在胸腺的鼠标采用双光子显微镜的原位成像

Biology

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Summary

我们目前新生儿嵌合体的产生,以及编制胸腺体外成像双光子显微镜和解剖一步一步的指示。

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Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy. J. Vis. Exp. (11), e652, doi:10.3791/652 (2008).

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Abstract

双光子显微镜(TPM),让我们深入到胸腺的图像和文件胸腺发展的重要事件。我们要按照个人在人群的胸腺细胞迁移,产生不到一%的胸腺细胞从捐赠者是一个无处不在表达荧光蛋白的转基因的派生的新生儿的嵌合体。为了产生这些部分造血嵌合体,新生儿收件人注入骨髓岁之间的3-7天。 4-6周后,小鼠牺牲和胸腺是仔细解剖和bissected维护将成像的组织架构。胸腺是由TPM到盖玻片粘在准备前体内成像。胸腺是保持在成像的DMEM无酚红灌注95%的氧气和5%的二氧化碳,并加​​热到37 ° C。使用这种方法,我们可以研究为一个多元化的T细胞剧目的产生所需的事件。

Protocol

继转移

注入骨髓50 - 100ul使用胰岛素注射器在第3-7天2-4次,最后的捐助到主机1:1的比例,新生儿。瞄准注射部位下方的胸骨和肋骨,但上面的肠道和胃。远远不够插入针穿透腹膜,小心不要刺穿隔膜。骨髓注射过程中失去一些,这并非罕见。您可以通过放松对你的小狗抓地力的损失,为你注入,让皮肤扩大,然后,慢慢消除针。

剖析胸腺

通过中线切口,剪开或撕开皮肤,露出肋骨。胸骨和穿过腹膜和隔膜。削减肋骨的两侧,以揭示胸腔。胸腺位于心脏上方。 ,以便保持胸腺的结构,对周围组织,为您剖析胸腺举行。用PBS冲洗,以保持干燥过程中剥离出的胸腺。轻轻挑逗胸腺囊表面上多余的组织和对开两叶。

准备组织成像

使用兽医组织粘合剂胶胸腺没有一个正方形的盖玻片。使用pipetteman把一小部分的胶粘剂微升。传播胶水的大致长度和宽度的胸腺。稳定胸腺对盖玻片和拖动到位。

双光子成像

该组织是被淹没的DMEM无酚红灌注95%的氧气和5%的二氧化碳,并加​​热到37 ° C。双光子激发是通过使用一个茅台酒光谱物理激光调谐至900nm,和CFP,GFP,YFP和得克萨斯红发射光分离使用的是495,515,560分色镜和使用光电倍增管探测器收集。

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Discussion

双光子成像在胸腺,使我们能够在生活,完整的器官胸腺内选择事件背后的相互作用和迁移研究。

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Acknowledgements

我们感谢提供技术援助的马特保罗和吉米吴。

References

  1. Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
  2. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  3. Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).

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