Isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

O objetivo deste protocolo é isolar microvasos de várias regiões do sistema nervoso central de vertebrados lissencefálicos e girofálicos.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M. L., Dorflinger, B. G., Cruz-Orengo, L. Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups. J. Vis. Exp. (155), e60291, doi:10.3791/60291 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

O isolamento de microvasos do sistema nervoso central (SNC) é comumente realizado apartir da combinação de tecido cortical de múltiplos animais, na maioria das vezes roedores. Esta abordagem limita o interrogatório de propriedades de barreira sangue-cérebro (BBB) ao córtex e não permite a comparação individual. Este projeto se concentra no desenvolvimento de um método de isolamento que permite a comparação da unidade neurovascular (NVU) de várias regiões do SNC: córtex, cerebelo, lobo óptico, hipotálamo, pituitário, tronco cerebral e medula espinhal. Além disso, este protocolo, originalmente desenvolvido para amostras de urina, foi adaptado com sucesso para uso em tecidos do SNC de pequenas e grandes espécies de vertebrados das quais também somos capazes de isolar microvasos da matéria branca do hemisfério cerebral. Este método, quando emparelhado com imunorotulagem, permite a quantidade de expressão proteica e comparação estatística entre indivíduos, tipo de tecido ou tratamento. Provamos essa aplicabilidade avaliando mudanças na expressão de proteínas durante encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo de urina de uma doença neuroinflamatória, esclerose múltipla. Além disso, micronavios isolados por este método poderiam ser usados para aplicações a jusante como qPCR, RNA-seq e mancha ocidental, entre outros. Mesmo que esta não seja a primeira tentativa de isolar micronavios do SNC sem o uso de ultracentrifugação ou dissociação enzimática, é único em sua adeptness para a comparação de indivíduos solteiros e múltiplas regiões do SNC. Portanto, permite a investigação de uma série de diferenças que, de outra forma, podem permanecer obscuras: porções do SNC (córtex, cerebelo, lobo óptico, tronco cerebral, hipotálamo, hipófise e medula espinhal), tipo de tecido cns (matéria cinzenta ou branca), indivíduos, grupos de tratamento experimental e espécies.

Introduction

Nosso cérebro é o órgão mais importante do nosso corpo. Por esta razão, manter a homeostase cerebral, apesar de fatores externos que podem desencadear um desvio da normalidade é uma prioridade. De acordo com alguns estudiosos, cerca de 400-500 milhões de anos atrás1, animais vertebrados desenvolveram o que hoje conhecemos como a barreira hemato-hematograse (BBB)2,3. Esta "cerca" protetora exerce a maior influência sobre a homeostase e as funções do sistema nervoso central (SNC), regulando firmemente o transporte de íons, moléculas e células entre sangue e snc. parenchyma. Quando o BBB é interrompido, o cérebro torna-se suscetível à exposição tóxica, infecção e inflamação. Portanto, a disfunção BBB está associada a muitos distúrbios neurológicos e neurodesenvolvimentais4,5,6.

A função sofisticada do BBB é atribuída à microvasculatura cns única conformada pela unidade neurovascular (NVU)2,3. Células endotélias altamente especializadas, pericitos e pés finais ascícticos são os componentes celulares do NVU2,3. A matriz extracelular gerada por essas células também é essencial para a fisiologia NVU e BBB2,3. Embora componentes celulares e moleculares essenciais do NVU sejam conservados entre vertebrados, a heterogeneidade é relatada entre ordens eespécies 7,8. No entanto, limitações técnicas impedem nossa capacidade de considerar plenamente essas diferenças em pesquisa sonoridade, biomédica ou translacional.

Devido a isso, expandimos um método de isolamento de micronavios específico da região do SNC para torná-lo aplicável a inúmeras espécies de todos os cinco grupos vertebrados: peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos. O protocolo é descrito para uso em vertebrados pequenos lissencefálicos e de grande girofálico, incluindo espécies com relevância translacional9. Além disso, incluímos outras regiões do SNC não investigadas antes neste contexto, mas relevantes para a neurofisiologia e com tremendas implicações clínicas: hipotálamo, hipófise e matéria branca. Por fim, testamos a capacidade deste método de isolamento como uma ferramenta confiável paraidentificar mudanças na expressão de proteínas ao longo da NVU e/ou BBB9,10,11. Como prova de conceito, mostramos como determinar as mudanças na expressão VCAM-1 e JAM-B durante o EAE usando o método de isolamento seguido de imunofluorescência.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os procedimentos do presente estudo estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Universidade da Califórnia (UC), Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). O cuidado animal em UC Davis é regulado por diversos recursos independentes e foi acreditado inteiramente pela associação para a avaliação e o accreditation do animal do laboratório internacional (AAALAC) desde 1966. Tecidos sincie foram obtidos do Departamento de Ciências Animais da UCD, Laboratório de Ciências da Carne. Tecidos do SNC de macacos rhesus foram obtidos do Departamento Nacional de Patologia do Centro de Pesquisa de Primatas da Califórnia (NIH P51OD011107). Nenhuma anestesia, eutanásia ou necropsia foi realizada por funcionários de laboratório em porcos e macacos. Portanto, não existem recomendações particulares sobre essas questões.

NOTA: Este método foi validado para várias espécies, mas o protocolo fornecido corresponde mais diretamente aos tecidos de camundongos e suínos. Detalhes relativos ao lobo óptico não se aplicam ao usar espécimes de mamíferos. Todos os materiais bioperigosos devem ser tratados em uma instalação adequada de nível de biossegurança (BSL). Todos os materiais agudamente tóxicos devem ser manipulados debaixo de um capô de fumaça. Todos os resíduos médicos bioperigosos e resíduos agudamente tóxicos devem ser eliminados adequadamente.

1. Preparação

  1. Prepare soluções(Tabela 1)pelo menos um dia antes.
    NOTA: É muito difícil dissolver 70 kDa peso molecular (MW) dextran. É mais eficiente deixar a solução agitar durante a noite coberta com filme de parafina ou folha. O protocolo requer o uso de duas soluções mv-2 diferentes, dependendo do espécime investigação. O dextran de 18% separa eficientemente a mielina da pelota do micronavio ao executar o protocolo em espécimes lissencephalic pequenos. No entanto, desenvolve uma mancha de mielina dentro da interface dos tecidos do SNC a partir de grandes espécimes girosféricos, bem como o hipotálamo e o pituitário de pequenos espécimes. Esta mancha é impedida usando 20% dextran.
  2. Prepare-os slides bem carregando 50 μL por poço de poli-D-lisina e deixe secar por 2 h à temperatura ambiente (RT), de preferência em um gabinete de segurança biológica classe 2 (BSC-2). Não se cansar. Lave duas vezes com soro soro para os soro vermelho-fosfato (PBS) e mantenha na geladeira até que esteja pronto para uso.

2. Dissecção de tecido cns de pequeno espécime de vertebrados lissencefálicos

NOTA: O artigo demonstra a aplicação do protocolo em um C57BL6/J, 10 semanas de idade, ~ 25 g, rato macho.

  1. Prepare dois tubos cônicos de 15 mL e um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL com 5 mL e 1 mL, respectivamente, de solução MV-1 por espécime. Mantenha tubos no gelo.
  2. Anesthetization
    1. Camundongos anestesos por injeção intraperitoneal de um coquetel anestésico de cetamina, xilacina e acepromazine em 100/10/3 mg por kg de peso corporal e spray com 70% de etanol. Confirme a anestesia avaliando a ausência de reflexos palpebral e pedal tocando um olho e beliscando um pé, respectivamente.
    2. Pombos anestesia por inalação de 5% isoflurano usando uma caixa de anestesia de indução.
    3. Anestesie peixes e rãs em 1% tricaino em um peixe segurando tanque de água ou solução de anfíbio ringer(Mesa de Materiais), respectivamente.
    4. Anestesie lagartos refrigerando a 4 °C antes da eutanásia.
  3. Decapite o animal com tesoura cirúrgica, descasque a pele com fórceps para expor o crânio, e corte com tesourala lagrange através do foramen magnum (Figura 1A).
  4. Dissecar o cérebro com uma espátula e transferir para um tubo cônico de 15 mL com solução MV-1. Mantenha tubo no gelo.
  5. Recuperar o pituitário da sella turcica do crânio com fórceps e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL com solução MV-1. Mantenha tubo no gelo.
  6. Retire a pele e o músculo para expor a coluna vertebral. Cortar os membros, caixa torácica, e órgãos internos (Figura 1B).
  7. Dissecar a medula espinhal por um dos dois métodos descritos abaixo. Em seguida, transfira para um tubo cônico de 5 mL com solução MV-1. Mantenha tubo no gelo.
    1. Realizar laminectomia cortando em uma direção rostral para caudal com tesoura LaGrange, começando através do foramen vertebralcervical , até chegar ao cordão lombar.
    2. Executar rubor em uma direção caudal para rostral em todo o foramen lombar vertebral com uma agulha de 18 G e seringa de 10 mL carregado com solução MV-1 (Figura 1C,D).
      NOTA: Este método só funciona com espécimes muito pequenos, principalmente roedores (<100 g).
  8. Usando um escopo de dissecação, corte o saco dural da medula espinhal com tesoura de mola e retire as meninges restantes com uma escolha dupla(Figura 2).
  9. Transfira o cérebro para uma placa de Petri e, usando um escopo de dissecação, retire as meninges com uma escolha dupla(Figura 2A-C).
  10. Excise os bulbos e o tálamo olfativos com fórceps, tesouras da íris, e tesouras da mola. Usando a picareta dobro-facetada, remova o plexo choroid de todos os ventrículos do cérebro. Certifique-se de remover todo o plexo choroide.
    NOTA: O plexo choroid e as lâmpadas olfativas são uma fonte maciça de contaminação. Em contraste com o BBB, esses capilares são altamente fenestrated e os resultados dos experimentos subseqüentes serão comprometidos se eles não forem removidos.
  11. Usando fórceps, separe as regiões distintas do SNC: córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico (não em espécimes de mamíferos) e hipotálamo.

3. Dissecção de tecido cns de um grande espécime de vertebrados gyrencefálicos

NOTA: Este protocolo utiliza tecidos snc sinéci obtidos a partir de um matadouro. Portanto, nenhuma anestesia, eutanásia ou necropsia é descrita ou mostrada aqui.

  1. Transporte de tecidos sinitios CNS em um recipiente de histologia de 0,946 L (32 oz) carregado com solução MV-1 dentro de um baú de gelo / balde.
  2. Usando um escopo de dissecação, retire as meninges com uma picareta de duas pontas, fórceps, tesoura de íris e tesouras de mola de cada tecido do SNC. Certifique-se de remover todos os pedaços de plexo choroide do cérebro ventrículos.

4. Homogeneização do tecido do SNC

NOTA: É mais eficiente quando dois investigadores se envolvem no processo de homogeneização: um dissecando as meninges o estereoscópio e o outro homogeneizando os tecidos picados. Desta forma, os tecidos são rapidamente devolvidos ao balde de gelo e mantidos frios.

  1. Coloque cada região cns em uma placa de Petri com ~ 1 mL de solução MV-1. Usando uma lâmina de borda única, picar o tecido para obter 1-2 mm pedaços.
    1. Para um pequeno espécime de vertebrados, use uma placa de Petri de 100 mm x 20 mm.
    2. Para um grande espécime de vertebrados, use uma placa de Petri de 150 mm x 15 mm.
  2. Homogeneização de um pequeno espécime de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3)
    1. Transfira o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e medula espinhal para ~1 mL de solução MV-1 em um moedor de tecido de vidro individual de 10 mL Potter-Elvehjem com um pilão PTFE usando uma pipeta de transferência. Adicione 5 mL de solução MV-1 e homogeneize cada tecido (~10 cursos). Transfira para tubos cônicos individuais de 15 mL. Mantenha tubos no gelo.
      NOTA: Para um pequeno vertebrado, 5 ou 4, com ou sem lóbulo óptico, respectivamente, são necessários 10 moedores mL Potter-Elvehjem e 15 tubos cônicos mL.
    2. Transfira o hipotálamo e o pituitário com fórceps para ~100 μL da solução MV-1 em um tubo individual de 1,7 mL e homogeneize cuidadosamente com um micropestle de vidro. Lave cada micropestle com ~1 mL da solução MV-1. Mantenha tubo no gelo.
      NOTA: Para um pequeno vertebrado, são necessários 2 micropestles de vidro e tubos de 1,7 mL.
  3. Homogeneização de um grande espécime de vertebrado(Tabela 4 e Tabela 5)
    1. Usando uma pipeta de transferência, transfira o tecido picado para um moedor de tecido de vidro De 55 mL Potter-Elvehjem com um pilão PTFE e anexar ao agitador aéreo. Adicione metade do volume recomendado da solução MV-1, de acordo com a parcela específica do SNC sendo homogeneizada(Tabela 5).
    2. Ligue o agitador aéreo em velocidade muito baixa (~ 150 rpm) e mova cuidadosamente o tubo de vidro para cima e para baixo por cerca de 30 s.
    3. Desligue o agitador aéreo, adicione mais solução MV-1 e repita o passo 4.3.2 até obter uma pasta homogênea.
    4. Transfira para um tubo cônico de 50 mL. Mantenha tubo no gelo.
    5. Lave o moedor com água desionizada entre cada homogeneização do tecido do SNC.
      NOTA: Para um grande vertebrado 5 ou 4, com ou sem matéria branca, respectivamente, 50 tubos cônicos mL são necessários. Da mesma forma, dois (2) 15 mL tubos cônicos são necessários para o hipotálamo e pituitário.

5. Purificação de micronavios

  1. Homogeneados de tecido de centrífuga resultantes do passo 4.2.1, 4.2.2, ou 4.3.4 a 2.000 x g para 10 min em 4 °C. Uma grande interface branca de mielina se formará na parte superior das pelotas dos micronavioes avermelhados. Descarte os supernatantes.
    1. Pequeno espécime de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3)
      1. Resuspenda o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e pelotas da medula espinhal em 5 mL de solução MV-2 gelada com uma pipeta sorológica de 5 mL (~10 flushes). Adicione 5 mL de solução MV-2 gelada para cada suspensão e misture cuidadosamente lançando os tubos.
      2. Resuspenda as pelotas hipotálamas e pituitárias com 1 mL da solução MV-2.
    2. Grande espécime de vertebrado(Tabela 4 e Tabela 5)
      1. Adicione 20 mL de solução MV-2 gelada para o córtex, cerebelo, tronco cerebral e pelotas de microvaso da medula espinhal. Resuspenda as pelotas misturando em um revólver do tubo, agitando em 40 rpm para ~5 min. Balance os volumes dos tubos cónicos do córtex, do cerebelo, do tronco cerebral, e das suspensões da medula espinal adicionando mais solução MV-2.
      2. Resuspenda as pelotas de micronavio hipotálamo e pituitário em 5 mL da solução MV-2 com uma pipeta sorológica de 5 mL (~10 flushes). Adicione 5 mL de solução MV-2 gelada para as suspensões e misture cuidadosamente lançando o tubo.
  2. Centrífuga a 4.400 x g por 15 min a 4 °C.
  3. Cuidadosamente destacar a camada de mielina espessa e densa na interface líquida das paredes de cada tubo, girando lentamente os tubos e permitindo que o supernatant passe ao longo das paredes.
  4. Descarte a interface de mielina e líquido e borre a parede interna de cada tubo com uma espátula embrulhada com uma limpeza de papel de fiapos baixo. Para pequenos espécimes de vertebrados, retire a camada de mielina de cada hipotálamo e tubo pituitário por sucção cuidadosamente com uma pipeta de transferência.
  5. Limpe o excesso de líquido com uma limpeza de papel de fiapo rasteiro torcido. Resuspenda cada pelota com 1 mL da solução MV-3 usando pontas low-binding. Mantenha tubos no gelo.

6. Elução e Filtração de Micronavios

  1. Despeje a solução MV-3 gelada em taças individuais para cada região do SNC. Mantenha-se a 4 °C.
    1. Para pequenos espécimes de vertebrados, use 10 mL de solução MV-3 por copo de 50 mL. Um total de 6-7 taças é necessária dependendo se o lobo óptico está incluído ou não.
    2. Para grandes espécimes de vertebrados, use 30 mL de solução MV-3 por copo de 100 mL. Um total de 6-7 taças é necessária dependendo se a matéria branca está incluída ou não.
  2. Coloque um filtro de célula em cima de um tubo cônico de 50 mL. Use um por região do SNC. Use um filtro de 100 μm para o córtex, tronco cerebral, lobo óptico, medula espinhal e pituitário. Use um filtro de células de 70 μm para o cerebelo e hipotálamo.
  3. Molhe cada filtro com 1 mL de solução MV-3 gelada.
  4. Adicione mais solução MV-3 às suspensões preparadas na etapa 5.5 com uma pipeta serológica ao misturar para evitar agregados. Cuidadosamente carregar microvessels em cima do filtro. Enxágüe com a solução MV-3 gelada.
    1. Para pequenos espécimes de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3),adicione 10-15 mL da solução MV-3 com uma pipeta sorológica e lave com 5 mL de solução MV-3.
    2. Para grandes espécimes de vertebrados, adicione 20 mL de solução MV-3 com uma pipeta sorológica e lave com 10 mL de solução MV-3.
  5. Monte a unidade de filtragem colocando um filtro líquido de nylon de 20 μm em um suporte de filtro modificado (Figura 2D),um por região do SNC.
    1. Para pequenos espécimes de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3),use suportes de filtro modificados de 25 mm para o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e medula espinhal. Use suportes de filtro modificados de 13 mm para o hipotálamo e hipólitaria.
    2. Para grandes espécimes de vertebrados(Tabela 4 e Tabela 5),use suportes de filtro modificados de 47 mm para o córtex, cerebelo, tronco cerebral e medula espinhal. Use 25 mm para o hipotálamo e hipólitaria.
  6. Coloque o filtro em cima de um tubo cônico de 50 mL e filtro molhado com 5 mL de solução MV-3 gelada certificando-se de que o buffer desça o suporte do filtro para o tubo cônico.
  7. Transfira os micronavioes eluted (da etapa 6.4) sobre o filtro líquido de nylon de 20 μm e lave os microvessels com 5-10 mL da solução MV-3 ice-cold.
  8. Recupere o filtro usando fórceps limpos e mergulhe-o no copo contendo a solução MV-3 gelada preparada na etapa 6.1.
  9. Desaseasse os microvessels do filtro agitando o delicadamente por aproximadamente 30 s. Para pequenos espécimes de vertebrados, despeje o teor de copo em um tubo cônico de 15 mL. Para grandes espécimes de vertebrados, despeje o teor de taça em um tubo cônico de 50 mL.
  10. Centrífuga a 2.000 x g por 5 minutos a 4 °C e resuspender a pelota em 1 mL de gelo-frio MV-3 solução usando uma ponta de pipeta de baixa ligação.
    1. Para pequenos espécimes de vertebrados, transfira a suspensão (do passo 6.10) para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL e centrífuga a 20.000 x g por 5 min a 4 °C.
      NOTA: Esta rotação é realizada em uma centrífuga bancada a uma velocidade máxima (~ 20.000 x g)para garantir um rendimento robusto.
    2. Para grandes espécimes de vertebrados, transfira a suspensão do passo 6.10 para um tubo de microcentrífuga de 5,0 mL, adicione 4 mL da solução MV-3 e centrífuga a 2.000 x g por 5 min a 4 °C.

7. Imunomanchas

NOTA: A coloração hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada em espécimes de répteis, anfíbios e peixes como prova de conceito da viabilidade do protocolo. Portanto, não há recomendação para imunorotulagem para esses espécimes.

  1. Retire o supernatant dos tubos de microcentrífuga.
  2. Resuspenda a pelota em PBS 1x estéril usando uma ponta de pipeta de baixa ligação(Tabela de Materiais). Mantenha os microvessels de dar forma a agregados pipetting épocas múltiplas. Para pequenos espécimes de vertebrados (Tabela 3),use ~100 μL-2.000 μL de acordo com o tamanho da pelota. Para grandes espécimes de vertebrados (Tabela 5),use ~1.000 μL-4.000 μL de acordo com o tamanho da pelota.
  3. Usando uma ponta de pipeta de baixa ligação, transfira os micronavioes para slides bem, tendo o cuidado de adicioná-los ao centro de cada poço, evitando as paredes laterais.
  4. Definir os slides bem, descoberto, dentro de um BSC-2, e deixe secar por 20 a 30 min em RT.
    NOTA: Um volume relativamente alto de 1x PBS é usado para evitar a formação agregada. Devido a isso, é necessário deixar os slides secar antes da fixação para se certificar de que os micronavioes estão sendo mantidos pelo revestimento de poli-D-lisina.
  5. Remover residual 1x PBS por pipetting para fora com uma pipeta de transferência, adicionar 200 μL de 4% paraformaldeído (PFA) e incubar por 30 min em RT.
  6. Pipette a solução fixa e lavar 3x com 200 μL de 1x PBS por 5 min em RT.
    NOTA: A mancha de H&E em micronavios cns de peixes, anfíbios e répteis foi realizada neste momento.
  7. Adicione 200 μL de bloqueio tampão para o poço slide e incubar por 60 min em 37 °C.
  8. Retire o tampão de bloqueio com uma pipeta de transferência e adicione 200 μL do coquetel de anticorpos primários em diluente de anticorpos(Mesa de Materiais). Incubar a 4 °C durante a noite.
  9. Pipette fora o coquetel de anticorpos primários e lavar 3x com 200 μL de 1x PBS por 5 min em RT.
  10. Carregue o coquetel de anticorpos secundários(Mesa de Materiais)diluído em 1x PBS e incubar por 2 h na RT, protegido da luz.
  11. Pipette fora do coquetel de anticorpos secundários e lavar 3x com 200 μL de 1x PBS por 5 min em RT, protegido da luz. Após a última lavagem destacar quadro do bem slide e borrar-sede qualquer excesso de 1x PBS com uma limpeza de papel de fiapos baixo.
  12. Adicione um coverslip, líquido antifade mountant médio, e 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para coloração nuclear. Deixe secar durante a noite em RT protegido da luz.
  13. Uma vez seco, mantenha-se protegido da luz em uma caixa de slides a 4 °C até que esteja pronto para microscopia confocal e aquisição de dados.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Microvasos isolados do CNS de urina mostraram todos os componentes celulares intrínsecos da unidade neurovascular2,3. Usando molécula de adesão de plaquetas endotelial-1 (PECAM, também conhecida como CD31) ou isolectinA IB4 (uma glicoproteína que liga o glycocalyx endotelilista) para células endotélias, plaquetas derivaram fator de crescimento-β (PDGFRβ) ou antígeno neuronal-glial 2 (NG2) para pericitos e aquaporina-4 (AQP4) para os pés finais ascícticos (Figura 3A,B)demonstra que esses componentes intrínsecos estão presentes em microvasos isolados. As regiões do SNC visíveis incluem os microvasos corticais (Figura 3B),cerebelo (Figura 3C),pituitário (Figura 3D),hipotálamo (Figura 3E), tronco cerebral (Figura 3F), e medula espinhal (Figura 3G). Todos mostraram expressão desses marcadores canônicos.

Da mesma forma, os microvasos mostraram expressão de proteína de junção de aderentes VE-cadherin (Figura 4A,C),proteínas de junção apertadas claudin-5 e zonula occludens-1 (CLDN5 e ZO-1, Figura 4A,D),angulina-1 de proteína de junção tricelular (Figura 4A,E)e marcadores apicobasal C-X-C, quimia ligand 12 e gama-glutamyltransferase 1 (CXCL12 e GGT1, Figura 4A,F). Estes resultados são relevantes porque estas proteínas são indicadores de propriedades BBB-específicas cruciais9,12,13,14. Uma presença limitada de astrócitos, oligodendrócitos e neurônios expressando proteína ácida fibrilária glial (GFAP, Figura 4B,C,G),proteína específica oligodendrocyte (OSP, Figura 4B,G),e neurofilamento médio (NFM, Figura 4B,H),respectivamente, demonstra que microvasos isolados tinham traços negativos de células não neurovasculares indesejadas. Além disso, a maioria dos microvessels era desprovida da expressão do actin do músculo α-liso (αSMA, figura 5B,C). Isso é relevante porque o αSMA é um marcador para células musculares lisas associadas a artérias e ventrículos (Figura 5A),indicando que esse protocolo de isolamento tem como alvo seletivamente micronavios de pequeno calibre15.

Microvasos obtidos de outros pequenos vertebrados lissencefálicos compartilham algumas características morfológicas, como pode ser visto em peixes (sapo e lagarto não mostrado) e microvasos aviários. Isso sugere que este método é útil para uma maior caracterização das diferenças na NVU entre as espécies (Figura 6). Além disso, micronavios cns aviários(Figura 6H-N)mostraram crossreatividade com muitos dos anticorpos desenvolvidos para humanos e camundongos. Isso incentiva uma investigação mais aprofundada de espécimes de aves para estudos biológicos e biomédicos de BBB. Observamos resultados semelhantes quando isolamos microvasos de porcos e macacos, duas espécies gyrencefálicas(Figura 7). Apenas marcadores canônicos nvu em microvasos suínos são mostrados. Além das regiões do SNC acima mencionadas, conseguimos isolar microvasos da matéria branca periventricular(Figura 7B). Isso é relevante porque a matéria branca está implicada em condições neuroinflamatórias (por exemplo, esclerose múltipla16,17,18).

Queríamos descobrir se esse método poderia ser usado como uma ferramenta confiável para determinar mudanças na expressão de proteínas. Sabendo que VCAM-1 e JAM-B foram implicados no processo neuroinflamatório na medula espinhal durante a EAE, decidimos quantitar a expressão dessas proteínas em estágios máximos e crônicos de EAE e camundongos de controle de farsa (10 ratos C57BL/6J de 10 semanas de idade)9,10,11. Para isso, medimos a unidade arbitrária de intensidade (IAI) ao longo do diâmetro das microembarcações. Em seguida, usando um limiar de IMPERMEÁVE 20 AUI para DAPI, calculamos a área a curva (AUC) para VE-cadherin, VCAM-1 e JAM-B para 50 micronavios por região do SNC (Figura 8A,B). Por fim, realizamos ANOVA biviais seguida pelo teste pós-hoc de Sidak para determinar a significância estatística das mudanças na expressão proteica.

Como previsto, observamos um aumento no VCAM-1 e JAM-B ao longo de microvasos da medula espinhal durante o pico da EAE (Figura 8D,E). No entanto, observamos mudanças em outras regiões do SNC não relatadas anteriormente para a EAE. Vcam-1 aumentou significativamente em microvasos pituitários e diminuiu nos microvasos hipotálamos e tronco cerebral. Houve mudanças durante o EAE crônico em todos os tecidos do SNC (Figura 8D). Jam-B aumentou significativamente nos micronavios hipotálamos e pituitários durante eae crônica (Figura 8E). Curiosamente, observamos mudanças na VE-cadherin ao longo de microvasos isolados do hipotálamo e tronco cerebral durante o pico do EAE, o cerebelo durante o EAE crônico (Figura 8C),e uma diminuição na largura do micronavio pituitário durante o pico e EAE crônica. Em geral, esses dados sugerem que este método de isolamento de micronavios é uma ferramenta útil para caracterizar mudanças nos padrões regionais de expressão de proteínas durante a saúde e a doença.

Figure 1
Figura 1: Dissecção eficiente da medula espinhal sem laminectomia. A dissecação da medula espinhal de pequenos espécimes de vertebrados (até 100 g) é realizada de forma mais rápida e eficiente, liberando o cordão em uma direção caudal para rostral em todo o foramen vertebral. Usando tesoura dissecando a cabeça é removida pela articulação do atlas e a coluna vertebral é cortada pelo quadril (A). Todos os órgãos remanescentes são removidos, deixando apenas a coluna vertebral(B). A medula espinhal dentro do lombar foram vertebralen aparece como um círculo branco muito pequeno (<1 mm de diâmetro) em comparação com a largura do cordão cervical (B, setas amarelas). Manter uma abertura estreita no foramen vertebral lombar facilita um gradiente de pressão da lombar para a coluna cervical ao rubor com uma agulha de 18 G e 10 cc seringa carregada com 1x PBS (C e D). Uma vez liberado, a medula espinhal (D,seta amarela) é quase totalmente desprovido do saco dural, e só pia precisa ser removido o escopo de dissecação. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Ferramenta de dissecação de picareta dupla e suporte de filtro modificado. Esta ferramenta de dissecação de 11 cm de comprimento (A)tem dois pontos muito afiados, quase horizontalmente opostos, 2 mm de ponta a ponta (B). Ao aplicar pressão suave para baixo e torcer ligeiramente de forma no sentido horário (C), os pontos incorporar-se horizontalmente nas meninges para que eles possam ser levantadas para cima. Isto é especialmente útil ao remover as meninges do ceebellum, porque permite o acesso à profundidade da cerebelli folia. Também é muito útil ao remover as meninges do tecido cortical, especialmente gyrencephalic. Neste caso, a pia é altamente incorporado com vasculatura de alto calibre que irá comprometer a pureza do isolamento microsevessel. Da mesma forma, facilita a remoção do plexo choroide, que é a fonte mais provável de contaminação. Os suportes do filtro de 47 milímetros, de 25 milímetros, e de 13 milímetros de diâmetro foram cortados a laser para remover o conector de entrada (D)do compartimento superior (E),mas manter o componente peneira (G). Esta modificação permitiu a montagem de uma unidade de filtro(I,J),colocando a rede de filtro de nylon de 20 μm sobre a peneira e parte inferior (G,H), garantindo a rede no lugar ao estragar a parte superior (E). Apenas o suporte de filtro de 25 mm é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Micronavioes isolados de múltiplas regiões do SNC expressaram marcadores de unidade neurovascular canônica. (A) Usando imunorotulagem e microscopia confocal, componentes celulares intrínsecos da NVU são usados para identificar micronavios CNS de urina de urina c57BL/6J adultos (8-14 semanas de idade). Como visto na imagem de fusão para microvasos corticais (B), acima das imagens confocais individuais para o marcador de células endoteliis CD31 (branco), marcador pericyte PDGFRβ (vermelho) e astastroctic marcador de pés finais AQP4 (verde) todos esses componentes celulares são mantidos. Observe que a relação íntima entre células endotélias e pericytes fazê-los aparecer magenta na imagem fundida, enquanto os estascíticos pés finais parecem ter um halo em torno deles (B). O mesmo padrão de expressão é observado para o cerebelo (C),pituitário (D),hipotálamo (E), tronco cerebral (F), e medula espinhal (G,DAPI, mancha nuclear = azul; barra de escala = 10 μm). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: Microvessels expressou proteínas associadas com propriedades BBB-específicas. As células endotélias dentro da unidade neurovascular (NVU) também são descritas pelas proteínas associadas às suas propriedades de barreira intrínsecas (A). Como visto na figura, as células endotelias têm junções feitas de VE-cadherin, CLDN5, ZO-1(A,amarelo), e angulina-1 (A,teal). Eles também exibem polaridade apicobasal para várias proteínas, incluindo GGT-1 e CXCL12 (A,verde e vermelho). Neurônios, oligodendrócitos e corpos de células astrócitos podem ser incluídos nos microvasos isolados, embora não sejam intrínsecos ao NVU (B). Estes são identificáveis pela expressão de NFM (vermelho), OSP (ciano) e GFAP (verde limão), respectivamente (B). Consistentes com estes, nossos microvessels isolados expressaram aderem proteína VE-cadherin(C,vermelho), proteínas de junção apertadaCLDN5 e ZO-1 (D, vermelho e verde, respectivamente, mesclar = amarelo), proteína de junção tricelular LSR (E,verde), e marcadores apicobasal CXCL12 e GGT1 (F, vermelho e verde, respectivamente). Eles também apresentaram quantidades limitadas de GFAP(A,verde, G,branco), OSP (G,verde) e NFM (H,vermelho), sugerindo retenção insignificante de células unitárias não neurovasculares (DAPI, mancha nuclear = azul; barra de escala = 10 μm). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: A maioria dos micronavios isolados não expressa αSMA. A unidade neurovascular exibe uma transição sofisticada do arteriole-capillary-venule (A). expressão anular αSMA identifica claramente o arteriole, e como se torna o capilar, αSMA(B,vermelho) expressão diminui, expondo o marcador mural NG2 (B, verde). Medimos o diâmetro dos vasos αSMA+ e αSMA (suportes brancos, n = 20), para distingui-los como arterioles ou capilares (DAPI, mancha nuclear = barra azul e em escala = 10 μm). A análise de t-teste não emparelhada do diâmetro das embarcações αSMA+ e αSMA-mostrou um alto significado estatístico (C,αSMA+ = vermelho, αSMA- vermelho/verde, ****p < 0.0001). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 6
Figura 6: Isolamento bem sucedido de micronavios do SNC de outras espécies lissencefálicas. O SNC foi colhido de um sapo capturado selvagem (8,2 cm), lagarto (12,7 cm), truta arco-íris criada em tanques (2 anos de idade, 35,6 cm) e pombo criado por aviário (9 meses de idade, ~300 g). Os micronavios do sapo, peixe e lagarto foram manchados por H & E (apenas microvasos de truta são mostrados, barra de escala = 20 μm). Os microvasos de pomboforam imunorotulados. Fomos capazes de identificar micronavios em todas as regiões como rotulados nos contornos do CNS de peixes e pombos: córtex(A e H),lóbulo óptico (B e Eu),cerebelo(C e J),pituitário (D e L), hipotálamo (E e K), cérebros (F e M), e medula espinhal (G e N). Além disso, conseguimos identificar células endotélias com isolectinIB4 (branco), pé-de-fim astrócitico com AQP4 (verde) e neurônios adjacentes com NFM (vermelho) dos microvasos isolados do pombo (DAPI, mancha nuclear = barra azul e escala = 10 μm). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 7
Figura 7: Isolamento de micronavios do SNC de espécies gyrencefálicas. O cérebro e a medula espinhal foram dissecados de um porco criado na fazenda (~6 mês de idade, ~120 kg) para isolamento de micronavios e imunorotulagem. Conseguimos identificar microvasos classificados positivamente para IB4 (branco), PDGFRβ (vermelho) e AQP4 (verde) em todas as regiões do CNS suíno: córtex (A),matéria branca periventricular (B), cerebelo (C),pituitary (D),hipotálamo (E), braintem (F), e medula espinhal (G,DAPI, mancha nuclear = azul, escala = 10 μm). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 8
Figura 8: Exemplo de outra aplicação do isolamento de micronavios do SNC. A expressão de JAB-B e VCAM-1 foi quantificada para microvessels de Murine EAE. Unidades arbitrárias de intensidade (IA) foram medidas para o córtex, cerebelo, hipotálamo, pituitário, tronco cerebral e medula espinhal de camundongos em estágios máximos e crônicos do EAE, com sham como controle (n = 4). Para cada região do SNC, doze micronavios foram avaliados por camundongo para determinar a AUI por fluorocromático e o diâmetro do micronavio (A). Os suportes brancos mostram exemplos da ferramenta de medição de software de microscópio confocal usada para determinar AUI para VCAM-1 (branco), VE-cadherin (verde), JAM-B (vermelho) e DAPI (barra azul, escala = 10 μm). Em seguida, a IA resultante foi traçada contra o diâmetro em mícrons(B)para calcular a área a curva (AUC) para cada proteína imunorotulada como uma estimativa de expressão proteica. A AUC média por grupo foi então analisada pela ANOVA bivial, seguida pelo teste pós-hoc de Sidak, para um total de 48 micronavios por região do SNC. Com exceção dos microvasos pituitários, não observamos grandes diferenças entre o diâmetro do micronavio associado ao estado da doença (C,inserção), mas uma diminuição significativa da expressão ve-cadherin do hipotálamo e tronco cerebral em camundongos EAE (C). Análiseestatística semelhante mostrou um aumento significativo para VCAM-1 (D) e JAM-B (E) na medula espinhal, consistente com o estado neuroinflamatório durante o pico do EAE. Curiosamente, também observamos mudanças para VCAM-1 no hipotálamo, pituitário e tronco cerebral. Estes resultados estão investigação (barras pretas e pontijões = farsa, barras vermelhas e pontijões = pico EAE, barras de salmão e pontijos = EAE crônica, * p <0,05, @p<0,01, #p<0.001, e &p<0.0001). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

MV-1 MV-1 10 mM HEPES
na solução de sal equilibrado de 1x Hank (HBSS) com cálcio e magnésio
MV-2 MV-2 18% 70 kDa peso molecular (MW) dextran
em 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
MV-2 MV-2 20% 70 kDa MW dextran
em 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
MV-3 MV-3 1% de albumina de soro bovino (BSA)
em 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
Fixador Paraformaldeído de 4% (PFA)
em 1x fosfato-buffered soline (PBS) pH 7.4
Tampão da lavagem 1x PBS pH 7.4
Permeabilização e bloqueio buffer 10% BSA
0,25% surfactante nonionic
em 1x PBS pH 7.4
Diluente do anticorpo 5% BSA BSA
0,25% surfactante nonionic
em 1x PBS pH 7.4

Tabela 1: Soluções utilizadas no protocolo.

Passo (s) Ação
4.1 e 4.1.1 Picar na solução MV-1 com uma lâmina de borda única
4,2 a 4,2,2 Homogeneizar na solução MV-1 usando um Potter-ELVJ PTFE ou pilão do microtubo
5.1 Gire a 2.000 x g,4 °C, 10 min
5,1,1 a 5,1,1,2 Resuspender a pelota na solução MV-2
5.2 Gire a 4.400 x g,4 °C, 15 min
5,3 a 5,5 Resuspender a pelota com 1 mL da solução MV-3
6,2 a 6,4,1 Elute sobre um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de célula e enxaguar com solução MV-3
6,5, 6,5,1, 6,6 e 6,7 Filtro com uma rede de nylon de 20 μm no suporte de filtro modificado
6.8 Carregue a rede de nylon no copo de 50 mL com 10 mL da solução MV-3 e agite para 30 s
6,9 a 6,10 Decantar em um tubo cônico de 15 mL e girar a 2.000 x g,4 °C, 5 min
6.10 Resuspender em 1 mL da solução MV-3
6.10.1 Transfira para um microtubo de 1,7 mL e gire a 20.000 x g,4 °C, 5 min
7,1 a 7,3 Resuspenda em 1x PBS e carregue em slides de poços

Tabela 2: Layout para o isolamento de micronavioes vertebrados pequenos. Este gráfico é uma versão resumida do protocolo ao usar um espécime lissencefálico.

Passo (s) Solução Ação Ctx Cbi Optar Bst Sc HYP Poço
4.1 MV-1 MV-1 Mince no prato 100 mm x 20 mm Placa de Petri, 1 mL n/a
4,2,1 e 4,2,2 MV-1 MV-1 Homogeneizar 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem com pilão 1 mL, micropestle
5.1.1.1 e 5.1.1.2 MV-2 MV-2 Resuspend 5 mL + 5 mL, 18% Dextran 1 mL, 20% dextran
5,5 e 6,4,1 MV-3 MV-3 Resuspend 1 mL + 10-15 mL 1 mL
6,2 e 6,4,1 MV-3 MV-3 Tamanho da filtro 100 μm 70 μm 100 μm 70 μm 100 μm
Enxágüe 5 mL 5 mL
6,5, 6,5,1 e 6,7 MV-3 MV-3 Tamanho do filtro, enxaguar Filtro de 25 mm, 10 mL 13 mm, 5 mL
6.8 MV-3 MV-3 Agite na taça 10 mL
6.10 MV-3 MV-3 Resuspend 1 mL
7.2 1x PBS 1x PBS Resuspend 1,5 a 2,0 mL 0,5 a 1,0 mL 0,1 a 0,2 mL
7.3 1x PBS 1x PBS Carga por poço 200 μL 200 μL 100 μL 100 μL 25 a 50 μL
CTX = córtex, CBL = cerebelo, BST = tronco cerebral, OPT = lobo óptico (não presente em mamíferos), HYP = hipotálamo, PIT = pituitário, SC = medula espinhal. Os volumes recomendados são para tecido inteiro de animais que variam em tamanho de 20 g (rato jovem) a 800 g (rato adulto).

Tabela 3: Volume/tamanho recomendados. Este esboço tem o volume recomendado de soluções para o uso de um pequeno espécime de vertebrados que variam de ~ 20-~800 g, ou mais especificamente, o mouse ~ 25 g mostrado no vídeo. O ajuste final dos volumes necessários deve ser determinado pelo pesquisador de acordo com a quantidade específica de tecido úmido obtida após a dissecação. Prática e solução de problemas são altamente recomendados. CTX = córtex, CBL = cerebelo, BST = tronco cerebral, OPT = lobo óptico (não presente em mamíferos), HYP = hipotálamo, PIT = pituitário, SC = medula espinhal.

Passo (s) Ação
4.1 e 4.1.2 Mince em MV-1 com uma lâmina de borda única
4,3 a 4,3,4 Homogeneizar na solução MV-1 usando um moedor Potter-Elvehjem com um pilão PTFE
5.1 Gire a 2.000 x g,4 °C, 10 min
5,1,2 a 5,1,2,2 Resuspender a pelota na solução MV-2
5.2 Gire a 4.400 x g,4 °C, 15 min
5,3 a 5,5 Resuspender a pelota com 1 mL da solução MV-3
6,2 a 6,4 e 6,4,2 Elute sobre um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de célula e enxaguar com solução MV-3
6,5, 6,5,2, 6,6 e 6,7 Filtro com uma rede de nylon de 20 μm no suporte de filtro modificado
6.8 Carregue a rede de nylon em um copo de 50 mL com 30 mL de solução MV-3, e agite por 30 s
6,9 e 6,10 Decantar em um tubo cônico de 50 mL e girar a 2.000 x g,4 °C, 5 min
6.10 Resuspender em 1 mL da solução MV-3
6.10.2 Transfira para um microtubo de 5 mL e gire a 2.000 x g,4 °C, 5 min
7,1 a 7,3 Resuspenda em 1x PBS e carregue em slides de poços

Tabela 4: Layout para o isolamento de micronavioes de vértebras grandes. Este gráfico é uma versão resumida do protocolo ao usar um espécime girofálico.

Passo (s) Soution Soution Ação Ctx Cbi Wm Bst Sc HYP Poço
4.1 MV-1 MV-1 Mince no prato 3 a 5 mL 1 mL
4,3 a 4,3,4 MV-1 MV-1 Homogeneizar 20-30 mL, 55 mL Potter-Elvehjem com pestle & agitador aéreo 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem com pilão
5,1,2 a 5,1,2,2 MV-2 MV-2 Resuspend >20 mL, 20% dextran 5 mL + 5 mL, 20% dextran
5,5, 6,4 e 6,4,2 MV-3 MV-3 Resuspend 1 mL + 20 mL 1 mL + 10 mL
6,2 e 6,4,2 MV-3 MV-3 Tamanho da filtro 100 μm 70 μm 100 μm 70 μm 100 μm
Enxágüe 10 mL
6,5, 6,5,2 e 6,7 MV-3 MV-3 Tamanho do filtro, enxaguar Filtro de 47 mm, 10 mL 25 mm, 10 mL
6.8 MV-3 MV-3 Agite na taça 30 mL 30 mL
6,10 e 6.10,2 MV-3 MV-3 Resuspend 1 mL + 4 mL
7.2 1x PBS 1x PBS Resuspend 2,0 a 4,0 mL 1,0 a 2,0 mL
7.3 1x PBS 1x PBS Carga por poço 200 μL 200 μL 100 μL 100 μL
CTX = córtex, CBL = cerebelo, WM = matéria branca, BST = tronco cerebral, HYP = hipotálamo, PIT = pituitário, SC = medula espinhal. Os volumes recomendados são para amostras de ~45 cm3 para CTX, CBL, BST e SC HYP e PIT inteiro.

Tabela 5: Volume/tamanho recomendados. Este esboço tem o volume recomendado de soluções para o uso de um grande espécime de vertebrados. Mais especificamente, aplica-se às biópsias do tecido do CNS de ~45 cm3 para o córtex, o cerebelo, a matéria branca, o tronco cerebral, a medula espinal, e o hypothalamus inteiro e o pituitary, como mostrado no vídeo. O ajuste final dos volumes necessários deve ser determinado pelo pesquisador de acordo com a quantidade específica de tecido úmido obtida após a dissecação. Prática e solução de problemas são altamente recomendados. CTX = córtex, CBL = cerebelo, WM = matéria branca, BST = tronco cerebral, HYP = hipotálamo, PIT = pituitário, SC = medula espinhal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O BBB inclui as propriedades únicas das células endotélias de microvasculatura cerebral juntamente com uma arquitetura sofisticada de junções apertadas, aderentes, "peg-soquete" e placas de adesão críticas para a homeostasedoSNC2,3,19. As propriedades das células endotélias são induzidas e mantidas pelos pericitos e pelos processos circundantes astroglia end-foot2,3,19. A microvasculatura BBB exibe polaridade (ou seja, o padrão de expressão assimétrica de proteínas localizadas em superfícies de células endotélias luminais ou abluminais)20. Embora isso possa definir brevemente o BBB, na realidade, continua a ser uma das noções mais enigmáticas em neurociência. Por exemplo, diferenças regionais, sexuais e de idade dentro da NVU podem explicar as vulnerabilidades regionais do SNC ao trauma, toxicidade, infecção e inflamação, que podem ter grandes consequências clínicas3,5,6. Outro obstáculo na compreensão do BBB são as diferenças observadas entre a taxa múltipla7,8. Um dos principais obstáculos de compreensão e investigação do BBB é precisamente a dificuldade relacionada ao isolamento da NVU que engloba o BBB, mantendo suas propriedades específicas de barreira14.

Na tentativa de acelerar nossa compreensão do BBB, as diferenças CNS-regionais, bem como as diferenças de espécies, adaptamos métodos publicados anteriormente. Adaptamos com sucesso estes, em particular Boulay et al.21, para obter microvasos de único cortical, cerebellar, hipotalâmico, pituitário, tronco cerebral, e tecidos espinhais em uma miríade de vertebrados lissencefálicos pequenos: peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos (Figura 3, Figura 4 , Figura 5, e Figura 6). Uma vantagem deste método é que suas adaptações são baseadas no tamanho total do tecido do SNC: o pesquisador escolhe a quantidade de solução, tamanho do moedor de tecidos, tubo cônico, suportes de filtro, etc. de acordo com o tecido úmido, independentemente de espécies, sexo e idade. Em nossa experiência com imunorotulagem, um espécime de ~ 20 g produz micronavios suficientes para um slide de 8 poços por córtex, cerebelo, lobo óptico, tronco cerebral e medula espinhal e metade de 8 poços de slide por hipotálamo e hipóvicio. No entanto, o rendimento do lobo cortical e óptico é muito maior em comparação com o cerebelo, tronco cerebral e medula espinhal.

Como mostrado, realizamos as adaptações necessárias para isolamento e imunorotulagem de microvasos cns de suínos e macacos, mamíferos gyrencefálicos maiores que são mais relevantes para a pesquisa translacional (Figura 7). Notavelmente, fomos capazes de incluir matéria branca periventricular apenas nestas espécies. Como o SNC nesses animais é maior, coletamos matéria branca suficiente para nos permitir separar uma pelota de micronavio da camada de mielina durante a segunda centrífugação (passo 5.3, MV-2 com 20% dextran). Nós especulamos que uma massa crítica é necessária para ser capaz de achive esta separação e estamos ativamente buscando como obter um resultado semelhante com o tecido cns murine.

Embora omitimos por uma questão de simplicidade, realizamos imunorotulagem além dos marcadores canônicos da NVU em microvasos de aves, suínos e macacos. Notavelmente, todas as espécies compartilharam marcadores celulares e moleculares previamente identificados em amostras de urina como relevantes para a função BBB (proteínas juncionais VE-cadherin, CLDN5, ZO-1 e LSR e marcadores apicobasal CXCL12 e GGT1) ou nas proximidades de NVU (NFM, OSP e GFAP). Mais uma vez, esses achados incentivam o uso desse método em outras espécies para identificar ainda mais a ortologia e divergência nvu entre as espécies. Também abre a oportunidade para uma investigação mais aprofundada sobre a estirpe NVU, sexo e diferenças de idade dentro da mesma espécie e a viabilidade do uso de outros organismos para pesquisa biomédica BBB. Também mostramos evidências de um uso bem-sucedido deste método de isolamento de micronavios para quantidader alterações nos níveis de expressão de proteínas durante a neuroinflamação (Figura 8). Mesmo que tenhamos realizado este experimento como uma prova de conceito, a abordagem usada aqui é atualmente amplamente explorada em nosso laboratório. Nós favorecemos essa abordagem sobre outros métodos quantitativos (por exemplo, mancha ocidental) porque queremos nos concentrar não apenas no nível de expressão, mas na abundância de proteínas relativas, na realocação de CXCL12 e outras proteínas apicobasal, ligação de proteínas juncionais, etc., dentro do aparecimento complicado dos micronavios cns9,13,22. Da mesma forma, estamos atualmente solucionando nosso método para outras aplicações, como o isolamento adicional de componentes celulares NVU (células endotélias e pericytes), RNA-seq e proteômica23,24,25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Dr. Cruz-Orengo foi apoiado pela Universidade da Califórnia, Davis, Escola de Medicina Veterinária Start Up Funds.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS ThermoFisher BP39920 Used for blocking and antibody diluent.
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713-S Used as fixative (4% PFA)
70,000 MW Dextran Millipore Sigma 9004-54-0 Used for MV-2 solution
Adson Forceps Fine Science Tools (FST) 11006-12 Used for removal of muscle and skin
Adson Forceps, student quality FST 91106-12 Same as above but cheaper
Bovine serum albumin (BSA) Millipore Sigma A7906-100G Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent
Corning 100 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431752-50EA
Corning 70 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431751-50EA
Corning Deskwork low-binding tips Millipore Sigma CLS4151 Same as below but cheaper.
Cultrex Poly-D-Lysine R&D 3439-100-01 Used for slide coating
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 Thermo A21432 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A21202 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 Thermo A21206 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 Thermo A31573 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10029 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Double-Pronged Tissue Pick FST 18067-11 Used for removal of meninges and choroid plexus
Dumont #3c Forceps FST 11231-20 Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)
Dumont #7 Forceps FST 11274-20 Used for CNS tisssue dissection and handling
Dumont #7 Forceps, student FST 91197-00 Same as above but cheaper
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips Eppendorf 22493008 Better quality than the tips above (more expensive).
Extra Fine Graefe Forceps, serrated FST 11151-10 Used for bone removal
Fine Scissors, sharp FST 14060-09 Used for removal of pig and macaque dural sac
Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 Chang Bioscience Inc. (eBay) GP1.5_10 Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Goat anti-CXCL12, biotinylated PeproTech 500-P87BGBT Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.
Goat anti-JAM-B R&D AF1074 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A11001 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 Thermo A21424 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-PDGFRβ R&D AF1042 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 Thermo A21249 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 Thermo 35552 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10021 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth FST 11054-10 Use for nylon filter net holding and shaking
HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium Corning 21-022-CM Used for MV-1 solution
HEPES, 1M liquid buffer Corning 25-060-CI Used for MV-1 solution
Isolectin GS-IB4-Biotin-XX ThermoFisher Scientific (Thermo) I21414 Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
LaGrange Scissors, serrated FST 14173-12 Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)
Millicell EZ slide 8-well unit Millipore Sigma PEZGS0816
Mouse anti-CLDN5 Thermo 35-2500 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-GGT1 Abcam ab55138 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-Human CD31 R&D BBA7 Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL.
Mouse anti-NFM Thermo RMO-270 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-αSMA Thermo MA5-11547 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Nylon Filter Net, roll Millipore Sigma NY6000010 Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 25 mm Millipore Sigma NY2002500 Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 47 mm Millipore Sigma NY2004700 Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
ProLong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher P36935 Used to coverslip slides.
Rabbit anti-AQP4 Millipore Sigma A5971 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-LSR Millipore Sigma SAB2107967 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-NG2 Millipore Sigma AB5320 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-OSP Abcam ab53041 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL.
Rabbit anti-VE-Cadherin Abcam ab33168 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-ZO-1 Thermo 61-7300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-CD31 Becton Dickinson BD 550274 Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-GFAP Thermo 13-0300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rat anti-VCAM-1 Becton Dickinson BD 553329 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Sterile Ringer's Solution, Frog Aldon Corporation IS5066 Used for amfibian anesthesia
Streptavidin-ALEXA 555 Thermo S32355 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647 Thermo S32357 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Surgical Scissors, sharp FST 14002-12 Used for removal of muscle and skin
Surgical Scissors, sharp-blunt FST 14001-16 Used for decapitation (except pig and macaque)
Swinnex Filter Holder, 13 mm Millipore Sigma SX0001300 Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 25 mm Millipore Sigma SX0002500 Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 47 mm Millipore Sigma SX0004700 Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
Triton X-100 ThermoFisher 50-165-7277 Used for blocking and antibody diluent.
Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer VWR (Supplier DWK Life Sciences) 62400-904 (DWK #903475) Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-384 (DWK #357979) Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-372 (DWK #357994) Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. 53208 (2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics