Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Describimos un sistema de cultivo in vitro de matriz-adipocitos extracelulares humanos 3D que permite la disección de las funciones de la matriz y los adipocitos en contribuir al fenotipo metabólico del tejido adiposo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Flesher, C. G., Baker, N. A., Strieder-Barboza, C., Polsinelli, D., Webster, P. J., Varban, O. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk. J. Vis. Exp. (153), e60486, doi:10.3791/60486 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La matriz extracelular (ECM) desempeña un papel central en la regulación de la homeostasis tisular, participando en la conversación cruzada con las células y regulando múltiples aspectos de la función celular. El ECM desempeña un papel particularmente importante en la función del tejido adiposo en la obesidad, y las alteraciones en la deposición y composición del ECM del tejido adiposo se asocian con enfermedades metabólicas en ratones y humanos. Los modelos in vitro tractables que permiten la disección de las funciones del ECM y las células para contribuir al fenotipo tisular global son escasos. Describimos un novedoso modelo 3D in vitro del cultivo humano ECM-adipocyte que permite estudiar las funciones específicas del ECM y los adipocitos en la regulación del fenotipo metabólico del tejido adiposo. El tejido adiposo humano se descelulariza para aislar la ECM, que posteriormente se repobla con preadipocitos que luego se diferencian dentro del ECM en adipocitos maduros. Este método crea construcciones ECM-adipocitos que son metabólicamente activas y retienen características de los tejidos y pacientes de los que se derivan. Hemos utilizado este sistema para demostrar la conversación cruzada ECM-adipocyte específica de la enfermedad en el tejido adiposo humano. Este modelo de cultivo proporciona una herramienta para disección de las funciones de la ECM y los adipocitos en la contribución al fenotipo metabólico del tejido adiposo global y permite el estudio del papel del ECM en la regulación de la homeostasis del tejido adiposo.

Introduction

La matriz extracelular (ECM) no sólo proporciona un andamio mecánico para los tejidos, sino que también se involucra en una compleja conversación cruzada con las células que residen dentro de ella, regulando diversos procesos necesarios para la homeostasis tisular, incluida la proliferación celular, diferenciación, señalización y metabolismo1. Mientras que el ECM sano desempeña un papel esencial el mantenimiento de la función normal del tejido, ECM disfuncional se ha implicado en múltiples enfermedades2.

El tejido adiposo desempeña un papel importante en la patogénesis de la enfermedad metabólica. La obesidad se asocia con hipertrofia excesiva de adipocitos e hipoxia celular, defectos en el metabolismo celular de los adipocitos, y el retículo endoplasmático del tejido adiposo y el estrés oxidativo y la inflamación. Si bien no se entienden bien, estos procesos complejos conspiran para afectar la capacidad de amortiguación de nutrientes del tejido adiposo, lo que conduce al desbordamiento de nutrientes del tejido adiposo, toxicidad en múltiples tejidos y enfermedad metabólica sistémica3,4 ,5. La secuencia de eventos y mecanismos específicos que subyacen a la insuficiencia del tejido adiposo se entienden mal, pero se han implicado alteraciones en el tejido adiposo ECM. La composición de ECM se altera dentro del tejido adiposo en la obesidad humana y murina, con una mayor deposición de la proteína ECM junto con diferencias bioquímicas y estructurales cualitativas en el tejido adiposo ECM asociado con la enfermedad metabólica humana, incluyendo diabetes tipo 2 e hiperlipidemia6,7,8,9,10,11.

A pesar de estas observaciones, el papel del ECM del tejido adiposo en la mediación de la disfunción del tejido adiposo no está bien definido. Esto se debe en parte a la falta de modelos experimentales tractables que permiten la disección de las funciones específicas de ECM y adipocitos en la regulación de la función final del tejido adiposo. El cultivo de ECM-adipocyte simula mejor el entorno in vivo del tejido adiposo nativo en al menos dos aspectos. En primer lugar, el cultivo ECM proporciona un entorno molecular similar al tejido adiposo nativo, incluyendo colágenos nativos, elastinas y otras proteínas de matriz ausentes en el cultivo 2D estándar. En segundo lugar, se ha demostrado que el cultivo en plástico 2D altera el metabolismo de los adipocitos a través de efectos mecánicos debido a la disminución de la elasticidad del sustrato plástico12,que elimina el cultivo ECM.

Se han estudiado métodos para diseñar andamios biológicos mediante el aislamiento de ECM de la adiposa descelularizada y otros tejidos en el contexto de la medicina regenerativa y reconstructiva y la ingeniería de tejidos13,14, 15,16,17,18. Hemos publicado previamente una metodología en la que adaptamos estos métodos para desarrollar un modelo 3D in vitro del cultivo humano de ECM-adipocitos, utilizando ECM y células madre de adipocitos (preadipocitos) derivadas de tejidos adiposos viscerales humanos11. En el presente artículo, describimos estos métodos en detalle. El procedimiento de descelularización para el tejido adiposo humano es un proceso de cuatro días que implica tratamientos mecánicos y enzimáticos para eliminar células y lípidos, dejando un andamio biológico que mantiene las características del tejido del que se deriva. El ECM descelularizado apoya la diferenciación adipogénica de los preadipocitos humanos, y cuando se reconstituye con adipocitos, mantiene la microarquitectura y las características bioquímicas y específicas de la enfermedad del tejido adiposo intacto y participa en características del tejido adiposo nativo. Esta matriz se puede estudiar sola o resembrada con células, permitiendo el estudio de interacciones y interrelación entre los componentes celulares y extracelulares del tejido adiposo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Los tejidos adiposos se obtienen de sujetos humanos sometidos a cirugía bariátrica electiva bajo la aprobación de la junta de revisión institucional.

1. Aislamiento de preadipocitos y preparación de reactivos de cultivo

  1. Preparar albúmina sérica bovina (BSA) al 2% en 1 solución salina tamponada de fosfato (PBS). Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.
  2. Preparar la colagenasa tipo II: 2 mg/ml en 2% de BSA en 1x PBS. Prepárese inmediatamente antes de usar.
  3. Preparar red blood cell (RBC) Lysing Solution: 1.5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM disodium EDTA in deionized EDTA (DI/H2O). Conservar a 4oC. Preparar 1 solución de lising RBC a partir de una solución de stock 10x en DI/H2O inmediatamente antes de su uso.
  4. Preparar medios de crecimiento: 15% suero bovino fetal (FBS), 1% solución antibiótica-antimicótica (ABAM) en el medio de águila modificado de Dulbecco:Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.
  5. Preparar la solución de congelación de preadipocitos: 10% Sulfóxido de dimetil, 15% FBS en medios DMEM/F12. Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.
  6. Preparar medios de diferenciación: 10 mg/L de transferrina, biotina de 33 m, solución de insulina humana de 0,5 m, sal hemicáltica de ácido D-pantoténico de 17 m, 100 nM de xametasona, 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tironina sal sódica (T3), 1 m de ciglitizona, 540M 3- 3- Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX),1% ABAM en DMEM/F12. Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.

2. Preparación de reactivos ECM

  1. Preparar la solución tampón de congelación: 10 mM Tris base, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% flúor fenilmetilsulfonil (PMSF) en DI / H2O. Agitar la solución para disolver EDTA. Ajuste el pH a 8,0 con HCl o NaOH.Store a 4 oC durante un máximo de 3 meses.
  2. Preparar la solución enzimática #1: 1% ABAM en 0.25% trypsin-EDTA. Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.
  3. Preparar solución tampón de entrada: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4,1% ABAM, 1% PMSF en DI/H2O. esterilizado O. Revuelva para disolver sales. Ajuste el pH a 8.0 con HCl o NaOH. Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.
  4. Preparar la solución enzimática #2: 55 mM Na2HPO4, 17 mM KH2PO4, 4,9 mM MgSO4x 7H2O, 1% ABAM, 1% PMSF en DI/H2O. Almacenar 4 oC durante un máximo de 3 meses. Revuelve para disolver las sales. Inmediatamente antes de su uso, añadir 80 U/ml de lipasa de páncreas porcino, tipo VI-S; 160 U/ml desoxirribonucleasa I de páncreas bovino, tipo II-S; y 100 g/ml ribonucleasa A del páncreas bovino, tipo III-A.
  5. Preparar solución de extracción de disolvente polar: 1% ABAM, 1% PMSF en isopropanol.
    ADVERTENCIA: El isopropanol es inflamable; almacenar en un armario inflamable a 25 oC y desechar en residuos inflamables.
  6. Preparar 70% etanol, 1% ABAM, 1% PMSF en DI/H2O. Añadir ABAM y PMSF justo antes de su uso.
    ADVERTENCIA: El etanol es inflamable; almacenar en un armario inflamable a 25 oC y desechar en residuos inflamables.
  7. Preparar la solución de almacenamiento: 1% ABAM, 1% PMSF en 1x PBS. Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.

3. Preparación de reactivos de fenotipado metabólico

  1. Toma de glucosa
    1. Preparar medios de hambre sérica: DMEM/F12, 1% ABAM. Filtrar esterilizar y almacenar a 4 oC
    2. Preparar 200 nM solución de insulina humana en 1x PBS inmediatamente antes de su uso.
    3. Preparar 200 nM de insulina humana, 0,1 mM 2-Deoxy-D-glucosa, 1 ci/bien Deoxy-D-glucosa, 2-[1,2-3H(N)]-, en 1x PBS. Prepárese inmediatamente antes de usar.
  2. Lipolisis
    1. Preparar el isoproterenol diluido en PBS: solución de stock de 3 mM. Diluir a una concentración de trabajo de 3 m para el ensayo.
  3. Tinción de petróleo rojo-O
    1. Preparar 4% de formalina en DI/H2O. Almacenar a temperatura ambiente.
    2. Prepare la solución de trabajo de Oil Red-O. Diluir aceite Rojo-O Solución (ORO) con DI/H2O en una relación de 3:2 (ORO:DI/H2O). Prepárese inmediatamente antes de usar. Filtrar por papel de filtro(Tabla de materiales).

4. Adquisición de tejido adiposo

NOTA: El tejido adiposo visceral (IVA) se recoge del mayor omento al comienzo de la operación por el cirujano y se transporta de vuelta al laboratorio sobre hielo para su procesamiento inmediato. Se deben tomar precauciones universales al manipular todos los tejidos humanos y reactivos cáusticos, incluida la realización de todo el trabajo en una campana de flujo laminar, el uso de un desgaste de seguridad de laboratorio completo y la no recapitulación de agujas.

  1. Añadir 5-10 g de IVA intacto a 15-25 mL de solución de tampón de congelación en un tubo cónico de 50 ml para sumergir la muestra de tejido. Almacene las muestras a -80 oC hasta la descelularización, hasta 1 mes.
  2. Utilice una muestra nueva separada del IVA para el aislamiento de los preadipocitos, tal como se describe en la sección 5.

5. Aislamiento de preadipocitos

  1. Colocar 2 g de IVA intacto en 20 ml de la colagenasa, tipo II, solución en un tubo cónico de 50 ml. A continuación, picar a fondo insertando tijeras estériles en el tubo cónico y picando el tejido dentro del tubo. Una vez completamente picado a una lodos finas, incubar el tejido en la solución de colagenasa en un agitador orbital a 130 rpm y 37 oC durante 60 min.
  2. Filtrar el digestato resultante a través de una malla de nylon de 100 m en un tubo cónico fresco de 50 ml vertiendo el digestato desde un tubo cónico a través de un pedazo de malla doblada sobre la parte superior de un tubo cónico fresco. El digestato en este punto debe ser un líquido amarillo-naranja con viscosidad moderada, con pequeñas cantidades de hebras residuales de tejido fibroso no digerido. La malla debe capturar trozos más grandes de tejido no digerido, que se descartan.
  3. Centrifugar la muestra a 270 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 2 ml de 1 solución de lising RBC con una pipeta.
    1. Incubar durante 1 min a 25oC y añadir 10 mL de 15% FBS-DMEM/F12. Centrífuga a 270 x g durante 10 min.
  4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de 15% de FBS-DMEM/F12 con una pipeta. Transfiera la suspensión celular a una placa Petri de 100 mm con una pipeta e incubar a 37 oC y 5% de CO2,hasta que las células alcancen una confluencia del 80-100%, normalmente 2-6 días. Cambie el medio cada 2-3 días.
  5. Separe y lave las células.
    1. Retire los medios con una pipeta y aplique 4 ml de trippsina-EDTA al 0,25% de trippsina-EDTA a las células adherentes. Incubar a 37oC durante 10 min, girando periódicamente la placa suavemente para separar las células.
    2. Agregue 20 ml de 15% FBS-DMEM/F12 y vuelva a suspender las células separadas en este medio con una pipeta. A continuación, transfiera a un tubo cónico fresco de 50 ml y centrífuga 270 x g durante 10 min.
    3. Retire el sobrenadante y deseche. Lavar el pellet celular una vez en 1x PBS, y luego resuspender el pellet celular en 20 ml de fresco 15% FBS-DMEM/F12 con una pipeta. Transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo T-150.
  6. Células de cultivo a 37oC y 5% CO2. Divida y amplíe las células cada 2-3 días a medida que alcanzan una confluencia del 80-100% aplicando 7 ml de trippsina-EDTA al 0,25%, expandiéndose de un matraz a 8 matraces.
    NOTA: Esto normalmente requiere 3-4 pasajes, lo que permite la expansión adecuada y conserva el potencial adipogénico y fenotipos metabólicos celulares específicos del paciente y del depósito. El paso de preadipocitos por encima de 4-5 pasajes conduce a la pérdida de potencial adipogénico.
  7. Separe las células en 8 matraces con 7 ml de trippsina-EDTA al 0,25% por matraz como se ha descrito anteriormente, e incubar a 37 oC durante 10 min.
  8. Añadir 8 ml de 15% FBS-DMEM/F12 por matraz y resuspender las células separadas con una pipeta. Transfiera toda la suspensión celular dividida uniformemente en tres tubos cónicos de 50 ml y centrífuga a 270 x g durante 10 min.
  9. Resuspender los gránulos de células resultantes en 5 ml de 15% DE FBS-DMEM/F12 en un tubo cónico de 15 ml y células de recuento utilizando contador de celdas y azul Trypan.
  10. Centrifugar la suspensión celular a 270 x g durante 10 min. A continuación, resuspenda el pellet celular en Preadipocyte Freezing Solution a una concentración celular final de 1 x 106/mL, y alícuota 1 mL de suspensión celular por tubo criovial de 1,5 ml.
  11. Conservar las células en crioviales durante 1 día a -80oC. A continuación, transfiera crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo durante 3-6 meses.
  12. Cuando esté listo para su uso, descongelar un criovial en un baño de agua de 37 oC durante 3-5 min. Resuspender las células en 20 ml de 15% FBS-DMEM/F12, y centrifugar a 270 x g durante 10 min.
  13. Resuspender el pellet celular en 20 ml de 15% FBS-DMEM/F12, pipeta en un solo matraz T-150, y luego crecer a 80% de confluencia durante 2-3 días a 37 oC y 5% CO2.
  14. Separe las células con 7 ml de trippsina-EDTA al 0,25% por matraz como se describe anteriormente en el paso 5.6. Resuspenda a 3 millones de células por ml (es decir, 6 x 104 células por 20 ?L) en 15% FBS-DMEM/F12, y utilícelo como se describe a continuación (sección 7, paso 7.4).

6. Preparación de ECM de tejido adiposo

  1. Día 1: Congelación-descongelación y digestión enzimática #1
    1. Congelación-descongelación previamente congelada (paso 4.2) Muestras de IVA almacenadas en La solución de tampón de congelación en tubos cónicos de 50 ml de -80 oC a 37 oC en un baño de agua precalentado, incubando 20 min con agitación manual suave. Una vez descongelado, transfiera de nuevo a -80 oC e incubar 20 min. Repita la congelación-descongelación 3x, terminando por descongelar las muestras en un baño de agua de 37 oC.
    2. Con fórceps estériles, transfiera las muestras de IVA a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de Solución Enzimática #1, asegurando que las muestras de IVA estén completamente sumergidas. A continuación, incubar durante la noche en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC).
  2. Día 2: Digestión enzimática #2
    1. Las muestras de lavado 3x con 15-25 ml de Solución tampón de enjuague en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 min cada lavado). Vierta la solución de tampón de enjuague después de cada lavado.
    2. Transfiera las muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de Solución Enzimática #2 e incubar en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, durante la noche).
  3. Día 3: Delipidación
    1. Las muestras de lavado 3x con 15-25 ml de Solución tampón de enjuague en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 min cada lavado). Vierta la solución de tampón de enjuague después de cada lavado.
    2. Transfiera las muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de solución de extracción de disolventepolar e incubar en un agitador orbital (130 rpm, 25 oC, durante la noche). Después de este paso, se debe eliminar la mayoría de los lípidos, y las muestras deben ser de color blanco o translúcido.
      ADVERTENCIA: La solución de extracción de disolvente polar es inflamable y debe almacenarse y utilizarse a 25 oC.
  4. Día 4: Lavado y almacenamiento
    1. Transfiera muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de solución de tampón de entrada. Las muestras de lavado 3 x en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 minutos por lavado).
    2. Enjuague las muestras 3 veces con 15-25 ml de etanol al 70% en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 minutos cada lavado) vertiendo la solución de etanol al 70% después de cada lavado.
    3. Lave las muestras una vez con la solución de almacenamiento en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 minutos por lavado).
    4. Usando fórceps estériles, transfiera muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de solución de almacenamiento. Asegúrese de que se utiliza suficiente solución de almacenamiento para sumergir completamente las muestras. Conservar a 4oC durante un máximo de 1 mes.

7. Preparación de ECM-adipocyte

  1. Transfiera fragmentos de ECM almacenados a pozos individuales de placa de 24 pocillos utilizando fórceps estériles. Agregue tantos fragmentos de ECM en tantos pozos como sea necesario para el ensayo descendente planificado (por ejemplo, la acumulación de glucosa o la lipólisis, ver más abajo), incluidos duplicados o triplicados. Lavar con 500 oL de 70% de etanol 3 veces en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 min cada lavado).
  2. Rehidratar el ECM lavando 3 veces en 1x PBS estéril en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 min cada lavado).
  3. Usando tijeras estériles, corte y pese ECM en fragmentos de 100 mg. Usando fórceps estériles, coloque un fragmento de 100 mg en cada pocal de una placa de 24 pocillos. Incubar a 25oC durante 15 min para permitir que el exceso de PBS extruya de fragmentos. Retire con cuidado cualquier exceso de PBS con una pipeta.
  4. Semilla cada fragmento de ECM de 100 mg con 20 ml de suspensión celular de preadipocitos (3 millones de células por ml, 6 x 104 células por 20 l, en 15% FBS-DMEM/F12, del paso 5.10). Pipetear las células directamente en el ECM colocando la punta de la pipeta en el ECM y expulsando suavemente la suspensión celular en el centro de la matriz, teniendo cuidado de que la suspensión celular no se desborde y termine en la parte inferior del pozo.
    1. Si la suspensión celular está desbordada del ECM donde se ha colocado la punta de la pipeta, retire la punta de esa ubicación e insértela en otro lugar del ECM. ECM sembrado por 40 min a 37oC.
      NOTA: Para la extracción de ARN para qrtPCR, semilla cada 500 mg de fragmentos de ECM con 3 x 105 células en 100 l (3 millones de células por ml, es decir, 3 x 105 células por 100 l, en 15% FBS-DMEM/F12).
  5. Llene cada pocal de la placa de 24 pocillos con 500 ml de medios de crecimiento para cubrir los fragmentos de ECM sembrados. Cultivo a 37oC y 5%CO2 durante 72 h.
  6. Después de 72 h, aspirar cuidadosamente 15% FBS-DMEM/F12, inclinando ligeramente la placa para permitir que los medios se agrupen debajo del fragmento, y colocando la punta de la pipeta justo adyacente al fragmento de ECM sin molestarla. Después de aspirar, añadir 500 l de medios de diferenciación, cambiando los medios cada 2-3 días utilizando una técnica similar, durante un período de cultivo total de 14 días.
    1. Compruebe la diferenciación mediante microscopía ligera: las células acumularán lípidos, se volverán de color marrón-amarillo y más esféricas en forma.
      NOTA: Las matrices sembradas se pueden utilizar para pruebas metabólicas (por ejemplo, ensayo de admisión de glucosa, ensayo de lipólisis, ORO), histología o inmunohistoquímica (IHC) o imágenes de tejido estándar. Para la tinción e imágenes de ORO de tejido fijo, congele muestras de ECM-adipocitos en nitrógeno líquido.

8. Fenotipado metabólico

  1. Microscopía electrónica de barrido
    1. Fijar muestras en 2.5% glutaraldehído en tampón de fosfato de Sorensen a 25 oC durante 12 h. Postfijo en 1% tetróxido de osmio en tampón de fosfato de Sorensen a 4 oC durante 1 h.
    2. Deshidratar en serie muestras en etanol. Lavar en hexamethyldisalizane y secar al aire. A continuación, montar en un talón de microscopía electrónica de barrido con grafito coloidal. Seca, y esputo-capa con oro.
    3. Capture imágenes con un microscopio electrónico de barrido.
  2. Tinción de petróleo rojo-O
    1. Tejido vivo: Solución de aceite Rojo-O
      1. Aspirar con cuidado los medios de los pozos con una pipeta. A continuación, lave las muestras una vez con 500 ml de 1 pbS por poca.
      2. Fijar muestras con 200 ml de formalina al 4% en H2O desionizado estéril a 25 oC durante 15 minutos. Aspirar formal con una pipeta, lavar las muestras dos veces con 1 x PBS (500 ol cada lavado).
      3. Añadir 200 s de muestras de isopropanol al 60% a 25 oC durante 5 min. Aspirar 60% isopropanol con una pipeta.
      4. Muestras de manchas con solución de trabajo Oil Red-O a 25oC durante 5 min. Aspirate Oil Red-O con una pipeta y luego lave las muestras 3 veces con 1pbS (500 ml cada lavado). A continuación, la imagen con un microscopio óptico.
    2. Tejido fijo: Kit de manchas de aceite rojo-o
      1. Muestras de ECM-adipocitos de congelación de flash en compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y sección (5 m) en un criostato.
      2. Colocar el portaobjetos en 85% propilenglicol en DI/H2O durante 2 min. Coloque la corredera en la mancha ORO a 60 oC durante 6 min. Coloque el lide dela estega en 85% de propilenglicol en DI/H2O durante 1 min.
      3. Coloque la corredera en Hematoxilina modificada de La hematoxilina de aceite rojo-o kit de tinción durante 1 min. Enjuague la diapositiva dos veces con agua del grifo. Enjuague el portaobjetos dos veces con DI/H2O.
      4. Monte el cubreobjetos con un medio de montaje acuoso y una imagen en un microscopio.
    3. Extracción de ARN de ECM para qrtPCR
      NOTA: Para maximizar el rendimiento del ARN, utilice 500 mg de fragmentos de ECM sembrados con 3 x 105 preadipocitos en 100 l y diferencie como se indica anteriormente en placas de 6 pocillos en medios de diferenciación de 3 ml por poca.
      1. Una vez diferenciada, transfiera cada muestra individual de ECM-adipocyte a un tubo cónico de 50 ml sobre hielo utilizando fórceps estériles.
      2. Lavar bien con 500 l de Tampón RLT. Añadir Tampón RLT a tubo cónico de 50 ml con muestra de ECM-adipocitos coincidentes.
      3. Usando tijeras estériles, picar finamente cada muestra de ECM-adipocyte dentro del tubo cónico de 50 ml, mientras sostiene el tubo en hielo, insertando las tijeras en el tubo cónico para picar el tejido.
      4. Congele y descongele completamente los tubos cónicos de -80 oC a 37 oC 3x.
      5. Centrífuga tubos cónicos a 500 x g y 4oC durante 10 min.
      6. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y utilícelo para la extracción de ARN con un kit de extracción de ARN de tejido fibroso(Tabla de materiales).
  3. Ensayo de acumulación de glucosa
    1. Diferenciar 6 x 104 preadipocitos en fragmentos de ECM de 100 mg en 0,5 ml de medio de diferenciación en placas de 24 pocillos como se ha descrito anteriormente (sección 5).
    2. Después de 14 días de diferenciación, retire el medio y lave los ECM-adipocitos una vez con 1x PBS. Añadir 0,5 ml/bien Medio de hambre sérica y cultivo a 37oC y 5%CO2 durante 12 h.
    3. Retire las células medianas y lave las células dos veces con 1 pbS. Añadir 0,5 mL/pozo 2% BSA en PBS y cultivo a 37oC y 5%co2 durante 2 h.
    4. Lavar las células una vez con 1x PBS, añadir 0,5 ml/bien 1x PBS con o sin 200 nM de insulina e incubar a 37 oC durante 40 min.
    5. Aspirar 1x PBS, añadir 0,5 mL/bien 1X PBS con 0,1 mM 2-desoxigen-D-glucosa, 2 ci/mL desoxi-D-glucosa, 2- [1,2-3H(N)], con o sin 200 nM de insulina, e incubar a 37 oC y 5% co2 durante 40 min. reactivos y residuos radiactivos, según lo manenten las leyes reguladoras institucionales locales.
    6. Retire el medio con una pipeta y lave las células 3 veces con 1 PBS. Añadir 420 sl de solución SDS al 1% en DI/H2O, y alas con pipeteo vigoroso. Incubar 25oC durante 10 min.
    7. Recoger 5 l de cada pocto para el ensayo de proteína Bradford. Transfiera 400 ml de lisado de célularestante restante a 2 ml de líquido centelleo en un vial de centelleo. Cuente 3actividades H-2DG en el contador de centelleo. Analizar los datos como recuentos por minuto normalizados a proteína, mg/ml.
  4. Ensayo de lipólisis
    1. Diferenciar 6 x 104 preadipocitos en fragmentos de ECM de 100 mg en 0,5 ml de medio de diferenciación humana en placas de 24 pocillos como se ha descrito anteriormente (sección 5).
    2. Después de 14 días de diferenciación, retire las células medianas y lave dos veces con 1 pbS caliente. Añadir 0,5 ml de medio de inanición sérica (sin insulina) con o sin isoproterenol de 3 m, y cultivo de adipocitos a 37 oC y 5% de CO2 durante 72 h.
    3. Recoger los supernatantes de cultivo, que pueden almacenarse a -80 oC hasta que estén listos para el ensayo. Recopile el ECM en tubos de microcentrífuga para la cuantificación del ADN para la normalización de datos.
    4. Pipet2 l de cada sobrenadante en una microplaca de 96 pocillos. Conservar pozos para espacios en blanco (destilados H2O) y solución estándar de glicerol proporcionada en el kit de determinación de triglicéridos.
    5. Añadir 270 ml de reactivo de glicerol libre del kit de determinación de triglicéridos a cada pocto, pipeta para mezclar. Incubar placa a 37oC durante 5 min.
    6. Mida la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro de microplacas.
    7. Calcular la concentración de glicerol y normalizar con el ADN de ECM:

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La preparación de ECM de tejido adiposo, la sembración con preadipocitos y la diferenciación in vitro en adipocitos maduros dan lugar a claros cambios morfológicos secuenciales en el tejido que permiten la evaluación visual del progreso a lo largo del protocolo(Figura 1) . Los preadipocitos utilizados para la semilla del ECM se aíslan mediante la digestión de la colagenasa de muestras de IVA separadas(Figura 2). La microscopía electrónica de barrido de construcciones ECM-adipocitos en cada etapa del procesamiento revela la descelularización de ECM y la posterior recapitulación de adipocitos que contienen lípidos tras la resedación y diferenciación(Figura 3). La inmunohistoquímica específica de colágeno 1 de ECM descelularizado revela el mantenimiento de la microarquitectura de colágeno, mientras que la tinción de aceite rojo-o de construcciones e-adipocitos 3D en vivo y fijos/seccionados revela adipocitos que contienen lípidos(Figura 4 A). qrtPCR de adipocitos diferenciados en ECM demuestra una marcada regulación ascendente de genes adipogénicos en relación con los preadipocitos indiferenciados cultivados en ECM(Figura 4B). El fenotipado metabólico de construcciones de ECM-adipocitos que estudian todas las combinaciones de ECM y adipocitos de sujetos diabéticos (DM) y no diabéticos (NDM) revela una absorción de glucosa deteriorada y la función liofótica en construcciones ECM-adipocitos de DM en relación con NDM tejidos, recapitulando defectos metabólicos específicos de DM que hemos informado previamente en adipocitos humanos en el cultivo 2D estándar11. Es importante destacar que NDM ECM rescata la ingesta de glucosa estimulada por insulina y la capacidad liolítica en adipocitos DM (Figura 4C)11. Juntos, estos datos demuestran la regulación específica de la enfermedad del metabolismo celular de los adipocitos por el ECM. Más detalles se informan en Baker et al.11.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo para la preparación de ECM-adipocyte. Día 1: Las muestras enteras de tejido adiposo visceral se someten a tres ciclos de congelación-descongelación seguidos de incubación durante la noche con solución de digestión enzimática #1. Día 2: Después de la digestión con solución enzimática #1, las muestras se digieren durante la noche con solución de digestión enzimática #2. En este punto, las muestras serán parcialmente deslipidadas. Día 3: Después de la digestión enzimática #2, las muestras se someten a incubación durante la noche con solución de extracción de disolvente polar, que completará la deslipidación. Después del día 3, las muestras deben ser completamente deslipidadas y de color blanco/translúcido. Las muestras se lavan a fondo con solución tampón de enjuague y luego 70% de etanol y se almacenan en una solución de almacenamiento en 40 oC hasta que estén listas para volver a sellarse con preadipocitos. Día 4: Los preadipocitos se sembran en el IVA descelularizado seguido de la diferenciación adipogénica durante 14 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Flujo de trabajo para el aislamiento de preadipocitos. El IVA se pica, se digiere con colagenasa, se filtra, centrifuga, y el pellet de células estromavasculares resultante salpicado y cultivado para expandir los preadipocitos. Para obtener más detalles sobre el aislamiento de preadipocitos humanos y el cultivo de adipocitos 2D, véase Baker et al.2017 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Escaneo de imágenes de microscopía electrónica. Tejido adiposo intacto, tejido adiposo descelularizado y tejido adiposo descelularizado repoblado con preadipocitos y diferenciado en medios adipogénicos durante 14 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Caracterización de adipocitos en ECM. (A) Tejido adiposo descelularizado ECM mantiene la microarquitectura y apoya la diferenciación de adipocitos: Top: Colágeno 1 inmunohistoquímica de IVA humano entero antes y después de la descelularización demostrando el mantenimiento de microarquitectura; medio: fotomicrografías confocales 3D de adipocitos humanos vivos dentro de ECM; IVA humano descelularizado intacto manchado con petróleo Rojo-O antes de volver a sembrar con preadipocitos, 4 días después de la sembración, y 14 días después de la sembración con preadipocitos seguidos de diferenciación adipogénica; azul: tinción DAPI de núcleos celulares; rojo: Tinción de aceite rojo-O de lípidos intracelulares; fondo: Fijación de formalina, incrustada en parafina, 5 m seccionada, IVA humano manchado de petróleo rojo-O antes de la descelularización, inmediatamente después de la descelularización, y después de la descelularización, preadipocyte-seeding, y 14 días de diferenciación adipogénica, demostrando la acumulación de lípidos citoplasma en adipocitos dentro de ECM. (B) Adipocitos en ECM regulan la expresión génica adipogénica: análisis qrtPCR comparando los niveles de transcripción genética adipogénica en ARN de adipocitos de IVA humano diferenciados en ECM IVA durante 14 días en relación con preadipocitos indiferenciados en el ECM del IVA cultivado durante 72 h en medios no adipogénicos. Los datos son medios - SEM. ACLY: ATP citrato liase, ATGL: lipasa de triglicéridos adiposo, FASN: ácido graso sintasa, PPARg: peroxisoma proliferativo activado receptor gamma; ordinado: diferencia de pliegue en el nivel de transcripción en adipocitos maduros en relación con el referente preadipcito indiferenciado-1; todas las diferencias de pliegue significativas (p<0.001, prueba t emparejada); ECM de 10 sujetos, preadipocitos/adipocitos de n-11 sujetos. (C) ECM regula el metabolismo de los adipocitos de una manera específica de DM: 3D-ECM de sujetos DM o NDM sembrados con preadipocitos de sujetos DM o NDM, diferenciados en adipocitos, y estudiados con fenotipado metabólico. Barras de datos etiquetadas con fuente de paciente (NDM, DM) de ECM y adipocitos (ECM/AD); por ejemplo, NDM/NDM denota tanto ECM como preadipocitos derivados de pacientes con NDM, mientras que NDM/DM denota ECM de pacientes con NDM combinados con preadipocitos de pacientes con DM. Los datos son medios: SEM. Ordinatos: la acumulación de glucosa (cpm), normalizada a la concentración de proteína de lisado ECM/célula (mg/ml); lipólisis: concentración de glicerol sobrenadante de cultivo (mg/ml) normalizado a ECM/concentración de ADN lisado celular (ng/mL); *p<0.050, **p<0.100 comparando el punto de datos indicado con el punto de datos correspondiente (basal o insulin-estimulado para la captación de glucosa, basal o isoproterenol estimulado para la lipólisis) en el brazo DM/DM, utilizando el análisis de modelos mixtos medidas; ECM de n-9 NDM, 8 sujetos DM, preadipocitos de 10 NDM, 9 SUJETOs DM para la ingesta de glucosa; ECM de 6 NDM, 6 sujetos DM, preadipocitos de 6 NDM, 6 sujetos DM para lipólisis. Esta figura ha sido adaptada de O'Rourke y Lumeng11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El modelo de cultivo de ECM-adipocitos proporciona una herramienta valiosa para disección de las funciones individuales de ECM y células en dictar fenotipo de tejido final. El protocolo de aislamiento ECM es bastante reproducible, pero se puede observar la variabilidad en el proceso de descelularización. El paso de deslipidación del Día 3 es un punto crítico en el protocolo. Al finalizar la extracción durante la noche, la solución de disolvente polar debe evidenciar la deslipidación de la matriz que se vuelve amarilla, mientras que la matriz debe pasar de un color amarillo-naranja característico del tejido adiposo intacto a translúcido/ blanco (Figura 1). Si estos cambios de color no se producen, es probable que la deslipidación no se complete. La variabilidad entre pacientes en la eficiencia de la deslipidación es común, pero hasta la fecha no hemos observado ninguna correlación de eficiencia de delipidación con el estado de DM del sujeto, edad, IMC u otras variables clínicas. Las muestras grandes (superiores a 20 g) no sufrirán una delipidación eficiente; el procesamiento de muestras <20 g puede prevenir este problema. Si una muestra no aparece completamente deslipidada después del día 3, divida la muestra por la mitad con tijeras estériles, luego transfiera las muestras a 15-20 ml de solución de extracción de disolvente polar y colóquela en un agitador orbital durante 3-5 h. Es posible que algunas muestras no se descelularcen completamente después de repetir el paso de extracción del disolvente polar. Si la mayoría de la muestra está descelularizada, es posible cortar las secciones que contienen lípidos antes de usar la muestra en experimentos.

La contaminación puede ocurrir si la esterilidad no se mantiene diligentemente durante todo el proceso. Todo el trabajo debe realizarse en una campana de flujo laminar utilizando precauciones de cultivo celular estándar. Normalmente almacenamos ECM hasta 3 meses a 4 oC, y preadipocitos hasta 6 meses en nitrógeno líquido. No se ha probado la retención de la biofuncionalidad y las propiedades específicas de enfermedades y depósitos más allá de este tiempo.

La microscopía confocal permite la visualización de adipocitos maduros dentro del ECM, que pueden mejorarse con la tinción de aceite rojo-o. La microscopía electrónica de barrido (SEM) también proporciona un método no cuantitativo para visualizar adipocitos dentro de ECM. Cabe destacar que la tinción SEM y Oil Red-O sugieren adipocitos unioculares en las construcciones ECM-adipocitos, una morfología similar a los adipocitos in vivo y en contraste con los típicos adipocitos multiloculares observados cuando los preadipocitos se someten a adipogénicos diferenciación en plástico 2D(Figura 3, Figura 4A). Esta observación sugiere que el ECM proporciona un entorno más fisiológico para la diferenciación adipogénica que el cultivo de tejido estándar en plástico. La fijación y seccionamiento de construcciones ECM-adipocitos puede ser difícil, ya que las construcciones incrustadas en OCT son frágiles y no se seccionan fácilmente. Seccionar los tejidos incrustados inmediatamente después de la extracción del almacenamiento del congelador de -80 oC y realizar la sección en una cámara frigorífica (4 oC) en un criostato preenfriado hace factible el seccionamiento.

El cultivo eCM-adipocitos proporciona un entorno fisiológico que se aproxima al entorno del tejido adiposo in vivo y proporciona un entorno sostenible para el crecimiento y la diferenciación de células madre de preadipocitos, como lo demuestra la regulación ascendente de genes adipogénicos en el cultivo 3D-ECM-adipocyte. Cultivos de ECM-adipocitos también participan en funciones metabólicas de adipocitos, incluyendo la captación de glucosa y lipólisis8. Reportamos la ingesta de glucosa como cpm normalizada a la proteína total extraída de cultivos ECM-adipocitos medidos con un ensayo de Bradford, o al contenido de ADN medido con un kit de ensayo de ADN, y hemos observado resultados similares con ambos métodos. Del mismo modo, informamos de lipólisis como mg/ml de liberación de glicerol normalizado a proteína o ADN, también con resultados similares obtenidos con cualquiera de los métodos de normalización. Otros sugieren normalizar los datos metabólicos de adipocitos al contenido de lípidos, pero hasta la fecha nuestros intentos de extraer lípidos de forma fiable de las construcciones de ECM no ha tenido éxito. Notificar la tasa de acumulación de glucosa como lunares de glucosa por unidad de tiempo y lipólisis como lunares de glicerol/ácido graso libre por unidad de tiempo puede permitir comparaciones más precisas entre experimentos separados. El aislamiento del ARN de ECM para el análisis qrtPCR se caracteriza por rendimientos más bajos en comparación con las células en el cultivo 2D, pero la preparación de fragmentos de ECM más grandes sembrados con más células supera este problema, como se describe en el paso 8.3.1. Hemos encontrado dificultades para aislar cantidades adecuadas de proteína no degradada con fosfomeaeyas intactas para el análisis de manchas occidentales, lo que representa una limitación del modelo.

Se ha publicado previamente una metodología similar para aislar la ECM del tejido adiposo y la sembración con preadipocitos, con pruebas que sugieren que la ECM puede promover la diferenciación adipogénica a falta de mediadores adipogénicos clásicos, incluidos los agonistas del juego, insulina, y agonistas PPAR-o12,14. Nuestros datos son los primeros en demostrar la regulación específica de la enfermedad del metabolismo celular por ECM en el tejido adiposo, utilizando métodos en los que se estimulan los adipocitos con factores de diferenciación adipogénicos clásicos11; estudios similares en ausencia de estímulos adipogénicos son un objetivo de futuras investigaciones. Otros han demostrado similares dilatorios de células ECM específicas de la enfermedad utilizando ECM y células aisladas del tejido pulmonar19,20. También se han empleado estrategias alternativas, incluida la creación de matrices mediante la mezcla de preparaciones de ECM de tejido adiposo homogeneizado en hidrogeles peptídrico12.

Si bien la variabilidad entre pacientes en el metabolismo celular de los adipocitos humanos se observa tanto en el cultivo de plástico 2D como en el cultivo 3D-ECM, cuando se analizan en conjunto, estas células manifiestan diferencias de enfermedad, depósito y sexo en el metabolismo celular, como se describe por nuestro grupo y otros11,21,22,23,24, validar la utilidad y generalización de estos modelos de cultivo para el estudio del metabolismo celular de los adipocitos. Hemos demostrado que los adipocitos diferenciados en ECM (es decir, adipocitos NDM en NDM ECM, adipocitos DM en DM ECM) recapitulan fenotipos metabólicos de adipocitos NDM y DM aislados en el cultivo 2D estándar, apoyando el cultivo de ECM-adipocitos como un modelo para estudiar alteraciones específicas de la enfermedad en el metabolismo celular de los adipocitos en un entorno más fisiológico. No hemos observado diferencias en la magnitud o dirección de las funciones metabólicas, incluyendo la ingesta de glucosa o lipólisis, cuando se estudian ECM y adipocitos de los mismos o diferentes donantes. En cualquier caso, ECM-adipocyte construye fenotipo metabólico específico de DM manifiesto (por ejemplo, disminución de GU en DM/DM en relación con construcciones NDM/NDM), sin diferencia clara al comparar construcciones compuestas por ECM y adipocitos de los mismos donantes o diferentes .

El cultivo eCM-adipocitos permite el estudio de combinaciones de ECM y preadipocitos de distintas poblaciones de pacientes y depósitos de tejidos, permitiendo el análisis de las contribuciones específicas de la enfermedad y del depósito de ECM y adipocitos al tejido adiposo definitivo metabólico Fenotipo. Demostrando esta fuerza del modelo de cultivo ECM-adipocitos, hemos demostrado que ECM del tejido NDM tiene la capacidad de rescatar defectos metabólicos en adipocitos DM(Figura 4C)11. Los datos preliminares en tejidos adiposos viscerales y subcutáneos murinos sugieren que la ECM murina regula el metabolismo de los adipocitos murinos de manera similar de manera específica del depósito (datos no publicados, O'Rourke RW, 2019), lo que sugiere que este sistema modelo puede ser utilizado para estudiar ECM-adipocyte habla cruzada tanto en sistemas murinos como humanos. Además, este modelo permite el estudio de la manipulación aislada de ECM como un medio para regular el fenotipo de tejido adiposo. El estudio preliminar de ECM tratado en condiciones que inducen glicación dirigida específicamente al ECM, por ejemplo, sugiere que estas modificaciones regulan el fenotipo metabólico celular de las células posteriormente sembradas en ECM tratadas (datos no publicados, O'Rourke RW, 2019), proporcionando un modelo para el estudio de los efectos de la manipulación dirigida del ECM en el fenotipo de adipocitos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no declaran intereses contradictorios.

Acknowledgments

Agradecemos a Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa y Retha Geiss por su ayuda en la coordinación del estudio. SeM fue realizado por University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Este proyecto fue apoyado por niH grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) Administración de Veteranos VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopía electrónica de escaneo realizada por la Universidad de Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La Figura 4 de este manuscrito fue publicada originalmente en Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, y ha sido reproducido con permiso de Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Para obtener permiso para reutilizar este material, visite http://global.oup.com/academic/rights.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#25200056
1.5 mL cryovial tube Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#02-682-557
10% Neutral Buffered Formalin VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#89370-094
100 µm nylon mesh filter Corning Inc., Corning, NY, USA Cat#352360
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#T6397
24-well tissue culture plates VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#I5879
96-well tissue culture plates VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#15240062
Biotin Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#A8806
Buffer RLT Qiagen, Hilden, Germany Cat#79216
Ciglitizone Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA Cat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#D4513
Dexamethasone Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#D4902
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#BP231 Flammable, caustic
Disodium EDTA Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium salt Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#11320033
Ethanol Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA Cat#DSP-MD.43 Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#10437028
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#G5882 Caustic
Hexamethyldisalizane Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#440191 Flammable, caustic
Human insulin solution Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#I9278
Isopropanol Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#A415 Flammable
Isoproterenol Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#I5627 Flammable
KCl Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S25484
KH2PO4 Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-S Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#L0382
MgSO4*7H2O Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#230391
Na2HPO4 Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S5136
NaCl Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S3014
NaHCO3 Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#S233
NH4Cl Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compound Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK Cat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO) Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#O1391
Oil Red-O Stain Kit American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA Cat#KTORO-G
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#201030 Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#93482 Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit Qiagen, Hilden, Germany Cat#74704
Scintillation Fluid Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate buffer Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ CAS #: 10049-21-5
T-150 culture flask VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master Mix ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer Benchmark Scientific Cat#D1030
Transferrin Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#T3309
Triglyceride Determination Kit Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4% VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10027-446
Type II collagenase Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#WHA5201150

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213, (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93, (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145, (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22, (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306, (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24, (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299, (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102, (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233, (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31, (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7, (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57, (1), e4 (2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5, (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9, (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186, (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124, (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8, (8), e71165 (2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55, (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18, (10), 1875-1880 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics