In situ avbildning av Mouse Thymus Använda 2-Photon Mikroskopi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi presenterar steg-för-steg-instruktioner för generering av neonatal chimärer samt dissekering och förberedelse av bräss för ex vivo imaging med 2-Photon mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy. J. Vis. Exp. (11), e652, doi:10.3791/652 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Två-foton mikroskopi (TPM) ger oss möjlighet att bilden djupt in i tymus och dokumentera händelser som är viktiga för tymocyt utveckling. För att följa migrationen av individer i en folkmassa av tymocyter skapar vi neonatal chimärer där mindre än en procent av tymocyter kommer från en donator som är transgena för en ubiquitously uttrycka fluorescerande protein. För att generera dessa partiella hematopoetisk chimärer, är neonatal mottagare injiceras med benmärg mellan 3-7 dagars ålder. Efter 4-6 veckor är musen offras och bräss är noggrant dissekeras och bissected bevara arkitekturen i den vävnad som ska avbildas. Bräss är limmad på ett täckglas som förberedelse för ex vivo avbildning av TPM. Under avbildning bräss hålls i DMEM utan fenolrött som är perfusion med 95% syrgas och 5% koldioxid och uppvärmd till 37 ° C. Med denna metod kan vi studera de händelser som krävs för generering av en mängd T-cell repertoar.

Protocol

Adoptiv transfer

Injicera nyfödda med 50-100ul av benmärg med en spruta 2-4 gånger under de första 3-7 dagarna av liv, med en sista givare till host 1:1. Sikta på ett injektionsställe nedanför bröstbenet och bröstkorgen, men framför tarmen och magen. In nålen tillräckligt långt för att tränga igenom bukhinnan, noga med att inte punktera membranet. Det är inte ovanligt för en del av benmärgen att gå förlorade under injektionen. Du kan minska förlusten genom att lossa greppet om valpen när du injicera så att huden att expandera och då långsamt att ta bort nålen.

Dissektion av Thymus

Gör ett snitt genom mittlinjen och skär eller riva huden bort att avslöja bröstkorgen. Håll i bröstbenet och skär genom bukhinnan och mellangärde. Skär upp sidorna av bröstkorgen för att avslöja brösthålan. Bräss ligger på toppen av hjärtat. I syfte att bevara strukturen på bräss, hålla fast vid omgivande vävnad som du dissekera ut bräss. Skölj bräss med PBS för att hålla den från att torka ut under dissekering. Försiktigt reta bort överflödig vävnad på ytan av thymic kapseln och HALVERA de två lober.

Förbereda Mjukpapper för bildbehandling

Använd veterinär vävnad lim för att limma bräss nej till en kvadrat täckglas. Använd en pipetteman att sätta en bråkdel av en mikroliter lim. Sprid lim till den ungefärliga längden och bredden på bräss. Steady bräss mot täckglas och dra den på plats.

Två-Photon Imaging

Vävnaden är nedsänkt i DMEM utan fenolrött som är perfusion med 95% syrgas och 5% koldioxid och uppvärmd till 37 ° C. Två-foton excitation uppnåddes med hjälp av en Spectra-Physics Maitai lasern inställd på 900nm, och den gemensamma fiskeripolitiken, GFP, YFP och Texas Red utsläpp ljus var separeras med en 495, 515, 560 dikroiskt speglar och in med PMT detektorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Två-foton avbildning i tymus ger oss möjlighet att undersöka i levande, intakta organ interaktionen och migration som ligger bakom valet händelser inom bräss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi tackar Matt Paul och Jimmy Wu för tekniskt stöd.

References

  1. Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
  2. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  3. Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics