लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके ड्रोसोफिला भ्रूण मोटर न्यूरॉन्स की प्रतिगामी ट्रेसिंग

Developmental Biology

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Summary

हम लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके ड्रोसोफिला भ्रूणीय मोटर न्यूरॉन्स के प्रतिगामी ट्रेसिंग के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

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Inal, M. A., Banzai, K., Kamiyama, D. Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (155), e60716, doi:10.3791/60716 (2020).

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Abstract

हम ड्रोसोफिलामें मोटर न्यूरॉन्स की प्रतिगामी लेबलिंग के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं । हम एक तेल से भंग लिपोफिलिक रंग का उपयोग करते हैं और माइक्रोइंजेक्टर द्वारा भ्रूण पट्टिका तैयार करने के लिए एक छोटी बूंद वितरित करते हैं। प्रत्येक मोटर न्यूरॉन जिसकी झिल्ली बूंद से संपर्क किया जाता है तो तेजी से लेबल किया जा सकता है। व्यक्तिगत मोटर न्यूरॉन्स लगातार लेबल कर रहे हैं, ठीक संरचनात्मक विवरण को सक्षम करने के लिए स्पष्ट रूप से कल्पना की जा सकती है । यह देखते हुए कि लिपोफिलिक रंग विभिन्न रंगों में आते हैं, तकनीक भी मल्टीकलर में लेबल आसन्न न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए एक साधन प्रदान करता है। इसलिए यह ट्रेसिंग तकनीक ड्रोसोफिलाके मोटर न्यूरॉन सिस्टम में न्यूरोनल मॉर्फोजेनेसिस और सिनैप्टिक कनेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है।

Introduction

ड्रोसोफिला की भ्रूणीय मोटर न्यूरॉन प्रणाली केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस)1,2,3के विकास में अंतर्निहित तंत्र का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करती है। मोटर न्यूरॉन सिस्टम जैव रासायनिक, आनुवंशिक, इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीकों के लिए उत्तरदायी है। तकनीकों का उपयोग करके, आनुवंशिक जोड़तोड़ और कार्यात्मक विश्लेषण एकल मोटर न्यूरॉन्स2,4,5,6के स्तर पर किए जा सकते हैं।

तंत्रिका तंत्र के प्रारंभिक विकास के दौरान, न्यूरोब्लास्ट बड़ी संख्या में ग्लिया और न्यूरॉन्स को विभाजित और उत्पन्न करते हैं। डेलामिनेशन और न्यूरोब्लास्ट के जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल के बीच स्थानिक संबंध ों की पहले7,8,9के विस्तार से जांच की गई है । मोटर न्यूरॉन सिस्टम के मामले में, भ्रूण न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) के गठन का एसीसी (पूर्वकाल कॉर्नर सेल), आरपी2 (कच्चा झींगा 2), और आरपी5 मोटर न्यूरॉन्स2,10का उपयोग करके बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। उदाहरण के लिए, जब आरपी5 मोटर न्यूरॉन एक नवजात सिनैप्टिक जंक्शन बनाता है, तो प्री-सिनैप्टिक और पोस्ट-सिनैप्टिक फिलोपोडिया11,12,13को आपस में मिला दिया जाता है। एनएमजे गठन शुरू करने के लिए इस तरह का प्रत्यक्ष सेलुलर संचार महत्वपूर्ण है। परिधीय तंत्रिका शाखाओं के बारे में हम जो जानते हैं, उसके विपरीत, सीएनएस के भीतर सिनैप्टिक कनेक्टिविटी कैसे मोटर डैंडरियों शुरू करते हैं, इसका हमारा ज्ञान अभी भी आदिम है।

इस रिपोर्ट में, हम एक तकनीक पेश करते हैं जो लिपोफिलिक रंगों की माइक्रोपिपेट-मध्यस्थता वितरण के माध्यम से भ्रूण में मोटर न्यूरॉन्स की प्रतिगामी लेबलिंग की अनुमति देती है। यह तकनीक हमें अंडे बिछाने (एईएल)14के बाद 15 घंटे में हेमी-सेगमेंट में 30 शरीर की दीवार की मांसपेशियों में से प्रत्येक को 38 मोटर न्यूरॉन्स का पता लगाने में सक्षम बनाती है। इस तकनीक का उपयोग करके, हमारे समूह ने कई लाभ-समारोह/हानि-समारोह एलील्स15,16,17की अच्छी तरह से जांच की है । हमने हाल ही में आणविक तंत्रों को सुलझाया है जो मोटर डेंडराइट कनेक्टिविटी की शुरुआत करते हैं और यह प्रदशत करते हैं कि एक Dscam1-डॉक-पाक बातचीत एसीसी मोटर न्यूरॉन17में डेंराइट आउटग्रोथ की साइट को परिभाषित करती है। सामान्य तौर पर, यह तकनीक जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती उपभेदों में किसी भी भ्रूणीय मोटर न्यूरॉन्स के फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए अनुकूलनीय है, जो ड्रोसोफिला तंत्रिका तंत्र के कार्यात्मक डिजाइन में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने की हमारी क्षमता को बढ़ाती है।

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Protocol

1. उपकरण और आपूर्ति

  1. भ्रूण इकट्ठा करने और वयस्कों को अंडे देने के लिए प्रशिक्षण के लिए सामग्री
    1. 50 मीटर ट्यूब को तोड़कर फिल्ट्रेशन उपकरण तैयार करें और ट्यूब और टोपी के बीच में 100 माइक्रोन(सामग्री की तालिका)के छिद्रों के साथ एक जाल फिल्टर सेट करने के लिए टोपी में एक छेद खोलें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, 100 माइक्रोन(सामग्रीकी तालिका) के छिद्रों के साथ सेल छलनी भ्रूण संग्रह के निस्पंदन चरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. सूचीबद्ध निर्देशों के अनुसार अंगूर आगर प्रीमिक्स(सामग्री की तालिका)के साथ आगर प्लेटें बनाएं। संक्षेप में, धीरे से कमरे के तापमान (आरटी, 23 डिग्री सेल्सियस) डीएच2ओ के 500 मिलील में पाउडर मिश्रण के 1 पैकेट हलचल और जोरदार फोड़ा करने के लिए भंग मिश्रण माइक्रोवेव। 70−75 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के बाद, मिश्रण को पेट्री व्यंजन (60 मिमी) में डालें। आगर जम जाने के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट स्टोर करें।
    3. सक्रिय शुष्क खमीर(सामग्री की तालिका)और पानी को पेस्ट स्थिरता में मिलाकर खमीर पेस्ट तैयार करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. अंडा संग्रह पिंजरों (60 मिमी पेट्री डिश, सामग्री की तालिका के लिए) का उपयोग करें जो पर्याप्त वायु प्रवाह प्रदान करते हैं।
  2. विच्छेदन सुई और रंग इंजेक्शन माइक्रोपाइपेट की तैयारी
    1. एक ही केशिका ट्यूबिंग से एक ही केशिका ट्यूबिंग से डाय इंजेक्शन माइक्रोपाइपेट और विच्छेदन सुई तैयार करें जिसमें 0.6 मिमी का आंतरिक व्यास और 1.2 मिमी(सामग्री की तालिका)का बाहरी व्यास है। 170 वी अधिकतम उत्पादन(सामग्री की तालिका)से 7% पर एक माइक्रोपाइपट पुलर द्वारा केशिका ट्यूबिंग खींचने के लिए लंबाई में ~ 0.4 सेमी के एक टेपर के साथ एक तेज सुई बनाने के लिए।
    2. रंगइंजेक्शन के लिए, इंस्ट्रूमेंट के मैनुअल में वर्णित एक बुलबुला बेवेलिंग तकनीक द्वारा माइक्रोपाइपेट बेवलर(सामग्री की तालिका)के साथ माइक्रोपाइपेट को समायोजित करें।
      1. संक्षेप में, सुई टिप को 'खींचने' से पानी को रोकने के लिए ग्राइंडर को गीले एजेंट(सामग्री की तालिका)के साथ भिगो दें। सुई को माइक्रोपिपेट क्लैंप पर 25−30 डिग्री पर रखें और टिप को बेवेलिंग सतह के केंद्र से दो-तिहाई त्रिज्या पर कम करें। सुई को पीसलें जबकि ट्यूबिंग के साथ एक सिरिंज हवा को सुई में धकेलती है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि माइक्रोपाइप्ट ग्लास शेविंग ्स के स्पष्ट हो जाएगा।
      2. एक कोण पर बनने वाले माइक्रोपाइपेट के संकीर्ण उद्घाटन का पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण है क्योंकि बेवेलिंग के बाद टिप पर खोलने की स्थिति को इंगित करने के लिए माइक्रोपाइपेट को ठीक-ठाक स्थायी मार्कर के साथ चिह्नित करें।

2. भ्रूण संग्रह के लिए तैयारी

  1. सुनिश्चित करें कि वयस्क मक्खियों (20−40 जंगली प्रकार के कैंटन-एस या सफेद मक्खियों), पुरुषों और महिलाओं को युवा (<7 दिनों) और आदर्श अंडा संग्रह के लिए स्वस्थ परिस्थितियों में बनाए रखा जाता है।
    नोट: अंडे बिछाने को प्रोत्साहित करने के लिए, मक्खियों को उनके अंडे संग्रह पिंजरे में कुछ दिनों पहले एगर प्लेटों पर अंडा संग्रह से पहले प्रशिक्षित किया जाता है जो हर दिन कम से कम एक बार खमीर पेस्ट के साथ लकीर होती है।

3. भ्रूण मंचन

  1. मक्खियों को रात भर अंडे डालने की अनुमति दें (या कम से कम 15 घंटे) आरटी पर भ्रूण इकट्ठा करने के लिए 15 घंटे एईएल, यानी, चरण 1618,एसीसी और RP3 मोटर न्यूरॉन्स के डेंड्रिटोजेनेसिस को देखने के लिए। सुबह अंडे के साथ थाली इकट्ठा करें।
    नोट: 15 घंटे AEL में भ्रूण एक अलग 4 चैंबर आंत18होगा । इमेजिंग के लिए विभिन्न चरण ों उनके विशिष्ट रूपात्मक मानदंडों और उम्र बढ़ने की स्थिति का पालन करें।
  2. भ्रूण को इकट्ठा करने के लिए, 5 मिन के लिए 50% ब्लीच के साथ प्लेट पर रखे अंडे को डिकोरियोनेट करें।
  3. एक बार चोरियों को मंजूरी दे दी है, छानने का काम उपकरण या सेल छलनी के माध्यम से थाली की सामग्री डालना भ्रूण को अलग करने के लिए । पानी की एक निचोड़ बोतल का उपयोग करना, थाली पर छोड़ दिया ब्लीच पतला और फिल्टर में मिश्रण decanting द्वारा संभव के रूप में कई भ्रूण के रूप में इकट्ठा ।
  4. फिल्टर 3−4x पर भ्रूण को अधिक पानी से धोएं या ब्लीच गंध नष्ट होने तक। उपकरण से फिल्टर निकालें और पानी के साथ एक और साफ थाली पर भ्रूण धोने। भ्रूण पर है कि नई थाली से पानी decant ।
  5. इसे केंद्र में विनाइल टेप की दो परतों के साथ कवर करके एक ग्लास स्लाइड तैयार करें, जो आयत बनाते हैं। रेजर ब्लेड का उपयोग करके टेप से एक आयताकार पूल काटें। पूल के ऊपरी छोर की ओर डबल तरफा टेप की एक पतली पट्टी रखें, यह वह जगह है जहां भ्रूण को चित्रा 1में दिखाया गया है।
  6. ठीक संदंश का उपयोग करके, व्यक्तिगत रूप से 15 घंटे एईएल में 5−10 भ्रूण का चयन करें और उन्हें पृष्ठीय पक्ष के साथ दो तरफा टेप पर रखें। भ्रूण को डिसिजन(चित्रा 1)से बचाने के लिए विच्छेदन पूल में कीट रिंगर की खारा19 जोड़ें।

4. विच्छेदन और धुंधला

  1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप(सामग्री की तालिका)के नीचे एक गिलास सुई का उपयोग करना, इसकी सतह पर एक भ्रूण के मिडलाइन के माध्यम से अपने पूर्ववर्ती अंत तक कटौती। फिर भ्रूण को टेप से विटेलिन झिल्ली से कांच पर खींचें (चित्रा 1में बॉक्स्ड)। ध्यान रखें कि भ्रूण के आंतरिक ऊतकों को नुकसान न हो।
  2. केंद्र से एपिथेलियल ऊतकों को पलटें और ग्लास स्लाइड(चित्रा 1,इनसेट) की सतह पर एपिडर्मल किनारे संलग्न करें।
  3. ~ 300 माइक्रोन के टिप खोलने के साथ ट्यूब-कनेक्टेड सुई का उपयोग करना (विच्छेदन सुई की पतली नोक को तोड़कर तैयार किया गया), एस्पिरेट या हवा को अलग करने और पृष्ठीय देशमंडल श्वास चड्डी के साथ-साथ किसी भी शेष हिम्मत को हटाने के लिए हवा उड़ाना।
  4. आरटी में 5 मिन के लिए भ्रूण को ठीक करने के लिए फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का इस्तेमाल करें । भ्रूण को पीबीएस से 3x धोलें ।
  5. 1 घंटे के लिए पीबीएस के 200 μL में साइनिन 3 डाइ (एंटी-एचआरपी Cy3)(सामग्री की तालिका)के साथ संयुग्मित एंटी-सहिजन पेरोक्सिडेस एंटीबॉडी के 1 μL के साथ भ्रूण को दाग दें।
    नोट: इंजेक्शन के लिए पसंद के लिपोफिलिक रंगों के आधार पर एंटी एचआरपी की रंगी भाषा को बदला जा सकता है।

5. इंजेक्शन माइक्रो पिपेट भरना

  1. उपयोग से पहले इथेनॉल: वनस्पति तेल के 1:10 मिश्रण में हीट लिपोफिलिक रंग (डीआईओ या डीआईडी, टेबल ऑफ मैटेरियल्स)के 5 मिलीग्राम/एमएल 60 डिग्री सेल्सियस तक करें।
  2. इंजेक्शन माइक्रोपाइपेट के लिए तेल से घुलित डाइन स्लाइड तैयार करें। माइक्रोपिपेट को केशिका धारक(चित्रा 2,#1) में रखें। माइक्रोजोड़क(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके, माइक्रोपाइपेट को रंगकी स्लाइड पर समायोजित करें। फिर, रंग(चित्रा 2,#2) पर माइक्रोपिपेट रखने के लिए मंच को समायोजित करें।
  3. माइक्रोपाइपेट को भरने के लिए माइक्रोइंजेक्टर(टेबल ऑफ मैटेरियल)(चित्रा 2,#3) का उपयोग करें। 200−500 एचपीए (हेक्टोपस्केल) के बीच पीआई (इंजेक्शन दबाव) सेट करके माइक्रोपाइपेट में डाया इकट्ठा करें, टीआई (इंजेक्शन समय) 0.1−0.5 एस और पीसी (मुआवजा दबाव) के बीच 0 एचपीए को 5 मिन(चित्रा 2,#4) के लिए 0 एचपीए के लिए।
  4. एक बार रंग एकत्र किया गया है, रंगे स्लाइड को हटा दें और माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना रखें। इसके बाद, केशिका कार्रवाई द्वारा पीबीएस के संदूषण को रोकने के लिए नमूने में माइक्रोपाइपेट को कम करने से पहले पीसी को 20−60 एचपीए की सीमा तक बढ़ाएं।

6. न्यूरॉन्स में रंग इंजेक्शन

  1. 10x उद्देश्य लेंस(सामग्रीकी तालिका) के साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग कर केंद्र में भ्रूण का पता लगाने और भ्रूण के साथ माइक्रोपाइपेट संरेखित करें ।
    नोट: रंग की बूंद के आकार को पीआई या माइक्रोपाइपेट टिप के उद्घाटन के आकार को बदलकर समायोजित किया जा सकता है। बूंद 10−20 माइक्रोन होनी चाहिए, जो लगभग 1 मांसपेशियों की चौड़ाई है।
  2. एक पानी विसर्जन 40x लेंस(सामग्री की मेज)के लिए उद्देश्य लेंस बदलें और भ्रूण को देखने के लिए PBS में लेंस जलमग्न ।
    1. एंटी-एचआरपी Cy3 द्वारा चिह्नित न्यूरोनल मॉर्फोलॉजी की जांच करने और इंजेक्शन साइट निर्धारित करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।
    2. इंजेक्शन के दौरान, रंग की बूंद देखने के लिए ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें। जब भ्रूण ध्यान में हो, तो ब्याज के एक्सॉन (जैसे, एसीसी, आरपी3) की नोक के साथ कोमल संपर्क बनाने के लिए माइक्रोपाइपेट की स्थिति बदलें।
    3. एंटी-एचआरपी Cy3 द्वारा चिह्नित न्यूरॉन्स का उपयोग करके, एसीसी या आरपी3(चित्रा 3)के न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पर दाहिने पेट (A2−A6) हेमी-सेगमेंट में डाइ को छोड़ दें। हाथ नियंत्रण का उपयोग करना (माउस; चित्रा 2,5) रंगे जारी करें और माइक्रोस्पेशकरने वाले के साथ रंगे छोड़ने के बाद माइक्रोपाइपेट को हटा दें और अगले इंजेक्शन साइट पर जाएं।
      नोट: अन्य रंगों के विपरीत (उदाहरण के लिए, लूसिफ़ेर पीला, कैल्सिन) जो गैप जंक्शनों के माध्यम से पड़ोसी कोशिकाओं में फैलता है, लिपोफिलिक रंग कोशिका झिल्ली के साथ संबद्ध होते हैं और पड़ोसियों को स्थानांतरित नहीं करते हैं। रंग की बूंद के अपेक्षाकृत बड़े आकार के कारण, हालांकि, इस तकनीक के परिणामस्वरूप साझेदारी की मांसपेशियों(चित्रा 3ए)की लेबलिंग भी होती है।
  3. इमेजिंग से पहले रंग-ड्रॉप के बाद 1 एच के लिए आरटी में नमूना इनक्यूबेट।
    नोट: प्रोटोकॉल बढ़ते से पहले यहां रोका जा सकता है, और नमूना रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है । यदि एक इंट्रासेलुलर डायरेक्ट-कपल्ड (डीसी) एम्पलीफायर आसानी सेउपलब्ध हैतो लाइपोफिलिक रंगों को आयनटोफोरेसिस का उपयोग करके भी वितरित किया जा सकता है।

7. एक Confocal माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग

  1. संदंश की मदद से ग्लास स्लाइड से दो तरफा टेप और विनाइल टेप निकालें।
  2. चार कोनों पर वैक्यूम तेल(सामग्री की तालिका)की एक छोटी राशि के साथ एक कवर स्लिप (22 x 22 मिमी2 नंबर 1 कवर ग्लास) तैयार करें और हवा के बुलबुले से बचते हुए नमूने पर सावधानी से रखें। टास्क वाइपर्स का उपयोग करके किसी भी अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें।
  3. ऑब्जेक्टिव लेंस और सैंपल के बीच वर्किंग डिस्टेंस को एडजस्ट करने के लिए कवर स्लिप को नीचे पुश करें । नेल पॉलिश के साथ कवर स्लिप के किनारों को पूरी तरह से सील करें।
  4. एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 10x और 100x आवर्धन पर छवि ।
  5. माइक्रोस्कोप(सामग्री की तालिका)से कच्चे चित्रों को संसाधित करने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: अवलोकन सबसे अच्छी छवियों के लिए बढ़ते के बाद 10 मिनट के भीतर शुरू करना चाहिए । अन्यथा, आरटी में, रंग इंजेक्शन साइट इमेजिंग के लिए अवांछित पृष्ठभूमि बनाने के निकट साइटों में फैल जाएगा। साये के प्रसार को धीमा करने के लिए, नमूना एक दो घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

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Representative Results

15 घंटे एईएल में मोटर न्यूरॉन्स की बहुरंगी लेबलिंग प्रदर्शित करने के लिए एसीसी और आरपी3 मोटर न्यूरॉन्स की एक प्रतिनिधि छवि चित्रा 3सी में दिखाई गई है। उनकी डेंड्रिटिक मॉर्फोलोजी भ्रूण के बीच काफी हद तक इनवैरिएंट होती है। एंटी-एचआरपी एंटीबॉडी के साथ प्राप्त धुंधला पैटर्न ग्रे में दिखाया गया है। डीआईओ या डीआईडी की एक छोटी सी बूंद क्रमशः मांसपेशियों 1 या 6/7 के एनएमजे पर जमा की गई थी। चित्रा 4 मात्रात्मक रूप से ब्याज के फेनोटाइप को मापने की क्षमता को दर्शाता है। हमने एक उत्परिवर्ती (जैसे, dscam1-/-की तुलना में एक जंगली प्रकार में डेंडराइट युक्तियों की कुल संख्या गिना।

Figure 1
चित्रा 1: विच्छेदन पूल का सेटअप। कांच की स्लाइड पर देखा गया नीला कक्ष बफ़र्स को अंदर रखते हुए विनाइल टेप के साथ बनाया गया है। दो तरफा टेप भ्रूण है कि ठीक से गठबंधन कर रहे है पर रखती है । इसके अलावा नीचे बाएं कोने में दिखाया गया खारा में एक विच्छेदित भ्रूण का एक उदाहरण है। पूर्वकाल अंत इस और बाद के सभी आंकड़ों में शीर्ष पर है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: डाया इंजेक्शन उपकरण। आंकड़ा में ग्लास पिपेट लेबलिंग ग्लास पिपेट (1) की स्थापना स्थल को दर्शाता है। एपीपी-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप एक एलईडी लाइट स्रोत और फिल्टर सेट की एक श्रृंखला से लैस है। माइक्रोस्पोरेटर (2) और माइक्रोइंजेक्शन (3) उपकरणों को माइक्रोस्कोप के दाईं ओर लेबल किया जाता है। इनसेट पीआई,टीआईऔर पीसीके उचित मूल्यों के साथ माइक्रोइंजेक्शन डिवाइस (4) के प्रदर्शन का एक क्लोज-अप है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिगामी लेबल मोटर न्यूरॉन्स की लिपोफिलिक रंग की तैयारी। (A)प्रतिगामी लेबल वाले मोटर न्यूरॉन्स और उनकी लक्षित मांसपेशियां। एसीसी मोटर न्यूरॉन इनरवेटिंग मांसपेशी 1 (डीओ: उत्तेजना/उत्सर्जन, 484 एनएम/501 एनएम); RP3 मोटर न्यूरॉन innervating मांसपेशियों 6/7 (DiD: उत्तेजना/उत्सर्जन, ६४४ एनएम/६६५ एनएम) । ध्यान दें कि 6/7 मांसपेशियों को भी लार्वा चरणों में एक और मोटर न्यूरॉन (MNISNb/d-Is) से अंतरवती प्राप्त; हालांकि, MNISNb/d-Is एक भ्रूण समकक्ष3नहीं है । हलकों रंग अनुप्रयोगों की साइटों का संकेत मिलता है। (ख)15 घंटे एईएल में शरीर की दीवार की मांसपेशियों और परिधीय तंत्रिका शाखाओं का एक योजनाबद्ध आरेख। वेंट्रल नर्व कॉर्ड (वीएनसी) में वेंट्रल मिडलाइन (बिंदीदार रेखा) के संबंध में खंडित रूप से दोहराया और द्विपक्षीय सममित न्यूरोमेरे होता है। प्रत्येक हेमी-सेगमेंट की शरीर की दीवार की मांसपेशियों को 38 मोटर न्यूरॉन्स द्वारा आंतरिक किया जाता है। मोटर न्यूरॉन्स छह प्रमुख तंत्रिका शाखाओं (हैन [अंतरखंडीय तंत्रिका], एसएनए [खंडीय तंत्रिका एक], एसएनबी, एसएन सीएनसी, एसएन डी एनडी और तमिलनाडु [ट्रांसवर्स तंत्रिका]) के माध्यम से अपने एक्सोन को प्रोजेक्ट करते हैं। (ग)एसीसी और आरपी3 मोटर न्यूरॉन्स की डेंड्रिटिक शाखाएं व्यापक ओवरलैप दिखाती हैं । दोनों न्यूरॉन्स द्विध्रुवी न्यूरॉन्स हैं, जिसका अर्थ है कि न्यूरॉन्स dendrites की दो अलग-अलग आबादी स्थापित करते हैं। प्रत्येक न्यूरॉन ipsilateral न्यूरोपिल में एक आर्बर परियोजनाओं और एक और कॉन्ट्रालेटरल न्यूरोपिल में । एरोहेड्स डेंड्रिटिक टिप्स की ओर इशारा करते हैं। फ्लोरेसेंस छवियों को 10x उद्देश्य या 100x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एसीसी डेंड्रिटोजेनेसिस के रूप में घंटे-15 भ्रूण में प्रतिगामी लेबलिंग के साथ पता चला । (क)जंगली प्रकार में, एसीसी अपने दंसंस्कार को इप्सिलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल न्यूरोपिल्स दोनों में फैलाता है। सादगी के लिए, हम केवल इस आंकड़े में एसीसी से ipsilateral dendrites प्रदर्शित करते हैं । एसीसी को डीआईओ के साथ लेबल किया गया है, जो हरे रंग में दिखाया गया है। (ख) डीस्कैम 1 म्यूटेंट (डॉ Tzumin ली, जेनेलिया रिसर्च कैंपस सेdscam121/21) में, एसीसी में ज्यादातर मामलों में कुछ ipsilateral dendrites है17मनाया । एरोहेड्स डेन्ड्रिटिक टिप्स दिखाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

न्यूरोनल आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए रंग लेबलिंग के उपयोग आनुवंशिक सेल लेबलिंग तकनीकों पर कई फायदे हैं । डाया लेबलिंग तकनीक मोटर न्यूरॉन्स की मॉर्फोलोजी को लेबल करने और इमेजिंग करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा को कम कर सकती है। डाया लेबलिंग प्रक्रिया काफी तेज है क्योंकि यह 2 घंटे से कम लेता है और हमें न्यूरोनल अनुमानों की रूपरेखा को परिभाषित करने में सक्षम बनाता है। एक विकल्प के रूप में, कोई भी एक GAL4 लाइन चुनकर एसीसी मोटर न्यूरॉन की कल्पना कर सकता है जो एसीसी में खमीर GAL4 प्रतिलेखन कारक को व्यक्त करता है, और इसे अपस्ट्रीम एक्टिवेशन अनुक्रम (यूएएस)21द्वारा नियंत्रित हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) रिपोर्टर के साथ पार करता है। एक GFP लेबलिंग तकनीक के रूप में इस तरह के एक आनुवंशिक पार की आवश्यकता है और इस तरह, अतिरिक्त कुछ दिन लगते हैं ।

रंग लेबलिंग का एक और लाभ एक अत्यंत उच्च घनत्व पर प्लाज्मा झिल्ली के लेबलिंग की अनुमति देने के लिए है। झिल्ली के हर हिस्से पर लिपोफिलिक रंगों का पर्याप्त घनत्व मौजूद हो सकता है, जिससे हमें लेबल वाली संरचना के ठीक विवरण ों को हल करने की अनुमति मिल सकती है। इसके विपरीत, यूएएस-GAL4 प्रणाली में किक करने के बाद जीएफपी अणुओं का घनत्व अक्सर प्रतीक्षा अवधि पर निर्भर होता है। उदाहरण के लिए, एसीसी 10 घंटे एईएल से जीएफपी व्यक्त करना शुरू कर देता है। जब हम देखते हैं, तो 15 घंटे एईएल द्वारा, पूरी झिल्ली को कवर करने के लिए जीएफपी अणुओं का घनत्व अपर्याप्त है। इसके परिणामस्वरूप ठीक न्यूरोनल अनुमानों (डी.के., अप्रकाशित डेटा) की अपर्याप्त लेबलिंग होती है।

हालांकि यह तकनीक कई फायदे प्रदान करती है, लेकिन मोटर अक्षों का गलत प्रक्षेपण स्पष्ट होने पर यह कम लाभप्रद होता है। उदाहरण के लिए, साइडस्टेपके अभाव में, मोटर न्यूरॉन्स समय से पहले स्टाल, सेगमेंटल सीमा पार करने और अत्यधिक शाखाओं में बंटी22जैसे गंभीर अक्षीय दोषप्रदर्शित करते हैं। नतीजतन, एक निश्चित एक्सॉन टर्मिनल तक पहुंचना बोझिल हो जाता है। लेबलिंग की दक्षता भी उम्र पर निर्भर है, 20 घंटे एईएल से छोटे भ्रूण में प्रभावी होने के नाते । जैसे-जैसे एक्स्सेल्युलर मैट्रिक्स प्रोटीन विकास के साथ बढ़ता है, मोटर न्यूरॉन्स की लेबलिंग बहुत जटिल प्रतीत होती है।

यहां वर्णित तकनीक हमें न्यूराइट कुल लंबाई और संख्या, और न्यूराइट शाखा पैटर्न और आकार15,16,17,23,24जैसे कई रूपात्मक मापदंडों को मापने की अनुमति देती है। क्योंकि लिपोफिलिक कार्बोक्सियानाइन रंग कई रंगों (जैसे डीआईओ, डीआईए, डीआईआई, डीआईडी और डीआईआर) में आते हैं, आसन्न मोटर न्यूरॉन्स की बहुरंगी लेबलिंग भी प्राप्त की जा सकती है। जैसा कि चित्रा 4में दिखाया गया है, एसीसी और आरपी3 मोटर न्यूरॉन्स से dendrites बड़े पैमाने पर ओवरलैप। मोटर सर्किट विकास में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए, डेन्राइट-डेंडराइट इंटरैक्शन के तंत्र की जांच की जाएगी ।

यहां, हम बहुमुखी तकनीक का विस्तार करते हैं जो मोटर सर्किट में न्यूरोनल कनेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए एक एवेन्यू प्रदान करता है। हालांकि प्रदर्शन 15 घंटे AEL में एसीसी और RP3 मोटर न्यूरॉन्स तक ही सीमित है, इस तकनीक भ्रूण विकास के विभिन्न चरणों में अन्य मोटर न्यूरॉन्स के लिए लागू किया जा सकता है। यदि एक एक्सॉन टर्मिनल इंजेक्शन माइक्रोपाइप्ट के साथ सुलभ है, तो इस तकनीक को मक्खियों के लार्वा और वयस्क चरणों में या अन्य जीवों में भी किसी भी न्यूरॉन की लेबलिंग के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए कामियामा लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । इस काम को एनआईएच आर01 NS107558 (I.I., K.B., और डी.के.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x objective lens Nikon Plan
40x water-immersion lens Nikon NIR Apo
Capillary tubing Frederick Haer&Co 27-31-1
Confocal microscope Andor N/A Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass Corning 22x22 mm Square #1
DiD ThermoFisher V22886
DiI ThermoFisher V22888
DiO ThermoFisher V22887
Dissecting microscope Nikon N/A SMZ-U
Double Sided Tape Scotch 665
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Sci. 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Egg collection cage FlyStuff 59-100
FemtoJet 5247 Eppendorf discontinued FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ NIH Image processing software
Micromanipulator Sutter MP-225
Micropipette beveler Sutter BV-10-B
Needle puller Narishige PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets FlyStuff 47-102
Nylon Net Filter Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 Any EM grades
PBS Roche 11666789001 Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200 Kodak 146 4510 Wetting agent
Upright fluorescence microscope Nikon N/A Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape Scotch 6143
VWR Cell Strainers VWR 10199-659
Yeast FlyStuff 62-103 Active dry yeast (RED STAR)

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References

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