Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Apresentação de antígenos em órgãos linfóides secundários pelas células dendríticas é crucial para o início da célula T mediada resposta imune adaptativa. Aqui demonstramos a cultura de medula óssea células dendríticas derivadas de camundongos, ativação e de rotulagem para os dois fótons de imagem.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

P. Matheu, M., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773, doi:10.3791/773 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vários métodos para a preparação de células dendríticas murinas podem ser encontrados na literatura. Aqui, apresentamos um método que produz mais de 85% CD11c alta células dendríticas em cultura que abriga o linfonodo de drenagem após a injecção subcutânea e antígeno presente nas células T antígeno específico (ver vídeo). Além disso, usamos instrumentos Essen Incucyte para acompanhar a maturação de células dendríticas, onde, no dia 10, a morfologia das células em cultura é típica de uma célula madura dendríticas e% <85 de células são CD11chigh. O estudo da apresentação de antígenos nos linfonodos periféricos por dois fótons de imagem revelou que há três fases distintas de células dendríticas e interação célula T 1, 2. A Fase I consiste de breves contatos serial entre altamente móveis antígeno de células T específicas eo antigénio transportando células dendríticas 1, 2. A fase dois é marcado por contatos prolongados entre antígeno-específica de células T e células dendríticas antígeno tendo 1, 2. Finalmente, a fase III é caracterizada por células T destacando a partir de células dendríticas, recuperando a mobilidade e começam a dividir 1, 2. Este é um exemplo do tipo de antígeno específico interações que podem ser analisados ​​por dois fótons de imagem de antígeno de células-carregados rastreador dye-rotulados células dendríticas.

Protocol

1) Remova os dois ossos do fêmur de um rato

  1. Use uma tesoura para cortar dissecção muscular e expor o osso fêmur acima e abaixo das articulações (joelho e quadril). Segure o centro do fêmur com uma pinça de dissecção e cortar acima e abaixo das articulações para deixar o máximo de epífise intacta possível.
  2. Limpar tanto músculo quanto possível, utilizando uma tesoura de dissecção de pequeno porte. Transferência do fêmur em um prato de RPMI.
  3. Todos os procedimentos devem ser realizados na capa a partir deste ponto, utilizando apenas meios estéreis, instrumentos, ponteiras e placas de cultura.

2) Esterilizar os ossos do fêmur:

  1. Na capa, a transferência de ossos da RPMI para um prato de cultura pequeno enchido com etanol a 70% sobre o gelo.
  2. Permitir que os ossos de molho em álcool por 5 minutos no gelo.

3) Recolha de medula óssea em condições estéreis:

  1. Transferência de ossos para um prato de cultura contendo pequenas estéril filtrado meios de cultura primária DC.
  2. Com uma pinça estéril, segure o osso sobre um prato descartar ou tubo, e com uma tesoura esterilizada, cortar cada epiphesis (extremidades do osso) para fora. O corte deve expor a medula óssea que é vermelho brilhante no centro do osso.
  3. Com uma seringa estéril (26-28 agulha), sugam cerca de 100-200 mL de meios estéreis.
  4. Segurar o osso com a pinça estéril sobre um prato de doce de mídia estéril e inserir a agulha em um lado do osso. A posição da ponta da agulha perto do topo do osso e, lentamente, lavar o osso com a mídia estéril. Se você está no centro do osso, a agulha deve deslizar facilmente.
  5. A medula óssea lava para fora, seja em pequenos pedaços ou como uma peça única. Ele deve ser empurrado para fora do osso e no prato de mídia estéril.
  6. Repita essa etapa conforme necessário para lavar completamente a medula do osso.
  7. Quando o osso está limpo, ele será branco e translúcido.
  8. Repita este procedimento com o osso fêmur outros. Descartar cada osso do fêmur, uma vez que está limpo.

4) Re-suspender e girar as células da medula óssea:

  1. Transferência de células para um tubo falcon estéril.
  2. Se a medula ainda está intacto, muito gentilmente pipeta media cima e para baixo no prato, para quebrar a medula em uma suspensão de células individuais. Isto pode levar alguns minutos e deve ser feito lentamente para evitar matar as células por pura força.
  3. Células centrífuga como faria com qualquer outras células de mamíferos.

5) Lise Celular:

  1. Retire o tubo da centrífuga, após o spin é feito e despeje mídia off (decantar) em um desperdício pequenos (50 mL tubo falcon) na capa.
  2. Ressuspender suavemente flicking pellet no fundo do tubo.
  3. Utilizando água filtrada estéril e DPBS 10x ou 10x PBS, realizar uma lise de água para remover as células vermelhas do sangue (hemácias), utilizando os seguintes volumes:
    • 900 mL de água estéril filtrado
    • 100 mL DPBS 10x ou 10x PBS
  4. Adicionar 100 mL de segundos 10x PBS 10/05 após a adição da água. É muito importante fazer isso imediatamente, para que apenas as hemácias são lisadas. É uma boa idéia ter as duas pipetas cheio e pronto.
  5. Adicionar 5 mL - 10 mL de estéril media DC básica.

6) contagem de células:

  1. Na capa, o mix mL 6-11 de células da medula óssea rodando suavemente o tubo com uma ligeira inversão, uma inclinação de 45 graus (não para que a mídia toca o topo do tubo)
  2. Retire 10 mL dos meios de comunicação em um tubo estéril para contar.
  3. Feche as células e centrifugar novamente.

7) células dendríticas Plating:

  1. As células devem ser banhados com uma densidade de 1 x 106/mL.
  2. Remove as células de centrífuga, a mídia decantar e re-suspensão em células a quantidade adequada de mídia primária DC para revestimento.
  3. Lugar na cultura de tecidos incubadora.

8) Cuidado Cultura e Maturação:

Sempre verifique culturas antes de adicionar mais mídia ou utilizar em qualquer experimentos. Verifique o estado geral de saúde das células e olhar para a contaminação potencial.

DIA 0: As células dendríticas banhado.

DIA 3: Remove 75% dos meios de comunicação e não adherant células e adicionar mídia primária de volta DC.

DIA 6: Depois de Plating célula inicial: Re placa-as células usando o seguinte procedimento:

  1. Remova a mídia, que deve conter alguns DCs não adherant neste momento, e colocar em um tubo de 50 mL estéreis falcão, deixando as placas ligeiramente úmido (você não quer que as células aderentes a secar)
  2. Adicione 3 mM EDTA em PBS para cada prato e deixe descansar por 5 minutos.
  3. Segure a placa em um ângulo de 45 graus e gentilmente pipeta mídia para cima e para baixo contra a parte inferior da placa gentilmente desalojar não adherant células.
  4. EDTA / PBS deve tornar-se mais espessa, indicando as células estão sendo coletados a partir do fundo doprato.
  5. Depois de alguns minutos disso, a mistura de células pode ser transferido para o tubo de 50 mL falcon.
  6. Girar todas as células, após esse procedimento para cada prato.
  7. Contagem e placa de as células a uma densidade de 1 x 10 ^ 6 por placa no Media Secundária DC em novas placas de cultura estéril 10 cm. Retorno células para cultura de tecidos incubadora.

DIA 11/10

DCs maduras prontas para a estimulação / antígeno de carga.

9) estimulação das células dendríticas:

  1. Use LPS (lipopolyscaccharide) em combinação com peptídeo desejado para a activação e carregamento de peptídeo. Dependendo da sua fonte de LPS, condições de estimulação diferentes poderão dar melhores resultados. Além disso, a quantidade desejada de peptídeo para apresentação DC deve ser otimizado. Condições de estimulação neste protocolo foram 100 ng / mL e 100 LPS OVA ug / mL (ovalbumina).
  2. Antígeno carga / tratar com LPS por 18-24 horas antes da colheita / utilização.

Mídia células dendríticas: filtro estéril depois de tudo ter sido adicionado

Por favor, consulte a seção de discussão para uma revisão de diferentes condições de cultura de células dendríticas e para o fenótipo resultante célula dendrítica. Estas condições de cultivo são projetados para produzir células dendríticas maduras que rapidamente se casa para os linfonodos de drenagem, 18-24 horas após a injecção subcutânea e antígeno presente de forma eficiente.

DC primário Media: filtro estéril depois de tudo ter sido adicionado

  • 500 mL IMDM (remove 55-60 mL de volume final de 500mL)
  • 50 mL de calor FBS inativada
  • 5 mL de 200 mM L-Gln, concentração final de 2 mM
  • 100 UI / ml de penicilina e estreptomicina 100 mg / mL (5 mL de 10.000 Pen IU / mL e 10.000 mg / mL de ações Strep)
  • 50 uM B-Me (14,3 M estoque B-Me, diluir 1:100 na capa químicos, use 35 ul por 100 mL de mídia para concentração de 50 micromolar)
  • 20-30 ng / mL GM-CSF
  • 100-400 UI / mL IL-4 cerca de 10-40 ng / mL

* Media SecondaryDC para maturação

100 ng / mL TNF-alfa (add to primário DC media)

* Nota: GM-CSF + IL-4 deve produzir células dendríticas imaturas. Usando GM-CSF + IL4 (400 UI / ul) + TNF-alfa (100 ug / mL) irá criar células que se assemelham madura monócitos derivados células dendríticas. Células dendríticas maduras são conhecidos por não levar até o antígeno de forma tão eficiente como células dendríticas imaturas e culturas pode ter endógena TNF-a liberados a partir de células do estroma 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

As células dendríticas são mediadores-chave da resposta imune adaptativa ea célula mais eficiente do antígeno apresentando caracterizada até o momento. Métodos para humanos e cultura de células dendríticas do mouse na literatura diferem no tipo de citocinas usadas para influenciar o desenvolvimento de diferentes tipos de células dendríticas. Nomeadamente, a GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alfa e IFN-gama são utilizadas em diferentes combinações para produzir maduros, imaturos, inflamatórias e steady-state, como medula óssea de camundongos células dendríticas derivadas in vitro 3-7. Aqui, apresentamos um método simples para a produção de células dendríticas maduras murino que são capazes de homing para linfonodos drenantes após a injeção subcutânea, apresentando antígeno e ativando as células T nd ve. A população de células dendríticas é tipicamente resultando> CD11chigh 85% com a expressão indutível de CD80/86 na ativação LPS. A adição de TNF- à cultura no dia 7 é opcional e produz um phenotype8 mais maduro. A manutenção de culturas in vitro de células dendríticas de Langerhans, TNF-alfa é um fator importante de sobrevivência, mas não estimular o amadurecimento das células 9. Note-se que o TNF-alfa a partir de fontes endógenas (provavelmente células do estroma) tem sido relatada a estar presente na cultura da mídia 7. Outros métodos bem sucedidos para a imagem latente subcutânea de células dendríticas incluem seleção positiva de células CD11c + do baço, bem como a rotulagem concorrentes e ativação da célula dendrítica endógena população1, 2, 10. Produção de células dendríticas CD11chigh da medula óssea é um método robusto que consistentemente produz um grande número de células dendríticas capaz de apresentação de antígenos in vivo, importante na imagem do processo de ativação do sistema imune adaptativo 11, 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

National Institutes of Health comunhão Fellowship Kirchstein predoctoral AI-64128 (MPM), GM-41514 (MDC), GM-48071 (IP)

References

  1. Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J Exp Med. 200, 847-856 (2004).
  2. Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).
  3. Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102, 1753-1763 (2003).
  4. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  5. Lutz, M. B., et al. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).
  6. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  7. Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. 3, (2001).
  8. Winzler, C., et al. Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. J Exp Med. 185, 317-328 (1997).
  9. Koch, F., et al. Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation. J Exp Med. 171, 159-171 (1990).
  10. Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
  11. Wei, S. H., et al. Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node. J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).
  12. Castellino, F., et al. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).

Comments

23 Comments

  1. what are the aproximate yeilds of the process, ie total per femur and the number (from one femur) at D6 replating?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 12, 2009 - 3:57 PM
  2. I usually have around 1² M DCs per femur on day 6, passing the cells using EDTA rather than trypsin (which is generally less efficient, but has other advantages). Typically the yield is higher if I use a younger animal.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 6:20 PM
  3. I read in other protocol that 10 ng/ml of GM-CSF (with out IL4) is enough to derive immature dendritic cells from bone marrow. Do we really need to supplement the media with IL-4?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 14, 2010 - 2:42 PM
  4. IL-4 is not necessary, but the resulting DCs will generally be different. Here is a publication that details this:

    " Influence of interleukin-4 on the phenotype and function of bone marrow-derived murine dendritic cells generated under serum-free conditions."

    Wells JW, Darling D, Farzaneh F, Galea-Lauri J.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 6:14 PM
  5. Have you tried splitting the cells when they're still immature? I am worried that splitting them would activate them and/or kill a large number of cells...

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:36 PM
  6. Hi Joanna,

    I typically do split the cells while they would be considered immature. This likely leads to a low level activation, but I have not defined the exact nature of the activation status after splitting the cells. In my experience large numbers of cells do not die off after splitting. Prolonged exposure to trypsin or a calcium chelator could result in die off of cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 6:11 PM
  7. Great, do they usually re-attach normally to the plate? I didnt use trypsin, but i scraped them for splitting, and they are floating around today... im not sure if they're still alive or not!
    Thanks!!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2010 - 10:02 AM
  8. Hi, yes they should be reattached to the plate by now if they were healthy.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2010 - 12:36 PM
  9. The video is great, but can you please remove the absolutely tedious music from it? It is so destracting and makes it very difficult to concentrate.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2010 - 6:12 AM
  10. Hello:

    I am slightly confused. Your video says to use 300 mM EDTA, but your protocol below says to use 3mM EDTA. Is this a typo?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 1, 2011 - 2:26 PM
  11. Can you please provide the supplier/manufacturer of the Cytokines (IL-4, GM-CSF, TNFa)?
    thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 16, 2011 - 9:54 AM
  12. R&D Systems

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 16, 2011 - 11:00 AM
  13. What is the difference between using the EDTA to remove the DCs and using a cell scraper? A ²008 JOVE protocol "Culture of myeloid DCs from bone marrow precursors" uses a cell scraper. Just wondering if there is a reason for using EDTA over a scraper?

    Reply
    Posted by: Greg P.
    June 5, 2012 - 10:54 AM
  14. Sorry for the late reply. You could use either method, i.e. either EDTA or scraper. Depending on your experiment and the needed number of cells, gentle pipeting up and down 5-10 times using a 5 ml pipet can also give you a good number of DCs. Instead of a scraper you can use a 5 ml syringe and 18G needle to draw in and then flush out media to the bottom of the plates to dislodge DCs. DCs are very sensitive to change. So another tip is to keep the DC plates towards the back of the incubator, so that opening/closing of doors dŒs not change the ambient temperature too much. Hope this helps. - D. Sen

    Reply
    Posted by: Debasish S.
    June 25, 2012 - 8:34 PM
  15. Could you please sent me an copy of this article which help me out in my PhD. I am culturing with ²0ng/ml of GM-CSF. Is that ok for growing the dendritic cells isolated from murine bome marrow.

    Reply
    Posted by: srinath g.
    June 22, 2012 - 8:13 AM
  16. ²0 ng/ml is the standard that we use for bone marrow preparation. If you want more mature DCs you can use more upto say 30 ng/ml.

    Reply
    Posted by: Debasish S.
    June 25, 2012 - 8:28 PM
  17. Hi, I was wondering if you could share or explain what your FSC SSC plot/gate look like? I am not sure what population to gate on the plot.

    Reply
    Posted by: kristin l.
    November 19, 2012 - 3:28 PM
  18. Hello, for plating the precursor cells, the video mentioned if I am correct 5x10 6/ml and the written protocol is "Cells should be plated at a density of 1 x 106/mL." which one would you recommend.
    About the EDTA I am confused after reading a previous reply. DŒs EDTA reduce the number of DC? So, if I need a large number of cells, you would recommend pipeting up and down or the 5 ml syringe and 18G needle?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Luis d.
    April 18, 2013 - 5:53 PM
  19. Hi Luis. I recommend plating at 1M/mL for the first plating of the cells. If you plan to collect them within a day or two (activation) you can plate them at a higher density. EDTA may be pipetted against the plate (held at about a 45' angle) during the harvesting stage. EDTA helps remove DCs that are adherent to the plate, this will increase your number of collected DCs. Be sure to be gentile at this stage and use a large pipette, not a small gauge needle for collection of cells. EDTA or scrapping is not necessary for collecting DCs and may lower your purity if your culture has a high percentage of fibroblasts. The needle is used to flush the bone marrow - you may use an 18 guauge or smaller as I did in the video. Insulin syringes are handy and most people have them around so I demonstrated the technique with this gauge (²6 1/²).

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    April 19, 2013 - 1:48 AM
  20. Thank you very much for your quick reply!

    Reply
    Posted by: Luis d.
    April 20, 2013 - 10:34 AM
  21. Hi, I was wondering which mice strain have you used in this experiment?

    Reply
    Posted by: anjali c.
    April 5, 2015 - 11:26 PM
  22. Hi Anjali,

    In this example we used wild-type C57BL/6J animals. This protocol can be used for most wt animal strains. If you have a transgenic animal with a specific defect you may need to modify growth conditions for optimal results.

    Good luck!

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    April 6, 2015 - 1:02 PM
  23. Hi. Can you tell me why you chose this strain for the experiment?

    Reply
    Posted by: Nymisha N.
    April 6, 2015 - 10:54 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics