Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

Biology

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Summary

Nós apresentamos o passo-a-passo para a geração de quimeras neonatal, bem como a dissecação e preparação do timo ex vivo de imagens por 2-Photon Microscopia.

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Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy. J. Vis. Exp. (11), e652, doi:10.3791/652 (2008).

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Abstract

Microscopia de dois fótons (TPM) nos permite imagem profundamente no timo e documentar os eventos que são importantes para o desenvolvimento timócito. Para acompanhar a migração de indivíduos em uma multidão de timócitos, geramos quimeras neonatal, onde menos de um por cento dos timócitos são derivados de um doador que é transgênico para expressar uma proteína fluorescente ubiquitously. Para gerar estas quimeras parcial hematopoéticas, os destinatários neonatal são injetados com medula óssea entre 3-7 dias de idade. Após 4-6 semanas, o rato é sacrificado e do timo é cuidadosamente dissecado e bissected preservar a arquitetura do tecido que será trabalhada. O timo é colado em uma lamela em preparação para ex vivo de imagens por TPM. Durante a gravação do timo é mantido em DMEM sem vermelho de fenol que é perfundido com 95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5% e aquecido a 37 ° C. Usando essa abordagem, podemos estudar os eventos necessários para a geração de um repertório diversificado de células T.

Protocol

Transferência adotiva

Injetar recém-nascidos com 50 100ul de medula óssea usando uma seringa de insulina 2-4 vezes durante os primeiros 3-7 dias de vida, com uma relação de doadores para hospedar-final de 1:1. Apontar para um local da injeção abaixo do esterno e costelas, mas acima do intestino e estômago. Inserir a agulha longe o suficiente para penetrar no peritônio, cuidado para não perfurar o diafragma. Não é incomum para alguns de medula óssea para ser perdido durante a injecção. Você pode reduzir a perda soltando o seu domínio sobre o cachorro como você injetar, de modo a permitir que a pele a se expandir e, em seguida, lentamente, retirar a agulha.

Dissecção da Thymus

Faça uma incisão através da linha média e cortar ou rasgar a pele para revelar a caixa torácica. Segure-se do esterno e cortar o peritônio e diafragma. Cortar os lados da caixa torácica para revelar a cavidade torácica. O timo fica em cima do coração. De forma a preservar a estrutura do timo, segurar o tecido circundante como você dissecar o timo. Lavar o timo com PBS para mantê-lo de secar durante a dissecção. Provocar suavemente o tecido em excesso na superfície da cápsula do timo e bisect os dois lóbulos.

Preparando Tissue for Imaging

Use cola de tecido veterinária para colar o timo não a uma lamela quadrados. Use uma pipetteman para colocar uma fração de um microlitro de adesivo. Espalhe a cola para o comprimento e largura aproximada do timo. Timo a constante contra as lamelas e arrastá-lo no lugar.

Dois Photon Imagens

O tecido é imerso em DMEM sem vermelho de fenol que é perfundido com 95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5% e aquecido a 37 ° C. Excitação de dois fótons foi obtido utilizando um Spectra-Física Maitai a laser sintonizado com 900nm, e PCP, GFP, YFP e Texas Red emissão de luz foi separada usando um 495, 515, 560 espelhos dicróicos e coletados por meio de detectores de PMT.

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Discussion

Imagem de dois fótons no timo nos permite examinar em que vivem, órgãos intactos as interações e as migrações que fundamentam eventos de seleção dentro do timo.

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Acknowledgements

Agradecemos a Matt Paul e Jimmy Wu para assistência técnica.

References

  1. Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
  2. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  3. Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).

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