Generatie van beenmerg afgeleide Murine dendritische cellen voor gebruik in twee-foton Imaging

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Antigeen presentatie in secundaire lymfoïde organen door de dendritische cellen is cruciaal voor de opening van het T-cel gemedieerde adaptieve immuunrespons. Hier laten we zien de cultuur van beenmerg afgeleide dendritische cellen van muizen, activering, en de etikettering voor 2-photon imaging.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

P. Matheu, M., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773, doi:10.3791/773 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Verschillende methoden voor de bereiding van muizen dendritische cellen kan worden gevonden in de literatuur. Hier presenteren we een methode die meer dan 85% CD11c hoge dendritische cellen produceert in cultuur die de thuishaven van de drainerende lymfeklier na subcutane injectie en presenteren antigeen aan antigeen specifieke T-cellen (zie video). Daarnaast maken we gebruik van Essen Instruments Incucyte naar dendritische cel rijping, waar, op dag 10, de morfologie van de gekweekte cellen is typerend voor een rijpe dendritische cel en <85% van de cellen zijn CD11chigh track. De studie van antigeen presentatie in perifere lymfeklieren door twee-foton beeldvorming bleek dat er drie verschillende fasen van dendritische cel en T-cel interactie 1, 2. Fase I bestaat uit korte seriële contacten tussen zeer beweeglijke antigeen specifieke T cellen en antigen dragen dendritische cellen 1, 2. Fase twee wordt gekenmerkt door langdurige contacten tussen antigeen-specifieke T-cel en antigeen met dendritische cellen 1, 2. Tot slot wordt fase III kenmerkt zich door T-cellen losmaken van dendritische cellen, het herwinnen van de beweeglijkheid en het begin tot het 1, 2 delen. Dit is een voorbeeld van het type van antigeen-specifieke interacties die kunnen worden geanalyseerd door twee-foton beeldvorming van antigeen-beladen cellen tracker dye-gelabelde dendritische cellen.

Protocol

1) Verwijder beide dijbeen botten van een muis

  1. Gebruik dissectie schaar weg te snijden spieren en het dijbeen bot bloot boven en onder de gewrichten (knie en heup). Pak het midden van het dijbeen met de dissectie een pincet en snijd boven en onder de gewrichten om zoveel mogelijk van de epifyse als mogelijk intact laten.
  2. Schoon uit zo veel spieren als mogelijk met behulp van kleine dissectie schaar. Overdracht het dijbeen in een schaal van RPMI.
  3. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in de motorkap vanaf dit punt, met alleen steriele media, instrumenten, pipetpunten en cultuur gerechten.

2) Steriliseer Femur botten:

  1. In de kap, transfer botten van de RPMI tot een kleine cultuur schotel gevuld met 70% ethanol op ijs.
  2. Laat botten om in ethanol weken voor 5 minuten op ijs.

3) Verzamel Beenmerg onder steriele omstandigheden:

  1. Overdracht botten om een ​​kleine cultuur schotel met steriel gefiltreerd Primair DC cultuur media.
  2. Met een steriele pincet, houdt het bot boven een gooi gerecht of buis, en met steriele schaar, snijd elke epiphesis (uiteinden van het bot) uit te schakelen. De cut moet blootstellen beenmerg, die is helder rood in het midden van het bot.
  3. Met een steriele spuit (26-28 gauge naald), zuigen ongeveer 100-200 ml steriele media.
  4. Houd het bot met de steriele pincet boven een verse schotel van steriele media en steek de naald in een kant van het bot. Plaats de punt van de naald buurt van de top van het bot en langzaam was het bot met de steriele media. Als u in het centrum van het bot, moet de naald glijden gemakkelijk in.
  5. Het beenmerg wast uit, hetzij in kleine stukjes of als een enkel stuk. Het moet worden uitgespoeld van het bot en in de schaal van steriele media.
  6. Herhaal deze stap als nodig is om volledig te wassen het merg uit het bot.
  7. Wanneer het bot schoon is, zal het wit en doorschijnend.
  8. Herhaal deze procedure met de andere dijbeen bot. Gooi elk dijbeen bot als het eenmaal schoon is.

4) Re-schorten en neer beenmergcellen Spin:

  1. Overdracht cellen om een ​​steriele falcon buis.
  2. Als beenmerg is nog intact, heel voorzichtig pipet media op en neer in de schaal, tot breken het merg in een enkele celsuspensie. Dit kan enkele minuten duren en moet langzaam worden gedaan om te voorkomen dat het doden van cellen door pure kracht.
  3. Centrifuge cellen zoals u elke andere cellen van zoogdieren.

5) cellysis:

  1. Haal de buis uit de centrifuge na de spin is klaar en giet media uit (giet) in een kleine afval (50 ml Falcon buis) in de motorkap.
  2. Resuspendeer pellet door voorzichtig flicking de bodem van de buis.
  3. Met behulp van steriel gefilterd water en 10x of 10x DPBS PBS, het uitvoeren van een water lysis aan de rode bloedcellen (RBC's) met behulp van de volgende hoeveelheden te verwijderen:
    • 900 ml steriel gefilterd water
    • 100 ml 10x DPBS of 10x PBS
  4. Voeg 100 ml van 10x PBS 5-10 seconden na toevoeging van het water. Het is heel belangrijk doen dit meteen, zodat alleen de rode bloedcellen worden gelyseerd. Het is een goed idee om zowel pipetten gevuld en klaar.
  5. Voeg 5 ml - 10 ml steriele DC basic media.

6) Aantal cellen:

  1. In de kap, meng de 6 tot 11 ml van beenmergcellen onder voorzichtig schudden de buis met een lichte inversie, een 45 graden hoek (niet zo dat de media de bovenkant van de buis raakt)
  2. Verwijder 10 ml van de media in een steriele buis voor het tellen.
  3. Re-cap de cellen en centrifuge opnieuw.

7) Plating Dendritische cellen:

  1. De cellen moeten worden uitgeplaat bij een dichtheid van 1 x 106/mL.
  2. Verwijder de cellen van centrifuge, giet de media en resuspendeer cellen in de juiste hoeveelheid primaire DC-Media voor plating.
  3. Plaats in weefselkweek incubator.

8) Cultuur Care en rijping:

Controleer altijd culturen voor het toevoegen van meer media of het gebruik in alle experimenten. Controleer de algemene gezondheid van de cellen en op zoek naar mogelijke verontreiniging.

DAG 0: Dendritische cellen uitgeplaat.

DAG 3: Verwijder 75% van de media en niet-adherant cellen en voeg terug Primair DC media.

Dag 6: Na de eerste Cell Plating: Re-bord van de cellen met behulp van de volgende procedure:

  1. Verwijder de media, die sommige niet-adherant DC's op dit punt, en plaats dient te bevatten in een steriele 50 ml Falcon buis, waardoor platen zeer licht vochtig (u niet wilt dat de hechtende cellen uit te drogen)
  2. Voeg 3 mM EDTA in PBS op elk bord en laat het zitten voor 5 minuten.
  3. Houd de plaat in een hoek van 45 graden en zachtjes pipet media op en neer tegen de onderkant van de plaat voorzichtig los te maken van niet-adherant cellen.
  4. EDTA / PBS zou moeten worden dikker aangeeft cellen worden verzameld van de bodem van deplaat.
  5. Na enkele minuten van deze, kan celmengsel worden overgebracht naar de 50 ml Falcon buis.
  6. Spin alle cellen na het uitvoeren van deze procedure voor elke plaat.
  7. Tellen en het bord van de cellen bij een dichtheid van 1 x 10 ^ 6 per plaat op de middelbare DC Media in nieuwe steriele 10 cm cultuur gerechten. Keer terug cellen om weefselkweek incubator.

DAG 10-11

Ouder DC's gereed voor stimulatie / antigen laden.

9) Dendritische cel stimulatie:

  1. Gebruik LPS (lipopolyscaccharide) in combinatie met de gewenste peptide voor activering en peptide laden. Afhankelijk van uw bron van LPS, kunnen verschillende stimulatie omstandigheden betere resultaten geven. Bovendien moet de gewenste hoeveelheid peptide voor DC-presentatie worden geoptimaliseerd. Stimulatie voorwaarden in dit protocol werden 100 ng / ml LPS en 100 ug / mL OVA (ovalbumine).
  2. Belasting antigeen / behandelen met LPS voor 18-24 uur voor de oogst / gebruiken.

Dendritische Cell Media: Steriel filter nadat alles is toegevoegd

Zie de discussie sectie voor een overzicht van de verschillende dendritische cel kweekomstandigheden en voor de daaruit voortvloeiende dendritische cel fenotype. Deze cultuur voorwaarden zijn ontworpen om rijpe dendritische cellen te produceren die snel naar huis om drainerende lymfeklieren, 18-24 uur na subcutane injectie en presenteren antigeen efficiënt.

Primaire DC Media: Steriel filter nadat alles is toegevoegd

  • 500 ml IMDM (verwijder 55-60 ml voor 500 ml eindvolume)
  • 50 ml hitte geïnactiveerd FBS
  • 5 ml 200 mM L-Gln, uiteindelijke concentratie van 2 mM
  • 100 IE / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine (5 ml van 10.000 IU / ml Pen en 10.000 mg / ml Strep voorraad)
  • 50 uM B-Me (14,3 M B-Me voorraad, 1:100 verdund in de chemische kap, gebruik van 35 ul per 100 ml media voor 50 micromolaire concentratie)
  • 20-30 ng / ml GM-CSF
  • 100 tot 400 IU / ml IL-4 ongeveer 10 tot 40 ng / mL

SecondaryDC media voor rijping *

100 ng / ml TNF-alfa (voeg toe aan primaire DC media)

* Opmerking: GM-CSF + IL-4 moet onvolgroeide dendritische cellen te produceren. Met behulp van GM-CSF + IL4 (400 IE / ul) + TNF-alfa (100 ug / ml) zal leiden tot cellen die lijken op volwassen monocyt afgeleid dendritische cellen. Rijpe dendritische cellen is bekend niet op te nemen antigeen zo efficiënt als onvolwassen dendritische cellen en culturen kunnen endogene TNF-a vrijgelaten uit stromale cellen 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dendritische cellen zijn de belangrijkste bemiddelaars van de adaptieve immuunrespons en de meest efficiënte antigeen presenterende cel gekenmerkt to-date. Methoden voor mens en muis dendritische cel-cultuur in de literatuur verschillen in de aard van de cytokines gebruikt om de ontwikkeling van de verschillende soorten dendritische cel beïnvloeden. Met name zijn GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alfa en IFN-gamma gebruikt in verschillende combinaties te produceren volwassen, onvolwassen, ontstekings-en steady-state, zoals muizen beenmerg afgeleide dendritische cellen in vitro 3-7. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor de productie van volwassen muizen dendritische cellen die in staat zijn om homing drainerende lymfeklieren na subcutane injectie, de presentatie van antigeen en het activeren van T-cellen na ve. De resulterende dendritische cel populatie is meestal> 85% CD11chigh met induceerbare expressie van CD80/86 op LPS activering. De toevoeging van TNF- om de cultuur op dag 7 is optioneel en produceert een meer volwassen phenotype8. Het onderhoud van de in vitro Langerhans dendritische cel culturen, TNF-alfa is een belangrijk factor te overleven, maar niet het stimuleren van de cellen 9 rijpen. Opgemerkt moet worden dat de TNF-alfa uit endogene bronnen (waarschijnlijk stromale cellen) is gemeld aanwezig te zijn in de cultuur media 7. Andere succesvolle methoden voor het afbeelden van subcutaan geïnjecteerd dendritische cellen omvatten positieve selectie voor CD11c + cellen van de milt als gelijktijdige etikettering en activering van de endogene dendritische cel population1, 2, 10. Productie van CD11chigh dendritische cellen uit beenmerg is een robuuste methode die consistent produceert grote aantallen van dendritische cellen die in staat van antigeen presentatie in vivo, belangrijk in de beeldvorming het proces van het adaptieve immuunsysteem activering van 11, 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

National Institutes of Health Kirchstein Fellowship predoctorale gemeenschap AI-64128 (MPM), GM-41514 (MDC), GM-48.071 (IP)

References

  1. Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J Exp Med. 200, 847-856 (2004).
  2. Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).
  3. Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102, 1753-1763 (2003).
  4. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  5. Lutz, M. B., et al. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).
  6. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  7. Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. 3, (2001).
  8. Winzler, C., et al. Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. J Exp Med. 185, 317-328 (1997).
  9. Koch, F., et al. Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation. J Exp Med. 171, 159-171 (1990).
  10. Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
  11. Wei, S. H., et al. Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node. J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).
  12. Castellino, F., et al. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).

Comments

23 Comments

  1. what are the aproximate yeilds of the process, ie total per femur and the number (from one femur) at D6 replating?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 12, 2009 - 3:57 PM
  2. I usually have around 1² M DCs per femur on day 6, passing the cells using EDTA rather than trypsin (which is generally less efficient, but has other advantages). Typically the yield is higher if I use a younger animal.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 6:20 PM
  3. I read in other protocol that 10 ng/ml of GM-CSF (with out IL4) is enough to derive immature dendritic cells from bone marrow. Do we really need to supplement the media with IL-4?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 14, 2010 - 2:42 PM
  4. IL-4 is not necessary, but the resulting DCs will generally be different. Here is a publication that details this:

    " Influence of interleukin-4 on the phenotype and function of bone marrow-derived murine dendritic cells generated under serum-free conditions."

    Wells JW, Darling D, Farzaneh F, Galea-Lauri J.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 6:14 PM
  5. Have you tried splitting the cells when they're still immature? I am worried that splitting them would activate them and/or kill a large number of cells...

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:36 PM
  6. Hi Joanna,

    I typically do split the cells while they would be considered immature. This likely leads to a low level activation, but I have not defined the exact nature of the activation status after splitting the cells. In my experience large numbers of cells do not die off after splitting. Prolonged exposure to trypsin or a calcium chelator could result in die off of cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 6:11 PM
  7. Great, do they usually re-attach normally to the plate? I didnt use trypsin, but i scraped them for splitting, and they are floating around today... im not sure if they're still alive or not!
    Thanks!!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2010 - 10:02 AM
  8. Hi, yes they should be reattached to the plate by now if they were healthy.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2010 - 12:36 PM
  9. The video is great, but can you please remove the absolutely tedious music from it? It is so destracting and makes it very difficult to concentrate.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2010 - 6:12 AM
  10. Hello:

    I am slightly confused. Your video says to use 300 mM EDTA, but your protocol below says to use 3mM EDTA. Is this a typo?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 1, 2011 - 2:26 PM
  11. Can you please provide the supplier/manufacturer of the Cytokines (IL-4, GM-CSF, TNFa)?
    thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 16, 2011 - 9:54 AM
  12. R&D Systems

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 16, 2011 - 11:00 AM
  13. What is the difference between using the EDTA to remove the DCs and using a cell scraper? A ²008 JOVE protocol "Culture of myeloid DCs from bone marrow precursors" uses a cell scraper. Just wondering if there is a reason for using EDTA over a scraper?

    Reply
    Posted by: Greg P.
    June 5, 2012 - 10:54 AM
  14. Sorry for the late reply. You could use either method, i.e. either EDTA or scraper. Depending on your experiment and the needed number of cells, gentle pipeting up and down 5-10 times using a 5 ml pipet can also give you a good number of DCs. Instead of a scraper you can use a 5 ml syringe and 18G needle to draw in and then flush out media to the bottom of the plates to dislodge DCs. DCs are very sensitive to change. So another tip is to keep the DC plates towards the back of the incubator, so that opening/closing of doors dŒs not change the ambient temperature too much. Hope this helps. - D. Sen

    Reply
    Posted by: Debasish S.
    June 25, 2012 - 8:34 PM
  15. Could you please sent me an copy of this article which help me out in my PhD. I am culturing with ²0ng/ml of GM-CSF. Is that ok for growing the dendritic cells isolated from murine bome marrow.

    Reply
    Posted by: srinath g.
    June 22, 2012 - 8:13 AM
  16. ²0 ng/ml is the standard that we use for bone marrow preparation. If you want more mature DCs you can use more upto say 30 ng/ml.

    Reply
    Posted by: Debasish S.
    June 25, 2012 - 8:28 PM
  17. Hi, I was wondering if you could share or explain what your FSC SSC plot/gate look like? I am not sure what population to gate on the plot.

    Reply
    Posted by: kristin l.
    November 19, 2012 - 3:28 PM
  18. Hello, for plating the precursor cells, the video mentioned if I am correct 5x10 6/ml and the written protocol is "Cells should be plated at a density of 1 x 106/mL." which one would you recommend.
    About the EDTA I am confused after reading a previous reply. DŒs EDTA reduce the number of DC? So, if I need a large number of cells, you would recommend pipeting up and down or the 5 ml syringe and 18G needle?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Luis d.
    April 18, 2013 - 5:53 PM
  19. Hi Luis. I recommend plating at 1M/mL for the first plating of the cells. If you plan to collect them within a day or two (activation) you can plate them at a higher density. EDTA may be pipetted against the plate (held at about a 45' angle) during the harvesting stage. EDTA helps remove DCs that are adherent to the plate, this will increase your number of collected DCs. Be sure to be gentile at this stage and use a large pipette, not a small gauge needle for collection of cells. EDTA or scrapping is not necessary for collecting DCs and may lower your purity if your culture has a high percentage of fibroblasts. The needle is used to flush the bone marrow - you may use an 18 guauge or smaller as I did in the video. Insulin syringes are handy and most people have them around so I demonstrated the technique with this gauge (²6 1/²).

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    April 19, 2013 - 1:48 AM
  20. Thank you very much for your quick reply!

    Reply
    Posted by: Luis d.
    April 20, 2013 - 10:34 AM
  21. Hi, I was wondering which mice strain have you used in this experiment?

    Reply
    Posted by: anjali c.
    April 5, 2015 - 11:26 PM
  22. Hi Anjali,

    In this example we used wild-type C57BL/6J animals. This protocol can be used for most wt animal strains. If you have a transgenic animal with a specific defect you may need to modify growth conditions for optimal results.

    Good luck!

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    April 6, 2015 - 1:02 PM
  23. Hi. Can you tell me why you chose this strain for the experiment?

    Reply
    Posted by: Nymisha N.
    April 6, 2015 - 10:54 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics