cellule de départ et la carte thermique affiche le nombre de cellules par puits à un point de temps donné. d = jour. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 . Séquençage d’ARN à une seule cellule. Visualisation des données d’expression d’ARN CTC utilisant l’incorporation de voisin stochastique distribué par t (tSNE). Chaque point représente une seule cellule dérivée d’un seul CTC, d’un cluster CTC ou d’un cluster CTC-WBC. Les couleurs des points correspondent à l’ID du donneur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La caractérisation moléculaire des CTCs tient la promesse d’améliorer notre compréhension du processus métastatique et de guider le développement de nouvelles thérapies anti-métastases. Ici, nous fournissons une description détaillée de ces protocoles qui permettent la micromanipulation de CTC et l’analyse en aval, y compris les essais fonctionnels à base de cellules uniques, l’analyse d’expression génique et la transplantation in vivo pour le potentiel métastatique l’évaluation20.

Parmi les étapes les plus critiques de notre protocole, la micromanipulation des produits enrichis en CTC vise à obtenir une résolution de cellules uniques provenant de suspensions cellulaires relativement hétérogènes, c’est-à-dire permettant d’atteindre les plus hauts niveaux de pureté et d’améliorer la qualité des analyses fonctionnelles ou moléculaires ultérieures. Par exemple, la cueillette d’une seule cellule de CTCs a permis à nous et à d’autres d’enquêter sur l’hétérogénéité de la CCT (p. ex., les différences entre les CTCs uniques, les grappes de CTC et les grappes CTC-WBC), tant du point de vue moléculaire que du point de vue de la capacité d’évaluer capacité d’initiation des métastases. Bien que nous privilégions généralement les protocoles de prélèvement de cellules qui permettent à l’expérimentat d’isoler manuellement les CTCs (c.-à-d. en permettant un degré plus élevé de flexibilité en fonction des caractéristiques des cibles individuelles), des solutions automatisées sont maintenant disponibles pour faciliter la cueillette des cellules et d’accélérer le processus d’isolement de la CCT dans des expériences bien contrôlées.

Lors de l’examen de la micromanipulation à cellule unique dans le contexte de l’analyse CTC, le temps est un facteur limitatif très critique. Étant donné que notre protocole est destiné à être conduit sur des cellules vivantes, il est impératif de procéder aussi vite que possible pour minimiser les changements dus à l’environnement ex vivo, tels que l’régulation positive ou la rétrorégulation des gènes qui dépendent du contexte. Par rapport aux techniques existantes pour l’analyse de CTC, la micromanipulation à une seule cellule des CTCs vivants offre une plus grande souplesse pour l’analyse de choix en aval, allant du séquençage des cellules individuelles aux essais fonctionnels directs.

Dans ce manuscrit, nous fournissons également de nouvelles données qui mettent en évidence des différences importantes entre les CTCs simples et en clusters par micromanipulation et ensemencement de plus de mille grappes de CTCs ou CTC uniques (avec une taille clairement définie) à partir d’une lignée de cellules dérivée de la CCT dans des puits individuels d’une plaque de microtitration. Premièrement, nous observons que les grappes de CTC (c.-à-d. la présence de cellules voisines) sont suffisantes pour obtenir de meilleurs taux de survie des cellules ensemencées, soutenant nos données in vivo suggérant des taux apoptotiques inférieurs des grappes de CTC lors de l’ensemencement à un site éloigné 19. en outre, même lors de la normalisation du nombre de cellules ensemencées, les cellules cancéreuses cultivées en grappes affichent des taux de prolifération beaucoup plus élevés, renforçant encore le concept selon lequel les CTCs groupés sont des contributeurs hautement efficaces de métastase.

Ensemble, nous présentons des protocoles spécifiques pour l’analyse de la CCT dans le but de promouvoir des enquêtes sur une seule cellule dans le domaine de la CCT. À l’avenir, nous prévoyons que ces protocoles pourraient être utiles pour les enquêtes liées à la CCT, visant à une meilleure compréhension de la biologie qui caractérise les métastases transmises par le sang dans divers types de cancers.

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Disclosures

N.A. et B.M.S. sont répertoriés comme inventeurs dans les demandes de brevet qui se rapportent aux cellules tumorales circulantes et au traitement du cancer. N.A. est un consultant rémunéré pour les sociétés pharmaceutiques et d’assurance ayant un intérêt dans la biopsie liquide.

Acknowledgments

Nous remercions tous les patients qui ont donné du sang pour notre étude, ainsi que tous les cliniciens impliqués et les infirmières d’étude. Nous remercions Jens Eberhardt, Uwe Birke et Dr. Katharina Uhlig de la SLA Automated Lab Solutions GmbH pour leur soutien continu. Nous remercions tous les membres du laboratoire Aceto pour leurs commentaires et discussions. La recherche dans le laboratoire Aceto est soutenue par le Conseil européen de la recherche, l’Union européenne, la Fondation nationale suisse des sciences, la Ligue suisse contre le cancer, la Ligue du cancer de Bâle, les deux cantons de Bâle par l’ETH Zürich et l’Université de Bâle.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human EpCAM-AF488 Cell Signaling Technology CST5198 clone: VU1D9
1X DPBS Invitrogen 14190169 no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate Corning 3471
Anti-human CD45-BV605 Biolegend 304041 clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC  GeneTex GTX11400 clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488  Biolegend 324410 clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605 Biolegend 103139 clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA BD 366643 for human blood collection
Cell Celector ALS CC1001 core unit 
CellD software ALS version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 R&D Systems 3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA Sarstedt 41.3395.005 for mouse blood collection
PCR tubes Corning PCR-02-L-C
RLT Plus Quiagen 1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor Thermo Fisher AM2696  1 U/µL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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