매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

Bioengineering

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Summary

우리는 지방 조직 신진 대사 표현형에 기여에 매트릭스 및 지방 세포의 역할의 해부를 허용하는 시험관 내 3D 인간 세포 외 매트릭스 -adipocyte를 설명합니다.

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Flesher, C. G., Baker, N. A., Strieder-Barboza, C., Polsinelli, D., Webster, P. J., Varban, O. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk. J. Vis. Exp. (153), e60486, doi:10.3791/60486 (2019).

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Abstract

세포외 매트릭스 (ECM)는 조직 항상성을 조절하고 세포와의 크로스 토크에 참여하고 세포 기능의 여러 측면을 조절하는 데 핵심적인 역할을합니다. ECM은 비만에서 지방 조직 기능에 특히 중요한 역할을 하며, 지방 조직 ECM 증착 및 조성물의 변화는 마우스 및 인간에서 대사 질환과 관련이 있다. 글로벌 조직 표현형에 기여하는 ECM 및 세포의 역할의 해부를 허용하는 견인성 체외 모델은 희소하다. 우리는 지방 조직 신진 대사 표현형을 조절에 ECM 및 지방세포의 특정 역할의 연구를 허용하는 인간 ECM-지방세포 문화의 새로운 3D 체외 모형을 기술합니다. 인간 지방 조직은 ECM을 분리하기 위해 탈세포화되며, 이는 이후에 ECM 내에서 성숙한 지방세포로 분화되는 preadipocytes로 다시 채워집니다. 이 방법은 대사적으로 활성화되어 있는 ECM-adipocyte 구조를 생성하고 조직과 환자가 파생되는 특성을 유지합니다. 우리는 인간 지방 조직에서 질병 특이적 ECM-지방 세포 누토크를 입증하기 위해이 시스템을 사용했습니다. 이러한 배양 모델은 글로벌 지방 조직 대사 표현형에 기여하는 ECM 및 지방세포의 역할을 해부하는 도구를 제공하고 지방 조직 항상성을 조절하는 ECM의 역할에 대한 연구를 허용한다.

Introduction

세포외 매트릭스 (ECM)는 조직에 대한 기계적 스캐폴드를 제공 할뿐만 아니라 그 안에 있는 세포와 복잡한 크로스 토크에 종사하여 세포 증식을 포함한 조직 항상성에 필요한 다양한 과정을 조절합니다. 차별화, 신호 및 신진 대사1. 건강한 ECM은 정상적인 조직 기능의 유지에 필수적인 역할을하지만, 기능 장애 ECM은 여러 질병에 연루되어있다2.

지방 조직은 신진 대사 질환의 발병기전에 중요한 역할을합니다. 비만은 과도한 지방세포 비대 및 세포 저산소증, 지방세포 세포 대사의 결함, 지방 조직 산후 염기 및 산화 스트레스 및 염증과 관련이 있습니다. 제대로 이해하는 동안, 이러한 복잡한 과정은 지방 조직 영양소 버퍼링 용량을 손상공모, 지방 조직에서 영양 오버플로로 이어지는, 여러 조직의 독성, 및 전신 대사 질환3,4 ,5. 지방 조직 실패의 기초가 되는 사건 그리고 특정 기계장치의 순서는 제대로 이해되지 않습니다, 그러나 지방 조직 ECM에 있는 변경은 연루되었습니다. ECM 조성물은 인간 및 뮤린 비만에서 지방 조직 내에서 변경되며, ECM 단백질의 증착이 증가하고, 인간 대사 질환과 관련된 지방 조직 ECM의 질적 생화학적 및 구조적 차이와 함께 타입-2 당뇨병과 고지혈증6,7,8,9,10,11.

이러한 관찰에도 불구하고, 지방 조직 기능 장애를 중재하는 지방 조직 ECM의 역할은 잘 정의되지 않는다. 이것은 부분적으로 궁극적인 지방 조직 기능을 조절에 ECM및 지방세포의 특정 역할의 해부를 허용하는 견인 가능한 실험 모형의 부족 때문이. ECM-지방세포 배양은 적어도 2개의 측면에서 네이티브 지방 조직의 생체 내 환경을 더 잘 시뮬레이션한다. 첫째, ECM 배양은 표준 2D 배양에 없는 네이티브 콜라겐, 엘라스틴 및 기타 매트릭스 단백질을 포함한 네이티브 지방 조직과 유사한 분자 환경을 제공합니다. 둘째, 2D 플라스틱에 대한 배양은 ECM 배양이 제거되는 플라스틱기판(12)의탄성 감소로 인한 기계적 효과를 통해 지방세포 대사를 변화시키는 것으로 나타났다.

탈세포화된 지방 및 기타 조직에서 ECM을 분리하여 생물학적 스캐폴드를 설계하는 방법은 재생 및 재생 의학 및 조직 공학 13,14, 15,16,17,18. 우리는 이전에 인간 내장 지방 조직으로부터 유래된 ECM 및 지방세포 줄기세포(preadipocytes)를 사용하여 인간 ECM-지방세포 배양의 체외 3D 모델을 개발하기 위해 이러한 방법을 적용한 방법론을 공표했다11. 본 기사에서는 이러한 방법을 자세히 설명합니다. 인간 지방 조직에 대한 탈세포화 절차는 세포와 지질을 제거하기 위한 기계적 및 효소 적 치료를 수반하는 4 일 간의 과정으로, 유래되는 조직의 특성을 유지하는 생물학적 스캐폴드를 남깁니다. 탈세포화된 ECM은 인간 preadipocytes의 지방 분화를 지원하고, 지방세포로 재구성될 때, 그대로 지방 조직의 미세 건축 및 생화학 및 질병 특이적 특성을 유지하고 대사에 관여합니다. 네이티브 지방 조직의 특징. 이 매트릭스는 단독으로 공부하거나 세포로 다시 시드 할 수 있습니다, 지방 조직의 세포와 세포 외 구성 요소 사이의 상호 작용과 누화의 연구를 허용.

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Protocol

지방 조직은 기관 검토 위원회 승인하에 선택적인 bariatric 수술을 받고 인간 과목에서 조달됩니다.

1. Preadipocyte 격리 및 배양 시약 준비

  1. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 2% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다. 필터 멸균, 4 °C에서 저장합니다.
  2. 타입 II 콜라게나아제 준비: 1x PBS에서 2% BSA에서 2 mg/mL. 사용하기 직전에 준비하십시오.
  3. 적혈구 (RBC) 용해 용액을 준비 : 1.5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3,탈이온수에서 10 mM 디 소듐 EDTA (DI / H2O). 4 °C에서 보관하십시오. 사용 직전에 DI/H2O의 10x 스톡 솔루션에서 1x RBC 용해 솔루션을 준비합니다.
  4. 성장 매체 준비: 15% 태아 소 혈 청 (FBS), 1% 항생제 항 균제 용액 (ABAM) 덜베코의 수정 된 독수리 매체에: 영양 혼합물 F-12 (DMEM/F12). 필터 멸균, 4 °C에서 저장합니다.
  5. Preadipocyte 동결 솔루션을 준비 : 10 % 디메틸 설폭사이드, DMEM / F12 미디어에서 15 % FBS. 필터 멸균, 4 °C에서 저장합니다.
  6. 분화 매체 준비: 10 mg/L 트랜스페린, 33 μM 비오틴, 0.5 μM 인간 인슐린 용액, 17 μM D-판토텐산 헤미칼슘산 염, 100 nM 덱사메타손, 2 nM 3,3,5-트리오도-L-티로닌 나트륨 염(T3), 1 μM 시글리티존 이소부틸-1-메틸산틴(IBMX),DMEM/F12의 1% ABAM. 필터 멸균, 4 °C에서 저장합니다.

2. ECM 시약 제제

  1. 동결 버퍼 용액 준비: 10 mM Tris 염기, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% 페닐메틸설포닐 불소(PMSF)를 DI/H2O. 증빙 용액에 넣고 EDTA를 용해시다. 최대 3개월 동안 HCl 또는 NaOH.Store를 4°C에서 8.0으로 조절합니다.
  2. 효소 용액 #1 준비 : 0.25 % 트립신 - EDTA에서 1 % ABAM. 4°C에서 최대 3개월간 보관하십시오.
  3. 헹구는 완충액 준비: 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4,1.5 mM KH2PO4,1% ABAM, 1% PMSF를 멸균 된 DI / H2O. 소금을 용해시키기 위해 저어줍니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정합니다. 4°C에서 최대 3개월간 보관하십시오.
  4. #2 효소 용액을 준비 : 55 mM Na2HPO4,17 mM KH2PO4,4.9 mM MgSO4∙7H2O, 1 % ABAM, DI / H2O. 스토어에서 1 % PMSF 최대 3 개월 동안. 소금을 녹이도록 저어주세요. 사용하기 직전에, 돼지 췌장에서 80 U /mL 리파아제, 유형 VI-S를 추가하십시오. 160 U/mL 디옥시리보누클리스 I로부터 소 췌장, 타입 II-S; 및 소 췌장에서 100 μg / mL 리보누클아전A, 타입 III-A.
  5. 극성 용매 추출 용액 준비 : 1 % ABAM, 이소 프로판 올에서 1 % PMSF.
    주의: 이소프로판올은 인화성; 인화성 캐비닛을 25°C에 보관하고 인화성 폐기물에 폐기하십시오.
  6. 70% 에탄올, 1% ABAM, DI/H2O에서 1% PMSF를 준비하십시오.
    주의: 에탄올은 인화성; 인화성 캐비닛을 25°C에 보관하고 인화성 폐기물에 폐기하십시오.
  7. 스토리지 솔루션 준비: 1% ABAM, 1x PBS에서 1% PMSF. 4°C에서 최대 3개월간 보관하십시오.

3. 신진 대사 자형질 시약 준비

  1. 포도당 장악
    1. 세럼 기아 미디어 준비: DMEM/F12, 1% ABAM. 필터 멸균 및 4 °C에서 보관
    2. 사용 직전에 1x PBS에 200 nM 인간 인슐린 용액을 준비하십시오.
    3. 200 nM 인간 인슐린, 0.1 mM 2-Deoxy-D-포도당, 1 μCi/well Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3 H(N)]-, 1x PBS에 준비합니다. 사용하기 직전에 준비하십시오.
  2. Lipolysis
    1. PBS에서 희석 된 이소 프로 테레놀을 준비하십시오 : 3 mM 스톡 솔루션. 분석에 대 한 3 μM의 작업 농도 희석.
  3. 오일 레드-O 스테인딩
    1. DI/H2O. 매장에서 4% 포르말린을 실온에서 준비합니다.
    2. 오일 레드-O 작업 솔루션을 준비합니다. 3:2 비율(ORO:DI/H2O)에서 DI/H2O로 오일 적색-O 용액(ORO)을 희석합니다. 사용하기 직전에 준비하십시오. 필터용지(재료 표)를통해 필터링합니다.

4. 지방 조직 조달

참고 : 내장 지방 조직 (VAT)은 외과 의사에 의해 수술 시작 부분에 큰 omentum에서 수집즉시 처리를 위해 얼음에 실험실로 다시 수송된다. 모든 인체 조직 및 부식성 시약을 취급할 때는 완전한 실험실 안전 마모를 사용하고 바늘을 교정하지 않는 등 모든 인체 조직 및 부식성 시약을 취급할 때 보편적인 예방 조치를 사용해야 합니다.

  1. 50 mL 원추형 튜브에 15-25 mL의 동결 버퍼 용액에 5-10 g의 기본 부가가치세를 추가하여 조직 샘플을 담급니다. 세포가 탈셀화될 때까지 샘플을 -80°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
  2. 섹션 5에 설명된 대로 preadipocyte 격리를 위해 별도의 새로운 VAT 샘플을 사용합니다.

5. 프레드포시테 격리

  1. 콜라게나아제, 타입 II, 용액을 50 mL 원점 튜브에 20 mL에 그대로 VAT 2g을 놓습니다. 그런 다음 멸균 가위를 원뿔형 튜브에 삽입하고 튜브 내의 조직을 다듬어 철저히 다듬습니다. 일단 미세 슬러리에 완전히 다진 후, 60 분 동안 130 rpm 및 37 °C에서 궤도 셰이커에 콜라게나제 용액의 조직을 배양합니다.
  2. 100 μm 나일론 메쉬를 통해 결과 굴착된 디지를 신선한 원뿔형 튜브 의 상단에 접힌 메쉬 조각을 통해 하나의 원뿔 튜브에서 파기된 굴착체를 부어 신선한 50 mL 원뿔 형 튜브로 필터링합니다. 이 시점에서 발굴은 소화되지 않은 섬유 조직의 잔류 가닥이 적은 적당한 점도를 가진 노란색 - 주황색 액체여야합니다. 메쉬는 폐기되는 소화되지 않은 조직의 더 큰 조각을 캡처해야합니다.
  3. 샘플을 270 x g에서 10 분 동안 원심 분리. 상급체를 제거하고 파이펫으로 1 x RBC 용해액의 2 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
    1. 25 °C에서 1 분 동안 배양 한 다음 15 % FBS-DMEM / F12의 10 mL를 추가합니다. 원심분리기는 270 x g에서 10분.
  4. 상판을 제거하고 파이펫으로 15% FBS-DMEM/F12의 10 mL에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 세포 현탁액을 파이펫으로 100 mm 페트리 접시로 옮기고 세포가 80-100 % 합류에 도달 할 때까지 37 °C 및 5 %CO2에서배양하고 일반적으로 2-6 일. 2-3일마다 미디어를 변경합니다.
  5. 세포를 분리하고 세척하십시오.
    1. 파이펫으로 매체를 제거하고 부착 셀에 0.25% 트립신-EDTA 의 4 mL를 적용합니다. 37°C에서 10분간 배양하고, 주기적으로 플레이트를 부드럽게 소용돌이치며 세포를 분리합니다.
    2. 15% FBS-DMEM/F12의 20mL를 추가하고 파이펫으로 이 매체의 분리된 셀을 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 신선한 50 mL 원두 튜브및 원심 분리기 270 x g을 10 분 동안 옮긴다.
    3. 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 1x PBS에 세포 펠릿을 한 번 세척한 다음 파이펫으로 신선한 15% FBS-DMEM/F12의 20 mL에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 세포 현탁액을 T-150 배양 플라스크로 옮김을 전달한다.
  6. 37°C 및 5%CO2에서배양 세포. 분할 및 확장 세포 2-3 일 그들은 에 도달 80-100% 합류 7 mL의 적용 하 여 0.25% 트립신-EDTA, 1 플라스크에서 확장 8 플라스크.
    참고 : 이것은 전형적으로 적당한 확장을 허용하고 지방 생성 잠재력 및 환자 및 depot 특정 세포 신진 대사 표현형을 유지하는 3-4 개의 통로를 요구합니다. 4-5 구절을 초과하는 preadipocytes를 통과하는 것은 지중 증식 잠재력의 손실로 이끌어 냅니다.
  7. 상술한 바와 같이 플라스크당 트립신-EDTA 당 7 mL의 7 mL로 8플라스크에서 세포를 분리하고, 10분 동안 37°C에서 배양한다.
  8. 플라스크당 15% FBS-DMEM/F12의 8mL를 추가하고 피펫으로 분리된 셀을 다시 일시 중단합니다. 전체 세포 현탁액을 3개의 50 mL 원점 튜브및 원심분리기를 270 x g에서 10분 동안 고르게 옮긴다.
  9. 15 mL 원뿔형 튜브에서 15% FBS-DMEM/F12의 5 mL에서 결과 세포 펠릿을 다시 중단하고 셀 카운터와 트라이판 블루를 사용하여 셀셀을 카운트합니다.
  10. 세포 현탁액을 270 x g에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 이어서 Preadipocyte 동결 용액에서 세포 펠릿을 1 x 10 6/mL의 최종 세포 농도로 재중단하고, 1.5 mL 극저온 튜브 당 세포 현탁액의 1 mL을 aliquot.
  11. 세포를 -80°C에서 1일 동안 극저온에 보관합니다. 그런 다음 3-6 개월 동안 장기 보관을 위해 액체 질소로 극저온을 옮깁니다.
  12. 사용 준비가 되면 3-5분 동안 37°C 수조에서 1개의 저온 제거물을 해동합니다. 15% FBS-DMEM/F12의 20 mL에서 세포를 다시 중단하고, 원심분리기를 270 x g에서 10분 동안 재혼합니다.
  13. 15% FBS-DMEM/F12의 20 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 단일 T-150 플라스크에 피펫을 넣고, 37°C 및 5%CO2에서2-3일 동안 80% 합류로 성장한다.
  14. 5.6단계에서 전술한 바와 같이 플라스크당 트립신-EDTA당 0.25% 트립신-EDTA의 7 mL로 세포를 분리한다. 15% FBS-DMEM/F12에서 mL당 3백만 개의 셀(즉, 20 μL당 6 x 104 셀)에서 다시 중단하고 아래에 설명된 대로 사용하십시오(섹션 7, 단계 7.4).

6. 지방 조직 ECM 준비

  1. 1일차: 동결해동 및 효소 소화 #1
    1. 동결 해동 이전에 동결 (단계 4.2) 사전 가열 된 수조에서 -80 ° C ~ 37 °C에서 50 mL 원추형 튜브에 동결 버퍼 솔루션에 저장된 VAT 샘플을, 부드러운 주기적인 수동 교반으로 20 분 배양. 해동되면 다시 -80 °C로 옮기고 20 분 간 인큐베이션합니다. 37 °C 수조에서 샘플을 해동하여 끝나는 3x를 반복하십시오.
    2. 멸균 집게를 사용하여 VAT 샘플을 효소 용액 #1 15-25mL가 들어있는 신선한 50mL 원추형 튜브로 전송하여 VAT 샘플이 완전히 침지되도록 합니다. 그런 다음 궤도 셰이커(130 rpm, 37°C)에서 밤새 배양합니다.
  2. 일 2: 효소 소화 #2
    1. 궤도 셰이커에 헹구는 완충액 15-25 mL로 3x 세척하십시오 (130 rpm, 37 °C, 각 세척 20 분). 세척 후 헹구는 완충액을 붓습니다.
    2. #2 15-25 mL의 효소 용액을 함유한 신선한 50 mL 원엽 튜브로 샘플을 옮기고 궤도 셰이커 (130 rpm, 37 °C, 하룻밤)에 배양하십시오.
  3. 3일: 삭제
    1. 궤도 셰이커에 헹구는 완충액 15-25 mL로 3x 세척하십시오 (130 rpm, 37 °C, 각 세척 20 분). 세척 후 헹구는 완충액을 붓습니다.
    2. 샘플을 15-25 mL의 극성 용매 추출 용액을 포함하는 신선한 50 mL 원엽 튜브로 옮기고 궤도 셰이커 (130 rpm, 25 °C, 하룻밤)에 배양하십시오. 이 단계 후, 지질의 대부분은 제거되어야하며, 샘플은 흰색 또는 반투명 색상이어야합니다.
      주의: 극성 용매 추출 용액은 가연성이며 25 °C에서 보관하고 사용해야 합니다.
  4. 4일: 세척 및 보관
    1. 헹구는 버퍼 용액의 15-25 mL를 포함하는 신선한 50 mL 원엽 튜브로 샘플을 옮김. 궤도 셰이커에 3x 시료를 세척하십시오 (130 rpm, 37 °C, 각 세척 20 분).
    2. 시료를 궤도 셰이커에 70% 에탄올 15-25 mL로 3x 세척(130 rpm, 37°C, 각 세척 20분)하여 세척 후 70% 에탄올 용액을 붓습니다.
    3. 오비탈 셰이커에 보관 용액으로 시료를 한 번 세척하십시오(130rpm, 37°C, 각 세척 시간 당 20분).
    4. 멸균 집게를 사용하여 샘플을 15-25mL의 저장 용액을 포함하는 신선한 50 mL 원추형 튜브로 옮김. 충분한 스토리지 솔루션이 샘플을 완전히 침지하는 데 사용되었는지 확인합니다. 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.

7. ECM-지방 세포 준비

  1. 저장된 ECM 단편을 멸균 집게를 사용하여 24웰 플레이트의 개별 우물로 옮김을 전달합니다. 계획된 다운스트림 분석(예: 포도당 섭취 또는 lipolysis, 아래 참조)에 필요한 만큼의 우물에 많은 ECM 단편을 추가하여 중복 또는 삼중항을 포함합니다. 궤도 셰이커에 70 % 에탄올 3 배의 500 μL로 씻어 주세요 (130 rpm, 37 ° C, 각 세척 20 분).
  2. 궤도 셰이커에 멸균 1x PBS로 3x세척하여 ECM을 재수화합니다(130 rpm, 37°C, 각 세척 20분).
  3. 멸균 가위를 사용하여 ECM을 100 mg 조각으로 자르고 무게를 측정하십시오. 멸균 집게를 사용하여 24 웰 플레이트의 각 우물에 100 mg 조각을 놓습니다. 25°C에서 15분 동안 배양하여 과도한 PBS가 조각에서 돌출될 수 있도록 합니다. 파이펫으로 여분의 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.
  4. 각 100 mg ECM 단편을 20 μL의 preadipocyte 세포 현탁액 (mL 당 3백만 세포, 20 μL 당 6 x 104 세포, 15% FBS-DMEM/F12, 단계 5.10에서). ECM에 파이펫 팁을 배치하고 셀 서스펜션을 매트릭스 의 중심으로 부드럽게 배출하여 셀 서스펜션이 오버플로되지 않고 웰의 바닥에 끝나는 것을 주의하여 ECM에 직접 셀을 피펫.
    1. 피펫 팁이 배치된 ECM에서 셀 서스펜션이 오버플로되는 경우 해당 위치에서 팁을 제거하고 ECM의 다른 곳에 삽입합니다. 37°C에서 40분 동안 ECM을 배양하였다.
      참고: 쿼트PCR용 RNA 추출의 경우, 각 500 mg ECM 단편을 100 μL에 3 x 105 세포(즉, 100 μL당 3x 105세포, 15% FBS-DMEM/F12)에 시드합니다.
  5. 24웰 플레이트의 각 웰을 500 μL의 성장 매체로 채우고 시드된 ECM 단편을 덮습니다. 72시간 동안 37°C 및 5%CO2에서 배양한다.
  6. 72시간 후, 조심스럽게 15% FBS-DMEM/F12를 흡인하고, 플레이트를 약간 기울여 미디어가 조각 아래로 풀링되도록 하고, 이를 방해하지 않고 ECM 조각에 인접한 파이펫 팁을 배치합니다. 흡입 후, 500 μL의 분화 매체를 추가하고, 유사한 기술을 사용하여 2-3일마다 배지를 14일의 총 배양 기간 동안 변경한다.
    1. 가벼운 현미경 검사를 사용하여 분화를 확인하십시오 : 세포는 지질을 축적하고 갈색 - 노란색으로 변하고 모양이 더 구형입니다.
      참고: 시드 매트릭스는 대사 검사(예를 들어, 포도당 섭취 분석, 탈분해 분석, ORO), 조직학 또는 면역 조직화학(IHC) 또는 표준 조직 이미징에 사용될 수 있다. 고정 조직 ORO 염색 및 이미징을 위해 액체 질소에서 ECM-지방 세포 샘플을 동결하십시오.

8. 신진 대사 자형질

  1. 주사 전자 현미경 검사법
    1. 소렌센의 인산 완충액에서 2.5% 글루타랄데히드에 있는 샘플을 25°C에서 12시간 동안 12시간 동안 소렌슨의 인산 완충액에서 4°C에서 1시간 동안 4°C에서 오스뮴 테트옥사이드에 붙입니다.
    2. 에탄올에서 샘플을 연속적으로 탈수합니다. 헥사메틸리살리잔으로 씻고 공기건조로 씻어내십시오. 그런 다음 콜로이드 흑연으로 주사 전자 현미경 스텁에 장착하십시오. 골드가 있는 스퍼터 코트.
    3. 주사 전자 현미경으로 이미지를 캡처합니다.
  2. 오일 레드-O 스테인딩
    1. 살아있는 조직: 오일 레드-O 솔루션
      1. 조심스럽게 파이펫 우물에서 미디어를 흡인. 그런 다음 잘 당 1 x PBS의 500 μL로 한 번 샘플을 씻어.
      2. 200 μL의 4% 포르말린을 멸균 된D2O에서 15 분 동안 25 °C에서 수정하십시오. 피펫으로 포르말린을 흡기, 1 x PBS (각 세척 500 μL)로 시료를 두 번 세척하십시오.
      3. 25°C에서 60% 이소프로판올 시료 200 μL을 5분 동안 첨가합니다.
      4. 오일 레드-O 작업 용액을 25°C에서 5분 동안 얼룩시고, 파이펫을 사용하여 오일 레드-O를 흡입한 다음 1x PBS(각 세척시 500 μL)로 샘플을 3x 세척합니다. 그런 다음 광학 현미경으로 이미지.
    2. 고정 조직 : 오일 레드 O 얼룩 키트
      1. 최적 절삭 온도 (OCT) 화합물 및 저온 저온 에 섹션 (5 μm)에서 플래시 동결 ECM -adipocyte 샘플.
      2. 슬라이드를 DI/H2O에 85% 프로필렌 글리콜을 2분 동안 2분 동안 놓고 60°C에서 ORO 얼룩에 슬라이드를 놓습니다.
      3. 오일 레드-O 염색 키트에서 수정된 메이어의 헤마톡실린에 슬라이드를 1분 동안 놓고 수돗물로 슬라이드를 두 번 헹굽습니다. DI/H2O로 슬라이드를 두 번 헹구십시오.
      4. 현미경에 수성 장착 매체와 이미지를 사용하여 커버 슬립을 장착합니다.
    3. 쿼트PCR용 ECM에서 RNA 추출
      참고: RNA 수율을 최대화하려면 100 μL에 3 x 105 preadipocytes로 시드된 500 mg ECM 조각을 사용하고 웰당 3 mL의 분화 매체에서 위와 같이 분화하십시오.
      1. 일단 분화되면, 멸균 집게를 사용하여 얼음에 50 mL 원추형 튜브로 각 개별 ECM-adipocyte 샘플을 전송합니다.
      2. 완충RLT 500 μL로 잘 비워주세요. 일치하는 ECM-지방세포 샘플로 버퍼 RLT를 50 mL 원점 튜브에 추가합니다.
      3. 멸균 가위를 사용하여 50 mL 원뿔 튜브 내에서 각 ECM-adipote 샘플을 미세하게 다진 후 튜브를 얼음 위에 유지하면서 가위를 원뿔 튜브에 삽입하여 조직을 다듬습니다.
      4. 원원관을 -80°C에서 37°C로 완전히 동결 및 해동합니다.
      5. 원심분리기 원유관은 500 x g, 4°C에서 10분 동안.
      6. 조심스럽게 피펫으로 상류를 제거하고 섬유 조직 RNA 추출 키트(재료 표)로RNA 추출에 사용하십시오.
  3. 포도당 섭취 분석
    1. 전술한 바와 같이 24-웰 플레이트에서 분화 배지의 0.5 mL에서 100 mg ECM 단편에서 6 x 104 프readipocytes를 분화한다(섹션 5).
    2. 분화 14일 후, 배지를 제거하고 1x PBS로 ECM-지방세포를 1회 세척하였다. 0.5 mL/웰 혈청 기아 배지와 배양액을 37°C에서, 12시간 동안 5%CO2를 첨가합니다.
    3. 중간 크기의 세포를 제거하고 1x PBS로 두 번 씻으소서. PBS 및 배양에 0.5 mL/well 2% BSA를 37°C, 2시간 동안 5%CO2를 추가합니다.
    4. 세포를 1x PBS로 한 번 씻고, 200 nM 인슐린의 유무에 관계없이 0.5 mL/well 1x PBS를 추가하고, 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
    5. 흡기 1x PBS, 0.1 mMM/well 1X PBS를 0.1 mMM 2-데옥시-D-포도당, 2 μCi/mL데옥시-D-포도당, 2-[1,2-3 H(N]], 200 nM 인슐린 유무에 관계없이, 37°C 및 5%CO2에서 배양하고 40분 사용 규약에 대해 모든 사용 규격을 위해 40분 사용 규약 방사성 시약 및 폐기물, 지역 기관 규제 법령에 의해 위임.
    6. 파이펫으로 배지를 제거하고 1x PBS로 셀을 3x 세척합니다. DI/H2O에 1% SDS 용액 420 μL을 추가하고 활발한 파이펫팅으로 세포를 용해시합니다. 10 분 동안 25 °C를 배양하십시오.
    7. 브래드포드 단백질 분석에 대해 각 우물에서 5 μL을 수집합니다. 잔여 세포 의 400 μL을 2 mL의 침전 바이알에서 송신 액으로 옮김을 전달합니다. 번광 카운터에서 3H-2DG 활동을 계산합니다. 단백질, mg/mL로 정규화된 분당 카운트로 데이터를 분석합니다.
  4. Lipolysis 분석
    1. 전술한 바와 같이 24-웰 플레이트에서 인간 분화 배지의 0.5 mL에서 100 mg ECM 단편에서 6 x 104 프readipocytes를 분화한다(섹션 5).
    2. 분화 14 일 후, 배지를 제거하고 따뜻한 1x PBS로 세포를 두 번 씻으하십시오. 0.5 mL의 혈청 기아 배지(인슐린 제외)를 3 μM 이소프로테레놀 유무에 추가하고, 배양 지방세포는 37°C에서, 배양 지방세포는 72시간 동안 5%CO2를 첨가한다.
    3. -80°C에서 분석준비가 될 때까지 보관될 수 있는 배양 상피제를 수집한다. 데이터 정상화를 위한 DNA 정립을 위해 미세 원심분리기 튜브에서 ECM을 수집합니다.
    4. 96 웰 마이크로 플레이트에 각 상급의 파이펫 2 μL. 트리글리세라이드 측정 키트에 제공된 블랭크(증류H2O)및 글리세롤 표준 용액을 위한 유정을 예약하십시오.
    5. 트리글리세라이드 결단 키트에서 270 μL의 프리 글리세롤 시약을 각 우물에 넣고 파이펫을 섞어 보세요. 37°C에서 5분 동안 배양플레이트.
    6. 마이크로 플레이트 분광광도계에서 540 nm에서 흡광도를 측정합니다.
    7. 글리세롤의 농도를 계산하고 ECM에서 DNA로 정상화 :

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Representative Results

지방 조직 ECM의 준비, preadipocytes와 파종, 성숙한 지방 세포로 시험관 내 분화는 프로토콜 전반에 걸쳐 진행의 시각적 평가를 허용하는 조직에 명확한 순차적 형태 변화를 초래(그림 1) . ECM을 종하는 데 사용되는 Preadipocytes는 별도의 VAT 샘플로부터 콜라게나아제 소화를 사용하여 분리됩니다(그림2). 처리의 각 단계에서 ECM-adipocyte 구성의 주사 전자 현미경은 ECM의 탈세포화 및 재종 및 분화 시 지질 함유 지방세포의 후속 재캡을 밝혀냅니다(그림 3). 비세포화된 ECM의 콜라겐 1특이적 면역조직화학은 콜라겐 미세아키텍처의 유지를 밝혀내고, 오일 레드-O 염색은 살아있는 3D ECM-adipocyte 구조가 지질 함유지방세포(그림 4)를 밝혀냅니다. A).ECM에서 분화된 지방세포로부터의 qrtPCR은 ECM에서 배양된 미분화 preadipocytes에 비해 지방형성 유전자의 현저한 업조절을 입증한다(도4B). ECM-adipocyte 의 대사 자형질은 당뇨병 (DM) 및 비 당뇨병 (NDM) 과목에서 ECM과 지방세포의 모든 조합을 연구하는 데, NDM에 비해 DM에서 ECM-adipocyte 구성부에서 손상된 포도당 섭취 및 지방분해 기능을 밝혀냅니다. 조직, 우리가 이전에 표준 2D배양11에서인간 지방세포에서 보고한 DM 특이적 대사 결함을 되풀이한다. 중요한 것은, NDM ECM은 DM 지방세포에서 인슐린 자극 포도당 섭취량 및 지방분해 능력을 구출한다(도 4C)11. 함께, 이러한 데이터는 ECM에 의해 지방세포 세포 대사의 질병 특이적 조절을 입증한다. 자세한 내용은 Baker et al.11에보고됩니다.

Figure 1
그림 1: ECM-지방세포 준비를 위한 워크플로우. 일 1: 전체 내장 지방 조직 샘플 은 효소 소화 용액 #1 하룻밤 배양 다음 세 동결 해동 주기를 겪는다. 2일차: 효소 용액#1소화후, 효소 소화 액으로 밤새 소화됩니다#2. 이 시점에서 샘플은 부분적으로 삭제됩니다. 3 일: 효소 소화 #2 후, 샘플은 극성 용매 추출 용액으로 밤새 배양을 거쳐 지각을 완료합니다. 3일째 가지나면, 샘플은 완전히 삭제되고 흰색/반투명색이어야 합니다. 시료는 헹구 버퍼 용액으로 70% 에탄올로 철저히 세척하고 preadipocytes로 재시딩할 준비가 될 때까지 40°C의 저장 용액에 보관합니다. 일 4: Preadipocytes는 14 일 동안 지방 분화에 선행된 탈세포화 된 VAT로 씨를 뿌입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: preadipocyte 격리를 위한 워크플로우. 부가가치세는 다진, 콜라게나제로 소화, 여과, 원심 분리, 그리고 그 결과 스트로모 혈관 세포 펠릿 도금 및 preadipocytes를 확장하기 위해 배양. 인간의 preadipocyte 격리 및 2D 지방 세포 문화에 대한 자세한 내용은 Baker et al. 201721을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 전자 현미경 이미지 스캔. 그대로 지방 조직, 탈세포화된 지방 조직 및 탈세포화된 지방 조직을 14일 동안 지방분화 매체에서 분화하고 preadipocytes로 재채우체화한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: ECM에서 지방세포의 특성화. (A)세포화 지방 조직 ECM은 미세 아키텍처를 유지하고 지방 세포 분화를 지원합니다 : 상단 : 콜라겐 1 전체 인간 VAT의 면역 조직 화학작용은 세포화 전후의 유지 보수를 입증합니다. 마이크로 아키텍처; 중간: ECM 내의 살아있는 인간 지방세포의 3D 공초점 현미경 사진; 그대로 오일 레드-O로 염색된 인간 VAT는 포디포세포로 재시딩하기 전에, 파종 후 4일, 그리고 14일 후, 지방분화에 이어 preadipocytes로 파종한 후; 파란색: 세포 핵의 DAPI 염색; 레드: 세포 내 지질의 오일 레드-O 염색; 바닥: 포르말린 고정, 파라핀 내장, 5 μm 단면, 탈세포화 전, 탈세포화 직후, 탈세포화 후, 그리고 탈세포화 후, 프레이드포시포시드 시딩 및 14일간의 지방분화, ECM 내의 지방세포에서 세포질 지질 축적을 입증. (B)ECM 업조절 지방분인 유전자 발현의 지방세포: vat ECM에서 분화된 인간 VAT 지방세포로부터 RNA에서 의 지멸 유전자 전사체 수준을 비교한 qrtPCR 분석은 VAT ECM에서 미분화 된 preadipocytes에 비해 14 일 동안 VAT ECM에서 분화 노나디포제닉 배지에서 72시간 동안 배양됩니다. 데이터는 평균 ± SEM. ACLY: ATP 구연산 리아제, ATGL: 지방성 트리글리세라이드 리파제, FASN: 지방산 신타제, PPARg: 퍼옥시좀 증식 활성 수용체 감마; 좌표: 미분화 preadipocyte 참조 =1에 비해 성숙한 지방세포에서 성적 증명서 수준의 접기 차이; 모든 접기 차이 유의(p&0.001, 페어링된 t-검정); 10과목으로부터의 ECM, n=11과목으로부터의 preadipocytes/지방세포. (C)ECM은 DM 특이적 방식으로 지방세포 대사를 조절합니다: DM 또는 NDM 피험자로부터 preadipocytes로 씨를 뿌린 DM 또는 NDM 피험자의 3D-ECM, 지방세포로 분화하고, 대사 자형질로 연구하였다. ECM 및 지방세포(ECM/AD)의 환자 소스(NDM, DM)로 표시된 데이터 막대; 예를 들어, NDM/NDM은 NDM 환자에서 파생된 ECM 및 preadipocytes를 모두 나타내며, NDM/DM은 DM 환자의 preadipocytes와 결합된 NDM 환자의 ECM을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SEM. 좌표: 포도당 섭취량 (cpm), ECM/세포 매해 단백질 농도로 정규화(mg/mL); lipolysis: 배양 상피 글리세롤 농도 (mg/mL) ECM/세포 용해 DNA 농도정상화 (ng/mL); * p&0.050, **p&0.100 DM/DM 암에서 해당 데이터 포인트(포도당 섭취량, 기저 또는 이소프로테네놀 자극에 대한 기저 또는 인슐린 자극)와 표시된 데이터 포인트를 비교하고, 반복에 대한 혼합 모델 분석 조정을 사용하여 대책; N =9 NDM에서 ECM, 8 DM 과목, 10 NDM에서 preadipocytes, 9 포도당 섭취에 대한 DM 과목; 6 NDM에서 ECM, 6 DM 과목, 6 NDM에서 preadipocytes, 6 지방 분해를위한 DM 과목. 이 수치는 오루크와 루멘11에서채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

ECM-지방세포 배양 모델은 궁극적인 조직 표현형을 지시하는 ECM 및 세포의 개별적인 역할을 해부하기 위한 귀중한 공구를 제공합니다. ECM 격리 프로토콜은 매우 재현 가능하지만 탈세포화 과정의 가변성이 관찰될 수 있습니다. 3일째 삭제 단계는 프로토콜의 중요한 지점입니다. 하룻밤 추출이 완료되면 매트릭스는 노란색으로 변하는 극성 용매 용액에 의해 입증되어야하며, 매트릭스는 손상되지 않은 지방 조직의 노란색 - 주황색 특성에서 반투명 / 흰색(그림 1)을참조하십시오. 이러한 색상 변경이 발생하지 않으면 삭제가 완료되지 않을 수 있습니다. 지질 효율성에 있는 환자 간 가변성은 일반적입니다, 그러나 현재까지 우리는 대상 DM 상태, 나이, BMI, 또는 그밖 임상 변수를 가진 삭제의 효율성의 어떤 상관관계도 관찰하지 않았습니다. 큰 샘플 (20g 이상)은 효율적인 지질 검사를 받지 않습니다. 처리 샘플 <20 g는이 문제를 방지 할 수 있습니다. 3일차 이후에 시료가 완전히 제거되지 않으면 샘플을 멸균 가위로 반으로 나누고 샘플을 신선한 15-20 mL의 극성 용매 추출 용액으로 옮기고 궤도 셰이커에 3-5 시간 동안 놓습니다. 일부 샘플은 극성 용매 추출 단계를 반복한 후 완전히 탈셀로화되지 않을 수 있습니다. 대부분의 시료가 탈세포화되는 경우, 실험에서 샘플을 사용하기 전에 지질을 함유하는 단면도를 잘라낼 수 있다.

공정 전반에 걸쳐 멸균이 부지런히 유지되지 않으면 오염이 발생할 수 있습니다. 모든 작업은 표준 세포 배양 예방 조치를 사용하여 층류 후드에서 수행되어야한다. 우리는 일반적으로 4 °C에서 최대 3 개월 동안 ECM을 저장하고 액체 질소에서 최대 6 개월 동안 preadipocytes를 저장합니다. 생체 기능 성 및 질병 및 이 시간 이후 의 서비스 센터 특정 속성의 보존은 테스트 되지 않았습니다.

공초점 현미경 검사법은 오일 적색 O 염색으로 강화될 수 있는 ECM 내의 성숙한 지방세포의 시각화를 허용합니다. 스캐닝 전자 현미경(SEM)은 또한 ECM 내에서 지방세포를 시각화하는 비정량적 방법을 제공한다. 참고로, SEM 및 오일 레드-O 염색은 ECM-adipocyte 구조에서 단구형 지방세포, 생체 내 지방세포와 유사한 형태이며, preadipocytes가 지방분인을 겪을 때 관찰되는 전형적인 다구형 지방세포와 는 대조적으로 제안합니다. 2D 플라스틱의 차별화(그림 3, 그림 4A). 이 관찰은 ECM이 플라스틱에 대한 표준 조직 배양보다 지질 분화를 위한 보다 생리적 환경을 제공한다는 것을 시사한다. OCT 임베디드 구문은 깨지기 쉽고 쉽게 단면도되지 않기 때문에 ECM-adipocyte 구문의 고정 및 단면화가 어려울 수 있습니다. -80°C 냉동고에서 제거한 직후 임베디드 조직을 분리하고 미리 냉각된 저온 극저온에 있는 냉장실(4°C)에서 단면을 수행하면 단면화가 가능합니다.

ECM-지방세포 배양은 생체 내 지방 조직 환경을 근사화하고 지방세포 줄기세포 성장 및 분화를 위한 지속 가능한 환경을 제공하는 생리적 환경을 제공하며, 지질학적 유전자의 상류조절에 의해 입증된 바와 같이 3D-ECM-지방세포 배양 문화. ECM-지방세포 배양은 또한 포도당 섭취 및 지방분해를 포함하는 지방세포 대사 기능에 관여한다8. 우리는 브래드포드 분석기로 측정된 ECM-adipocyte 문화에서 추출된 총 단백질 또는 DNA 분석 키트로 측정된 DNA 함량으로 cpm이 정규화됨에 따라 포도당 섭취를 보고하고 두 가지 방법으로 유사한 결과를 관찰했습니다. 유사하게, 우리는 단백질 또는 DNA에 정규화된 글리세롤 방출의 mg/mL로, 또한 정규화 방법으로 얻은 유사한 결과로 lipolysis를 보고합니다. 다른 지질 콘텐츠에 지방 세포 대사 데이터를 정상화 제안, 하지만 현재까지 안정적으로 ECM 구조에서 지질추출 하는 우리의 시도 실패 되었습니다. 시간 단위당 포도당 섭취량을 두더지로 보고하고 시간 단위당 글리세롤/유리 지방산의 두더지로서 지방분해는 별도의 실험 간의 보다 정확한 비교를 허용할 수 있습니다. qrtPCR 분석을 위한 ECM으로부터의 RNA의 분리는 2D 배양에서 세포에 비해 낮은 수율을 특징으로 하지만, 더 많은 세포를 시드한 더 큰 ECM 단편의 제제는 8.3.1단계에서 설명한 바와 같이 이러한 문제를 극복한다. 우리는 모형의 한계를 나타내는 서쪽 얼룩 분석을 위한 인산화한 으로 적당량을 비분해되지 않은 단백질을 그대로 격리하는 데 어려움을 겪었습니다.

지방 조직에서 ECM을 분리하고 preadipocytes를 가진 파종을 위한 유사한 방법론은 ECM이 cAMP 주선염을 포함하여 지방 분화 결석 고전적인 지방 분화 중재자를 승진시킬 수 있다는 것을 건의하는 기록과 함께 이전에 간행되었습니다, 인슐린, 및 PPAR-γ 아고닉스12,14. 우리의 데이터는 지방 조직에서 ECM에 의한 세포 대사의 질병 특이적 조절을 입증하는 첫 번째, 지방세포가 고전적인 지방 분화 인자11로자극되는 방법을 사용하여; 지방 자극의 부재에서 유사한 연구는 미래 연구의 대상입니다. 그 외는 폐 조직 으로부터 분리된 ECM 및 세포를 사용하여 유사한 질병 특이적 ECM 세포 누담을입증했다 19,20. 펩타이드하이드로겔(12)에서균질화된 지방조직 ECM 제제를 혼합하여 매트릭스의 생성을 포함하는 대체 전략도 채택되었다.

인간 지방세포 세포 대사에서 환자 간 가변성은 2D-플라스틱 및 3D-ECM 배양모두에서 관찰되지만, 이 세포는 집단으로 분석될 때, 이 세포는 세포 대사에 있는 질병, 창고 및 성별 특정 다름을 명시합니다, 에 의해 기술된 바와 같이 우리 그룹 및 기타11,21,22,23,24, 지방 세포 세포 대사 의 연구를위한 이러한 배양 모델의 유용성과 일반화성을 검증. 우리는 질병 일치 ECM에서 분화 된 지방 세포체 (즉, NDM ECM의 NDM 지방세포, DM ECM의 DM 지방세포)가 표준 2D 배양에서 분리 된 NDM 및 DM 지방세포의 대사 표현형을 재입증하여 ECM-지방세포 배양체로서 지원한다는 것을 입증했습니다. 더 생리적인 환경에서 지방 세포 세포 대사에 질병 특정 변경을 공부하기위한 모델. 우리는 동일하거나 다른 기증자에서 ECM 그리고 지방세포가 공부될 때 포도당 장악 또는 지방 분해를 포함하여 신진 대사 기능의 규모 또는 방향에 있는 다름을 관찰하지 않았습니다. 두 경우 모두, ECM-adipocyte 구성 매니페스트 DM 특이적 대사 표현형 (예를 들어, NDM/NDM 구조에 비해 DM/DM에서 감소 GU), 동일 하거나 다른 기증자에서 ECM 및 지방 세포로 구성 된 구성을 비교할 때 명확한 차이 없이 .

ECM-지방세포 배양은 ECM과 preadipocytes의 조합을 별개의 환자 인구 및 조직 창고에서 연구의 연구를 허용, 궁극적 인 지방 조직 대사에 ECM 및 지방 세포의 질병 및 창고 특정 기여의 분석을 허용 형. ECM-지방세포 배양 모델의 이러한 강도를 입증하는, NDM 조직에서 ECM은 DM 지방세포에서 대사 결함을 구출할 수 있는 능력을 갖는다는 것을보여주었다(도 4C)11. 뮤린 내장 및 피하 지방 조직에 있는 예비 데이터는 뮤린 ECM이 창고 특정 방식으로 유사하게 뮤린 지방세포 대사를 통제한다는 것을 건의합니다 (미공개 데이터, O'Rourke RW, 2019), 이 모형 시스템이 공부하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 건의합니다 뮤린과 인간 시스템 모두에서 ECM-지방 세포 크로스 토크. 게다가, 이 모형은 지방 조직 표현형을 통제하는 수단으로 ECM의 고립된 조작의 연구 를 허용합니다. ECM을 특이하게 표적으로 하는 당화화를 유도하는 조건에서 처리된 ECM의 예비 연구 결과는, 예를 들면, 이 수정이 처리된 ECM으로 연속하여 시드된 세포의 세포 대사 표현형을 조절한다는 것을 건의한다(미공개 데이터, O'Rourke RW, 2019), 지방 세포 표현형에 대한 ECM의 표적 조작의 효과에 대한 연구를 위한 모델을 제공합니다.

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Disclosures

저자는 상충하는 이해관계를 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

다니엘 버거, 마릴린 우드럽, 시몬 코레아, 레타 가이스에게 연구 조정에 도움을 주신 것에 감사드립니다. SEM은 미시간 대학 현미경 검사법 및 이미지 분석 실험실 생물 의학 연구 핵심 시설에 의해 수행되었습니다. 이 프로젝트는 NIH 보조금 R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), 재향 군인 업무 공로 그랜트 I01CX001811 (RWO), 미시간 당뇨병 연구 센터 (NIH 그랜트 P30-DK020572)에서 파일럿 및 타당성 부여 (RWO), 재향 군인 관리 VISN 10 스파크 파일럿 그랜트 (RWO). 미시간 대학 현미경 검사법 및 이미지 분석 실험실 생물 의학 연구 핵심 시설에 의해 수행 된 주사 전자 현미경 검사법. 이 원고의 그림 4는 원래 베이커 외, J 클린 엔도 Metab 2017에 게시되었습니다; 3월 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, 옥스포드 대학 출판부 [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]의 허가에 의해 복제되었습니다. 이 자료를 재사용할 수 있는 권한을 받으려면 http://global.oup.com/academic/rights 방문하십시오.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#25200056
1.5 mL cryovial tube Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#02-682-557
10% Neutral Buffered Formalin VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#89370-094
100 µm nylon mesh filter Corning Inc., Corning, NY, USA Cat#352360
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#T6397
24-well tissue culture plates VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#I5879
96-well tissue culture plates VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#15240062
Biotin Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#A8806
Buffer RLT Qiagen, Hilden, Germany Cat#79216
Ciglitizone Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA Cat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#D4513
Dexamethasone Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#D4902
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#BP231 Flammable, caustic
Disodium EDTA Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium salt Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#11320033
Ethanol Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA Cat#DSP-MD.43 Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#10437028
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#G5882 Caustic
Hexamethyldisalizane Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#440191 Flammable, caustic
Human insulin solution Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#I9278
Isopropanol Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#A415 Flammable
Isoproterenol Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#I5627 Flammable
KCl Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S25484
KH2PO4 Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-S Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#L0382
MgSO4*7H2O Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#230391
Na2HPO4 Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S5136
NaCl Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S3014
NaHCO3 Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#S233
NH4Cl Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compound Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK Cat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO) Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#O1391
Oil Red-O Stain Kit American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA Cat#KTORO-G
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#201030 Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#93482 Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit Qiagen, Hilden, Germany Cat#74704
Scintillation Fluid Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate buffer Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ CAS #: 10049-21-5
T-150 culture flask VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master Mix ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer Benchmark Scientific Cat#D1030
Transferrin Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#T3309
Triglyceride Determination Kit Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4% VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10027-446
Type II collagenase Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#WHA5201150

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References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213, (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93, (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145, (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22, (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306, (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24, (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299, (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102, (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233, (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31, (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7, (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57, (1), e4 (2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5, (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9, (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186, (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124, (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8, (8), e71165 (2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55, (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18, (10), 1875-1880 (2010).

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