בידוד אמין של מערכת העצבים המרכזית מיקרואוניות על פני חמש קבוצות בעלי חוליות

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את כלי המיקרו מאזורים מרובים של מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות lissencephalic וגירנאריים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M. L., Dorflinger, B. G., Cruz-Orengo, L. Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups. J. Vis. Exp. (155), e60291, doi:10.3791/60291 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

בידוד של כלי מיקרו ממערכת העצבים המרכזית (CN) מבוצע בדרך כלל על ידי שילוב של רקמה קורטיקלית מבעלי חיים מרובים, לרוב מכרסמים. גישה זו מגבילה את חקירת מחסום הדם-מוח (BBB) לקליפה ואינה מאפשרת השוואה אישית. פרויקט זה מתמקד בפיתוח של שיטת בידוד המאפשר השוואה של יחידת נוירונימי (NVU) מאזורים מרובים של ה-CN: קליפת המוח, המח האופטי, האונה האופטית, ההיפותלמוס, בלוטת יותרת המוח, בראש וחוט השדרה. יתר על כן, פרוטוקול זה, שפותחה במקור עבור דגימות murine, הותאם בהצלחה לשימוש ברקמות המוח מפני מינים קטנים וגדולים של בעלי חוליות שמהם אנו גם מסוגלים לבודד כלי מיקרו מתוך מערכת האונה הלבנה חומר לבן. שיטה זו, כאשר היא משויכת לאימונואולבלינג, מאפשרת כימות של ביטוי חלבונים והשוואה סטטיסטית בין אנשים, סוג רקמה או טיפול. הוכחנו את הישימות הזאת על ידי הערכת שינויים בביטוי החלבון במהלך הencephalomyelitis הנסיוני הניסיוני, מודל murine של מחלה נוירודלקתית, טרשת נפוצה. בנוסף, כלי מיקרו מבודדים על ידי שיטה זו ניתן להשתמש עבור יישומים במורד כמו qPCR, RNA-seq, ואת האבן המערבית, בין היתר. למרות שאין זה הניסיון הראשון לבודד את כלי המיקרו-מיקרו-משתמשים ללא שימוש בדיסוציאציה האוטרטית או אנזימטית, היא ייחודית באופן מיוחד להשוואת אנשים יחידים ולאזורי ה-CN המרובים. לפיכך, היא מאפשרת חקירה של מגוון של הבדלים שעשויים אחרת להישאר מעורפל: מנות CN (קליפת, המוח התחתון, האונה האופטית, גזע המוח, ההיפותלמוס, בלוטת יותרת השדרה), סוג של רקמת CN (חומר אפור או לבן), אנשים, קבוצות טיפול ומינים ניסיוניים.

Introduction

המוח שלנו הוא האיבר. החשוב ביותר בגופנו מסיבה זו, שמירה על הומאוסטזיס המוח למרות גורמים חיצוניים שעלולים לעורר סטייה מנורמליות היא עדיפות. על פי כמה חוקרים, כ 400-500 מיליון שנה לפני1, בעלי חוליות פיתחו את מה שאנחנו יודעים כעת כמכשול הדם במוח (bbb)2,3. זה "גדר" המגן מפעילה את ההשפעה הגדולה ביותר על פני מערכת העצבים המרכזית (CN) הומאוסטזיס ופונקציות על ידי ויסות היטב את ההובלה של יונים, מולקולות, תאים בין דם לבין המערכת המרכזית של ה-CN. כאשר BBB מופרת, המוח הופך להיות פגיע חשיפה רעילה, זיהום, ודלקת. לפיכך, bbb בתפקוד משויך רבים, אם לא כולם, הפרעות נוירולוגיות התפתחותית נוירולוגית4,5,6.

הפונקציה המתוחכמת של bbb מיוחסת למערכת העצבים הייחודית של היחידה לנוירוכלי (nvu)2,3. תאים אנדותל מיוחדים מאוד, קרום הלב, ו astrocytic הרגליים הקצה הם הרכיבים הסלולריים של nvu2,3. מטריקס החילוץ שנוצר על ידי תאים אלה הוא גם חיוני הפיזיולוגיה של nvu ו bbb2,3. למרות שרכיבים סלולאריים ומולקולריים חיוניים של nvu נשמרים בין החוליות, טרוגניות מדווחת בקרב הזמנות ומינים7,8. עם זאת, מגבלות טכניות לעכב את היכולת שלנו לשקול באופן מלא את ההבדלים הללו בנוירוביולוגיה, ביו-רפואית, או מחקר הטרנסלבותית.

בגלל זה, הרחבנו את האזור בידוד מיקרוכלי ספציפי שיטה ספציפית כדי להפוך אותו לרלוונטי למינים רבים מכל חמשת קבוצות בעלי החוליות: דגים, דו-חיים, זוחלים, ציפורים ויונקים. הפרוטוקול מתואר לשימוש בחוליות lissencephalic קטנות וגדולות, כולל מינים עם רלוונטיות טרנסלתית9. בנוסף, אנו כוללים אזורים אחרים של ה-CN שאינם נחקרים לפני בהקשר זה, אלא רלוונטיים לנוירופיזיולוגיה ועם השלכות קליניות עצומות: ההיפותלמוס, יותרת המוח והחומר הלבן. לבסוף, בדקנו את היכולת של שיטת בידוד זו ככלי אמין כדי לזהות שינויים בביטוי החלבון לאורך nvu ו/או bbb9,10,11. כהוכחה למושג, הצגנו כיצד לקבוע שינויים בביטוי VCAM-1 ו-JAM-B במהלך השנה, תוך שימוש בשיטת הבידוד ולאחריה immunofluorescence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים של המחקר הנוכחי הם בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי אוניברסיטת קליפורניה (UC), דיוויס מוסדיים טיפול בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC). טיפול בעלי חיים ב-UC דייוויס מוסדר על ידי מספר משאבים עצמאיים, כבר מוכר באופן מלא על ידי האגודה להערכת והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים הבינלאומי (AAALAC) מאז 1966. רקמות המין העצמי הושגו ממחלקת UCD של מדעי החי, המעבדה למדעי הבשר. רקמות ה-CN של רזוס קופי מאני התקבלו מהמחלקה לחקר הפרימטים הלאומית של קליפורניה (NIH P51OD011107). ללא הרדמה, המתת חסד או נמק בוצע על ידי צוות מעבדה על חזירים ומקופי. לכן אין המלצות מיוחדות לגבי הנושאים הללו.

הערה: שיטה זו אומתה עבור מינים מרובים, אך הפרוטוקול שסופק מתאים יותר ישירות לרקמות העכבר והפורצין. הפרטים הנוגעים לאונה האופטית אינם תקפים בעת שימוש בדגימות של יונקים. כל החומרים הביוסוכנים חייבים להיות מטופלים במתקן ביולוגי ברמת בטיחות (BSL) מתאים. יש לטפל בחומרים רעילים. מתחת למכסה המנוע כל הפסולת הרפואית הביומסוכנת והפסולת הרעילה חייבים להיות מושלך כראוי.

1. הכנה

  1. הכינו פתרונות (שולחן 1) לפחות יום אחד קדימה.
    הערה: קשה מאוד לפזר 70 משקל מולקולרי kDa (MW) dextran. יעיל יותר לאפשר לפתרון לערבב בין לילה מכוסה בסרט פרפין או בנייר. הפרוטוקול דורש את השימוש שני פתרונות MV-2 שונים בהתאם לדגימה תחת חקירה. ב 18% תוספי מפריד ביעילות את המיאלין מן הגלולה microvessel יקרוכלי בעת ביצוע הפרוטוקול על דגימות קטנות lissencephalic. עם זאת, היא מפתחת הכתם של המיאלין בתוך הממשק של רקמות ה-CN של דגימות גדולות, כמו גם את ההיפותלמוס ואת יותרת ההיפופיזה מדגימות קטנות. הכתם הזה מונע על ידי שימוש ב -20% דקטרן.
  2. להכין היטב שקופיות על ידי טעינת 50 μL לכל טוב של פולי ליזין ולתת יבש 2 h בטמפרטורת החדר (RT), רצוי בארון בטיחות ביולוגית-class 2 (תואר שני). . אל תייבש יותר מדי שטפו פעמיים בתמיסת מלח (PBS) ושמרו במקרר עד שהוא מוכן לשימוש.

2. מערכת הניתוח לחיתוך רקמות של Lissencephalic קטן בעלי חוליות הדגימה

הערה: המאמר מדגים את יישום הפרוטוקול על C57BL6/J, בן 10 שבועות, ~ 25 g, עכבר זכר.

  1. הכינו 2 15 מ"ל שפופרת חרוטי ו 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה עם 5 מ"ל ו 1 mL, בהתאמה, של הפתרון MV-1 לכל דגימה. . שמרו על הצינורות בקרח
  2. הרדמה
    1. עכברים מורדם על ידי הזרקה תוך הצפק של קטמין, xylazine, ו-איזופרומאזין קוקטייל הרדמה ב 100/10/3 mg למשקל משקל הגוף ותרסיס עם 70% אתנול. לאשר הרדמה על ידי הערכת העדר palpebral ו הדוושה רפלקסים על ידי נגיעה בעין וצובט רגל, בהתאמה.
    2. באמצעות קופסת הרדמה. מהאינדוקציה
    3. דגים וצפרדעים מורדם ב 1% Tricaine ב דג מחזיק מיכל מים או הפתרון של המצלצל אמפיבי (טבלת חומרים), בהתאמה.
    4. לטאות מורדם על ידי קירור ב 4 ° צ' לפני המתת חסד.
  3. ראשו של בעל החיים במספריים מנתחים, מקלף את העור בעזרת מלקחיים כדי לחשוף את הגולגולת, ולחתוך עם מספריים לגראנז ' דרך מגנום הפוראמאן (איור 1א).
  4. לנתח את המוח עם מרית ולהעביר לצינור 15 מ"ל עם פתרון MV-1. . שמור על הקרח
  5. לאחזר את בלוטת יותרת המוח של סלה turcica של הגולגולת עם מלקחיים והעברה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 mL עם פתרון MV-1. . שמור על הקרח
  6. להסיר את העור ואת השריר כדי לחשוף את העמודה החוליות. חותכים את הגפיים, כלוב הצלעות והאברים הפנימיים (איור 1ב).
  7. לנתח את חוט השדרה באחת משתי השיטות המתוארות להלן. לאחר מכן, העבר לצינור החרוט של 5 מ"ל עם פתרון MV-1. . שמור על הקרח
    1. לבצע כריתת למינציה על ידי גזירה rostral לכיוון caudal עם מספריים לגראנז ', החל דרך החוליה הצווארי של החוליות, עד להגיע חוט המותניים.
    2. לבצע השטיפה ב caudal לכיוון rostral ברחבי החוליה המותני השדרה עם המחט 18 G ו 10 mL מזרק טעון עם MV-1 פתרון (איור 1ג, ד).
      הערה: שיטה זו פועלת רק עם דגימות קטנות מאוד, בעיקר מכרסמים (< 100 גרם).
  8. באמצעות היקף מבתר, לחתוך את ריר sac מן חוט השדרה עם מספריים באביב ולהסיר את הקרום הנותר עם בחירת כפול (איור 2).
  9. מעבירים את המוח לצלחת פטרי, ומשתמשים בהיקף מבתר, מסירים את הקרום בעזרת בחירת כפולה (איור 2א – ג).
  10. בלו את מנורות הריח והתלמוס עם מלקחיים, מספריים איריס ומספריים באביב. הסרת מקלעת הדמית. מכל חללי המוח הקפד להסיר את כל מקלעת ה-דמית.
    הערה: מקלעת כוראיד ונורות הריח הם מקור מסיבי של זיהום. בניגוד BBB, נימים אלה הם מאוד מדורגים ואת התוצאות של הניסויים הבאים יהיה להתפשר אם הם לא יוסרו.
  11. באמצעות מלקחיים, הפרד את אזורי ה-CN הנפרדים: קליפת, מוח מוחי, גזע המוח, האונה האופטית (לא על דגימות היונקים) וההיפותלמוס.

3. ניתוח רקמות המעי הגבוה מדגימה של בעלי חוליות

הערה: פרוטוקול זה משתמש ברקמות שהתקבלו מ-חזירי מתוך מטבחיים. לכן, לא מתואר הרדמה, המתת חסד, או נקרופסי, או מוצג כאן.

  1. הובלה ברקמות הגוף ב 0.946 L (32 עוז) היסטולוגיה מיכל טעון עם MV-1 פתרון בתוך חזה קרח/דלי.
  2. באמצעות היקף הניתוח, להסיר את קרום העור עם בחירת כפול, מלקחיים, מספריים איריס, ומספריים באביב מכל רקמת השיטה. הקפד להסיר את כל החלקים של מקלעת דמית מן החדרים המוח.

4. מערכת העור המהומוזציה

הערה: הדבר יעיל יותר כששני חוקרים עוסקים בתהליך ההעצמה: האחד מבתר את הקרום מתחת לסטריאוסקופ והשני הומוגניזציה של הרקמות הטחון. בדרך זו, הרקמות מוחזרות במהירות לדלי הקרח ושמרו על קור.

  1. מניחים כל אזור מערכת התחתית על צלחת פטרי עם ~ 1 mL של פתרון MV-1. באמצעות להב חד הקצה, הבשר את הרקמה להשיג 1 – 2 מ"מ חתיכות.
    1. עבור דגימה קטנה בעלי חוליות, השתמש בצלחת פטרי של 100 מ"מ x 20 מ"מ.
    2. עבור דגימה גדולה בעלי חוליות, השתמש בצלחת פטרי של 150 מ"מ x 15 מ"מ.
  2. הומוגון של דוגמית בעלי חוליות קטנה (שולחן 2 ושולחן 3)
    1. העבר את קליפת המוח, המוח העצמי, גזע המוח, העין האופטית, חוט השדרה כדי ~ 1 mL של פתרון MV-1 בודד 10 mL פוטר-Elvehjem מטחנת רקמת זכוכית עם מצופיסל באמצעות העברת צנרת. הוסף 5 מ ל של פתרון MV-1 והמגון כל רקמה (~ 10 משיכות). העברה לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מ ל . שמרו על הצינורות בקרח
      הערה: עבור בעלי חוליות קטנות, 5 או 4, עם או בלי האונה האופטית, בהתאמה, 10 mL-Elvehjem מטחנות ו 15 מ"ל שפופרות חרוט נדרשים.
    2. העבר את ההיפותלמוס ואת יותרת ההיפופיזה עם מלקחיים ל ~ 100 μL של הפתרון MV-1 בתוך שפופרת בודדת 1.7 mL והומוהגון בזהירות עם מיקרופטסל זכוכית. לשטוף כל מיקרופטסל עם ~ 1 mL של פתרון MV-1. . שמור על הקרח
      הערה: עבור בעלי חוליות קטנות, 2 מיקרופטני זכוכית ו-1.7 מנורות mL נחוצים.
  3. הומוגון של דגימה גדולה של בעלי חוליות (טבלה 4 ושולחן 5)
    1. באמצעות פיפטה העברה, להעביר את הרקמה הטחון לתוך מטחנת רקמת זכוכית 55 mL-Elvehjem עם מצוסל ולהצמיד לתקורה. הוסף מחצית מכמות הנפח המומלצת של פתרון MV-1, בהתאם לחלק ה-CN הספציפי המהווה הומוגניים (טבלה 5).
    2. הפעל את התקורה במהירות נמוכה מאוד (~ 150 rpm) ובזהירות להזיז את צינור הזכוכית למעלה ולמטה עבור כ 30 s.
    3. בטל את השטירר, הוסף פתרון MV-1 וחזור על שלב ה4.3.2 עד לקבלת שאיפה אחידה.
    4. העברה לשפופרת חרוט ב50 mL. . שמור על הקרח
    5. שטוף את המטחנה במים מפוהים. בין כל רקמת העור
      הערה: עבור בעלי חוליות גדול 5 או 4, עם או בלי חומר לבן, בהתאמה, 50 mL הצינורות חרוט נדרשים. כמו כן, 2 (2) 15 מ ל שפופרות חרוט נדרשות עבור ההיפותלמוס ואת יותרת הבלוטת.

5. טיהור מיקרוכלי

  1. רקמת צנטריפוגה הומומטר כתוצאה משלב 4.2.1, 4.2.2, או 4.3.4 ב 2,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. ממשק לבן גדול של המיאלין יהיה ליצור על גבי כדורי מיקרולים אדמדם. . להיפטר מהסופרנטנמלים
    1. דוגמית בעלי חוליות קטנות (טבלה 2 ושולחן 3)
      1. השהה מחדש את קליפת המוח, המוח השני, גזע המוח, האונה האופטית וכדורי חוט השדרה ב-5 מ ל של תמיסת הקרח-2-הקרה-מיטה עם פיפטה של 5 מ"ל (~ 10 הריקות). הוסף 5 מ ל של הקרח קר MV-2 פתרון לכל השעיה ולערבב בזהירות על ידי היפוך הצינורות.
      2. השהה מחדש את ההיפותלמוס ואת כדורי יותרת ההיפופיזה עם 1 מ ל של פתרון MV-2.
    2. דגימה גדולה של בעלי חוליות (שולחן 4 ושולחן 5)
      1. הוסף 20 מ ל של הקרח קר MV-2 פתרון לקליפת המוח, מוח מוחי, גזע המוח, וכדורי השדרה microvessel מיקרושוט. השהה מחדש את כדורי על ידי ערבוב על האקדח שייקר שפופרת, ערבוב ב 40 rpm עבור ~ 5 דקות. איזון הכרכים של צינורות חרוט של קליפת המוח, המוח השני, גזע המוח, ואת השעיה חוט השדרה על ידי הוספת יותר MV-2 פתרון.
      2. השהה מחדש את ההיפותלמוס ואת כדוריות יותרת ההיפופיזה ב-5 מ ל של פתרון MV-2 עם פיפטה של 5 מ"ל (~ 10 הריקות). הוסיפו 5 מ ל של תמיסה בקירור-2-ice להשעיות וערבבו בזהירות על ידי היפוך הצינור.
  2. צנטריפוגה ב 4,400 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
  3. נתק בזהירות את שכבת המיאלין העבה והצפופה על הממשק הנוזלי מקירות הצינור על ידי הסתובבות איטית של הצינורות והתרת הסופרנטאנט לעבור לאורך הקירות.
  4. התעלם מממשק המיאלין והנוזל וכבה את הקיר הפנימי של כל צינורית עם מרית עטופה במטלית נייר נמוכה. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות, הסר את שכבת המיאלין מכל ההיפותלמוס ומצינור יותרת ההיפופיזה על-ידי העברת הסדר בזהירות עם פיפטה העברה.
  5. תמחק את הנוזלים העודפים. עם מגבון מעוות בנייר נמוך השהה מחדש כל גלולה בעלת 1 מ ל של פתרון MV-3 באמצעות עצות בכריכה נמוכה. . שמרו על הצינורות בקרח

6. הללויה וסינון מיקרוכלי

  1. שופכים את תמיסת MV-3 הקרה בתוך כוסות בודדות עבור כל אזור הcn. שמרו על 4 ° c.
    1. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות, השתמש ב-10 mL של פתרון MV-3 לכל 50 mL. סך של 6 – 7 כוסות הוא הכרחי בהתאם אם האונה האופטית כלולה.
    2. עבור דגימות בעלי חוליות גדולות, השתמש 30 mL של פתרון MV-3 לכל 100 מ"ל גביע. סך של 6 – 7 ספלים כוסות הוא הכרחי, תלוי אם החומר הלבן כלול.
  2. מניחים מסננת תא על גבי צינורית חרוט 50 mL. השתמש באחד לכל אזור של מערכת השניה. השתמש מסננת 100 יקרומטר עבור הקליפה, גזע המוח, האונה האופטית, חוט השדרה, ובלוטת היותרת. השתמש מסננת תא 70 יקרומטר עבור המוח ההמח וההיפותלמוס.
  3. רטוב כל מסננת עם 1 מ ל של הקרח קר MV-3 פתרון.
  4. הוסף יותר מענה MV-3 לשעיות המוכנות בשלב 5.5 עם פיפטה סרוולוגית תוך ערבוב כדי להימנע מאגרגטים. בזהירות לטעון מיקרואוניות על גבי מסננת. לשטוף עם תמיסת MV-3 קר-קרח.
    1. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות (טבלה 2 ושולחן 3), הוסף 10 – 15 מ ל של התמיסה mv-3 עם פיפטה סרוולוגית ולשטוף עם 5 מ ל של פתרון mv-3.
    2. עבור דגימות של בעלי חוליות גדולות, להוסיף 20 מ ל של הפתרון mv-3 עם הצנרת סרולוגית ולשטוף עם 10 מ ל של פתרון mv-3.
  5. להרכיב את יחידת הסינון על ידי הצבת מסנן ניילון 20 יקרומטר נטו על מחזיק מסנן שונה (איור 2ד), אחד לכל אזור במערכת.
    1. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות (טבלה 2 ושולחן 3), השתמש במחזיקי מסנן שעברו 25 מ"מ עבור קליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח, האונה האופטית וחוט השדרה. השתמש 13 מ"מ מחזיקי מסננים שונה עבור ההיפותלמוס ואת יותרת הבלוטת.
    2. עבור דגימות בעלי חוליות גדולות (טבלה 4 ושולחן 5), השתמש 47 mm שונה מחזיקי מחזיק הקליפה, מוח מוחי, גזע המוח, ואת חוט השדרה. השתמש ב -25 מ"מ עבור. ההיפותלמוס ויותרת הבלוטת
  6. מסנן במקום על גבי צינור 50 mL ו מסנן רטוב עם 5 מ ל של הקרח קר MV-3 פתרון לוודא מאגר הופך את מחזיק המסנן לצינור חרוט.
  7. להעביר את המיקרוכלים מיקרו (משלב 6.4) על גבי מסנן 20 יקרומטר ניילון נטו לשטוף את המיקרוכלים עם 5 – 10 מ ל של הקרח קר MV-3 פתרון.
  8. לשחזר את המסנן באמצעות מלקחיים נקיים לטבול אותו בגביע המכיל את הקרח קר MV-3 פתרון מוכן בשלב 6.1.
  9. נתק את המיקרוכלים מהמסנן על ידי ניעור בעדינות במשך 30 ס מ. לדגימות של בעלי חוליות קטנות, יוצקים את תוכן הגביע בשפופרת חרוט של 15 מ ל. לדגימות של בעלי חוליות גדולות, יוצקים את תוכן הגביע בשפופרת חרוט 50 mL.
  10. צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ו להשעות את הגלולה ב 1 מ ל של הקרח קר MV-3 פתרון באמצעות מאגד נמוך מחייב הצנרת.
    1. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות, להעביר את ההשעיה (משלב 6.10) לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.7 mL ו צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
      הערה: ספין זה מבוצע על צנטריפוגה העליון שחקן במהירות מקסימלית (~ 20,000 x g) כדי להבטיח תשואה חזקה.
    2. עבור דגימות בעלי חוליות גדולות, להעביר את ההשעיה משלב 6.10 לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 5.0 mL, להוסיף 4 מ ל של הפתרון MV-3, ו צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.

7. מכתים חיסוני

הערה: המטאוקסילין והאאוזין (H & E) כתמים בוצעו על בדיקת זוחלים, דו-שלבית ודגים כהוכחה למושג הכדאיות של הפרוטוקול. לכן, אין המלצה לאימונוולאבילינג עבור הפרטים הללו.

  1. הסירו את הסופרנטאנט. מצינורות המיקרוצנטריפוגה
  2. השהה מחדש את הגלולה ב-PBS 1 x מעוקר באמצעות קצה מחייב נמוך של פיפטה (טבלת חומרים). שמרו על המיקרוכלים מיצירת אגרגטים באמצעות ליטוף מספר פעמים. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות (שולחן 3), השתמש ~ 100 μl – 2000 μl לפי גודל הגלולה. עבור דגימות בעלי חוליות גדולות (שולחן 5), השתמש ~ 1,000 μl – 4000 μl לפי גודל הגלולה.
  3. באמצעות טיפ בכריכה נמוכה, העבירו את כלי המיקרו-מכלים לשיקופיות, היזהרו להוסיף אותם למרכז הבאר, והימנעות מהקירות הצידיים.
  4. הגדר את השקופיות היטב, נחשף, בתוך תואר שני, ולתת יבש 20 עד 30 דקות ב RT.
    הערה: נפח גבוה יחסית של 1x PBS משמש כדי למנוע היווצרות צבירה. בשל כך, יש להניח לשקופיות להתייבש לפני הקיבעון כדי לוודא שכלי המיקרוכלים מוחזקים בציפוי פולי-ליזין.
  5. הסרת שיורית 1x PBS ידי ליטוף עם החוצה עם פיפטה העברה, להוסיף 200 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ו דגירה עבור 30 דקות ב RT.
  6. פיפטה את הפתרון הקבע ולשטוף 3x עם 200 μl של 1x PBS עבור 5 דקות ב RT.
    הערה: כתמים של H & E על דגים, דו-כלים וזוחלים, ובוצעו בשלב זה.
  7. הוסף 200 μL של חסימת מאגר לשקופית היטב ו-הדגירה עבור 60 דקות ב 37 ° c.
  8. הסר את מאגר חסימת עם מפית העברה והוסף 200 μL של קוקטייל הנוגדן העיקרי בנוגדן מדלל (טבלת חומרים). מודטה ב -4 ° c ללילה.
  9. פיפטה את קוקטייל הנוגדן העיקרי ולשטוף 3x עם 200 μL של PBS 1x עבור 5 דקות ב RT.
  10. טען את קוקטייל הנוגדן המשני (טבלת חומרים) מדולל ב-1X PBS ו דגירה עבור 2 h ב RT, מוגן מפני אור.
  11. פיפטה את קוקטייל הנוגדן המשני לשטוף 3x עם 200 μL של 1x PBS עבור 5 דקות ב RT, מוגן מפני אור. לאחר השטיפה האחרונה לנתק את המסגרת של שקופית היטב למחוק את כל העודפים 1x PBS עם מחיקה נמוכה נייר המוך.
  12. להוסיף שמיכות, נוזל מדיום לדעוך בינוני, ו 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) עבור כתמים גרעיניים. תנו להתייבש לילה בשעה RT מוגנים מאור.
  13. לאחר הייבוש, המשך להגן מפני אור על תיבת שקופיות ב-4 ° צ' עד שהוא מוכן למיקרוסקופיה ולרכישת נתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מיקרואוניות הראו את כל הרכיבים הסלולאריים. הפנימיים של יחידת נוירונימי2,3 שימוש באחת מהטסיות של תא הדבקה של מולקולה 1 ("פקאם", הידועה גם בשם CD31) או isolectin IB4 (גליקופרוטאין המחבר את הגליקקליום של תאי האנדותל) לתאי האנדותל, טסיות הגדילה הנגזרת הצמיחה-β (PDGFRβ) או תא העצב-glial אנטיגן 2 (NG2) עבור קרום הלב ו aqu in-4 (AQP4) עבור הקצה של הרגליים astrocytic (איור 3a, B) ממחיש כי רכיבים פנימיים אלה נמצאים בתוך מיקרואוניות מבודדים. אזורי המוח נראים לעין כוללים את מיקרואוניות בקליפת המוח (איור 3ב), מערכת מרבית (איור 3ג), בלוטת ההיפופיזה (איור 3ד), ההיפותלמוס (איור 3E), בצורת גזע (איור 3F), ואת חוט השדרה (איור 3G). כולם הראו את הסימונים. הקנוניים האלה

כמו כן, המיקרוכלים הראו ביטוי של חלבון צומת מדומה VE-קדהרין (איור 4א, ג), הצומת הדוק חלבונים קלאודין-5 וזונולה אטימות-1 (CLDN5 ו-ZO-1, איור 4a, D), הצומת Tricellular חלבון של הצטלבות-1 (איור 4a, E) ו-apicobasal סמנים C-X-C מוטיב כימוקין ליגו12 ו גמא-glutamyltransferase 1 (CXCL12 ו GGT1, איור 4 ממצאים אלה הם רלוונטיים כי חלבונים אלה הם אינדיקטורים של מרכזי bbb תכונות ספציפיות9,12,13,14. נוכחות מוגבלת של אסטרוציטים, oligodendrocytes הפוך, ונוירונים ביטוי גליה בחלבון חומצי (gfap, איור 4b, C, g), אוליגודנדרוציטים חלבון ספציפי (osp, איור 4b, g), ו-נוירופילמנט-בינוני (nfm, איור 4b, H), בהתאמה, מדגים מיקרוכלים מבודדים היו עקבות זניח של תאים לא רצויים היחידה נוירונימי. יתר על כן, רוב המיקרוכלים היו נטולי הביטוי של השריר α-חלקה שריר (αSMA, איור 5ב, ג). זה רלוונטי בגלל αSMA הוא סמן עבור תאי שריר חלקה הקשורים עם העורקים והדו (איור 5א), המציין כי זה פרוטוקול בידוד מטרות באופן סלקטיבי מיקרו כלי קטן קליבר15.

מיקרואוניות שהתקבלו מlissencephalic אחרים קטנים שיתוף כמה תכונות מורפולוגיות, כמו לראות דגים (צפרדע ולטאה לא הראו) ו מיקרואוניות העופות. הדבר מרמז על כך ששיטה זו שימושית לאפיון נוסף של הבדלים ב-NVU בין מינים (איור 6). יתר על כן, העופות מיקרוכלים של ה-CN (איור 6H – N) הראו פעילות מחודשת עם רבים של נוגדנים שפותחו עבור האדם והעכבר. הדבר מעודד חקירה נוספת של דגימות העופות ללימודי BBB ביולוגיים וביורפואיים. הבחנו בתוצאות דומות כאשר בודדנו מיקרואוניות מחזירים ומקופי מינן, שני מינים מנגיתיים (איור 7). רק סמנים קנוניים nvu בכלי מיקרו של חזירי מוצגים. בנוסף לאזורי ה-CN האמורים, הצלחנו לבודד כלי מיקרו מחומר לבן שחור (איור 7ב). זה רלוונטי משום שהחומר הלבן מעורב במצבים נוירודלקתיים (למשל, טרשת נפוצה16,17,18).

רצינו לגלות אם שיטה זו יכולה לשמש ככלי אמין כדי לקבוע שינויים בביטוי חלבון. בידיעה כי vcam-1 ו-ריבה-B היו מעורבים בתהליך נוירודלקתי בחוט השדרה במהלך הימים האחרונים, החלטנו לכמת את הביטוי של חלבונים אלה בשיא שלבים כרוניים של עכברים האלה ובקרה שליטה (10 שבוע-בן C57BL/6j עכברים)9,10,11. לשם כך, מדדנו את יחידת האינטנסיביות הרירותית (AUI) לאורך הקוטר של המיקרוכלים. לאחר מכן, באמצעות סף של ≤ 20 AUI עבור DAPI, אנו מחושב את האזור תחת עקומת (ג ' ו) עבור VE-קדהרין, VCAM-1, ו-JAM-B עבור 50 מיקרואוניות לאזור ה-CN (איור 8a, B). לבסוף, אנו ביצעו ANOVA דו-כיוון ואחריו בדיקה שלאחר-הוק של Sidak כדי לקבוע את המשמעות הסטטיסטית של שינויים בביטוי החלבון.

כפי שציפינו, הבחנו עלייה ב VCAM-1 ו-JAM-B לאורך מיקרואוניות בחוט השדרה במהלך שיא הימים (איור 8D, E). עם זאת, הבחנו בשינויים באזורים אחרים שאינם מדווחים עליהם בעבר. VCAM-1 גדל באופן משמעותי בכלי מיקרו בבלוטת יותרת המוח וירד בהיפותלמוס ומיקרוכלים גזע המחקר. היו שינויים במהלך השנה הכרונית בכל רקמות ה-CN (איור 8ד). ג'אם-B גדל באופן משמעותי בבלוטת ההיפותלמוס ובהיפופיזה במהלך השנה הכרונית (איור 8E). מעניין, הבחנו שינויים ב-VE-קדהרין לאורך כלי מיקרו מבודדים מן ההיפותלמוס ואת גזע המוח במהלך השיא של האלה, המוח הקטן במהלך השנה הכרונית (איור 8ג), וירידה ברוחב בלוטת ההיפופיזה במהלך השיא האורך הכרוני. באופן כללי, נתונים אלה מצביעים על כך ששיטה זו של בידוד microvessel היא כלי שימושי לאפיון שינויים בתבניות ביטוי חלבונים אזוריים במהלך בריאות ומחלות.

Figure 1
איור 1: ניתוח יעיל בחוט השדרה ללא כריתת למינציה. חיתוך חוט השדרה מתוך דגימות בעלי חוליות קטנות (עד 100 g) מבוצע מהר יותר וביעילות רבה יותר על ידי שטיפה את החוט ב caudal לכיוון rostral לאורך החוליה החוליות. באמצעות ניתוח מספריים הראש מוסר על ידי מפרק האטלס ואת עמוד השדרה הוא נחתך על ידי הירך (א). כל האיברים המיפוי מוסרים, ומשאירים רק את עמוד השדרה (ב). חוט השדרה בתוך החוליות המותניים המותני מופיע כמעגל לבן קטן מאוד (< קוטר 1 מ"מ) בהשוואה לרוחב של חוט הרחם (ב, חיצים צהובים). שמירה על פתיחה צרה בחוליות המותניים המותני מקלה על הדרגתי לחץ מתוך המותניים לעמוד השדרה הצווארי בעת שטיפה עם המחט 18 G ו 10 cc מזרק טעון עם 1X PBS (C ו -D). לאחר הריקון, חוט השדרה (D, החץ הצהוב) הוא כמעט לגמרי devoided של ריר sac, ורק pia צריך להיות מוסר תחת היקף מבתר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: לקטוף כפול באמצעות מבתר כלי מחזיק מסנן שונה. זה במרחק של 11 ס מבכליהניתוח (A) יש שני מאוד חדים, כמעט אופקית נקודות מנוגדים, 2 מ"מ עצה לטיפ (ב). על-ידי הפעלת לחץ עדין כלפי מטה ופיתול מעט בכיוון השעון (C), הנקודות מטמימות את עצמן אופקית לתוך הקרום, כדי שניתן יהיה להעלות אותן למעלה. הדבר שימושי במיוחד כאשר מסירים את קרום המוח מהמח ההוא, משום שהיא מאפשרת גישה לעומק הפוליה הקרייתי. הוא גם שימושי מאוד כאשר מסירים את קרום העור מרקמת הקליפת השומן, במיוחד הגירצליום. במקרה זה, הפיה היא מוטבעת במידה רבה עם ואצלב בקוטר גבוה אשר יסכן את טוהר הבידוד של כלי המיקרו. כמו-כן, היא מקלה על ההסרה של מקלעת הדמית הכלי, שהיא המקור הטוב ביותר לזיהום. מחזיקי מסננים של 47 מ"מ, 25 מ"מ, ו -13 קוטר של 13 מ"מ היו לייזר לחתוך כדי להסיר את מחבר כניסת (D) מהתא העליון (E), אבל לשמור את רכיב מסננת (G). שינוי זה מותר עבור ההרכבה של יחידת מסנן (I,J) על ידי הצבת הרשת 20 יקרומטר ניילון מסנן על הנפה והחלק התחתון (G,H), אבטחת הרשת במקום כאשר דופקים את החלק העליון (E). רק מחזיק המסנן של 25 מ"מ מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מיקרואוניות מבודדות מתוך מספר אזורים במערכת העצבים הביע סמנים היחידה נוירונימי היחידה. (א) באמצעות אימונויניום ו מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי, רכיבים סלולריים פנימיים של nvu משמשים לזיהוי מבוגר (8 – 14 שבוע בן C57BL/6j) מורטין מיקרוכלי המוח. כפי שנראה על תמונת המיזוג עבור מיקרואוניות קליפת המוח (ב), מעל התמונות קונפוקלית וקד הפרט עבור הסמן תא אנדותל CD31 (לבן), סמן קרום הלב PDGFRβ (אדום), ו astrocytic קצה-רגל סמן AQP4 (ירוק) כל אלה הרכיבים הסלולריים נשמרים. שים לב כי היחסים האינטימיים בין תאים אנדותל וקרום הלב לגרום להם להופיע מגנטה על התמונה הממוזגת, בעוד הקצה האסטרוציטוטי מופיע יש הילה המקיפים אותם (ב). אותה תבנית ביטוי היא נצפתה עבור המוח ה, (C), בלוטת יותרת (D), ההיפותלמוס (E), גזע המוח (F), חוט השדרה (G, dapi, כתם גרעיני = כחול; סרגל סרגל = 10 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מיקרואוניות הביעו חלבונים הקשורים למאפיינים ייחודיים של BBB. תאי האנדותל בתוך יחידת נוירונימי (NVU) מתוארים גם על ידי החלבונים הקשורים למאפייני המכשול הפנימיים שלהם (א). כפי שנראה בדמות, לתאי האנדותל יש מצמתים שנעשו על-ידי-קדהרין, CLDN5, ZO-1 (a, צהוב), והקקלין-1 (a, ירקרק). הם גם מוצגים קוטביות האפאליות למספר חלבונים, כולל GGT-1 ו-CXCL12 (A, ירוק ואדום). נוירונים, oligodendrocytes הפוך, ו astrocyte תאים הגופים עשויים להיכלל במיקרוכלים מבודדים, למרות שהם לא מהותי NVU (ב). אלה ניתנים לזיהוי על-ידי הביטוי של NFM (אדום), OSP (ציאן), ו GFAP (ירוק ליים), בהתאמה (ב). בהתאם לאלה, המיקרוכלים המבודדים שלנו הביעו חלבון מדומה VE-קדהרין (ג, אדום), הצומת הדוק חלבונים CLDN5 ו-ZO-1 (D, אדום וירוק, בהתאמה, מיזוג = צהוב), הצומת tricellular חלבון (E, ירוק), ו apicobasal סמנים CXCL12 ו GGT1 (F, אדום ו הם גם הציגו כמויות מוגבלות של GFAP (A, ירוק, G, לבן), osp (G, ירוק), ו nfm (H, אדום), הרומז שמירה זניחה של תאים שאינם נוירונימי היחידה (dapi, הכתם הגרעיני = כחול; סרגל סרגל = 10 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: רוב המיקרוכלים המבודדים אינם מבטאים αSMA. יחידת נוירו-וסקולרית מציגה מעבר מתוחכם מ-arteriole-נימי-וניט (א). ביטוי αSMA anular מזהה בבירור את arteriole, וכפי שהוא הופך נימי, αSMA (ב, אדום) הביטוי פוחתת, חשיפת סמן ציור קיר NG2 (ב, ירוק). מדדנו את הקוטר של αSMA + ו-αSMA-כלי (בסוגריים לבנים, n = 20), כדי להבדיל אותם כמו העורקים או נימים (DAPI, כתם גרעיני = כחול, סרגל קנה מידה = 10 μm). ניתוח לא מזווג t-test של קוטר של αSMA + ו-αSMA-כלי הראו משמעות סטטיסטית גבוהה (C, αSMA + = אדום, αSMA-אדום/ירוק, * * * * p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: בידוד מוצלח של מיקרוכלי הlissencephalic ממינים אחרים. ה-CN נקצרו מצפרדע פראית שנתפסה (8.2 ס מ), לטאה (12.7 ס מ), דגי טרוטה בקשת טנקים (בת 2, 35.6 ס מ), ויונה מורמת בכלוב (9 חודשים, ~ 300 g). כלי המיקרו של הצפרדע, הדג, והלטאה היו מוכתמים על ידי H & E (רק מיקרוכלים מפורל מוצגים, סרגל קנה מידה = 20 μm). . כלי מיקרויונים היו מחיסלים היינו מסוגלים לזהות מיקרואוניות בכל האזורים כפי שמסומן על הדגים והיונים קווי מתאר: קליפת המוח (A ו- H), האונה האופטית (B ו- I), מערכת המוח (C ו- J), יותרת המוח (D ו- L ),ההיפותלמוס (E ו- K ),בדוק (F בנוסף, הצלחנו לזהות תאים אנדותל עם isolectin IB4 (לבן), כפות הרגליים astrocytic עם AQP4 (ירוק), והנוירונים הסמוכים עם NFM (אדום) מ מיקרואוניות מבודדים של היונה (DAPI, כתם גרעיני = כחול, סרגל קנה מידה = 10 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: בידוד של כלי המיקרו-מיקרו של המינים. המוח וחוט השדרה היו גזור חזיר הרים החווה (~ 6 חודש בן, ~ 120 ק"ג) עבור בידוד microvessel ואימונואולבלינג. הצלחנו לזהות כלי מיקרו מסומנים באופן חיובי עבור IB4 (לבן), PDGFRβ (אדום), ו AQP4 (ירוק) על כל האזורים של חזירי cn: קליפת (א), החומר הלבן הפרינטאלי (ב), המוח (ג), יותרת המוח (ד), ההיפותלמוס (E), גזע (F), חוט השדרה (G, dapi, הכתם הגרעיני = כחול, סרגל קנה מידה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: דוגמה ליישום אחר של בידוד מיקרוכלי של התוכנה. ביטוי של דקירה-B ו-VCAM-1 היה לכמת עבור מיקרולים הרבה מורניים. יחידות שרירותיות של עוצמה (AUI) נמדדו לקליפת המוח, המוח החלק, ההיפותלמוס, בלוטת יותרת המוח, גזע שדרתי, וחוט השדרה של עכברים בשיא שלבים כרוניים של העין, עם התחזות כפקד (n = 4). עבור כל אזור ה-CN, 12 כלי מיקרו הוערכו לכל עכבר כדי לקבוע את AUI ל-fluorochrome ואת קוטר המיקרוכלי (A). בסוגריים מרובעים לבנים מציגים דוגמאות של כלי מדידה של תוכנת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד המשמש כדי לקבוע aui עבור vcam-1 (לבן), VE-cadherin רין (ירוק), ג'אם-B (אדום), ו dapi (כחול, סרגל קנה מידה = 10 μm). לאחר מכן, AUI וכתוצאה מכך הותוו נגד הקוטר במיקרון (ב) כדי לחשב את האזור תחת העקומה (אוק ') עבור כל חלבון אימונויניום כאומדן של הביטוי חלבון. ה-אוק הממוצע לקבוצה נותח לאחר מכן על-ידי ANOVA בשתי הדרכים, ואחריו הבדיקה הפוסט-הוק של Sidak, עבור סך של 48 מיקרואוניות לכל אזור ה-CN. פרט לכלי המיקרו-בלוטת יותרת המוח, לא הבחנו בהבדלים משמעותיים בין קוטר המיקרו-כלי המקושר לסטטוס המחלה (C, insert), אך ירידה משמעותית בביטוי ה-VE-קדהרין מן ההיפותלמוס והמוח בעכברי הקצה (c). ניתוח סטטיסטי דומה הראה עלייה משמעותית של VCAM-1 (ד) ו-ריבה-B (E) בחוט השדרה, עקבי עם מצב נוירודלקתי בשיא הימים. מעניין, הבחנו גם בשינויים עבור VCAM-1 על ההיפותלמוס, יותרת המוח, ואת גזע. תוצאות אלה נמצאות תחת חקירה (ברים שחורים ונקודות = שם, בארים אדומים ונקודות = שיא, ברים סלמון ונקודות = האלה כרונית, * p < 0.05, @p < 0.01, #p < 0.001, ו & p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

MV-1 10 מ"מ הופס
ב-1x תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) עם סידן ומגנזיום
MV-2 18% 70 משקל מולקולרי kda (MW) תוספי
ב 10 מ"מ HEPES/HBSS (MV-1)
MV-2 20% 70 kda MW תוספי
ב 10 מ"מ HEPES/HBSS (MV-1)
MV-3 1% בסרום שור (BSA)
ב 10 מ"מ HEPES/HBSS (MV-1)
קבע 4% פראפורמלדהיד
ב-1x פוספט באגירה מלוחים (PBS) pH 7.4
שטיפת מאגר 1x PBS pH 7.4
הפראותזציה & חסימת מאגר 10% BSA
0.25% nonionic חומרים
ב-1x PBS pH 7.4
מדלל נוגדן 5% BSA
0.25% nonionic חומרים
ב-1x PBS pH 7.4

טבלה 1: פתרונות המשמשים בפרוטוקול.

סטפ (ים) פעולה
4.1 ו-4.1.1 האוהב בתמיסה MV-1 עם להב בעלת קצה אחד
4.2 ל4.2.2 הומוגון בתמיסה MV-1 באמצעות שפופרת קדר-ELVJ
5.1 ספין ב 2,000 x g, 4 ° צ', 10 דקות
5.1.1 ל5.1.1.2 השהה מחדש את הגלולה בתמיסה של MV-2
5.2 ספין ב 4,400 x g, 4 ° צ', 15 דקות
5.3 עד 5.5 השהה מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של הפתרון MV-3
6.2 ל6.4.1 אליוט מעל 50 מ"ל שפופרת חרוטי דרך מסננת תא ולשטוף עם MV-3 פתרון
6.5, 6.5.1, 6.6, ו 6.7 מסנן עם רשת ניילון 20 יקרומטר על מחזיק מסנן שהשתנה
6.8 טען את נטו ניילון לתוך גביע 50 mL עם 10 מ ל של הפתרון MV-3 ולנער עבור 30 s
6.9 עד 6.10 Decant לתוך 15 מ"ל צינור חרוטי ו ספין ב 2,000 x g, 4 ° צ', 5 דקות
6.10 השהה מחדש 1 mL של פתרון MV-3
6.10.1 העברה למיקרו-שפופרת 1.7 mL וספין ב 20,000 x g, 4 ° c, 5 דקות
7.1 עד 7.3 השהה מחדש ב-1x PBS וטען לתוך שקופיות היטב

טבלה 2: מיתאר לבידוד מיקרואוניות בעלי חוליות קטנות. תרשים זה הוא גירסה ממקוצרת של הפרוטוקול בעת שימוש בדוגמית lissencephalic.

סטפ (ים) פתרון פעולה אקס CBL בחור בסט SC היפרפ בור
4.1 MV-1 האוהב על צלחת 100 מ"מ x 20 מ"מ צלחת פטרי, 1 מ ל n/a
4.2.1 ו4.2.2 MV-1 הומוגון 5 מל, 10 מ ל פוטר-אלווחג'ם עם מכתש 1 מ ל, מיקרופסל
5.1.1.1 ו5.1.1.2 MV-2 השהה מחדש 5 מ"ל + 5 מל, 18% דקטרן 1 מ ל, 20% דקטרן
5.5 ו-6.4.1 MV-3 השהה מחדש 1 מ"ל + 10-15 mL 1 מ ל
6.2 ו-6.4.1 MV-3 גודל מסננת 100 יקרומטר 70 יקרומטר 100 יקרומטר 70 יקרומטר 100 יקרומטר
שטוף 5 מ ל
6.5, 6.5.1 ו 6.7 MV-3 גודל מסנן, לשטוף מסנן 25 מ"מ, 10 מ ל 13 מ"מ, 5 מ ל
6.8 MV-3 טלטול בגביע 10 מ ל
6.10 MV-3 השהה מחדש 1 מ ל
7.2 1x PBS השהה מחדש 1.5 ל 2.0 מ ל 0.5 ל 1.0 מ ל 0.1 ל 0.2 מ ל
7.3 1x PBS טען בטוב 200 מיקרומטר 100 מיקרומטר 25 עד 50 μL
ה-סי. טי. אקס = קליפת המוח, לח ק = המוח ה, בסט = גזע מוחי, OPT = האונה האופטית (לא קיים יונקים), HYP = ההיפותלמוס, PIT = יותרת המוח, SC = חוט השדרה. אמצעי אחסון מומלצים הם עבור רקמה שלמה של בעלי חיים החל בגודל של 20 גרם (עכבר צעיר) כדי 800 g (עכברוש למבוגרים).

טבלה 3: אמצעי אחסון/גודל מומלצים. חלוקה לרמות זו כוללת את הנפח המומלץ של פתרונות לשימוש בדוגמית בעלי חוליות קטנות החל מ-~ 20 – ~ 800 גרם, או באופן ספציפי יותר, העכבר ~ 25 g המוצג על הווידאו. התאמה סופית של אמצעי האחסון הדרושים חייב להיקבע על ידי החוקר על פי כמות ספציפית של רקמות רטובות שהתקבלו לאחר הניתוח. מומלץ מאוד לתרגל ולפתור בעיות. ה-סי. טי. אקס = קליפת המוח, לח ק = המוח ה, בסט = גזע מוחי, OPT = האונה האופטית (לא קיים יונקים), HYP = ההיפותלמוס, PIT = יותרת המוח, SC = חוט השדרה.

סטפ (ים) פעולה
4.1 ו-4.1.2 האוהב ב-MV-1 עם להב בעלת קצה אחד
4.3 ל4.3.4 הומוגון בתמיסה MV-1 באמצעות מטחנת קדר-אלווג'ם עם מצופפי
5.1 ספין ב 2,000 x g, 4 ° צ', 10 דקות
5.1.2 ל5.1.2.2 השהה מחדש את הגלולה בתמיסה של MV-2
5.2 ספין ב 4,400 x g, 4 ° צ', 15 דקות
5.3 עד 5.5 השהה מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של הפתרון MV-3
6.2 ל 6.4 ו 6.4.2 אליוט מעל 50 מ"ל שפופרת חרוטי דרך מסננת תא ולשטוף עם MV-3 פתרון
6.5, 6.5.2, 6.6 ו 6.7 מסנן עם רשת ניילון 20 יקרומטר על מחזיק מסנן שהשתנה
6.8 טען את נטו ניילון לתוך גביע 50 mL עם 30 מ ל של פתרון MV-3, ולנער עבור 30 s
6.9 ו-6.10 Decant לתוך צינור 50 mL ו ספין ב 2,000 x g, 4 ° צ', 5 דקות
6.10 השהה מחדש 1 mL של פתרון MV-3
6.10.2 העברה למיקרו-שפופרת של 5 מ"ל וספין ב 2,000 x g, 4 ° c, 5 דקות
7.1 עד 7.3 השהה מחדש ב-1x PBS וטען לתוך שקופיות היטב

טבלה 4: פריסה עבור בידוד מיקרואוניות בעלי חוליות גדולות. תרשים זה הוא גרסה ממקוצרת של הפרוטוקול בעת שימוש בדגימה מתורגתית.

סטפ (ים) סויון פעולה אקס CBL WM בסט SC היפרפ בור
4.1 MV-1 האוהב על צלחת 3-5 מ ל 1 מ ל
4.3 ל4.3.4 MV-1 הומוגון 20 ל 30 מ"ל, 55 מ"ל פוטר-אלווג'ם עם מ& תקורה 5 מל, 10 מ ל פוטר-אלווחג'ם עם מכתש
5.1.2 ל5.1.2.2 MV-2 השהה מחדש > 20 מ ל, 20% דקטרן 5 מ"ל + 5 מ"ל, 20% דקטרן
5.5, 6.4 ו 6.4.2 MV-3 השהה מחדש 1 מ ל + 20 מ ל 1 מ"ל + 10 mL
6.2 ו-6.4.2 MV-3 גודל מסננת 100 יקרומטר 70 יקרומטר 100 יקרומטר 70 יקרומטר 100 יקרומטר
שטוף 10 מ ל
6.5, 6.5.2 ו 6.7 MV-3 גודל מסנן, לשטוף מסנן 47 מ"מ, 10 מ ל 25 מ"מ, 10 מ ל
6.8 MV-3 טלטול בגביע 30 מ ל
6.10 ו-6.10.2 MV-3 השהה מחדש 1 מ"ל + 4 מ ל
7.2 1x PBS השהה מחדש 2.0 ל 4.0 מ ל 1.0 ל 2.0 מ ל
7.3 1x PBS טען בטוב 200 מיקרומטר 100 מיקרומטר
ה-סי. טי. אקס = קליפת המוח, לח ק = משכל, WM = חומר לבן, בסט = במוח גזע, HYP = ההיפותלמוס, PIT = בלוטת היותרת, SC = חוט השדרה. אמצעי אחסון מומלצים הם עבור דגימות של ~ 45 ס"מ3 עבור ה-סי-טי-אקס, לח ק, בסט ומכל hyp ו-PIT.

טבלה 5: אמצעי אחסון/גודל מומלצים. חלוקה לרמות זו כוללת את נפח הפתרונות המומלץ לשימוש בדגימה גדולה של בעלי חוליות. באופן ספציפי יותר, זה חל על ביופסיות רקמת המוח של ~ 45 ס מ3 עבור קליפת, מקסימום, חומר לבן, גזע המוח, חוט השדרה, ואת ההיפותלמוס כולו בלוטת היותרת, כפי שמוצג על הווידאו. התאמה סופית של אמצעי האחסון הדרושים חייב להיקבע על ידי החוקר על פי כמות ספציפית של רקמות רטובות שהתקבלו לאחר הניתוח. מומלץ מאוד לתרגל ולפתור בעיות. ה-סי. טי. אקס = קליפת המוח, לח ק = משכל, WM = חומר לבן, בסט = במוח גזע, HYP = ההיפותלמוס, PIT = בלוטת היותרת, SC = חוט השדרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bbb כולל את המאפיינים הייחודיים של המוח מיקרוקובלטורה בתאי השלד בשילוב עם ארכיטקטורה מתוחכמת של הדוק, חסיד-, "יתד-שקע"-צמתים, ולוחיות הדבקה קריטי עבור הומאוסטזיס2,3,19. המאפיינים של תאים אנדותל הם המושרה ומתוחזק על ידי קרום הלב ואת התהליכים המקיפים את הרגל הקצה astroglia2,3,19. מיקרוטבקוטבלטורה BBB מציגה קוטביות (כלומר, תבנית ביטוי סימטרית של חלבונים המותאמים לאור משטחי התאים של לומינאל או אביטואל אנדותל)20. בעוד זה עשוי להגדיר בקצרה את BBB, במציאות היא נשארה אחת התפיסות המסתורית ביותר במדעי המוח. לדוגמה, אזורי, מין והבדלי גיל בתוך nvu יכול להסביר את הפגיעויות האזוריות של הcn לטראומה, רעילות, זיהום ודלקת, אשר יכול להיות השלכות קליניות הגדולות3,5,6. מכשול נוסף בהבנת bbb הוא ההבדלים שנצפו בין מספר רב של מטקא7,8. אחד המכשולים העיקריים של הבנה וחקירת ה-BBB הוא בדיוק הקושי הקשור לבידוד של NVU המקיף את BBB, תוך שמירה על תכונות ספציפיות למכשול14.

בניסיון להאיץ את ההבנה שלנו של BBB, הבדלים אזוריים, כמו גם הבדלים במינים, התאמתי שיטות שפורסמו בעבר. הצלחנו להתאים אותם בהצלחה, במיוחד בולאי ואח '21, כדי להשיג כלי מיקרו מקליפת המוח היחידה, המוח, ההיפותלמי, יותרת המוח, גזע במעי, ורקמות עמוד השדרה על מספר רב של חוליות lissencephalic קטנות: דגים, דו-חיים, זוחלים, ציפורים, ויונקים(איור 3, איור 4, איור 5 אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי העיבודים שלה מבוססים על הגודל הכולל של רקמת ה-CN: החוקר בוחר את כמות הפתרון, גודל של מטחנת הרקמה, שפופרת חרוט, מחזיקי מסננים, וכו ' על פי הרקמה רטוב, ללא קשר למינים, מין, וגיל. בניסיון שלנו עם immunolabeling a ~ 20 g הדגימה התשואות מספיק מיקרואוניות עבור 8 שקופית היטב לכל קליפת המוח, מקסימום, האונה האופטית, גזע המוח, חוט השדרה וחצי 8 השקופית היטב לכל ההיפותלמוס ובלוטת היותרת. עם זאת, התשואה של האונה הקליפת המוח האופטית היא הרבה יותר גבוה בהשוואה לחלק העליון, גזע המוח, ואת חוט השדרה.

כפי שמוצג, בוצעו את העיבודים הדרושים עבור בידוד ואימונויניום של מיקרוכלים של מיקרו-המערכת של חזיר ומקוק, יונקים גדולים יותר, כי הם יותר רלוונטיים למחקר הטרנסלtional (איור 7). בעיקר, היינו יכולים לכלול חומר לבן המוח על המינים האלה בלבד. מאז ה-CN בבעלי חיים אלה הוא גדול יותר, אספנו מספיק חומר לבן כדי לאפשר לנו להפריד את הגלולה מיקרוכלי מתוך שכבת המיאלין במהלך צנטריפוגה השני (שלב 5.3, MV-2 עם 20% dextran). אנו משערים כי מסה קריטית צריך להיות מסוגל להיות מסוגלים להיות הפרדה זו ההפרדה ואנחנו באופן פעיל מחפשים כיצד להשיג תוצאה דומה עם רקמת מורטין.

למרות שהושמט למען הפשטות, באמת בנינו מעבר לסמנים הקנוניים של NVU על העופות, הפורצין, ומיקרואוניות מקוק. בעיקר, כל המינים משותפים סמנים סלולריים ומולקולריים שזוהו בעבר על דגימות murine כרלוונטיים לפונקציה BBB (junctional חלבונים VE-קדהרין, CLDN5, ZO-1, ו-APICOBASAL סמנים CXCL12 ו GGT1) או בסמיכות NVU (NVU, OSP, ו GFAP). שוב, ממצאים אלה מעודדים את השימוש בשיטה זו על מינים אחרים כדי לזהות עוד NVU הומולוגיה והתפצלות בין המינים. זה גם פותח את ההזדמנות לחקירה נוספת לתוך זן NVU, מין, והבדלים בגיל בתוך אותו מינים הכדאיות של שימוש באורגניזמים אחרים עבור BBB מחקר ביו רפואי. כמו כן, אנו מראים עדות לשימוש מוצלח בשיטת הבידוד המיקרוכלי באמצעות מיקרוטייט שינויים ברמות ביטוי החלבונים במהלך דלקת המוח (איור 8). למרות שעשינו ניסוי זה כהוכחה למושג, הגישה המשמשת כאן מנוצלת באופן מקיף במעבדה שלנו. אנו מעדיפים גישה זו על שיטות כמותיים אחרות (למשל, אבן חשופה מערבית) מכיוון שאנחנו רוצים להתמקד לא רק על רמת הביטוי, אבל השפע החלבון היחסי, העתקת CXCL12 וחלבונים אחרים apicobasal הצמדה של junctional חלבונים, וכו ', בתוך המראה המסובך של מיקרוכלי המהימנות9,13,22. כמו כן, אנחנו כרגע לפתור את השיטה שלנו עבור יישומים אחרים, כגון בידוד נוסף של רכיבים סלולריים nvu (תאים אנדותל ו קרום הלב), רנ א-seq, ו פרוטאומניקס23,24,25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

ד ר קרוז-Orengo נתמך על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דיוויס, בית הספר לרפואה וטרינרית להתחיל כספים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS ThermoFisher BP39920 Used for blocking and antibody diluent.
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713-S Used as fixative (4% PFA)
70,000 MW Dextran Millipore Sigma 9004-54-0 Used for MV-2 solution
Adson Forceps Fine Science Tools (FST) 11006-12 Used for removal of muscle and skin
Adson Forceps, student quality FST 91106-12 Same as above but cheaper
Bovine serum albumin (BSA) Millipore Sigma A7906-100G Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent
Corning 100 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431752-50EA
Corning 70 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431751-50EA
Corning Deskwork low-binding tips Millipore Sigma CLS4151 Same as below but cheaper.
Cultrex Poly-D-Lysine R&D 3439-100-01 Used for slide coating
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 Thermo A21432 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A21202 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 Thermo A21206 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 Thermo A31573 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10029 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Double-Pronged Tissue Pick FST 18067-11 Used for removal of meninges and choroid plexus
Dumont #3c Forceps FST 11231-20 Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)
Dumont #7 Forceps FST 11274-20 Used for CNS tisssue dissection and handling
Dumont #7 Forceps, student FST 91197-00 Same as above but cheaper
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips Eppendorf 22493008 Better quality than the tips above (more expensive).
Extra Fine Graefe Forceps, serrated FST 11151-10 Used for bone removal
Fine Scissors, sharp FST 14060-09 Used for removal of pig and macaque dural sac
Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 Chang Bioscience Inc. (eBay) GP1.5_10 Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Goat anti-CXCL12, biotinylated PeproTech 500-P87BGBT Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.
Goat anti-JAM-B R&D AF1074 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A11001 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 Thermo A21424 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-PDGFRβ R&D AF1042 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 Thermo A21249 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 Thermo 35552 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10021 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth FST 11054-10 Use for nylon filter net holding and shaking
HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium Corning 21-022-CM Used for MV-1 solution
HEPES, 1M liquid buffer Corning 25-060-CI Used for MV-1 solution
Isolectin GS-IB4-Biotin-XX ThermoFisher Scientific (Thermo) I21414 Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
LaGrange Scissors, serrated FST 14173-12 Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)
Millicell EZ slide 8-well unit Millipore Sigma PEZGS0816
Mouse anti-CLDN5 Thermo 35-2500 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-GGT1 Abcam ab55138 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-Human CD31 R&D BBA7 Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL.
Mouse anti-NFM Thermo RMO-270 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-αSMA Thermo MA5-11547 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Nylon Filter Net, roll Millipore Sigma NY6000010 Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 25 mm Millipore Sigma NY2002500 Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 47 mm Millipore Sigma NY2004700 Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
ProLong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher P36935 Used to coverslip slides.
Rabbit anti-AQP4 Millipore Sigma A5971 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-LSR Millipore Sigma SAB2107967 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-NG2 Millipore Sigma AB5320 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-OSP Abcam ab53041 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL.
Rabbit anti-VE-Cadherin Abcam ab33168 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-ZO-1 Thermo 61-7300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-CD31 Becton Dickinson BD 550274 Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-GFAP Thermo 13-0300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rat anti-VCAM-1 Becton Dickinson BD 553329 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Sterile Ringer's Solution, Frog Aldon Corporation IS5066 Used for amfibian anesthesia
Streptavidin-ALEXA 555 Thermo S32355 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647 Thermo S32357 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Surgical Scissors, sharp FST 14002-12 Used for removal of muscle and skin
Surgical Scissors, sharp-blunt FST 14001-16 Used for decapitation (except pig and macaque)
Swinnex Filter Holder, 13 mm Millipore Sigma SX0001300 Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 25 mm Millipore Sigma SX0002500 Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 47 mm Millipore Sigma SX0004700 Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
Triton X-100 ThermoFisher 50-165-7277 Used for blocking and antibody diluent.
Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer VWR (Supplier DWK Life Sciences) 62400-904 (DWK #903475) Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-384 (DWK #357979) Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-372 (DWK #357994) Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. 53208 (2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics