Neocortex में रक्त प्रवाह का एक कपालीय खिड़की के माध्यम से 2 फोटॉन इमेजिंग के लिए एक विधि

Biology

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Summary

Cortical रक्त प्रवाह की गतिशीलता इमेजिंग फ्लोरोसेंट dextran रंजक 2-photon माइक्रोस्कोपी के साथ कृन्तकों की पूंछ नस में इंजेक्शन द्वारा vivo में अध्ययन किया जा सकता है. इस वीडियो का पता चलता है कि चूहों के एक गिलास कवर कपाल विंडो तैयारी के माध्यम से neocortex में रक्त प्रवाह की गतिशीलता छवि के लिए कैसे.

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Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678, doi:10.3791/678 (2008).

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Abstract

रहने वाले कृन्तकों के बरकरार मस्तिष्क में मस्तिष्क vasculature (capillaries को बड़े जहाजों से) रिकॉर्ड और रक्त प्रवाह की गतिशीलता छवि के लिए की क्षमता एक शक्तिशाली तकनीक है. Vivo में एक कपाल खिड़की के माध्यम से 2-photon माइक्रोस्कोपी का प्रयोग छवि फ्लोरोसेंट नसों के द्वारा इंजेक्शन रंजक के लिए संभव है. यह एक परमिट cortical vasculature की छवि को और भी करने के लिए रक्त के प्रवाह की माप प्राप्त है. इस तकनीक को मूल डेविड Kleinfeld और Winfried Denk द्वारा विकसित किया गया था. विधि मस्तिष्क ischemia के दौरान या बाद में रक्त प्रवाह की गतिशीलता का अध्ययन किया जा सकता neurodegenerative विकारों में मस्तिष्क ट्यूमर में, या सामान्य मस्तिष्क शरीर क्रिया विज्ञान में. उदाहरण के लिए, यह रक्त के प्रवाह की दिशा में स्ट्रोक कैसे का कारण बनता है परिवर्तन और लाल रक्त कोशिका या में और आसपास रोधगलितांश वेग प्रवाह में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहाँ हम का प्रदर्शन कैसे फ्लोरोसेंट रंजक पूंछ नस में इंजेक्शन का उपयोग रहने वाले चूहों की neocortex में 2-photon माइक्रोस्कोपी छवि रक्त प्रवाह की गतिशीलता के लिए उपयोग करने के लिए.

Protocol

फ्लोरोसेंट dextrans रंगों की पूंछ नस इंजेक्शन

  1. छवि मस्तिष्क vasculature को आदेश में, पशुओं के एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ नसों के द्वारा इंजेक्शन चाहिए. हम dextran - संयुग्मित रंगों का उपयोग करें, क्योंकि dextran आधा भाग मस्तिष्क रक्त बाधा पार करने और रक्त वाहिकाओं के बाहर लीक से डाई को रोकता है.
  2. चूहे isoflurane (प्रेरण के लिए 4%, इंजेक्शन के दौरान 1.5-2%) के साथ anesthetized हैं.
  3. टेल 70% शराब के साथ कीटाणुरहित किया हुआ है.
  4. एक 26 गेज सुई के साथ, एक 5% rhodamine dextran के समाधान v / v खारा में भंग के 75-100 μl पूंछ, पूंछ के शाफ्ट साथ नस से रास्ते के मध्य में के माध्यम से इंजेक्शन है.
  5. पशु पूंछ नस इंजेक्शन के बाद तुरंत imaged किया जा सकता है जब तक डाई मूत्र, जो गुलाबी बारी अगर लगभग 2 घंटे में एक rhodamine डाई का उपयोग करेंगे में excreted है.

रक्त प्रवाह का उपयोग कर दो photon माइक्रोस्कोपी इमेजिंग (कुल अवधि प्रति सत्र 30-60 मिनट, imaged जहाजों की संख्या के आधार पर)

  1. फ्लोरोसेंट dextran डाई इंजेक्शन के बाद, माउस isoflurane (प्रेरण के लिए 4%, इमेजिंग के लिए 1-1.5%) के साथ anesthetized है.
  2. माउस मजबूती खुर्दबीन मंच है, जो thermo विनियमित एक हीटिंग पैड जानवर को गर्म रखने के शामिल करने के लिए टाइटेनियम पट्टी का उपयोग करने के लिए जुड़ा हुआ है. कुछ आँख मरहम आंखें नम रखने के लिए लागू किया जाता है.
  3. कपाल खिड़की के कांच कवर 70% शराब के साथ साफ है.
  4. खिड़की समानांतर फोकल हवाई जहाज़ के लिए तैनात है और 4X उद्देश्य के तहत देखने के क्षेत्र में केंद्रित है.
  5. यह सबसे अच्छा है एक डिजिटल कैमरा के साथ मस्तिष्क की सतह वाहिकाओं के एक तस्वीर लेने के. इस चित्र इमेजिंग सत्र के बाद आज के दिन तक दिन से imaged क्षेत्र को बार - बार मिल में संदर्भ की छवि के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.
  6. 4X उद्देश्य चलती चरण के बिना पानी विसर्जन 40x उद्देश्य के साथ की जगह है. फिर से देखने के क्षेत्र के एक डिजिटल तस्वीर ले लिया है. चरण जोड़तोड़ में निर्देशांक शून्य पर सेट कर रहे हैं.
  7. हम छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के रूप में ScanImage का उपयोग करें. इस MatLab में टॉम Pologruto और बर्नार्डो Sabatini द्वारा कैरेल SVOBODA (Pologruto एट अल., 2003) की प्रयोगशाला में लिखा गया था. लेजर, बिजली मीटर, फोटो मल्टीप्लायरों ट्यूबों, एम्पलीफायरों, आदि: हम अगले सभी अन्य उपकरणों पर बारी
  8. imaged किया जा उपयुक्त खिड़की के क्षेत्र संक्षेप में कम बढ़ाई स्कैन के लिए सबसे अच्छा क्षेत्रों को खोजने के. एक बार इन की पहचान कर रहे हैं चुना छवि लिया है क्षेत्र के एक कम बढ़ाई ढेर, और अपने XY निर्देशांक एनोटेट हैं.
  9. छोटे जहाजों या capillaries में रक्त प्रवाह की गतिशीलता रिकॉर्ड हम ब्याज की कम से कम 40 सुक्ष्ममापी पोत के साथ लाइन स्कैन का उपयोग करें. इन एकल "sweeps" स्थायी एक दूसरे संभव के रूप में छोटे लेजर शक्ति और निर्देशांक और स्कैनिंग के कोण नीचे लिखा जाता है के रूप में प्रयोग किया जाता है.
  10. एक बार इमेजिंग सत्र खत्म हो गया है, पशु जहां यह संज्ञाहरण से ठीक हो सकता है एक गर्म कक्ष ले जाया जाता है.

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Discussion

Cortical रक्त प्रवाह की गतिशीलता इमेजिंग फ्लोरोसेंट dextran रंजक दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ कृन्तकों की पूंछ नस में इंजेक्शन द्वारा vivo में अध्ययन किया जा सकता है. यह वीडियो कैसे छवि चूहों के एक गिलास कवर कपाल विंडो तैयारी के माध्यम से neocortex में रक्त प्रवाह की गतिशीलता के लिए एक विधि दिखाया.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fluorescein isothio-cyanate-dextran Reagent Sigma-Aldrich FD500S mol wt 500,000
Rhodamine B isothio-cyanate-dextran Reagent Sigma-Aldrich R9379 mol wt ~70,000

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References

  1. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).
  2. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).
  3. Zhang, S., Murphy, T. H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo. 5, (2007).
  4. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Hi Carlos

    What is the thickness of the coverslip?thanks!

    Reply
    Posted by: Niloufar K.
    January 18, 2016 - 12:04 PM

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